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DE60129721T2 - Zusammensetzung zur verminderung neutralen fetts im blut - Google Patents

Zusammensetzung zur verminderung neutralen fetts im blut Download PDF

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DE60129721T2
DE60129721T2 DE60129721T DE60129721T DE60129721T2 DE 60129721 T2 DE60129721 T2 DE 60129721T2 DE 60129721 T DE60129721 T DE 60129721T DE 60129721 T DE60129721 T DE 60129721T DE 60129721 T2 DE60129721 T2 DE 60129721T2
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globulin
proteins
phytate
protein
neutral
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DE60129721T
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Mitsutaka Tsukuba-gun KOHNO
Motohiko Tsukuba-gun HIROTSUKA
Toshiaki Izumisano-shi AOYAMA
Kiyoharu Izumisano-shi TAKAMATSU
Yukio Izumisano-shi HASHIMOTO
Makoto Kyoto-shi KITO
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Fuji Oil Co Ltd
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Fuji Oil Co Ltd
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett.
  • STAND DER TECHNIK
  • Unter den Gemüseproteinen besitzt ein Sojaprotein nicht nur eine ausgezeichnete Ernährungseigenschaft, sondern es wurde auch kürzlich herausgefunden, dass es verschiedene physiologische Wirkungen besitzt und es wurde ein attraktives Nahrungsmittelmaterial als ein physiologisch funktioneller Wirkstoff.
  • Ein reduzierender Effekt auf das neutrale Blutfett eines Sojaproteins wurde bereits festgestellt, basierend auf einem körperfettreduzierenden Effekt des Sojaproteins, und über seinen Mechanismus wurde durch Iritani et al., (J. Nutr. 126, 380, 1996) berichtet, dass er ein inhibitorischer Effekt auf die Aktivität einer Fettsäuresynthetase in einer Leber ist. Zusätzlich wurde jedes eines ganzen Sojabohnenglobulins, ein 7S-Globulin und ein 11S-Globulin auf seinen Effekt auf Fett im Blut und der Leber untersucht, und es wurde berichtet, dass es im allgemeinen in Bezug auf die Fähigkeit Blutcholesterin oder neutrales Fett zu reduzieren besser ist, wenn es mit Kasein, das ein Tierprotein ist, verglichen wird (Okita et al., J. Nutr., 27, 379, 1981).
  • Es wurde auch über eine 11S-Globulin-Defektsojabohne, sprich eine 7S-globulinreiche Saat, die durch eine Züchtung erhalten wurde, berichtet (Breeding Science, 46, 11, 1996) zusammen mit ihrer Nützlichkeit (Breeding Science, 50, 101, 2000) und ihrem Patent ( US 6,171,640 B1 ).
  • Dennoch ist es von einem Sojaprotein, einschließlich einem 7S-Globulin, bekannt, dass es einen Komplex mit Phytat bildet, wodurch die Verdauung des Sojaproteins nachteilig beeinträchtig wird (M. A. Ritter, et al., J. Food Sci., 52, 325, 1987).
  • Es wurden auch von Sojabohnen stammende Proteine, Proteine mit hohen Affinitäten zu polaren Lipiden als Bestandteile einer cytoplasmatischen Membran, wie auch einer Proteinkörper- oder Ölkörpermembran identifiziert und durch Samoto et al., als "Ölkörper-assoziierte Proteine" bezeichnet. Ein Ölkörper-assoziiertes Protein ist eine allgemeine Bezeichnung für die Proteine, die hauptsächlich aus Membranproteinen bestehen, insbesondere diejenigen, deren Molekulargewichte, gemessen durch eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, 34 kDa, 24 kDa und 18 kDa betrugen, und die als eine Fraktion bestehen, die ungefähr 10 bis 12 Gew.% polarer Lipide enthält, die mit einer 2:1 polaren Lösungsmittelmischung von Chloroform:Ethanol extrahierbar sind, und über die durch Samoto et al. berichtet wurde, dass sie in einer Menge hergestellt werden, die so hoch ist wie ungefähr 35 % der industriell hergestellten fraktionierten Sojaproteine (B.B.B., 62 (5), 935–940 (1998)). Ein Ölkörper-assoziiertes Protein hat einen schlechten Geschmack und eine hohe Allergenität.
  • Dennoch wird, da ein Ölkörper-assoziiertes Protein bei einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, die heute zur Bestimmung der Zusammensetzung eines Sojaproteins verwendet wird, nur leicht gefärbt wird, seine geschätzte Menge weit weniger als seine tatsächliche Menge oder fast vernachlässigbar. So konzentriert sich eine konventionelle Fraktionierung nur auf ein 7S und ein 11S und achtet nicht auf die Ölkörper- assoziierten Proteine, die jede Fraktion kontaminieren. Von einem physiologischen Standpunkt aus sollte das Verhalten dieser Ölkörper-assoziierten Proteine jedoch zum Zwecke des Erhaltens des 7S und des 11S in höheren Reinheiten mit beachtet werden.
  • Ein 7S-Globulin effizient aus einem Sojaprotein herzustellen, während die Phytatbindung als ein Komplex abgespalten wird und die Kontaminierung mit dem Ölkörper-assoziierten Proteinen unterdrückt wird, wodurch die Reinheit erhöht wird, ist bei der Verwendung nicht nur als ein extrem sicheres pharmazeutisches Material zur Senkung von neutralem Blutfett, sondern auch als ein Nahrungsmittel sehr wichtig.
  • EP-A-1,174,516 beschreibt ein Verfahren zur Fraktionierung von Sojaproteinen in eine 7S-globulinreiche Fraktion und eine 11S-globulinreiche Fraktion.
  • EP-A-992,395 beschreibt ein Verfahren, das die Beimpfung von Koji-Schimmelpilz ("mould") auf Hülsenfrüchte, um die Kojivermehrung zu bewirken, und die Hydrolyse des resultierenden Produkts umfasst. Zwischen den Beimpfungs- und Hydrolyseschritten, werden Bakterien, die darmregulierende Effekte auf Tiere mit Einzelmagen ausüben, zu den Hülsenfrüchte zugegeben.
  • J. Nutr. Sci Vitaminal., 1981, 27(4): 379–388 (Okita Takuo et al.) beschreibt die Effekte von diätetischen Sojaglobulinen auf Plasma- und Leberlipide und eine fekale Exkretion von neutralen Sterolen bei Ratten.
  • J Food Sci 1987, 5112: 325–327 und 341 (Ritter MA et al.) beschreibt die in vitro-Verdaubarkeit von Phytat-reduzierten und Phenol-reduzierten Sojaproteinisolaten.
  • AUFGABEN DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist es, aus den Sojaproteinen eine Fraktion zu erhalten, die eine Fähigkeit zur Reduktion von neutralem Blutfett aufweist, und diese Fraktion zu behandeln, um ihre Fähigkeit zu steigern, wodurch sie als ein Nahrungsmittel oder ein Arzneimittel bereitgestellt wird. Die Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Wir untersuchten intensiv und erhielten die folgenden Ergebnisse.
    • (1) Wenn ein 11S-Globulin durch ein Verfahren von Thahn und Shibasaki, das ein Standardverfahren für die Fraktionierung der Sojaproteine aus einer entfetteten Sojabohne, gefolgt durch Fraktionierung eines 7S-Globulins davon, ist, entfernt wird, ist eine Fraktionierung in einer Reinheit, die so hoch wie 50 % oder höher ist, möglich, ohne dass irgendein Reduzierungsmittel verwendet wird.
    • (2) Wenn das oben beschriebene 7S-Globulin und ein 7S-Globulin, das nach der Abspaltung der Phytatbindung an das 7S-Globulin erhalten wurde (hier im folgenden als ein Phytat-reduziertes 7S-Globulin bezeichnet), einer Studie bei Ratten für 21 Tage unter Verwendung von Kasein als einer Referenzkontrolle unterworfen wurden, zeigten das 7S-Globulin und das Phytat-reduzierte 7S-Globulin bessere neutrale Blutfett-reduzierende Fähigkeiten, wenn sie mit dem Kasein verglichen wurden, wobei das Phytat-reduzierte 7S-Globulin einen besonders hohen Neutralfett-reduzierenden Effekt zeigte.
    • (3) In Antwort auf den Beginn dieses Neutralfett-reduzierenden Effektes wird der Cholesterin-Blutspiegel erniedrigt. Während diese Cholesterin-reduzierende Fähigkeit durch sowohl das 7S-Globulin wie auch das Phytat-reduzierte 7S-Globulin gezeigt wird, wird der HDL-Cholesterin (HDLC)-Spiegel eher durch das Phytat-reduzierte 7S-Globulin verbessert. Das HDLC ist das sogenannte gute Cholesterin, das überschüssige Cholesterine aufnimmt, und ein verbessertes HDLC führt zu einer großen Reduktion bei dem arteriellen Skleroseindex, wenn es mit einem Gesamtcholesterin-reduzierenden Effekt kombiniert wird. Arterieller Skleroseindex = (Gesamtcholesterin – HDL-Cholesterin)/HDL-Cholesterin)
    • (4) Durch weitere Behandlung der Sojaproteine mit einem Phytat-abbauenden Enzym kann ein Niedrig-Phytin-7S-Globulin, von dem Phytat abgespalten wurde, fraktioniert werden.
    • (5) Durch weitere Entfernung eines Membranprotein-reichen Ölkörper-assoziierten Proteins, das ein Sojaprotein kontaminiert, kann die Wirksamkeit des 7S-Globulins als ein aktiver Inhaltsstoff weiter gesteigert werden. Als ein Ergebnis wurde entdeckt, dass durch Abspaltung von Phytat von einem 7S-Globulin, von dem angenommen wird, dass es einen neutrales Blutfett-reduzierenden Effekt aufweist, und durch Entfernung der Ölkörper-assoziierten Proteine, um die Reinheit zu steigern, eine höhere Wirksamkeit zusammen mit einer korrespondierenden Reduktion bei der Dosis erreicht werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung festgelegt wurde.
  • Die Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett bereit, deren aktive Inhaltsstoffe 7S-globulinreiche Phytat-reduzierte Sojaproteine sind. Es wird auch eine neutrales Blutfett-reduzierende Zusammensetzung bereitgestellt, deren aktiver Inhaltsstoff ein Phytat-reduziertes hochgereinigtes 7S-Globulin ist, das ein 7S-globulinreiches Sojaprotein ist, das durch Reinigung einer Fraktion, die einen großen Anteil eines 7S-Globulins als einen Hauptbestandteil der Sojaproteine enthält, auf eine Proteinreinheit (auf der Basis von SPE, unten beschrieben) von so viel wie 50 % oder höher erhalten wird, worin die Chloroform:Methanol-extrahierbaren polaren Lipide als die Indizes des Ölkörper-assoziierten Proteins auf einen Spiegel von 1/3 oder weniger reduziert wurden und worin der Phytatgehalt, der bei ungefähr 2 % liegt, basierend auf den Proteinen in einem kommerziellen Sojaproteinprodukt, auf einen Spiegel von 0,2 % oder weniger durch Abspaltung von Phytat reduziert wurde, basierend auf den Proteinen. So kann mit Hilfe einer Fraktionierung, die eine Suppression der Kontaminierung mit den Membranprotein-reichen Ölkörper-assoziierten Protein so weit wie möglich und eine Abspaltung von Phytat involviert, eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett mit einer weiter gesteigerten Wirksamkeit bereitgestellt werden. Auf der anderen Seite wird durch Anwendung eines Phytat-abbauenden Enzyms während des Herstellungsverfahrens eines Sojaproteins die Fraktionierung eines 7S-Globulins erleichtert, wodurch eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett bereitgestellt wird, die als einen aktiven Inhaltsstoff ein hochgereinigtes Phytat-reduziertes 7S-Globulin enthält, resultierend aus einer Reduktion im Phytat auf 0,2 % oder weniger, basierend auf den Proteinen, und aus einer Reduktion bei den Ölkörper-assoziierten Proteinen auf 10 % oder weniger. Ebenfalls bereitgestellt wird eine Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett, die ohne Verwendung irgendwelcher Reduktionsmittel während des Herstellungsprozesses, der oben beschrieben wird, hergestellt wird.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSARTEN
  • Bei dieser Erfindung bedeutet ein 7S-Globulin ein Globulin, dessen Ultrazentrifugations-Sedimentationskoeffizient unter den löslichen globulären Proteinen, die allgemein als Globuline bezeichnet werden, 7S ist. Basierend auf der Molekulargewichtsverteilung werden die Globuline in 2S, 7S, 11S und 15S klassifiziert, unter denen von 7S und 11S bekannt ist, dass sie in den Depot-Proteinen einer Hülsenfrucht, wie einer Sojabohne, reichlich vorkommen. Das 7S-Globulin einer Sojabohne ist im wesentlichen das gleiche wie β-Conglycinin, was ein immunologischer Begriff ist.
  • Bei dieser Erfindung wird eine 7S-globulinreiche Fraktion, die aus Sojaproteinen erhalten wird, als ein Inhaltsstoff verwendet. Der erste Schritt für die Fraktionierung des 7S-Globulins aus den Sojaproteinen involviert die Entfernung eines 11S-Globulins. Diese Entfernung kann durch en Verfahren von Thahn und Shibasaki (Thahn, V.H., und Shibasaki, K., J. Agric. Food Chem., 24, 117, 1976), das in diesen Tagen für den Erhalt von jeder Globulinfraktion breit angewendet wird, wie auch ein Kälte-unlösliche Fraktion (CIF)-Verfahren, das Kryopräzipitation verwendet (Briggs, D. R., und Mann, R.L., Cereal Chem, 27, 243, 1950) und eine Fraktionierung mit der Zugabe von 0,1 N Kalziumchlorid, das durch Wolf et al. (Wolf, W.J. und Sly, D.A., Cereal Chem, 44, 653, 1967) vorgeschlagen wird, hervorgerufen werden. Eine Fraktion, die von dem 11S und den Ölkörper-assoziierten Proteinen durch das Verfahren, das unten in Herstellungsbeispiel 2 beschrieben wird, befreit wurde, kann auch verwendet werden.
  • Nach der Entfernung des 11S-Globulins durch irgend eines der Verfahren, die oben beschrieben werden, wird ein 7S-Globulin durch ein gewöhnliches Verfahren zur Herstellung eines isolierten Sojaproteins fraktioniert. Bei einem solchen Verfahren kann ein 7S-Globulin mit einer Reinheit, die ausreichend akzeptabel für die Verwendung ist, in der Abwesenheit eines Reduktionsmittels erhalten werden und eine solche Abwesenheit eines Reduktionsmittels ist für eine breitere Anwendung, auch wenn es als ein Neutralfett-reduzierender Wirkstoff verwendet wird, vorzuziehen. Es kann ein 7S-globulinreiches Sojaprotein erhalten werden, dessen Proteinreinheit (auf der Basis von SPE) 50 % oder mehr, vorzugsweise 60 % oder mehr, mehr vorzuziehen 80 % oder mehr, insbesondere 85 % oder mehr beträgt. Die so erhaltene 7S-globulinreiche Fraktion wird weiter einer Behandlung mit einem Enzym unterworfen, das eine Phytat-abbauende Wirkung aufweist, wie Phytase oder Phosphatase oder eine Formulierung davon, wodurch Phytat abgespalten wird. Als ein Ergebnis wird die neutrales Blutfett-reduzierende Fähigkeit, die ein Phytat-reduziertes 7S-Globulin, das man durch Abspaltung von Phytat auf einen Spiegel von 0,2 % oder weniger, vorzugsweise 0,1 % oder weniger, mehr vorzuziehen 0,05 % oder weniger, basierend auf den Proteinen, erhält, natürlich besitzt, gesteigert.
  • Ein Verfahren zur Fraktionierung des Phytat-reduzierten 7S-Globulins, das man durch Abspaltung von Phytat, wie oben beschrieben, erhält, kann gleichzeitig mit einer Entfernung eines 11S-Globulins erreicht werden, indem man ein Sojaprotein direkt mit einem Enzym behandelt, das eine Phytat-abbauende Wirkung aufweist, wie Phytase und Phosphatase, wie auch eine Formulierung davon.
  • Weiter kann durch Entfernung der Ölkörper-assoziierten Proteine die neutrales Blutfett-reduzierende Fähigkeit des Phytat-reduzierten 7S-Globulins weiter gesteigert werden. Für diesen Zweck können die Ölkörper-assoziierten Proteine als eine Präzipitation bei pH 5,6 bis 6,8 nach Erhitzung (30 bis 75°C) bei einem schwach sauren pH (pH 3,8 bis 6,8), bei dem sie dazu neigen, unlöslich zu sein, entfernt werden.
  • Eine Zusammensetzung der Erfindung kann als eine orale Zusammensetzung formuliert sein, deren aktiver Inhaltsstoff eine Fraktion ist, die wie oben beschrieben erhalten wird, oder ein Sojaprotein und sie kann in verschiedene Dosierungsformen, wie Pulver, Zucker-beschichtete Tabletten und Granulate durch bekannte Verfahren wahlweise zusammen mit anderen Arzneiträgern und Zusatzstoffen formuliert werden.
  • Eine Fraktion oder ein Sojaprotein, das als ein aktiver Inhaltsstoff gemäß der Erfindung verwendet wird, ist ein sicheres essbares Material, dessen Menge, die in einer Zusammensetzung enthalten sein wird, oder die aufgenommen werden soll, nicht besonders begrenzt ist und es kann aufgenommen werden wie es ist oder es kann in ein Nahrungsprodukt für eine diätetische Therapie eingeschlossen sein. Eine bevorzugte Menge, die pro kg Körpergewicht aufgenommen werden kann, liegt bei 50 bis 500 mg, vorzugsweise bei 100 bis 300 mg als 7S-globulinreiche Phytat-reduzierte Sojaproteine.
  • BEISPIELE
  • Die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen diskutiert.
  • Die hauptsächlichen analytischen Verfahren, die bei dieser Erfindung Verwendung finden, werden unten beschrieben.
    • – Rohprotein; basierend auf einem Kjeldahl-Verfahren, wurde ein Stickstoffgehalt bestimmt und mit dem Koeffizient 6,25 multipliziert, um in ein Rohprotein zu konvertieren.
    • – SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese; basierend auf einem Verfahren von Laemmli (Nature, 227, 680 (1970)) wurde eine Analyse mit einer Gradientengelkonzentration von 10 bis 20 % durchgeführt. Die Menge einer aufgetragenen Probe betrug 10 μg.
    • – Phytat; es wurde ein Verfahren von Alii Mohamed (Cereal Chemistry 63, 475–478, 1986) verwendet.
    • – Chloroform-Methanol-extrahierbare Ölfraktion; eine getrocknete Probe wurde mit einem ungefähr 50-fachen Volumen einer Mischung aus Chloroform und Methanol (2:1 Volumen/Volumen) verbunden und das Gewichtsverhältnis der Feststoffe, die durch Rückfluss extrahiert wurden, wurden als ein Chloroform·Methanol-extrahierbarer Ölanteil bestimmt.
    • – Reinheit (SPE-Standard); das Muster der Banden, die bei der oben beschriebenen SDS-Polyacrylamidelektrophorese erhalten wurden, wurde durch ein Densitometer gemessen und ein Prozentbereich der korrespondierenden Bande, basierend auf dem Gesamtbereich, wurde als eine Reinheit (auf der Basis von SPE) dargestellt. Ein hier erwähnter 7S-Globulingehalt bedeutet die Gesamtmenge von α,α' und β-Untereinheiten, während ein 11S-Globulingehalt die Gesamtmenge von sauren Polypeptiden (A) und basischen Polypeptiden (B) bedeutet.
    • – Korrigierte Reinheit; basierend auf einer Reinheit (auf Basis von SPE), die oben erhalten wurde, und Annahme irgendwelcher kontaminierender Ölkörper-assoziierter Proteine, wurde eine korrigierte Reinheit berechnet, wie unten beschrieben wird. So wird die Reinheit einer Probe (auf Basis von SPE) als A % dargestellt und eine Reinheit wird als ein Wert berechnet, basierend auf den Gesamtproteinen, einschließlich dem 7S-Globulin, den 11S-Globulinen und den Ölkörper-assoziierten Proteinen, da die Probe die Ölkörper-assoziierten Proteine in einer Menge von mindestens dem 10-fachen des Chloroform·Methanol-extrahierbaren Ölanteils zusätzlich zu dem 7S-Globulin und dem 11S-Globulin enthält. Korrigierte Reinheit (%) = (100 (%) – Chloroform·Methanol-extrahierbarer Ölanteil (%) ·10)·A(%)/100
    • – Neutralfette, Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterine (HDLC); es wurde ein DRYCHEM-Modell 5500, hergestellt durch Fuji Film, in einem Festphasenverfahren angewendet.
  • Bevorzugte Ausführungsarten der Erfindung werden unten beschrieben.
  • HERSTELLUNGSBEISPIEL 1 (Herstellung von 7S-Globulin = "7S" und Phytat-reduziertem 7S-Globulin = "7S-PH")
  • Eine entfettete Sojabohne wurde mit Wasser in einem Gewichtsverhältnis von 1:10 verbunden und unter Einstellung auf einen pH 7,0 für 1 Stunde gerührt und dann zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min, 20°C, 10 Minuten), um ein Präzipitat zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde auf pH 6,4 eingestellt, man ließ in bei 4°C über Nacht stehen und er wurde zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min, 4°C, 10 Minuten), um das Präzipitat zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde auf pH 4,5 eingestellt und zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min, 4°C, 10 Minuten) und das resultierende Präzipitat wurde als ein käsiger 7S-Globulin-Niederschlag gewonnen.
  • Dieser käsige 7S-Globulin-Niederschlag wurde mit einem 4-fachen Volumen an Wasser kombiniert, auf pH 6,0 eingestellt, mit Phytase (NOVO, PHYTASE NOVO L) bei 0,2 %, basierend auf den Proteinen, ergänzt und dann ließ man ihn bei 40°C für 1 Stunde reagieren. Die Reaktionsmischung wurde auf pH 5,0 eingestellt, zentrifugiert (4.000 Umdrehungen/min, 20°C, 10 Minuten), um eine Molkefraktion zu entfernen, wodurch ein Phytat-reduzierter käsiger 7S-Globulin-Niederschlag erhalten wurde. Sowohl der käsige 7S-Globulin-Niederschlag, wie auch der Phytat-reduzierte käsige 7S-Globulin-Niederschlag wurden hydriert und dann bei pH 7,0 neutralisiert, bei 140°C für 15 Sekunden sterilisiert und dann schnell sprühgetrocknet, um ein 7S-Globulin und ein Phytat-reduziertes 7S-Globulin zu erhalten. Jedes der so erhaltenen 7S-Globuline und der Phytat-reduzierten 7S-Globuline wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektorphorese unterworfen und die Intensität der Farbe einer gefärbten Proteinbande enthüllte, dass die Reinheit 80 % betrug. Die Phytatgehalte in beiden betrugen 1,8 % bzw. 0,05 % was enthüllte, dass die Phytasebehandlung in einer fast vollständigen Spaltung des Phytats resultierte. Der Chloroform-Methanol-extrahierbare Ölanteil dieser Probe betrug 2,8 %. Auf der anderen Seite betrug die Gesamtmenge der Schwefel-enthaltenen Aminosäuren, Cystin und Methionin, 25 mg/g Protein, was höher war als 5 mg/g Protein, was natürlicherweise durch ein gereinigtes 7S gezeigt wird, was nahe legt, dass eine wesentliche Menge an Unreinheiten weiter verblieb.
  • HERSTELLUNGSBEISPIEL 2 (Herstellung von hoch gereinigtem Phytat-reduziertem 7S-Globulin: "7S-PH-LP")
  • Ein Gewichtsanteil einer niedrig-modifizierten entfetteten Sojabohne wurde mit 10 Gew.-Anteilen von Extraktionswasser bei 40°C verbunden und auf pH 5,3 mit Salzsäure eingestellt. Diese Lösung wurde mit 8 Einheiten pro Protein Phytase (NOVO, PHYTASE NOVO L) ergänzt und einer Proteinextraktion gleichzeitig mit einer Enzymreaktion für 30 Minuten bei 40°C unterworfen, um einen enzymbehandelten Aufschlämmungsextrakt zu erhalten. Dieser enzymbehandelte Aufschlämmungsextrakt wurde auf ungefähr 25°C abgekühlt, auf pH 6,1 mit Salzsäure eingestellt und unter Verwendung einer Chargentyp-Zentrifuge zentrifugiert (3.000 G). Dabei wurde eine diskrete Trennung zwischen einer löslichen Fraktion und einer unlöslichen Fraktion beobachtet. Die Lösungstemperatur dieser Zentrifuge betrug ungefähr 25°C. Darauffolgend wurde die lösliche Fraktion auf pH 4,9 mit Salzsäure eingestellt und zentrifugiert, um einen käsigen Präzipitat-Niederschlag zu erhalten. Der käsige Präzipitat-Niederschlag wurde mit einem 10-fachen Volumen an Wasser gewaschen, hydriert (auf das 4-fache Gewicht), mit Natriumhydroxid neutralisiert, bei 140°C für 15 Sekunden sterilisiert und dann schnell sprühgetrocknet, um ein Phytase-behandeltes 7S-globulinreiches fraktioniertes Sojaprotein ("7S-PH-LP") zu erhalten.
  • Das Phytat-reduzierte 7S-Globulin, das so erhalten wurde, wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und die Farbintensität einer gefärbten Proteinbande enthüllte, dass die Reinheit 95 % betrug. Der Phytatgehalt betrug 0,05 % basierend auf den Proteinen, was eine fast vollständige Spaltung des Phytats anzeigt. Auf der anderen Seite war der Chloroform·Methanol-extrahierbare Ölanteil dieser Probe 0,5 %, was wesentlich niedriger ist, wenn es mit Herstellungsbeispiel 1 verglichen wird. Die Gesamtmenge der Schwefel-enthaltenden Aminosäuren, Cystin und Methionin, betrug 12 mg/g Protein, was darauf hinweist, dass ein hoch gereinigtes 7S erhalten wurde, dessen Unreinheiten im Hinblick auf den Wert 5 mg/g Protein, der natürlich durch ein gereinigtes 7S gezeigt wird, substantiell niedrig waren.
  • BEISPIEL 1 (Verifikation von neutralem Blutfett-reduzierendem Effekt bei Ratten)
  • Ein neutrales Blutfett-reduzierender Effekt wurde bei Ratten verifiziert. Jedes Futter, das hier verwendet wurde, enthielt als ein diätetisches Protein das Sojaprotein, das in dem oben beschriebenen Herstellungsbeispiel 2 erhalten wurde, oder Kasein (vitaminfreies Kasein, ORIENTAL YEAST) als eine Kontrolle in einer Konzentration von 20 %, zusammen mit 0,5 % Cholesterin und 0,125 % Natriumcholat, wie auch einer 1:2-Mischung von Saccharose und Maisstärke. Eine typische Formulierung wird in Tabelle 1 dargestellt, die unten gezeigt wird. TABELLE 1 Futterformulierung von jeder Behandlungsgruppe
    Bestandteil Zusammensetzung (%)
    Protein Eingestellt auf 20 % als Rohprotein mit α-Maisstärke
    Saccharose 20,0
    Maisöl 5,0
    Vitaminmix 1,0
    Mineralmix 3,5
    Pulverisierte Cellulose 5,0
    Cholinhydrogentartrat 0,2
    Cholesterin 0,5
    Natriumcholat 0,125
    α-Maisstärke auf insgesamt 100
  • Die Versuchstiere waren 5 Wochen alte (Wachstumsperiode) und 20 Wochen alte (Reifeperiode) männliche Wistar-Ratten (Gewicht von 100 bis 120 g, und 330 bis 360 g), wurden von NIPPON SLC erworben, und erhielten ein kommerzielles Festfutter (ORIENTAL YEAST, CRF-1) vorläufig für 1 Woche und sie wurden dann in zwei Behandlungsgruppen eingeteilt, von denen jede aus 6 Tieren ohne Abweichung in den Körpergewichten zwischen den Gruppen bestand, und die Tiere wurden für 10 Tage mit Testfuttern aufgezogen. Jede Ratte wohnte in einem individuellen Käfig bei einer Temperatur von 23±1°C und einer Feuchtigkeit von 55±5 % bei einem 12 Stunden Beleuchtungszeitraum (7:00 morgens bis 7:00 abends). Während der Aufzuchtperiode ließ man die Tiere Wasser und Futter ad libitum erhalten.
  • Die Behandlungsperiode betrug 10 Tage, während denen das Körpergewicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2 und 3, die unten gezeigt werden, dargestellt. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Gewichtszunahme zwischen den Gruppen beobachtet. TABELLE 2 Änderung im Körpergewicht bei der Behandlungsgruppe von 5 Wochen alten Ratten, Einheit: g
    Behandlungsgruppe Kasein Phytat-reduziertes 7S-Globulin (7S-PH)
    Beginn der Behandlung 153,3±1,3 153,3±1,3
    Ende der Behandlung 201,7±1,3 192,0±1,5
    Gewichtszunahme 48,4±1,3 38,7±1,6
    TABELLE 3 Änderung im Körpergewicht bei der Behandlungsgruppe von 20 Wochen alten Ratten, Einheit: g
    Behandlungsgruppe Kasein Phytat-reduziertes 7S-Globulin (7S-PH)
    Beginn der Behandlung 357,2±2,7 356,4±5,8
    Ende der Behandlung 358,7±3,7 352±10,3
    Gewichtszunahme 0,3±2,1 4,4±4,6
  • Nach der 10-tägigen Behandlungsperiode ließ man jedes Tier für 7 Stunden vom Morgen an (8:00 morgens) an dem 11. Tag fasten und dann wurde es einer Laparotomie unter einer Anästhesie mit Nembutal unterworfen und es wurde Blut aus der abdominellen Aorta über eine heparinisierte Spritze abgenommen. Das Blut wurde zentrifugiert (3.000 Umdrehungen/min, 5°C für 15 Minuten), um Plasma zu trennen, welches auf die Neutralfette und die Cholesterine untersucht wurde. Es wurde das Mittel und die Standardabweichung der Daten in jeder Gruppe berechnet und eine statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Duncan's multiplem Range-Test analysiert. Die Ergebnisse werden in Tabellen 4 und 5 gezeigt. In den Tabellen sind ein % Neutralfettreduktion und ein % Cholesterinreduktion die Verhältnisse (%) der Differenz bei den jeweiligen Daten zwischen der Kaseingruppe und der Behandlungsgruppe, basierend auf den Daten in der Kaseingruppe. TABELLE 4 Änderung der neutralen Blutfette bei der Behandlungsgruppe von 5 Wochen alten Ratten
    Behandlungsgruppe Kasein Phytat-reduziertes 7S-Globulin (7S-PH)
    Neutralfettspiegel 176,2±10,9 89,1±5,7
    %-Neutralfettreduktion 49,6
    Gesamtcholesterinspiegel 144,1±6,0 93,5±2,9
    %-Cholesterinreduktion 35,1
    • Einheit; (Spiegel) mg/dl, (Verhältnis) %
    TABELLE 5 Änderung der neutralen Blutfette bei der Behandlungsgruppe von 20 Wochen alten Ratten
    Behandlungsgruppe Kasein Phytat-reduziertes 7S-Globulin (7S-PH)
    Neutralfettspiegel 261,2±22,5 108,6±21,6
    %-Neutralfettreduktion 58,4
    Gesamtcholesterinspiegel 132,5±3,5 92,8±14,5
    %-Cholesterinreduktion 30,0
    • Einheit; (Spiegel) mg/dl, (Verhältnis) %
  • Wie aus den oben gezeigten Daten offensichtlich ist, zeigte das Phytat-reduzierte 7S-Globulin deutliche Cholesterin- und neutrales Blutfett-reduzierende Effekte sowohl in der Wachstumsperiode (5 Wochen alt) wie auch der Reifeperiode (20 Wochen alt).
  • VERGLEICHSBEISPIEL 1 (Verifikation des neutrales Blutfett-reduzierenden Effekts bei Ratten)
  • Ähnlich zu Beispiel 1 wurde ein neutrales Blutfett-reduzierender Effekt bei Ratten verifiziert. Ein Behandlungsfutter besaß eine Zusammensetzung, die der in Beispiel 1 ähnlich war, außer, dass als ein Sojaprotein das 7S-Globulin (7S), das in Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde, verwendet wurde.
  • Die Versuchstiere waren 5 Wochen alte männliche Wistar-Ratten (Gewicht von 90 bis 110 g), erworben von NIPPON SLC, und sie erhielten ein kommerzielles Festfutter (ORIENTAL YEAST, CRF-1) vorläufig für 1 Woche und dann wurden sie in zwei Behandlungsgruppen aufgeteilt, die jeweils insgesamt aus 6 Tieren ohne Abweichung in dem Körperwicht zwischen den Gruppen bestand, und die Tiere wurden für 3 Wochen mit Testfuttern aufgezogen. Jede Ratte wurde in einem individuellen Käfig bei einer Temperatur von 23±1°C und einer Feuchtigkeit von 55±5 % bei einem 12-ständigen Beleuchtungszeitraum (7:00 morgens bis 7:00 abends) untergebracht. Während der Aufzuchtperiode ließ man die Tiere Wasser und Futter ad libitum erhalten.
  • Der Behandlungszeitraum betrug 21 Tage, während denen das Körpergewicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6, die unten gezeigt wird, dargestellt. Es wurde kein signifikanter Unterschied bei der Gewichtszunahme zwischen den Gruppen beobachtet. Tabelle 6 Gewichtsveränderung bei der Behandlungsgruppe; Einheit: g
    Behandlungsgruppe Kasein 7 Globulin (7S-PH)
    Behandlungsbeginn 151,0±1,3 151,1±0,9
    Ende der Behandlung 243,8±1,6 240,8±5,5
    Gewichtszunahme 92,7±1,5 89,7±6,0
  • Nach dem 21-tägigen Behandlungszeitraum ließ man jedes Tier für 6 Stunden von dem Morgen (8:00 morgens) an dem 22. Tag an fasten und dann wurde es einer Laparotomie unter einer Anästhesie mit Nembutal unterworfen und es wurde Blut aus der abdominellen Aorta über eine heparinisierte Spritze abgenommen. Das Blut wurde zentrifugiert (3.000 Umdrehungen/min, 5°C für 10 Minuten), um Plasma abzutrennen, was auf die Neutralfette und die Cholesterine untersucht wurde. Das Mittel und die Standardabweichung der Daten in jeder Gruppe wurden berechnet und eine statistische Signifikanz wurde unter Verwendung von Duncan's multiplem Range-Test analysiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Jedes % Reduktion wurde durch ein Verfahren bestimmt, das demjenigen von Tabelle 4 und 5 in Beispiel 1 ähnlich war. Tabelle 7 Änderung bei den neutralen Blutfetten in der Behandlungsgruppe; Einheit: g
    Behandlungsgruppe Kasein 7S-Globulin (7S-PH)
    Neutralfettspiegel 190,4±12,2 122,7±6,6
    Neutralfettreduktion 35,6
    Gesamtcholesterinspiegel 118,7±4,5 109,9±5,8
    Cholesterinreduktion 7,4
    • Einheit: (Spiegel) mg/dl, (Verhältnis) %
  • Wenn mit den Cholesterin- und Neutralfett-reduzierenden Effekten des Phytat-reduzierten 7S-Globulins, das in Beispiel 1 verwendet wurde, relativ zu Kasein verglichen wurde, war der reduzierende Effekt des 7S-Globulins im Vergleichsbeispiel 1 niedriger, was offen legt, dass das Phytat-reduzierte 7S-Globulin einen höheren Blutfett-verbessernden Effekt besitzt, wenn es mit dem 7S-Globulin verglichen wird.
  • BEISPIEL 2
  • Es wurde der neutrales Blutfett-reduzierende Effekt des hoch gereinigten Phytat-reduzierten 7S-Globulins (7S-PH-LP), das in Herstellungsbeispiel 2 hergestellt wurde, untersucht. Als Kontrollen wurde das Kasein, das in Beispiel 1 verwendet wurde, das 7S-Globulin (7S), das Phytat-reduzierte 7S-Globulin (7S-PH) und ein kommerziell getrenntes Sojaprotein (SPI) verwendet. Die Zusammensetzung von jedem Protein wird in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8 Einheit: %
    SPI 7S 7S-PH 7S-PH-LP
    Rohprotein 86,2 88,0 90,5 92,3
    Reinheit (auf der Basis von SPE) 80,0 82,2 95,7
    Chloroform·Methanolextrahierbare Ölfraktion 3,2 2,8 2,8 0,5
    Phytat 1,8 1,8 0,05 0,05
    Korrigierte Reinheit 57,6 59,2 90,9
  • Es wurden 5 Wochen alte Ratten, die denjenigen von Beispiel 1 ähnlich waren, als Versuchstiere verwendet und für 2 Wochen aufgezogen, während denen das Körpergewicht unter den Bedingungen, die denjenigen von Beispiel 1 ähnlich waren, beobachtet wurde. Nach dem Behandlungszeitraum wurde Blut ähnlich Beispiel 1 entnommen und auf die Neutralfette und die Cholesterine untersucht.
  • Die Ergebnisse beinhalteten die Änderung in dem Körpergewicht, gezeigt in Tabelle 9, und die Neutralfette, das Cholesterin, HDLC und den arteriellen Skleroseindex, der daraus berechnet wird, gezeigt in Tabelle 10. TABELLE 9 Einheit: g
    Kasein SPI 7S 7S-PH 7S-PH-LP
    Behandlungsbeginn 138,5 138,7 135,8 135,5 137,8
    Ende der Behandlung 210,2 212,9 206,9 179,6 206,5
    Gewichtszunahme 71,7 74,3 71,1 44,0 68,8
    TABELLE 10 Einheit: mg/dl
    Kasein SPI 7S 7S-PH 7S-PH-LP
    Neutralfettspiegel 178,3 120,0 105,0 92,7 91,0
    Gesamtcholesterinspiegel 125,6 88,3 88,3 90,8 87,3
    HDLC 37,1 36,8 34,2 43,5 44,0
    Arterieller Skleroseindex 2,39 1,40 1,58 1,09 0,98
  • Basierend auf den Ergebnissen, die oben beschrieben werden, waren die Neutralfett- und die Cholesterin-reduzierenden Effekte in der Reihenfolge, die unten gezeigt wird, höher, Kasein<<PI=7S<7S-PH<7S-PH-LP und es wurde gezeigt, dass HDLC in einer Phytat-freien Gruppe verbessert war. So zeigte das hoch gereinigte Phytat-reduzierte 7S-Globulin, das man durch Entfernung von Phytat und auch durch Entfernung der Ölkörper-assoziierten Proteine erhielt, den offensichtlichsten Serumlipid-verbessernden Effekt, insbesondere einen arteriellen Skleroseindex-reduzierenden Effekt.
  • GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine effiziente Reduktion bei dem Blutspiegel von Neutralfett und eine Zusammensetzung der Erfindung, die sehr sicher ist, ist nicht nur als ein prophylaktisches oder therapeutisches Mittel für den Zweck der Reduktion des Neutralfett-Blutspiegels wesentlich, sondern auch in der Lage als ein Nahrungsprodukt für solche Zwecke zu dienen.

Claims (13)

  1. Verwendung eines 7S-globulinreichen, im Phytatgehalt reduzierten Sojaproteins, dessen Phytatgehalt 0,2 % oder weniger beträgt, basierend auf den Proteinen, als Wirkstoff für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Reduktion von neutralem Blutfett.
  2. Verwendung gemäß Anspruch 1, umfassend 50 % oder mehr eines 7S-Globulins, basierend auf den Proteinen.
  3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend 10 % oder weniger eines Ölkörper-assoziierten Proteins, basierend auf den Proteinen.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend 1 % oder weniger einer Chloroform:Methanol (2:1)-löslichen Fraktion, basierend auf den Proteinen.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 1, erhalten durch Umsetzung eines Sojaproteins mit einem Phytatabbauenzym.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 1, aus einer Sojabohne hergestellt, enthaltend 50 % oder mehr eines 7S-Globulins, basierend auf den Proteinen.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 1, ohne Verwendung irgendwelcher Reduktionsmittel im gesamten Herstellungsverfahren hergestellt.
  8. Neutrale Blutfett-reduzierende Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff ein 7S-globulinreiches, im Phytatgehalt reduziertes Sojaprotein, dessen Phytatgehalt 0,2 % oder weniger beträgt, basierend auf den Proteinen, wobei die Zusammensetzung 50 % oder mehr eines 7S-Globulins umfaßt, basierend auf den Proteinen.
  9. Neutrale Blutfett-reduzierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, umfassend 10 % oder weniger eines Ölkörper-assoziierten Proteins, basierend auf den Proteinen.
  10. Neutrale Blutfett-reduzierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, umfassend 1 % oder weniger einer Chloroform:Methanol (2:1)-löslichen Fraktion, basierend auf den Proteinen.
  11. Neutrale Blutfett-reduzierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, die erhalten wird durch Umsetzung eines Sojaproteins mit einem Phytatabbauenzym.
  12. Neutrale Blutfett-reduzierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, die aus einer Sojabohne hergestellt wird, enthaltend 50 % oder mehr eines 7S-Globulins, basierend auf den Proteinen.
  13. Neutrale Blutfett-reduzierende Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, die ohne Verwendung irgendwelcher Reduktionsmittel im gesamten Herstellungsverfahren hergestellt wird.
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Inventor name: TAKAMATSU, KIYOHARU, IZUMISANO-SHI, OSAKA 598 , JP

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