DE1767099B1

DE1767099B1 - Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins mit einer Hemmwirkung gegenueber Magensaeureabsonderung und einer Antiaktivitaet gegenueber Ulcus-Bildung

Info

Publication number: DE1767099B1
Application number: DE19681767099
Authority: DE
Inventors: Miki Kawasaki; Masayoshi Kobayashi; Masaaki Yamamoto
Original assignee: Teikoku Hormone Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1967-03-29
Filing date: 1968-03-29
Publication date: 1972-02-03
Also published as: FR8375M; GB1179384A; NL6804473A; US3522229A; SE348107B; NL138816B

Description

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sublingualen Drüsen, submaxillaren Drüsen und Ohr- 37⁰C erhalten werden kann, und es enthält lediglich Speicheldrüsen verwendet werden. etwa 3 % Zucker. Es ist somit deutlich von den Glyko-

AIs Ausgangsmaterial für Speichel oder Speichel- proteinen gemäß der Erfindung verschieden, drüsen von Säugetieren sind solche von den Huftieren, Die ausgefällten unwirksamen Proteinsubstanzen

z. B. Rind, Pferd, Schwein und Sehaf, und von anderen 5 werden von der das Glykoprotein gemäß der Erfin-Säugetieren als den Huftieren, z. B. Hund, Katze, dung enthaltenden Mutterlauge durch eine gewählte Kaninchen bzw. Hase, Maus und Wal, brauchbar. Feststoff-Flüssigkeits-Trennarbeitsweise, beispielsweise

Die vorstehend genannten Speicheldrüsen werden durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Dekantieren, gedurch Extraktion in einem wäßrigen Medium mit trennt.

einem pH-Wert von 6 bis 8, beispielsweise Wasser, io Ein wasserlösliches Zinksalz wird der sich ergebenschwach alkalisches Wasser oder Salzlösung, ge- den Mutterlauge zugesetzt, und der Niederschlag aus wünschtenfalls nach Entfernung des Fetts aus den einem Komplex des Zinksalzes und Protein wird geDrüsen, zu einem flüssigen Extrakt verarbeitet. bildet. Das im Speichel oder in den Speicheldrüsen Der erhaltene flüssige Extrakt von Speichel oder vorhandene Mucoid verbleibt in der Flüssigkeit. Als Speicheldrüsen wird in dem so erhaltenen Zustand 15 wasserlösliches Zinksalz kann irgendein Salz ver- oder erforderlichenfalls nachdem er einer Feststoff- wendet werden, sofern es ein solches ist, in welchem Flüssigkeits-Trennarbeitsweise unterworfen wurde, bei- ein lösliches Chelatsalz durch Chelatbildung gebildet spielsweise einer Filtration oder Zentrifugierung, um wird, wenn das Zink in dem Zink-Protein-Komplex den unlöslichen Anteil daraus zu entfernen, ange- durch das Chelatbildungsmittel zur Einwirkung gesäuert, um dadurch die gemischten oder unreinen 20 bracht wird; zweckmäßig verwendete Zinksalze gemäß Proteine mit isoelektrischen Punkten von etwa einem der Erfindung umfassen Zinkchlorid, Zinkbromid, pH-Wert von 5,4 bis 5,6 und etwa einem pH-Wert von Zinkacetat od. dgl. Das Zinksalz wird der Mutter-4,0 bis 4,6 auszufällen. Als zu verwendende Säure lauge in der Weise zugegeben, daß die Zinkkonzentrasind zweckmäßig die anorganischen Säuren, z. B. tion in der letzteren einen Wert von 0,01 bis 0,05 Mol Salzsäure, Schwefelsäure und Bromwasserstoffsäure, 25 erreicht. Normalerweise wird eine 0,1- bis 0,5molare brauchbar. Gemäß der bevorzugten Arbeitsweise wäßrige Lösung des Zinksalzes bei einem neutralen wird zunächst der pH-Wert auf 5,4 bis 5,6 eingestellt, pH-Wert in einer Menge zugegeben, die ein Zehntel und die sich abscheidenden Ausfällungen werden ent- der Menge der Mutterlauge beträgt. Der erhaltene fernt, worauf der pH-Wert der überstehenden Flüssig- Zink-Protein-Komplex-Niederschlag wird durch eine keit auf 4,5 bis 4,6 eingestellt und erneut die erhaltenen 30 gewählte Feststoff-Flüssigkeits-Trennarbeitsweise ab-Ausfällungen entfernt werden. Auf diese Weise werden getrennt, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifudie meisten der unwirksamen Proteinsubstanzen ein- gieren. In diesem Fall kann ein mit Wasser mischbares schließlich von Parotinen (parotins) entfernt, und eine organisches Lösungsmittel, z. B. Aceton oder Methaklare Mutterlauge wird erhalten. Beispielsweise ist in nol, zur Beschleunigung der Absetzung des Kom-Ann. New York Acad. Sei., 85, Art. 1, S. 228 bis 310 35 plexes eingemischt werden.

(1960), beschrieben, daß, wenn der pH-Wert entweder Danach wird ein chelatbildendes Mittel von Zink

auf 5,4 oder 4,6 bei der Stufe der Extraktion von zugesetzt, um auf die sich ergebende Ausfällung ein-Parotin und Speichelparotin aus Speichel oder Speichel- zuwirken, worauf die Ausfällung erneut in Wasser drüsen eingestellt wird, diese ausgeschieden werden, da oder einem anderen wäßrigen Medium gelöst wird, durch den isoelektrischen Punkt bei den jeweiligen 40 Als Chelatbildungsmittel für Zink kann irgendeines vorstehend genannten pH-Werten eine Ausfällung be- der bekannten Mittel, z. B. Hydroxysäuren, Ketowirkt wird, wobei jedoch gemäß der Erfindung das säuren, Ketosäureester, /3-Diketon, Aminosäuren, Glykoprotein nicht ausgefällt wird, sondern in der Nitrilotriessigsäure und Äthylendiamintetraessigsäure, oberen Mutterlaugeschicht zurückbleibt. verwendet werden. Chelatbildende Mittel, die für die

Es ist auch bekannt, daß andere dem Parotin, 45 Zwecke gemäß der Erfindung besonders geeignet sind, (X-Parotin (Endocrinol. Japan, 12, S. 69249 [1965]) und sind Natriumeitrat, Glycin und Äthylendiamintetraß-Parotin (Endocrinol. Japan, 12, S. 69249 [1965]) essigsäure (ÄDTA). Es ist natürlich erwünscht, daß ähnliche Substanzen aus der Ohrspeicheldrüse er- das chelatbildende Mittel in einer äquivalenten oder halten werden, während S-Parotin (Ann. N. Y. Acad. größeren Menge als das Zink zugegeben wird. Sei., 85, Art. 1, S. 228 bis 310 [I960]) aus der sub- 5° Anschließend wird die sich ergebende Lösung einer maxillaren Drüse erhalten wird. Außerdem wurde Dialyse unterworfen, um das Zinkchelat zu entfernen eine dem Speichelparotin ähnliche Substanz, nämlich und dadurch ein Dialysat zu erhalten, das das Glyko-Speichelparotin-A, aus dem Speichel extrahiert (Ann. protein gemäß der Erfindung enthält. Die Dialyse, die N. Y. Acad. Sei., 85, Art. 1, S. 228 bis 310 [I960]). nach der an sich bekannten Arbeitsweise ausgeführt Das Λ-Parotin und S-Parotin werden jedoch als Aus- 55 wird, wird mühelos durch Dialysieren der bei der f ällungen am isoelektrischen Punkt bei einem pH-Wert Wiederauflösung in der vorstehend beschriebenen von 5,4 oder von 4,5 bis 4,6, wie das Parotin, ausge- Stufe erhaltenen Lösung gegen fließendes Wasser fällt. Daher können diese von dem Glykoprotein gemäß durch eine dialytische Membran, beispielsweise ZeIlder Erfindung in der vorstehend beschriebenen Be- glas, ausgeführt.

handlungsstufe getrennt werden. Speichelparotin-A ist 60 Das so erhaltene Dialysat ist eine Flüssigkeit, die ein Protein von niedrigem Molekulargewicht, das nur hauptsächlich wirksame Substanzen enthält. Zur durch Heißextraktion mit Eisessig erhalten werden Sammlung der wirksamen Substanzen in reinerer Form kann und überhaupt keinen Zucker enthält. Auch wird vorzugsweise nach Zusatz einer geringen Menge Parotin und S-Parotin sind einfache Proteine, die von Natriumchlorid ein mit Wasser mischbares orgakeinerlei Zucker enthalten und einwandfrei von dem 65 rasches Lösungsmittel, beispielsweise Aceton und Glykoprotein gemäß der Erfindung unterscheidbar Äthanol, dem Dialysat zugegeben, um dessen Konzensind. Andererseits ist /S-Parotin eine Substanz, die tration auf 30°/₀ einzustellen. Ferner werden die ge* lediglich durch Autolyse der Ohrspeicheldrüse bei bildeten, nicht benötigten Ausfällungen, die durch den

Zusatz des Lösungsmittels erhalten werden, mittels einer zentrifugalen Trennung entfernt, und der überstehenden Flüssigkeit wird das gleiche organische Lösungsmittel zugesetzt, wobei deren Konzentration zwischen 30 und 60 °/₀ eingeregelt wird. Dadurch werden die gewünschten aktiven Substanzen gemäß der Erfindung erhalten.

Bei Verwendung von submaxillaren Drüsen allein oder gemischtem Speichel und/oder gemischten Drüsen wird vorzugsweise ein Sulfat von Ammoniak oder einem Alkalimetall unter Einregelung von dessen Konzentration bis auf eine Sättigung von 0,5 zugegeben, und der sich ergebende Niederschlag wird gesammelt. Brauchbare Alkalisulfate sind Natriumsulfat und Kaliumsulfat, wobei jedoch die Verwendung 15 proteine ähnlicher Aktivität von Ammoniumsulfat besonders bevorzugt wird. Das erhalten.

aktivität gegenüber Ulcus-Bildung und kann daher für verschiedene Magenerkrankungen in einer geeigneten Form für die orale Verabreichung oder für die Injektion verwendet werden. Da dieses Glykoprotein sehr leicht wasserlöslich ist, kann es ferner nach üblichen Arbeitsweisen zur Reinigung von Proteinen homogenisiert werden. Die bevorzugten Arbeitsweisen sind insbesondere die Ionenaustauschchromatographie, die Gelfiltrationsarbeitsweise und die Stärkeblockelektrophorese, die sowohl einzeln als auch in Kombination zur Anwendung gelangen können.

Wenn die aus den verschiedenen Ausgangsmaterialien erhaltenen gereinigten Glykoproteine noch mehr homogenisiert werden, werden homogenisierte Glyko-

und Zusammensetzung

wirksame Glykoprotein gemäß der Erfindung kann zu diesem Zeitpunkt als Ausfällung ausgeschieden werden, während andererseits die anderen Proteinsubstanzen in der Lösung zurückbleiben.

Bei Verwendung von submaxillaren Drüsen enthält der flüssige Extrakt den Nervenwachstumsfaktor (NGF), und wie das Glykoprotein gemäß der Erfindung wird auch der Faktor NGF als Zinkkomplex durch Ausfällung abgetrennt. Mit Bezug auf den Nervenwachstumsfaktor wird auf die Veröffentlichungen Levi — Montalcini, Ann. N. Y. Acad. Sei., 118, S. 149, 1964, und Levi —Montalcini, Science, 143, S. 105, 1965, und Yamamoto, japanische Auslegeschrift 20957/66 hingewiesen.

Da jedoch NGF durch ein fraktioniertes Ausfällungsverfahren mit Sulfat in einer Konzentration zwischen einer Sättigung von 0,5 und 0,71 (24 bis 33 Gew./Gewichtsprozent) ausgefällt werden kann,

jedoch bei einer Konzentration einer Sättigung von 35

unterhalb 0,5 nicht ausgefällt wird und in der überstehenden Flüssigkeit verbleibt, kann es von dem Glykoprotein gemäß der Erfindung unterschieden werden. Überdies ist NGF von der Substanz gemäß Lysin der Erfindung im Hinblick auf ein einfaches Protein, 40 Histidin das keinerlei Zucker enthält, verschieden. Arginin

Wenn die mit einer Sulfatsättigung von 0,5 erhaltene Ausfällung in Wasser gelöst wird, von dem Sulfat durch Dialysieren nach der gleichen Arbeitsweise, wie vorstehend angegeben, befreit und anschließend das Dialysat gefroren und getrocknet wird (Gefriertrocknung), wird das gereinigte wirksame Glykoprotein gemäß der Erfindung erhalten. Das gereinigtere Glykoprotein kann jedoch auch unter Anwendung von beiden der vorstehend angegebenen Behandlungen mit einem 50 Isoleucin in Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und Leucin

dem genannten Sulfatfraktionierverfahren in Kombina- Tyrosin

tion erhalten werden. Phenylalanin

Die Ausbeute von dem gemäß der Erfindung er- Cystin haltenen gereinigten Glykoprotein aus den verschie- 55 Tryptophan denen Ausgangsmaterialien sind im allgemeinen wie nachstehend angegeben: 100 mg je 1 Liter Speichel, mg je 1 kg sublingualen Drüsen, 700 mg je 1 kg submaxillaren Drüsen und 100 mg je 1 kg Ohrspeicheldrüsen; dabei besteht die Neigung, daß das gereinigte Glykoprotein aus den Drüsen in bezug auf die Reinheit etwas schlechter ist als dasjenige, das aus Speichel erhalten wurde und außerdem auch eine etwas geringere Aktivität aufweist.

Das nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene Glykoprotein ist vollständig gereinigt und besitzt überdies eine ausgeprägte Hemmwirkung gegenüber der Magensäureabsonderung sowie eine Anti-Das homogenisierte Glykoprotein ist ein nichtdialysierbares Glykoprotein mit einem hohen Molekulargewicht von oberhalb 150 000. Die Ergebnisse von dessen Elementaranalyse sind: H = 7,68%; C = 42,31%; N = 9,15%; und es besteht aus 34,9% Zucker und 62,6% Peptid. Es besitzt eine maximale Absorption im ultravioletten Bereich bei 280 πιμ und der Extinktionskoeffizient bei dieser Wellenlänge ist Ei* = 4,67.

Der isoelektrische Punkt, gemessen durch Elektrophorese, mit einer Acetylcellulosemembran als Träger zeigt einen pH-Wert von 2,6.

In der nachstehenden Tabelle I sind die analytischen Ergebnisse der Zucker- und Aminosäurezusammensetzung angegeben.

Tabelle I

Aminosäuren- und Zuckerzusammensetzung des homogenisierten neuen Glykoproteins

Aminosäure mMol/g mg/g

Zucker mg/g

Asparaginsäure + Asparagin
Glutaminsäure + Glutamin

Threonin

Serin

Prolin

Glycin

Alanin

Valin

Galactose

Fucose

Glucosamin

Sialinsäure (Sialic acid)

Gesamt

578 349

Der Lipid- und Phosphorgehalt von diesem Glykoprotein beträgt nicht mehr als 0,1 %, und es enthält keine Fette oder Nucleinsäuren. Es neigt zu einem Verlust seiner Aktivität in alkalischer Lösung, und dessen Aktivität zeigt eine ausgeprägte Abnahme bei Behandlung während 3 Stunden bei einem pH-Wert

pylorus-abgebundenen (pylorus-ligated) Ratten wurde hinsichtlich der Magensekretion gefunden, daß bei Verabreichung von 500 μg/kg Rattengewicht eines aus Speichel erhaltenen Glykoproteins, das gereinigt war, 5 eine Abnahme nach 6 Stunden Unterbindung (Ligatur) von 67% der Menge an Magensekretion, von 76% der freien Azidität und von 35% der Gesamtazidität, verglichen mit denjenigen einer Kontrollgruppe, vorhanden war. Hinsichtlich der Magengeschwürbildung

oberhalb 10. Es ist in saurer Lösung stabil, wobei überhaupt keine Änderung beobachtet wird, auch wenn es während 3 Stunden bei einem pH-Wert von 1,5 behandelt wird. Es ist ebenfalls verhältnismäßig stabil gegenüber Verdauungsenzymen. Das Glykoprotein gemäß der Erfindung ist eine neue Substanz, die sich von anderen bekannten Proteinsubstanzen, die im Speichel und in den Speicheldrüsen vorhanden sind, unterscheidet.

Wie vorstehend angegeben, sind Parotin und paro- io des Vorderbereiches des Magens traten andererseits tinähnliche Substanzen, wie S-Parotin und Speichel- überhaupt keine Magengeschwüre, selbst nach einer parotin, und NGF einfache Proteine, die von dem Abbindung während 20 Stunden, auf, verglichen mit Glykoprotein gemäß der Erfindung hinsichtlich ihres dem Auftreten von Magengeschwüren in der Kontrollisoelektrischen Punktes verschieden sind. Außerdem gruppe, wobei diese bereits nach lediglich 12 Stunden unterscheiden sich «-Parotin und /?-Parotin von dem 15 Abbindung auftraten.

Glykoprotein gemäß der Erfindung sowohl hinsichtlich Wenn andererseits 5 mg je Kilogramm von aus

ihres isoelektrischen Punktes als auch ihres Zucker- Speicheldrüsen erhaltenem Glykoprotein in ähnlicher

gehaltes. Weise an pylorus-abgebundene Ratten verabreicht

Es ist bekannt, daß neben den vorstehend ange- wurden, trat eine Abnahme nach 6stündiger Abbingebenen Parotinen und NGF der Speichel und die ao dung von 76% in der Menge des Magensaftes, 88% Speicheldrüsen solche Enzyme, wie Amylase, Lysozym der freien Azidität und 44% der Gesamtazidität, ver- und Protease, und derartige biologisch aktive Sub- glichen mit der Kontrollgruppe, auf. Überdies war stanzen, wie Callicrein, enthalten. Jedoch enthalten das Auftreten von Magengeschwüren in dem vorderen sämtliche dieser Substanzen keine Zucker und sind Bereich des Magens selbst nach 20stündiger Abbineinfache Proteine und sind in ihren chemischen Eigen- 25 dung vollständig gehemmt.

schäften von dem Glykoprotein gemäß der Erfindung Aus diesen Versuchen, bei welchen pylorus-abge-

verschieden. Auf Grund der Tatsache, daß die vor- bundene Ratten verwendet wurden, ist es klar ersicht-

stehend angegebenen enzymatischen und biologischen lieh, daß das gereinigte Glykoprotein aus Speichel und

Aktivitäten in dem Glykoprotein gemäß der Erfindung Speicheldrüsen ausgeprägte Hemmwirkungen auf die

selbst nicht beobachtet werden und daß im Gegensatz 30 Magensäureabsonderung und die Ulcus-Bildung be-

dazu die vorstehend aufgeführten Substanzen die sitzt.

Antiaktivitäten gegenüber einer Magensäureabsonde- Bei der Untersuchung der Hemmwirkung auf die

rung und Ulcus-Bildung überhaupt nicht aufweisen, Geschwürbildung bei Shey-Ratten wurde festgestellt,

ist es klar ersichtlich, daß das Glykoprotein gemäß der daß, wie in der nachstehenden Tabelle II gezeigt wird,

Erfindung ein neuartiger Stoff ist. Überdies wird 35 bei einer Dosis von 2 mg/kg Glykoprotein aus Speichel

weder eine Aktivität gegenüber Magensäureabsonde- nur bei 40 % der Tiere eine Geschwürbildung eintritt,

rung noch gegenüber Ulcus-Bildung in irgendeinem die in den meisten Fällen nur von schwachen Symp-

der Parotine und deren analogen Substanzen oder in tomen begleitet wurde, während bei den Kontroll-

NGF beobachtet. gruppen bei allen Tieren ein Magengeschwür auftrat,

Bei einer Untersuchung der Hemmwirkungen des 40 wobei diese Fälle von ernsthafter Kondition waren.

nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltenen Glykoproteins gegenüber Magensäureabsonderung und Magengeschwürbildung unter Verwendung von

Selbst bei einer Verabreichung von 0,5 mg/kg erreichte das Auftreten nur 65 %> wobei die meisten Fälle von leichter Kondition waren.

Tabelle II
Hemmwirkung des gereinigten Glykoproteins auf beschränkte Magengeschwüre von Ratten

Probendosierung
(mg/kg Körpergewicht)

Anzahl

von Tieren

Auftreten*

von Erkrankungen

(7a)

Erkrankungen**

Morphologische Reihenfolge

(Anzahl von Tieren)

Salzlösung (Kontrolle)

Gereinigtes Glykoprotein, erhalten aus Speichel

2,0

0,5

Gereinigtes Glykoprotein, erhalten aus Drüsen

20,0

5,0

20

20 20

20 (100)

8 13

12

(40) (65)

(30) (60)

12
7

14

5
7

2
5

0 0

2 2

0 0

* Anzahl und Prozentsatz von Tieren, die wenigstens eine auf einen bestimmten Teil des Körpers beschränkte Erkrankung (Magengeschwür oder Herd [focus]), mit wesentlichen Kreislaufstörungen als Begleiterscheinung, zeigen.
** Die angegebenen Symbole sind in folgender Weise definiert:

— Keine auffallenden, örtlich beschränkten Erkrankungen (Geschwür, Herd, Hyperämie, ödem, Krebs, hämorrhagischer

Belag).

+ Leichte, örtlich beschränkte Erkrankung, deutliche Hyperämie, wobei jedoch kein hämorrhagischer Belag erhalten wird. -1—(- Deutliche, örtlich beschränkte Erkrankung (kein Geschwür), hämorrhagischer Belag einer Größe von unterhalb 1 mm. +++ Deutliche, örtlich beschränkte Erkrankung (Geschwür), nicht ausgedehnt über ein Fünftel Fläche des Magens.
_|—[--j-+ Deutliche, örtlich beschränkte Erkrankung (Geschwür), ausgedehnt über ein Fünftel Fläche des Magens hinaus.

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9 10

Andererseits war im Falle von gereinigtem Glyko- ersten flüssigen Extrakt vermischt wurde, in ein Zellprotein, das aus Speicheldrüsen erhalten worden war, glasrohr gegossen und gegen fließendes Wasser wähdas Auftreten von Geschwüren in einem Ausmaß von rend 48 Stunden dialysiert wird. 30% bei einer Verabreichung von 20 mg/kg und in 1,25 g NaCl werden zu 250 ml des Dialysats zugeeinem Ausmaß von 60 % bei einer Verabreichung 5 geben, worauf 107 ml Aceton unter Rühren und Kühvon 5 mg/kg, wobei diese Geschwüre leichte Fälle len zugesetzt werden, um eine Konzentration von 30% waren. Es ist somit ersichtlich, daß das aus Speichel zu erhalten. Danach wird die Lösung über Nacht erhaltene gereinigte Giykoprotein ebenso wie das aus stehengelassen.

Speicheldrüsen erhaltene gereinigte Giykoprotein eine Die erhaltene Ausfällung wird durch Zentrifugieren ausgeprägte Wirkung bezüglich der Hemmung des io entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wird auf

Auftretens von begrenzten Geschwüren aufweist. eine Konzentration von 60% durch einen weiteren

Das neue Giykoprotein gemäß der Erfindung kann Zusatz an Aceton gebracht. Die Ausfällung, die sich zur Erleichterung von verschiedenen Magenerkrankun- infolge des Stehenlassens der überstehenden Flüssiggen durch Einverleiben einer therapeutisch wirksamen keit über Nacht bildete, wird durch Zentrifugieren abMenge desselben mit einem pharmazeutisch annehm- 15 getrennt. Eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung wird baren Träger nach Gefriertrocknung des Glyko- einer Lösung dieser Ausfällung in der 5fachen Menge proteins verwendet werden. Die therapeutisch wirk- Wasser zugegeben, um die Sättigung der Lösung auf same Menge wird beträchtlich variiert in Abhängigkeit eine Sättigung von 0,5 (24 Gew./Gewichtsprozent) zu von den Symptomen, dem Körpergewicht, den Ver- bringen. Der pH-Wert der Lösung wird dann auf neuabreichungszeiten od. dgl. Im allgemeinen wird eine 20 tral eingestellt, worauf die Lösung über Nacht in Menge im Bereich von 0,1 bis 100 mg wunschgemäß einem Eisschrank stehengelassen wird. Die dabei abals eine Dosierung gewählt. Das neuartige Glyko- geschiedene Ausfällung wird entweder durch Zentrifuprotein gemäß der Erfindung wird den Patienten gieren oder Filtration gesammelt, und nach Auflösung mittels oraler Verabreichung oder intramuskulärer in einer geringen Menge Wasser wird die Lösung in Injektion gegeben. Bei der oralen Verabreichung wird 25 ein Zellglasrohr gebracht und gegen destilliertes das neuartige Giykoprotein gemäß der Erfindung in Wasser dialysiert. Wenn nach mehrmaliger Änderung Form von Granulaten, Tabletten oder Pillen, die der äußeren Flüssigkeit das Dialysat lyophil gemacht unter Verwendung von Lactose, Stärke, Talk od. dgl. wird, wird ein aus dem Speichel stammendes Glykoals Träger hergestellt wurden, oder in einem Zustand, proteinpulver in einer Menge von 1 g erhalten, bei welchem es in eine Gelatinekapsel eingebracht ist, 30 Zur Homogenisierung von diesem gereinigten verabreicht. Bei der intramuskulären Injektion wird Glykoproteinpulver kann irgendeines der verschiededas gefriergetrocknete Pulver von Giykoprotein in nen Verfahren, die gewöhnlich zum Reinigen von Proeiner physiologischen Lösung von Natriumchlorid teinen angewendet werden, zur Anwendung gelangen, oder in sterilisiertem destilliertem Wasser gelöst und Nachstehend wird beispielsweise ein brauchbares Verdie Lösung dem Patienten injiziert. 35 fahren beschrieben.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand von Nach gründlichem Waschen von 30 g Diäthyl-

Beispielen näher erläutert. aminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose) mit destillier-

. -I₁ ^tem Wasser wird die DEAE-Cellulose in eine 4 · 40 cm

Beispiel 1 Kolonne eingefüllt und durch Durchleiten einer

10 Liter Speichel vom Menschen werden zentrifu- 40 Phosphorsäurepufferlösung von einem pH-Wert von

giert, worauf dessen pH-Wert auf 5,4 durch Zugabe 7,4 und schließlich einer 0,01molaren Phosphorsäure-

zu dessen oberen Schicht einer 5 n-HCl unter Rühren pufferlösung gepuffert.

und unter Kühlen auf 5,4 eingestellt wird. Anschließend 1 g des vorstehend beschriebenen gereinigten Glyko-

läßt man die Masse über Nacht in einem Eisschrank proteinpulvers wird in einer geringen Menge einer

stehen. Die sich ergebende Ausfällung wird durch 45 0,01molaren Phosphorsäurepufferlösung gelöst und

Zentrifugieren entfernt, und nach Einstellung des pH- in die Kolonne gegeben. Anschließend werden eine

Werts der Lösung auf 4,6 durch einen weiteren Zusatz 0,01molare Phosphorsäurepufferlösung und dann eine

von 5 n-HCl zu deren oberen Schicht wird die Lösung 0,05molare Phosphorsäurepufferlösung durch die Ko-

über Nacht in einem Eisschrank stehengelassen. Die lonne geleitet, und die nicht ausgetauschten oder

erhaltene Ausfällung wird entfernt, und die Lösung 5° eluierten, unwirksamen Substanzen werden entfernt,

wird auf einen pH-Wert von 7 durch Zusatz einer Wenn dann eine 0,05molare Phosphorsäurepuffer-

5 n-NaOH zu der oberen Schicht unter Rühren ein- lösung mit einem Zusatz von 0,5 Mol NaCl durch die

gestellt. Kolonne geführt wird, wird die wirksame Substanz

1 Liter einer 0,3molaren Lösung von ZnCl₂ wird eluiert. Diese eluierte Lösung wird getrennt mit einem

zu 10 Liter der vorstehenden Lösung unter Rühren 55 Fraktionssammler in 5-ml-Anteilen gesammelt, und

und Kühlen zugegeben, worauf die Lösung über Nacht die optische Absorption bei 280 ΐημ von diesen An-

in einem Eisschrank stehengelassen, wird Die sich er- teilen wird bestimmt. Wenn lediglich jene Anteile,

gebende Ausfällung wird durch Zentrifugieren abge- die eine Proteinanzeigespitze aufweisen, gesammelt

trennt. Die 4fache Menge einer 1- bis 3%igen Natrium- werden und dann unter verringertem Druck konzen-

citratlösung wird dieser Ausfällung zugegeben, und die 60 triert und dialysiert werden, worauf das Dialysat

Extraktion davon wird während 2 Stunden ausge- lyophil gemacht wird, wird ein in einer ersten Stufe

führt. gereinigtes Pulver des Glykoproteins erhalten.

Der flüssige Extrakt wird zentrifugiert, und dem Danach wird nach gründlichem Quellen von

Niederschlag wird eine weitere Zugabe einer 4fachen Sephadex G-75 (vernetztes Dextran) mit Wasser

Menge einer l%igen Natriumcitratlösung zugegeben, 65 dieses in eine 2,5 · 50-cm-Säule eingefüllt. Nachdem

worauf 1 Stunde lang extrahiert wird. Das Zentrifu- das Sephadex durch Durchleiten einer 0,05m-

gieren wird in ähnlicher Weise ausgeführt, um den NH₄HCO₃-Lösung durch die Säule vollständig ins

flüssigen Extrakt zu trennen, der, nachdem er mit dem Gleichgewicht gebracht wurde, wird eine Lösung, in

welcher 120 mg des nach dem vorstehend beschriebenen Ionenaustauschchromatographieverfahren gereinigtes Glykoproteinpulvers in einer geringen Menge einer 0,05m-NH₄HCO₃-Lösung gelöst sind, eingeführt und entwickelt und mit der gleichen NH₄HCO₃-Lösung eluiert.

Wenn man das Elut aus dem Molekularsieb in 3-ml-Portionen getrennt auffängt und die Anteile, die, welche bei 280 ηιμ ein charakteristisches Absorptionsmaximum zeigen, sammelt, so erhält man drei verschiedene Fraktionen, von denen die erste Fraktion die gewünschte Substanz enthält. Diese Fraktion wird dann unter verringertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei ein gereinigtes Pulver des Glykoproteins in der zweiten Stufe erhalten wird.

Danach wird für die Ausführung der dritten Stufe nach wiederholtem Waschen von etwa 400 g Stärke zunächst mit n-HCl und dann mit destilliertem Wasser die Stärke gründlich in 0,05m-Veronalpuffer bei einem pH-Wert von 8,6 gepuffert, worauf wiederholt gerührt und dekantiert wird, um sie in eine pastenförmige Masse überzuführen. Durch Eingießen der so erhaltenen pastenförmigen Masse in eine 1,5 · 7 ■ 40-cm-Zelle wird ein Stärkeblock bereitet.

100 mg des gereinigten Glykoproteinpulvers, das in der vorstehend beschriebenen zweiten Stufe erhalten wurde, werden in einer geringen Menge Veronalpuffer unter nachfolgendem Zusatz von Stärke gelöst, um eine pastenförmige Masse zu bilden. Diese pastenförmige Masse wird in die Mitte des Stärkeblockes eingebettet, und die Stärkeblockelektrophorese wird entweder nach der waagerechten oder aufrechten Methode ausgeführt, wobei elektrischer Strom unter Verwendung von Veronalpuffer als Elektrodenlösung durchgeleitet wird.

Nach Ausführung der Elektrophorese in einem Raum von niedriger Temperatur während 20 Stunden mit 2mA/cm² wird der Stärkeblock in Stücke von 0,5 cm Breite geschnitten, und jedes der schmalen Stärkestücke wird mit 10 ml Wasser extrahiert. Nach Entfernen der Stärke durch Filtration wird die Absorption bei 280 πιμ. der Filtrate gemessen. Jene Anteile, die die charakteristische Proteinspitze aufweisen, werden gesammelt.

Die aktive Substanz ist lediglich in dem flüssigen Extrakt enthalten, der aus dem Stärkeblock bei 5 bis 7 cm in der Plus-Richtung von Anfang her erhalten wurde. Wenn dieser Anteil daher unter verringertem Druck konzentriert und dialysiert wird und das Dialysat gefriergetrocknet wird, wird das gereinigte Pulver von Glykoprotein in der dritten Stufe erhalten.

Das gereinigte Produkt weist ein einziges Wanderbild oder eine einzige Lauffigur während der Elektrophorese mit Polyacrylamidgel als Träger auf, und somit ist ersichtlich, daß ein homogenes Glykoprotein erhalten wurde.

Die Ausbeute von 1 g des aus Speichel erhaltenen gereinigten Glykoproteins beträgt 50 mg (5 mg/Liter Speichel). Die Zunahme in der Antiaktivität gegenüber Magensäureabsonderung beträgt das lOfache.

Beispiel 2

ίο 50 Liter Speichel, aus welchem ein Rückstand durch Zentrifugieren entfernt worden war, werden auf 10 Liter unter verringertem Druck bei 30° C konzentriert. 10 Liter dieses konzentrierten Speichels werden dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei 15 g des aus dem Speichel erhaltenen gereinigten Glykoproteins erhalten werden.

Die Homogenisierungsweise wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, ausgeführt.

_ao B e i s ρ i e 1 3

Zu 100 Liter Speichel (oder 20 Liter eines konzentrierten Speichels) werden 200 Liter Aceton zugegeben (bei Verwendung des konzentrierten Speichels 40 Liter), und nach Stehen über Nacht werden die Ausfällungen durch Zentrifugieren abgetrennt.

200 g des so erhaltenen trocknen Pulvers werden mit 10 Liter Wasser (oder einer 0,9%igen NaCl-Lösung) während 3 Stunden extrahiert, wobei der pH-Wert bei etwa 8 gehalten wird.

Beispiel 4

Speicheldrüsen von Tieren (Parotis-, submaxillare und sublinguale Drüsen) werden nach Entfernen von deren Fett- und anderen Geweben gemahlen, worauf 1 Kilogramm der gemahlenen Drüsen mit einer 5fachen Menge Wasser (oder einer 0,9%igen NaCl-Lösung) während 3 Stunden extrahiert wird, wobei der pH-Wert in Nähe von etwa 8 mit einer NaOH-Lösung gehalten wird. Anschließend wird zur Gewinnung eines flüssigen Extraktes zentrifugiert.

Mit diesem flüssigen Extrakt werden die im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweisen ausgeführt.

Ähnliche Ergebnisse werden auch erhalten, wenn ein mit Aceton getrocknetes Pulver der Drüsen an Stelle der gemahlenen Drüsen verwendet wird.

Die Ausbeute und die Zunahme in der Aktivität des von den Drüsen erhaltenen gereinigten Glykoproteinpulvers nach fraktionierter Ausfällung sowie diejenige eines homogenisierten Glykoproteinpulvers, das durch Ausführung der zusätzlichen Dreistufenreinigungsarbeitsweise, wie im Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde, sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben.

Tabelle III
Ausbeute und Aktivität des neuartigen Glykoproteins, das aus Speicheldrüsen erhalten wurde

	Drüsen	gei Ausbeute*) (mg)	Neuartiges ( einigt Aktivität**) (μβ)	jlykoprotein horn Ausbeute*) (mg)	agenisiert Aktivität*) (μβ)*
Parotis		100		0,5	10
Submaxillar ....		700 1000		3,5 5,0	10 10
Sublingual		1000
1000 1000

*) Je Kilogramm Drüsen.

**) Je 200 g Körpergewicht von Ratten, minimal wirksame Dosis der Antisekretionsaktivität bei der Methode der Pylorus-Abbindung.

Claims

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Glykoproteins, das bei der Therapie der HyperPatentanspruch: azidität des Magensaftes und von Ulcuserkrankungen

wertvoll ist. Ferner bezweckt die Erfindung die

Verfahren zur Gewinnung eines Glykoproteins Schaffung eines neuen Glykoproteins, das in gereinigmit einer Hemmwirkung gegenüber Magensäure- 5 ter Form zur Verabreichung an den menschlichen absonderung und einer Antiaktivität gegenüber Körper geeignet ist und überdies eine ausgeprägte Ulcus-Bildung, dadurch gekennzeich- Magensäureabsonderungshemmung sowie eine Antin e t, daß man Speichel oder einen wäßrigen aktivität gegenüber Ulcus-Bildung aufweist. Ein wei-Extrakt von Speicheldrüsen zur Entfernung von terer Zweck der Erfindung ist die Schaffung eines unerwünschten Proteinen auf einen pH-Wert io technisch durchführbaren Verfahrens zur Isolierung von 5,4 bis 5,6 und einen pH-Wert von des vorstehend genannten Glykoproteins in gereinigter 4,0 bis 4,6 einstellt, nach Abtrennung der bei diesen Form aus Speichel und Speicheldrüsen. pH-Werten ausfallenden Proteine neutralisiert, Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Ge-

aus der neutralen Lösung das Glykoprotein mit winnung eines Glykoproteins mit einer Hemmwirkung einem in Wasser löslichen Zinksalz ausfällt, den 15 gegenüber Magensäureabsonderung und einer AntiNiederschlag mit der wäßrigen Lösung eines Zink- aktivität gegenüber Ulcus-Bildung geschaffen, das chelatbildner extrahiert, den Extrakt zur Ent- dadurch gekennzeichnet, ist daß man Speichel oder fernung des Zinkchelats dialysiert, die vom Zink- einen wäßrigen Extrakt von Speicheldrüsen zur Entchelat befreite Lösung entweder mit einem mit fernung von unerwünschten Proteinen auf einen pH-Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel bis 20 Wert von 5,4 bis 5,6 und einen pH-Wert von 4,0 bis zu einer Konzentration von 30 Volumprozent ver- 4,6 einstellt, nach Abtrennung der bei diesen pH-setzt, in der vom Niederschlag befreiten Lösung Werten ausfallenden Proteine neutralisiert, aus der die Konzentration des organischen Lösungsmittels neutralen Lösung das Glykoprotein mit einem in auf 60 Volumprozent erhöht, den Niederschlag ab- Wasser löslichen Zinksalz ausfällt, den Niederschlag trennt und sammelt oder die Lösung mit einem 25 mit der wäßrigen Lösung eines Zinkchelatbildners Alkalisulfat oder Ammoniumsulfat bis zu einer extrahiert, den Extrakt zur Entfernung des Zink-Sättigung von 0,5 versetzt den Niederschlag ab- chelats dialysiert, die vom Zinkchelat befreite Lösung trennt und sammelt oder die Fraktionierung mit entweder mit einem mit Wasser mischbaren orgaeinem organischen Lösungsmittel und die Aus- nischen Lösungsmittel bis zu einer Konzentration von fällung mit einem Sulfat in beliebiger Reihenfolge 30 30 Volumprozent versetzt, in der vom Niederschlag nacheinander durchführt. befreiten Lösung die Konzentration des organischen

Lösungsmittels auf 60 Volumprozent erhöht, den

Niederschlag abtrennt und sammelt oder die Lösung

mit einem Alkalisulfat oder Ammoniumsulfat bis zu 35 einer Sättigung von 0,5 versetzt den Niederschlag

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur abtrennt und sammelt oder die Fraktionierung mit Gewinnung eines Glykoproteins mit einer Hemmwir- einem organischen Lösungsmittel und die Ausfällung kung gegenüber Magensäureabsonderung sowie mit mit einem Sulfat in beliebiger Reihenfolge nacheiner Antiaktivität gegenüber Ulcus-Bildung aus einander durchführt.

Speichel oder Speicheldrüsen. 40 Als Speichel sind außerdem Speichel, wie er von

Es ist allgemein bekannt, daß der Magensaft von Menschen und Säugetieren erhalten wird, Speichel-Tieren Gastron enthält, eine Substanz, die eine Hemm- produkte, die auf einen Bereich von der Hälfte bis aktivität gegenüber einer Magensäureabsonderung einem Fünftel des ursprünglichen Volumens konzenaufweist. Es wird auch darauf hingewiesen, daß eine triert wurden, pulverisierter Speichel, der durch Zuähnliche Aktivität auch im Speichel, der äußeren 45 gäbe von z. B. Aceton oder Alkohol zu Speichel oder Sekretion des gleichen Verdauungskanals, vorhanden konzentriertem Speichel und anschließender Bildung ist. So ist in Fed. proc, 8, 26, 1949, von C ο d e et al. von Ausfällungen daraus und durch Trocknen der darauf hingewiesen worden, daß im Speichel von Ausfällungen erhalten wurde, oder pulverförmiger Mensch und Hund eine Antiaktivität gegenüber Speichel, der durch Trocknen des Speichels, wie er Magensäureabsonderung vorhanden ist. 50 erhalten wird, oder des konzentrierten Speichels nach

Obgleich es bisher bekannt war, daß der Speichel einer Trocknungsarbeitsweise, bei welcher die Aktivität eine die Magensäureabsonderung hemmende Substanz des Speichels nicht beeinträchtigt wird, beispielsweise enthielt, war jedoch das Wesen der wirksamen Sub- durch direktes Sprühtrocknen oder durch Gefrieren stanz sowie deren Isolierung bisher nicht bekannt, und Trocknen (Gefriertrocknung) erhalten wurde, und überdies war es bisher unbekannt, daß diese 55 brauchbar. Der hier verwendete Ausdruck »Speichel« Substanz eine Antiaktivität gegenüber Ulcus-Bildung umfaßt den vorstehend beschriebenen konzentrierten besitzt. Speichel als auch die wäßrige Lösung der vorstehend

Gemäß der Erfindung wurde erfolgreich ein neues angegebenen pulverförmigen Speichel. Glykoprotein aus dem Speichel von Mensch und Säuge- Obgleich als Speicheldrüsen sowohl die sublin-

tieren isoliert und festgestellt, daß dieses neue Glyko- 60 gualen, submaxillaren als auch die Ohrspeicheldrüsen protein nicht nur eine ausgeprägte Hemmwirkung (Parotiddrüse) von Säugetieren zur Anwendung gegegenüber einer Magensäureabsonderung, sondern langen können, werden solche, die Überfluß an auch eine therapeutische Aktivität auf Magenge- Schleim haben, beispielsweise die sublingualen und schwüre sowie eine Hemmaktivität gegenüber deren submaxillaren Drüsen, bevorzugt, während die Ohren-Bildung besitzt. Ferner wurde festgestellt, daß dieses 65 Speicheldrüse mit Bezug auf die Ausbeute an Glykoneue Glykoprotein mühelos aus den Speicheldrüsen protein etwas unterlegen ist. Diese Drüsen werden von Säugetieren isoliert werden kann. vermählen oder als getrocknetes Pulver verwendet.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines neuen Gemäß der Erfindung können auch Gemische von