DE60122899T2

DE60122899T2 - Verfahren zur detektion von haplotypen mittels massenspektrometrie

Info

Publication number: DE60122899T2
Application number: DE60122899T
Authority: DE
Inventors: Glynne Ivo GUT; Doris Lechner
Original assignee: Consortum National De Recherche En Genomique (CNRG)
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-07-24
Filing date: 2001-07-23
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2021-07-24
Also published as: EP1303638B1; EP1176212A1; ES2271066T3; EP1303638A1; ATE338829T1; AU2001284351A1; WO2002008462A1; CA2417201A1; US20040053260A1; DE60122899D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ausführung einer Haplotypisierung einer Mehrzahl von Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), welches allelspezifische PCR und eine Massenspektrometrie-Analyse einsetzt.
Die vollständige Sequenz des menschlichen Genoms wird in den nächsten Monaten erhalten und vollständig veröffentlicht werden. Dieses Projekt wird die vollständige Sequenz der 3 Milliarden Basen und die relativen Positionen von allen geschätzten (von 30.000 bis über 100.000) Genen in diesem Genom enthüllen. Das Verfügen über diese Sequenz eröffnet zahlreiche Möglichkeiten für die Ermittlung von Genfunktionen und Wechselwirkungen von verschiedenen Genen.
Sie ermöglicht auch die Implementierung von Pharmakogenetik und Pharmakogenomik. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik zielen auf eine zielgerichtete Verwendung einer Medikation abhängig von dem Genotyp eines Individuums und so auf die dramatische Verbesserung der Wirksamkeit von Arzneimitteln ab. Ein notwendiger Zwischenschritt dazu besteht in der Bestimmung der Variabilität von verschiedenen Individuen auf einer Genom-Basis. Dies wird bewerkstelligt, indem verschiedene Marker bestimmt und diese dann für eine Genotypisierung (Charakterisierung des Vorhandenseins eines Markers in einem Individuum) und eine Haplotypisierung (Verknüpfung zwischen verschiedenen Markern, die sich in großer Nähe zueinander befinden) verwendet werden.
Gegenwärtig werden zwei Arten von Markern für die Genotypisierung verwendet: Mikrosatelliten und Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs).
Mikrosatelliten sind hochgradig polymorphe Marker, wobei unterschiedliche Allele aus unterschiedlichen Anzahlen von repetitiven oder wiederholten Sequenzelementen zwischen konservierten flankierenden Regionen gebildet werden. Ein Mikrosatellit wird im Durchschnitt alle 100.000 Basen gefunden. Eine vollständige Karte von Mikrosatelliten-Markern, welche das menschliche Genom überspannen, wurde von der CEPH (Dib et al., Nature 1996, 14. März; 380 (6570): 152–4) präsentiert. Mikrosatelliten werden üblicherweise genotypisiert, indem die Größe von PCR-Produkten, die im Bereich der repetitiven Region erzeugt worden sind, auf Gelen bestimmt wird. Die am weitesten verbreitet verwendeten Systeme basieren auf der Verwendung von fluoreszierend markierter DNA und deren Detektion in Fluoreszenz-Sequenziergeräten.
Im patentfreien Bereich gibt es gegenwärtig weniger SNPs. Eine SNP-Karte mit 300000 SNPs wird gegenwärtig durch das SNP-Konsortium erstellt (Science, 1999, 284, 406–407).
Für die Genotypisierung von SNPs gibt es ein paar Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet zur Verfügung stehen, alle von diesen mit Vorteilen und Nachteilen.
Einige von diesen Verfahren beruhen auf einer auf Gelen basierenden Detektion, wie der Oligonukleotid-Ligase-Assay (OLA), und ermöglichen aus diesem Grund nur Anwendungen mit mittlerem Durchsatz.
Andere beruhen auf einer reinen Hybridisierung, die nicht so unterscheidungskräftig ist und schwierig abzustimmen ist, um die erforderliche hohe Stringenz zu erhalten (Oligonukleotid-Anordnungen (Arrays), DNA-Chips). Obwohl DNA-Chips für eine gleichzeitige Genotypisierung einer großen Anzahl von Genotypen in einer sehr stark begrenzten Region des Genoms und bei einer übersehbaren Anzahl von Individuen gut geeignet sind, ist das Hauptproblem, das bei der Verwendung dieser Gegenstände festgestellt wird, die Schwierigkeit, die Hybridisierungsbedingungen (insbesondere hinsichtlich der Stringenz) zu optimieren.
Es sind Ansätze unter Verwendung von Primer-Extension (Primer-Verlängerung) und Detektion durch Fluoreszenz gezeigt worden. Ihr Vorteil ist eine leichte Emissionsdetektion in einem Lesegerät vom ELISA-Typ. Die Einschränkung dieser Verfahren ist die zur Verfügung stehende begrenzte Anzahl von fluoreszierenden Farbstoffen, welche wiederum die Anzahl von Proben, die gleichzeitig analysiert werden können, begrenzt.
Mehrere Verfahren einer SNP-Genotypisierung verwenden Massenspektrometrie-Detektion, da eine Massenspektrometrie einen sehr hohen Durchsatz ermöglicht und zugleich zusätzliche Informationen über die Base, die vorhanden ist, durch die Masse des erhaltenen Produkts liefert. Bei Anwendungen, wo ein allelspezifisches Produkt gemessen wird, stellt dies eine direkte Information dar und ist dementsprechend sehr überzeugend.
Für die SNP-Genotypisierung sind mehrere Verfahren unter Verwendung von Massenspektrometrie vorgeschlagen worden (WO 98/23774, US 5,843,669 ).
Matrixgestützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie („Matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry", MALDI) ermöglicht die massenspektrometrische Analyse von Biomolekülen (Karas und Hillenkamp, Anal. Chem. 60, 2299–3301 (1988)). Tatsächlich ist MALDI auf die Analyse von DNA in Variationen, die von der Analyse von PCR-Produkten bis zu Ansätzen unter Verwendung einer allelspezifischen Termination bis zu Einzelnukleotid-Primer-Extension-Reaktionen, Sequenzierung und Hybridisierung angewendet worden ( US 5,885,775 , WO 96/29431, US 5,691,141 , WO 97/37041, WO 94/16101, WO 96/27681, GB 2339279 .
Hauptnachteile dieser Ansätze liegen darin, dass sie stark auf stringenten Reinigungsprozeduren vor der MALDI-Analyse beruhen, die sich ihrerseits nicht für eine leichte Automatisierung anbieten und einen Hauptteil der Kosten ausmachen. Es werden häufig Spin-Säulen-Reinigung und/oder magnetische Kügelchen-Technologie und Umkehrphase-Reinigung angewendet.
Tatsächlich ist die Analyse von Nukleinsäuren durch MALDI stark von dem Ladungszustand abhängig und es kann eine 100-fache Erhöhung der Analysenempfindlichkeit erzielt wer den, wenn die DNA so konditioniert wird, dass sie eine positive Ladung trägt. Solche modifizierten DNA-Produkte neigen auch signifikant weniger zu einer Addukt-Bildung und erfordern so keine Reinigungsprozeduren (WO 96/27681, GB 2339279 , Gut und Beck (1995) Nucleic Acids Research, 23, 1367–1373, Gut et al. (1997) Rapid Commun. Mass Spectrom., 11, 43–50.
Ein ausgehend davon entwickelter Assay für die Erzeugung von allelspezifischen Produkten für SNPs ist als der „GOOD-Assay" für die SNP-Analyse bezeichnet worden (Sauer et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28, E13).
Nichtsdestotrotz ermöglicht die Genotypisierungsinformation allein keine vollständige Beurteilung der Translation einer DNA-Sequenz in ein Protein oder der Regulation der Transkription. Insbesondere wenn die zwei Allele eines gegebenen Gens unterschiedliche SNPs tragen, ist es sehr wichtig, über Informationen über die Kombination von verschiedenen SNPs in Bezug zu einander (Haplotypisierung) und darüber, welche der Allele sich auf dem gleichen DNA-Strang befinden, zu verfügen.
Es gibt einige wenige Verfahren zur Haplotypisierung. Sie beruhen auf der Erzeugung von allelspezifischen Produkten durch allelspezifische PCR unter Verwendung eines Primers, dessen Base am 3'-Ende spezifisch zu einem Allel, das amplifiziert werden soll, passt. Dennoch sind sie in ihrem Leistungsvermögen, eine Mehrzahl von Positionen gleichzeitig abzuklären, beschränkt. Das Vorhandensein oder das Fehlen eines PCR-Produkts wird für die Identifizierung eines Haplotyps verwendet.
Ruano et al. (1989), Nucleic Acids Research, 20, 8392, offenbaren die Haplotypisierung von Chromosomensegmenten aus einer Mehrzahl von Heterozygoten über allelspezifische PCR-Amplifizierung und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Detektion. Sauer et al. (2000), Nucleic Acids Research, 28, 2000, und WO 97 47766 beschreiben die Verwendung von Massenspektrometrie für die Genotypisierung.
Um die Spezifität einer allelspezifischen PCR zu erhöhen, werden zwei hauptsächliche Strategien verfolgt. Eine ist die Hinzufügung von GC-reichen Schwänzen an das 5'-Ende der Primer für die PCR und das Ausführen der PCR mit einer hohen Hybridisierungs- (Annealing-)-Temperatur (Liu et al. (1997), Genome Res 7(4): 389–98). Für anfängliche Zyklen der PCR wird so hohe Stringenz erhalten. In späteren Zyklen gewährleistet der GC-Schwanz eine Präferenz für die Amplifizierungsmatrizen. Dies ergibt jedoch nicht in allen Fällen ausreichende Stringenz.
Ein anderer Weg, um die Stringenz der allelspezifischen PCR zu erhöhen, ist die Einführung von weiteren Fehlpaarungen (Newton et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17(7): 2503–16). Dieses Verfahren allein kann ebenfalls begrenzte Stringenz ergeben.
Es könnte sich daher als interessant erweisen, diese beiden Verfahren zur Erhöhung der Spezifität und Stringenz bei der allelspezifischen PCR-Reaktion zu kombinieren.
Nichtsdestotrotz hat die allelspezifische PCR (mit oder ohne Verbesserungen) den Nachteil, dass sie nur zwei Polymorphismen in Bezug zu einander abklären kann.
Clark et al. (1998, Am. J. Hum. Genet., 69, 595–612) beschreiben ein Verfahren für die Analyse von Nukleotid-Sequenzvariationen in der humanen Lipoprotein-Lipase, das eine Sequenzierung der Gene und der allelspezifischen PCR-Produkte als das Analysenverfahren für die Genotypisierung verwendet. Die Autoren legen die Schwächen dieses Haplotypisierungsverfahrens dar, insbesondere da eine Menge Aufwand erforderlich ist.
Es ist das Ziel der Erfindung, ein einfaches und Hochdurchsatz-Verfahren zur Haplotypisierung bereitzustellen, das eine Bestimmung der Verknüpfung einer Mehrzahl von SNPs in einer schnellen, kosteneffizienten und verlässlichen Weise ermöglicht. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die gleichzeitige Analyse einer Mehrzahl von polymorphen Stellen, nachdem nur eine allelspezifische PCR-Reaktion ausgeführt wurde.
Tatsächlich ist es oftmals erforderlich, die Allele von mehr als zwei Einzelnukleotidpolymorphismen durch Genotypisierung zu bestimmen. Wenn es sich herausstellt, dass der individuelle Genotyp hinsichtlich mehr als eines der SNPs heterozygot ist, ist es interessant, zu bestimmen, welche der Allele sich auf demselben DNA-Strang befinden.
Die Erfindung verwendet allelspezifische PCR für die Amplifizierung von nur einem Allel aus der genomischen DNA. Der allelspezifische Primer ist so gestaltet, dass er zu einem Allel eines heterozygoten SNPs passt. Das Amplifizierungsprodukt wird dann genotypisiert, was offenbart erlaubt, abzuleiten, welches die anderen Allele auf diesem Produkt sind, und die Bestimmung des Haplotyps erlaubt, da die zuvor heterozygoten SNPs nun homozygot erscheinen.
Die Assoziation des der allelspezifischen PCR zugrunde liegenden Polymorphismus mit den bestimmten Allelen der Allele der anderen Polymorphismen ergibt den Haplotyp.
Die Erfindung ist dementsprechend auf ein Verfahren zur Bestimmung des Haplotyps eines Individuums gerichtet, welches die Schritte umfasst:

a) Genotypisieren von mehr als zwei Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs; „single nucleotide polymorphisms") durch Massenspektrometrie;
b) allelspezifische PCR, wobei ein Primer für ein Allel eines heterozygoten Polymorphismus spezifisch ist, wenn mehr als ein Polymorphismus heterozygot ist;
c) Genotypisieren an dem allelspezifischen PCR-Produkt durch Massenspektrometrie;
d) Assoziierung des der allelspezifischen PCR zugrunde liegenden Polymorphismus mit den bestimmten Allelen der anderen getesteten Polymorphismen.

Das Verfahren der Erfindung könnte auch verwendet werden, um nahezu identische Sequenzen zu identifizieren, um herauszufinden, ob eine Sequenz verdoppelt oder heterozygot ist. Die Variationen können verwendet werden, um „allelspezifische" Produkte zu erzeugen; wenn andere Polymorphismen, die bei der anfänglichen Genotypisierung heterozygot waren, heterozygot bleiben, ist es klar, dass eine Sequenz verdoppelt ist. Wenn die zweite Genotypisierungsrunde dieses Systems zu allesamt homozygoten SNPs führt, ist es wahrscheinlich, dass die Sequenz, die untersucht wird, nicht verdoppelt ist.
Die Verwendung von Massenspektrometrie erlaubt, die Analyse einer großen Anzahl von Proben auszuführen und die entsprechenden Daten in einer Multiplex-Reaktion zu erhalten. Dementsprechend kann das Verfahren der Erfindung, das durch eine Kombination zwischen allelspezifischer PCR und der Verwendung von Massenspektrometrie für die Genotypisierung und Datenanalyse gekennzeichnet ist, bei hohem Durchsatz verwendet werden. Es kann auch automatisiert werden und wird eine leichte und schnelle Bestimmung des SNP-Profils der Patienten ermöglichen. Es wird dementsprechend die vollständige Implementierung von Pharmakogenetik und Pharmakogenomik und eine verbesserte Nutzung der Daten, die aus dem Genomsequenzierungsprojekt erhalten werden, ermöglichen.
Die Genotypisierung der SNPs in den Schritten a) und c) wird durch Massenspektrometrie nach Erzeugung von allelspezifischen Produkten, die herkömmlicherweise durch Primer-Extension, Oligonukleotidligation, Spaltungsreaktionen erhalten werden können, ausgeführt.
Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Möglichkeit, die Analyse einer Mehrzahl von SNPs in einer DNA-Probe zu gleicher Zeit in einer Multiplex-Reaktion, wie sie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, auszuführen, indem die geeigneten Bedingungen gewählt werden.
Um die allelspezifische PCR-Reaktion von Schritt b) auszuführen, würde man einen Primer verwenden, der zu einem Allel eines heterozygoten SNPs passt, und vorzugsweise einen Primer, der spezifisch mit dem heterozygoten SNP, der sich an der am weitesten 5' oder am weitesten 3' gelegenen Stelle von allen getesteten SNPs befindet, hybridisiert. Der andere Primer würde mit beiden Allelen hybridisieren und so gelegen sein, dass die Amplifizierung der Region, die alle heterozygoten SNPs enthält, erhalten wird.
Bei einer bevorzugten Implementierung der Erfindung wird eine Allelspezifität für die PCR-Amplifizierung durch die Base am 3'-Ende des Primers erzielt. Diese Base wird so gewählt, dass sie zu einem Allel und nicht zu dem anderen passt. Weitere Spezifität kann erzielt werden, indem ein Primer verwendet wird, bei dem zwischen 10 und 25 Basen komplementär zu der Sequenz der genomischen DNA sind, am meisten bevorzugt zwischen 15 und 20 oder 22, wobei die Spezifität, wie beschrieben, durch die Base am 3'-Ende erhalten wird.
Man könnte auch einen unspezifischen CG-reichen Schwanz an dem 5'-Ende des Primers und/oder weitere Fehlpaarungen vor der allelspezifischen Base am 3'-Ende, wie beschrieben, vorsehen. Mehr bevorzugt weist der Primer eine Fehlpaarung mehr als 3 Basen entfernt von dem 3'-Ende auf.
Die Hybridisierungs-(Annealing-)-Temperatur wird als kritisch (höher als die berechnete Schmelztemperatur) gewählt. In den ersten Runden der PCR kann nur die vollständig komplementäre Sequenz anhybridisieren. Sind einmal einige PCR-Runden erhalten worden, stellt die höhere Hybridisierungstemperatur aufgrund des GC-reichen Schwanzes eine hauptsächliche Amplifizierung eines einzelnen Allels sicher.
Für diese Prozedur wird Massenspektrometrie verwendet, da sie für die Analyse von bis zu mehreren zehn Polymorphismen gut geeignet ist und im Betrieb sehr leicht ist. Daher ist eine vollständige Automatisierung der Probenvorbereitung durch dieses Verfahren möglich. Abhängig von der Probenvorbereitungsprozedur, die für die massenspektrometrische Genotypisierung verwendet wird, ist diese Technologie sehr effektiv.
Bei einer bevorzugten Implementierung dieser Erfindung verwendet das für einen oder beide der Genotypisierungsschritte (a) und (c) ausgeführte Verfahren Primer, die von chimärer Natur sind, und die verfolgte Vorgehensweise ist ein für MALDI entwickelter Assay, der als der GOOD-Assay, beschrieben von Sauer et al., bezeichnet wird.
Bei einer bevorzugten Implementierung der Erfindung, in welcher matrixgestützte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI) für die Analyse der Genotypen verwendet wird. In einer anderen Ausführungsform wird für die Detektion Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie verwendet.
Bei einer bevorzugten Implementierung der Erfindung sind die Reagenzien für die anfängliche Genotypisierung die gleichen wie diejenigen, die für die Genotypisierung nach der allelspezifischen PCR verwendet werden.
Diese Erfindung stellt ein leichtes Verfahren zur Bestimmung von Haplotypen bereit, welches kosteneffizient ist, hochgradig verlässlich ist und leicht automatisiert werden kann und sich so für einen hohen Durchsatz anbietet.
Dieses verbesserte Verfahren nutzt das Potential einer hochgradig parallel verlaufenden Vorbereitung von Produkten für die Genotypisierung, deren Konditionierung, so dass sie keine Reinigung erfordern, und das Potential von Massenspektrometern, große Anzahlen von Produkten gleichzeitig in einem Spektrum unterscheiden zu können, und welche in der Lage sind, ein einzelnes Spektrum in wenigen Sekunden aufzuzeichnen, aus. Diese Erfindung umreißt Möglichkeiten, um die Probleme beim Haplotypisieren einer großen Anzahl von SNPs, auf welche man gegenwärtig in diesem Fachgebiet trifft, in dramatischer Weise zu lösen, und macht eine verbesserte und effiziente SNP-Genotypisierung möglich.
Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung von Primern für eine PCR, die allelspezifische Produkte erzeugen, für die Implementierung einer Haplotypisierung durch das Verfahren der Erfindung. Die oben erwähnte Verwendung in einem Kit kann auch die Reagenzien, um die Schritte a) und c) des Verfahrens (Erzeugung von Proben, die durch Massenspektrometrie für eine Genotypisierung analysiert werden sollen) und die Instruktionen, wie das Verfahren der Erfindung auszuführen ist, umfassen.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 beschreibt das Prinzip des Verfahrens der Erfindung, angewendet auf 4 SNPs, von denen zwei heterozygot sind. Der erste Genotypisierungsschritt (1.A) führt zu der Erzeugung von 6 Produkten, wie durch Massenspektrometrie bestimmt. Eine allelspezifische PCR (1.B) führt zu der Amplifizierung des väterlichen Strangs. Eine Genotypisierung dieses Produkts (1.C) ermöglicht die Identifizierung der SNPs, die auf diesem Allel vorhanden sind.
2 zeigt typische Massenspektrometerdaten, die nach einer Genotypisierung und Haplotypisierung für die SNPs 298 und 390 (2.A) und 325 und 423 (2.B) des Gens des β2-adrenergen Rezeptors erhalten worden sind. Die oberen Spektren zeigen das Genotypisierungsergebnis, während die mittleren und unteren Spektren die Ergebnisse, die jeweils für Haplotyp 1 bzw. 2 nach allelspezifischer PCR erhalten worden sind, zeigen.
BEISPIEL
Das Beispiel veranschaulicht das Verfahren der Erfindung und kann leicht durch den Fachmann auf diesem Gebiet für andere Gene verallgemeinert werden.
Das hier gezeigte Beispiel ist die Haplotypisierung von 4 veröffentlichten SNPs in dem Gen des β2-adrenergen Rezeptors. Die SNPs sind T/C bei 298, C/T bei 325, G/A bei 390 und G/C bei 423. Für jeden SNP wurde die Genotypisierung durch den GOOD-Assay an einem (mittels der Primer SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2) amplifizierten Fragment der genomischen DNA erstellt. Die Genotypisierung wurde ausgeführt, indem dem Verfahren von Sauer et al. (Nucleic Acids Research, 2000, 28, E13) gefolgt wurde, mit den Primern SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8 für die Primer-Extension. Die Analyse erfolgt im positiven Ionen-Modus an einem MALDI-Massenspektrometer.
In einem ersten Experiment wird der Genotyp für alle vier SNPs bestimmt. Der Genotyp für SNP 298 und SNP 390 ist auf dem Bild von 2.A gezeigt, während der Genotyp für SNP 325 und SNP 423 auf dem Bild von 2.B gezeigt ist. Das m/z, das für die Produkte beobachtet wird, liegt im Bereich von 1400 bis 1500 Da (2, obere Spektren).
Die Daten zeigen, dass das Individuum, dessen DNA getestet wird, hinsichtlich der vier SNPs heterozygot ist.
Um den Haplotyp zu bestimmen, werden allelspezifische PCR-Reaktionen ausgeführt unter Verwendung der allelspezifischen Primer SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 in Kombination mit dem Primer SEQ ID Nr. 2.
Die Primer SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 4 sind für ein Allel von SNP 298 (welcher der am weitesten 5' gelegene der heterozygoten SNPs ist) spezifisch und tragen des Weiteren einen GC-reichen Schwanz und eine Fehlpaarung, die 5 Basen von dem 3'-Ende des Primers entfernt gelegen ist.
Die allelspezifische PCR hätte auch mit dem Primer SEQ ID Nr. 1 und Primern, die für SNP 423 (den am weitesten 3' gelegenen der heterozygoten SNPs) allelspezifisch sind, ausgeführt werden können.
Die Genotypisierung wird an den allelspezifischen Produkten (2, mittlere Spektren für Haplotyp 1, untere Spektren für Haplotyp 2) durch Verwendung des gleichen Verfahrens wie zuvor ausgeführt.
Es ist klar, dass die zwei erhaltenen Haplotypen sich zu dem Genotyp des Individuums aufsummieren und die Daten ermöglichen die Bestimmung des vollständigen Haplotyps des getesteten Individuums.
Die PCR-Reaktion wird mittels klassischer Bedingungen ausgeführt mit 0,5 μl genomischer DNA (50 ng/μl), 0,5 μl von jedem der Primer SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 (7,5 pmol/μl) und den Zyklus-Bedingungen:

1. 95°C 2 min
2. 95°C 20 s
3. 68°C 30 s
4. 72°C 30 s,

Primer-Extension-Reaktionen werden klassischerweise ausgeführt unter Verwendung von 1 μl des Kopier-Primers („copy primer") (SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 8) (25 pmol/μl) mit den Zyklus-Bedingungen:

1. 95°C 3 min
2. 95°C 10 s
3. 58°C 30 s
4. 72°C 15 s,

Ein Phosphodiesterase-Verdau wird ausgeführt, indem 1 μl Essigsäure (0,5 M) und 3 μl PDE zugegeben werden, und durch Inkubation bei 37°C für 80 min.
Eine Alkylierung wird ausgeführt durch Zugabe von 45 μl Acetonitril, 15 μl Triethylamin/CO2-Puffer (2 M, pH 8,0) und 14 μl Mel und Inkubation bei 40°C für 25 min. Eine 20 μl-Probe wird entnommen und mit 45 μl 40% Acetonitril gemischt.
Die MALDI-Analyse wird ausgeführt mit α-Cyanozimtsäuremethylester in Aceton, aufgetüpfelt auf das Ziel, und 0,5 μl der Probe, die auf die Matrix aufgetüpfelt wird.
Eine Analyse erfolgt im positiven Ionen-Modus an einem MALDI-Massenspektrometer.
Eine allelspezifische PCR wird unter Verwendung entweder des Primers SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 2 ausgeführt, indem den gleichen klassischen Bedingungen, wie zuvor beschrieben, gefolgt wurde.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Bestimmung des Haplotyps eines Individuums, welches die Schritte umfasst: a) Genotypisieren von mehr als zwei Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs; „single nucleotide polymorphism") durch Massenspektrometrie; b) allelspezifische PCR, wobei ein Primer für ein Allel eines heterozygoten Polymorphismus spezifisch ist, wenn mehr als ein Polymorphismus heterozygot ist; c) Genotypisieren an dem allelspezifischen PCR-Produkt durch Massenspektrometrie; d) Assoziierung des der allelspezifischen PCR zugrunde liegenden Polymorphismus mit den bestimmten Allelen der Allele der anderen getesteten Polymorphismen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Genotypisieren der SNPs in Schritt a), Schritt c) oder beiden Schritten ausgeführt wird nach Erzeugung von allelspezifischen Produkten, wobei die Erzeugung von allelspezifischen Produkten durch Primerverlängerung („primer extension"), Oligonukleotidligation, eine Spaltungsreaktion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Genotypisieren für eine Mehrzahl von SNPs in Schritt a), Schritt c) oder beiden Schritten in einer Reaktion im Rahmen einer Multiplex-Prozedur ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die allelspezifische PCR-Reaktion in Schritt b) erzielt wird, indem ein Primer gewählt wird, der zu einem Allel eines heterozygoten SNPs komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Primer so gewählt wird, dass er spezifisch mit dem heterozygoten SNP, der sich bei der am weitesten 5' oder der am weitesten 3' gelegenen Position aller getesteten SNPs befindet, hybridisiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei wenigstens ein Primer, der für die allelspezifische PCR verwendet wird, zu der Sequenz eines Allels vollständig komplementär ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die am 3'-Ende gelegene Base des allelspezifischen Primers spezifisch zu einem Allel des heterozygoten SNPs komplementär ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 7, wobei der allelspezifische Primer 10 bis 25 Basen aufweist, die zu der Sequenz des genannten einen Allels der genomischen DNA komplementär sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5, 7 und 8, wobei der allelspezifische Primer einen 5'-Schwanz, der reich an G und C ist, aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5, 7 bis 9, wobei der allelspezifische Primer eine Fehlpaarung in der komplementären Sequenz mehr als 3 Basen entfernt von dem 3'-Ende aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei matrixgestützte Laser-Desorption/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie für entweder einen der oder beide Schritte a) und c), wie in Anspruch 1 definiert, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Primer, die für die Erzeugung der in der Genotypisierung in den Schritten a) und/oder c) detektierten Produkte verwendet werden, chimärer Natur sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei ein Assay mit MALDI-Massenspektrometrie-Detektion für entweder einen oder beide der Genotypisierungsschritte angewendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei für entweder einen der oder beide Schritte a) und c) von Anspruch 1 Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie verwendet wird.
Verwendung von Primern für eine PCR, welche allelspezifische Produkte für die Ausführung einer Haplotypisierung durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 erzeugen.