DE69230873T2

DE69230873T2 - Selektive Restriktionsfragmentenamplifikation: generelles Verfahren für DNS-Fingerprinting

Info

Publication number: DE69230873T2
Application number: DE69230873T
Authority: DE
Inventors: Pieter Vos; Marc Zabeau
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 1991-09-24
Filing date: 1992-09-24
Publication date: 2000-11-09
Anticipated expiration: 2012-09-25
Also published as: FI941360A; DK0534858T3; FI941360A0; HU223760B1; FI115402B; DE69230873D1; DK0534858T4; DE69233719T2; EP0534858B2; CA2119557C; DK0969102T3; ES2147550T5; JPH06510668A; ATE382094T1; AU672760B2; ES2147550T3; ES2299229T3; IL103267A; EP0969102A2; NO318016B1

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft Anwendungen von DNA-Fingerprinting und die Verwendung von DNA-Markern in einer Anzahl unterschiedlicher Gebiete, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Pflanzen- und Tierzüchtung, Sorten- oder Cultivaridentifizierung, diagnostische Medizin, Diagnose von Krankheiten bei Tieren und Pflanzen, Identifizierung von genetisch vererbten Krankheiten bei Menschen, Familienverwandtschaftsanalyse, forensische Analyse und mikrobielle Typisierung.
Spezieller betrifft diese Erfindung Verfahren zum DNA- Fingerprinting und zum Nachweisen von spezifischen DNA-Markern in Genomen, die von Mikroorganismen bis zu höheren Pflanzen, Tieren und Menschen reichen. Die Erfindung betrifft auch synthetische DNA- Moleküle und darauf basierende Produkte, die in den Verfahren der Erfindung in den unterschiedlichen Anwendungsgebieten verwendet werden.

2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG

2. 1. DNA-Fingerprinting

DNA-Fingerprinting oder DNA-Typisierung ("DNA-typing") wie auch andere Verfahren zur Genotypisierung, zum Profiling und zur DNA- Identifizierungsanalyse beziehen sich auf die Charakterisierung entweder von Ähnlichkeiten oder von einem oder mehreren Unterscheidungsmerkmalen in der genetischen Ausstattung oder im Genom eines Individuums, einer Sorte oder Rasse oder einer Spezies. Es ist die allgemeine Regel, daß je enger die genetische Verwandtschaft ist, desto größer die Identität oder passender die Ähnlichkeit von Genomen ist, und folglich werden Unterscheidungsmerkmale in dem Genom seltener sein. Diese ähnlichen Merkmale oder Unterscheidungsmerkmale können durch Analysieren der DNA eines Organismus enthüllt werden, nachdem die DNA mittels einer Restriktionsendonuklease gespalten worden ist. Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die kurze Nukleotidsequenzen, üblicherweise von 4 bis 8 Basen Länge, erkennen und die zwei DNA-Stränge spalten, wodurch DNA-Fragmente von diskreter Länge erzeugt werden. Aufgrund ihres hohen Ausmaßes an Sequenzspezi fität werden Restriktionsendonukleasen DNA-Moleküle auf sehr spezifische Weise spalten. Das Ergebnis ist, daß ein reproduzierbarer Satz von DNA-Fragmenten erzeugt wird. DNA-Fragmente können entsprechend ihrer Länge auf porösen Matrices oder Gelen aufgetrennt werden, wodurch typische Bandenmuster erhalten werden, die einen DNA- Fingerprint der genetischen Ausstattung eines Organismus bilden.

2. 2. DNA-Polymorphismen

Wenn die Fingerprints von sehr eng verwandten Spezies, Sorten oder Rassen verglichen werden, können die DNA-Fingerprints identisch oder sehr ähnlich sein. Wenn Unterschiede innerhalb ansonsten identischer DNA-Fingerprints beobachtet werden, bezeichnet man solche Unterschiede als DNA-Polymorphismen: diese sind neue DNA-Fragmente, die in einem Fingerprint auftreten. Man sagt, die DNA sei an jener Position polymorph, und das neue DNA-Fragment kann als ein DNA- Marker verwendet werden. DNA-Polymorphismen, die in DNA- Fingerprints, die durch Restriktionsenzymspaltung erhalten wurden, nachgewiesen werden, können aus einer beliebigen der folgenden Veränderungen in der DNA-Sequenz resultieren: Mutationen, die den Restriktionsendonukleasezielort beseitigen, Mutationen, die neue Zielorte erzeugen, Insertionen, Deletionen oder Inversionen zwischen den zwei Restriktionsstellen.
Solche DNA-Polymorphismen werden allgemein als RFLP, Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen, bezeichnet. Solche Mutationsveränderungen werden sich als echte genetische Marker verhalten, wenn sie nach den Mendelschen Regeln vererbt werden. Folglich können DNA- Polymorphismen als genetische Marker auf im wesentlichen die gleiche Weise wie andere genetische Marker verwendet werden: bei einer E1- ternschaftsanalyse, bei genetischen Studien über die Vererbung von Merkmalen, bei der Identifizierung von Individuen.

2.3. DNA-Fingerprinting-Techniken

Für nahezu alle lebenden Organismen mit Ausnahme von Viren ergeben Restriktionsverdaue der gesamten genomischen DNA der Organismen so viele Banden, daß es nicht möglich ist, einzelne Banden auszuzählen. Dementsprechend beruhen alle Methoden zum DNA- Fingerprinting auf dem Prinzip, daß nur ein kleiner Bruchteil der DNA-Fragmente sichtbar gemacht wird, um ein einfaches Bandenmuster zu erhalten, das den DNA-Fingerprint bildet.
Die am häufigsten verwendete Methode umfaßt ein Verdauen der DNA des Organismus mit Restriktionsendonukleasen, Auftrennen der Restriktionsfragmente durch Gelelektrophorese, Transferieren und Binden der aufgetrennten DNA-Fragmente auf Membranen und Hybridiseren der Membran mit einem spezifischen DNA-Fragment ("Sonde", "probe") Das DNA-Fragment wird doppelsträngige DNA-Moleküle mit dem DNA- Fragment (oder -Fragmenten) auf der Membran, das (die) komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist (aufweisen), bilden. Wenn die Sonde mit einem sichtbar zu machenden Marker markiert ist, kann das DNA- Fragment, an das die Sonde angeheftet ist, sichtbar gemacht werden. Diese Prozedur wird allgemein als "Southern-Hybridisierung" bezeichnet. Wenn Unterschiede in den Größen der entsprechenden Restriktionsfragmente, an die sich die Sonde anheftet, in eng verwandten genomischen DNA-Molekülen beobachtet werden, werden diese Unterschiede als DNA-Polymorphismen, spezieller Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen, bezeichnet. Die Restriktionsfragmentlängenunterschiede entsprechen den unterschiedlichen allelen Formen des Genorts, die von der DNA-Sonde erkannt werden. Obwohl die Southern-Hybridisierungsmethode zum DNA-Fingerprinting weithin verwendet worden ist, ist die Methode arbeitsaufwendig und zeitaufwendig.
Darüber hinaus hat die Methode eine niedrige Auflösung und kann folglich nur verwendet werden, um einzelne Loci oder höchstens einige wenige Loci in einer einzelnen Reaktion auszuzählen bzw. zu analysieren.

2.4. Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik ist eine Methode zum Synthetisieren spezifischer DNA-Fragmente in vitro. Die Methode beruht auf der Verwendung von spezifischen Oligonukleotiden, die sich an einmalig vorkommende Sequenzen auf einem DNA-Molekül anheften werden, und einer thermostabilen DNA-Polymerase. Die Oligonukleotide sind so gestaltet, daß sie mit den einander gegenüberliegenden Strängen der DNA durch Annealing hybridisieren können, und dienen als Primer bei einer DNA-Synthesereaktion in solcher Weise, daß jedes die Synthese von neuen DNA-Strängen dirigiert. Folglich wird in einer Syntheserunde eine vollständige Kopie des DNA-Moleküls zwi schen den Primern hergestellt, so daß die DNA zwischen den Primern dupliziert wird. Jede Runde einer DNA-Synthese führt zur Verdopplung der DNA-Menge, was folglich zu der Amplifizierung der zwischen den zwei Primern umfaßten DNA führt. Folglich erlaubt die PCR-Technik, einen präzise definierten DNA-Abschnitt unter Verwendung einer geringen Menge von "Substrat-DNA" zu synthetisieren. WO 90/11372 offenbart, ein "Testnukleotid" ("test nucleotide") in einer bekannten DNA-Sequenz nachzuweisen. Der Nachweis umfaßt eine Verwendung von definierten Primern, die ausgehend von der DNA-Sequenz, die dem "Testnukleotid" benachbart ist, starten.
WO 90/08821 betrifft eine Mikrosektion von chromosomaler DNA und einen weiteren Verdau der erhaltenen DNA. Die Verdaue werden dann an beiden Enden an Oligonukleotid-Doppelstränge ligiert, die verwendet werden, um Primer entsprechend einem ihrer Stränge zu verankern.

3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

In der vorliegenden Erfindung haben wir ein neues Verfahren entwickelt, um mittels der PCR-Methode Restriktionsfragmente, die nach Spalten der DNA eines Organismus mit mindestens einem Restriktionsenzym erhalten worden sind, zu amplifizieren. In dieser neuen Anwendung der PCR-Methode sind die verwendeten Oligonukleotide nicht gegen eine bekannte DNA-Sequenz gerichtet, sondern sind so gestaltet, daß sie die Enden der Restriktionsfragmente erkennen. Zu diesem Zweck ist es notwendig, die Enden der Restriktionsfragmente zu modifizieren, indem Oligonukleotid-Linker (oder -Adaptoren) an die Enden angefügt werden. Der Grund dafür ist, daß die Enden von Restriktionsenzymen üblicherweise nur wenige Nukleotide gemeinsam haben, d. h. 2 bis 8 Nukleotide, zu kurz, um zur Gestaltung von Primern für eine PCR-Amplifizierung verwendet zu werden.
Die Erfindung beruht auf der Verwendung einer neuen Anwendung der Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR) zum Amplifizieren von einem oder mehreren Restriktionsfragmenten aus komplexen Mischungen von DNA-Fragmenten, die durch Verdauen von genomischen DNA-Molekülen mit Restriktionsendonukleasen erhalten werden. Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, die Amplifizierung von DNA- Restriktionsfragmenten in Situationen, wo die Nukleotidsequenz der 5'- und 3'-Enden von Restriktionsfragmenten nicht bestimmt sind, zu ermöglichen. In solchen Fällen können die üblichen sequenzspezifischen Primer, die an jeden Strang eines zu amplifizierenden Restriktionsfragments hybridisieren, nicht definiert werden und dementsprechend kann man die im Stand der Technik zu Amplifizierungszwecken bekannten Methoden nicht verwenden.
Das Verfahren der Erfindung kann beispielsweise in zwei unterschiedlichen Weisen, die zu zwei unterschiedlichen Anwendungstypen führen, verwendet werden:
(1) Verfahren zum DNA-Fingerprinting von Genomen, indem man zufallsbedingt Untergruppen von einem oder mehreren durch die PCR-Technik zu amplifizierenden Restriktionsfragmenten auswählt. Die Erfindung umfaßt auch synthetische Oligonukleotide für eine Verwendung in diesen Verfahren und einige Anwendungen dieser Verfahren können forensische Typisierung, Identifizierung von Mikroben, Identifizierung von Sorten, Stammbaumanalyse und Screening von DNA-Markern, die mit genetischen Merkmalen verknüpft sind, sein;
(2) Verfahren zur Identifizierung von einem oder mehreren vorab ausgewählten DNA-Fragmenten, die polymorph sein können, durch PCR-Amplifizierung. Die Erfindung umfaßt auch spezifische synthetische Oligonukleotide für eine Verwendung in diesen Verfahren und einige Anwendungen dieser Verfahren können das Screening von genetisch vererbten Krankheiten bei Menschen, Monitoring der Vererbung von agronomischen Merkmalen bei der Pflanzen- und Tierzüchtung und der Nachweis von infektiösen Agentien bei Krankheiten sein.

4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 liefert einen graphischen Grundriß für das allgemeine Verfahren der PCR-Amplifizierung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten, die durch Verdauen von Molekülen genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym erhalten werden.
Fig. 2 zeigt die Ligation von Adaptoren an unterschiedliche Enden von Restriktionsfragmenten: glatte Enden und versetzte oder überhängende Enden.
Fig. 3 zeigt die PCR-Amplifizierung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten. Die eingerahmten Flächen zeigen die Adaptoren, die an das Restriktionsfragment ligiert werden, und die Primer, die bei der PCR-Amplifizierung verwendet werden. Die Pfeile zeigen die Richtung der DNA-Synthese an.
Fig. 4 liefert einen graphischen Grundriß für die PCR- Amplifizierung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten.
Fig. 5 zeigt die allgemeine Gestaltung der selektiven Primer, die bei der PCR-Amplifizierung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten verwendet werden. Die Rahmen bezeichnen die umgekehrten/invertierten Wiederholungssequenzen ("inverted repeat" - Sequenzen) an den Enden der Restriktionsfragmente. Die Selektivität der Primer wird in zwei Beispielen veranschaulicht, wo es jeweils eine perfekte Übereinstimmung/Basenpaarung ("match") und eine vollständige Fehlpaarung ("mismatch") zwischen der selektiven Basensequenz und jener der Restriktionsfragment-Matrizen-DNA gibt.
Fig. 6 zeigt das Prinzip der selektiven PCR-Amplifizierung unter Verwendung eines PCR-Primers, der Matrizen-DNA-Moleküle auswählt, die eine Trinukleotidsequenz benachbart zu der Adaptorsequenz aufweisen.
Fig. 7 zeigt die selektive PCR-Amplifizierung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten.
Fig. 8 zeigt das Prinzip einer Fragmentspezifischen Amplifizierung unter Verwendung einer Kombination von zwei PCR-Primern, von denen jeder 6 selektive Basen umfaßt. Jeder Primer bildet eine doppelsträngige Struktur in dem unterschiedlichen Strang des Restriktionsfragments und bildet dadurch einen Primer/Matrizen-Komplex, ausgehend von welchem eine DNA-Synthese initiiert werden kann (angegeben durch die Pfeile).
Fig. 9 zeigt die allgemeinen Sequenzelemente, die mit dem Verfahren der selektiven Restriktionsfragmentamplifizierung erkannt werden, einschließlich der zwei Nukleotidsequenzen, die erkannt werden, und des Abstands, der die zwei Sequenzen trennt.
Fig. 10 zeigt die Typen von Nukleotidsequenzvariationen, die in dem Verfahren zur Identifizierung von amplifizierten Fragmentlängenpolymorphismen nachgewiesen werden.
Fig. 11 zeigt ein 1,0%-iges Agarosegel mit der Analyse der Ergebnisse aus der Amplifizierung von Tomaten-DNA, die einer Restriktion mit PstI unterworfen worden ist, unter Verwendung von Primern von zunehmender Selektivität.
Fig. 12 zeigt ein 1,0%-iges Agarosegel mit der Analyse der Ergebnisse einer spezifischen Amplifikation von 3 unterschiedlichen PstI-Fragmenten von Tomaten-DNA unter Verwendung von Fragmentspezifischen Primern.
Fig. 13 zeigt ein 2,5% Polyacrylamid/l% Agarosegel mit DNA- Fingerprints, die durch Selektive Restriktionsfragmentamplifizierung von zwei Tomaten-Linien erhalten worden sind.
Fig. 14 zeigt einen Teil eines denaturierenden 4,5%-igen Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 4 Tomaten-Linien unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination PstI/MseI.
Fig. 15 zeigt einen Teil eines denaturierenden 4,5%-igen Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 10 Lactuca-Linien unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination PstI/MseI.
Fig. 16 zeigt einen Teil eines denaturierenden 4,5%-igen Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 2 Maislinien unter Verwendung von SRFA mit den Enzymkombinationen PstI/TagI und EcoRI/TagI.
Fig. 17 zeigt einen Teil eines denaturierenden 4,5%-igen Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von 26 Xanthomonas campestris- Stämmen unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination ApaI/TagI.
Fig. 18 zeigt einen Teil eines denaturierenden 4,5%-igen Polyacrylamidgels mit DNA-Fingerprints von unterschiedlichen Individuen von 4 Haustieren, Huhn, Schwein, Kuh und Pferd, unter Verwendung von SRFA mit der Enzymkombination SseI/MseI.

5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

5.1 Definitionen

In der Beschreibung und den Beispielen, die folgen, wird hier eine Anzahl von Begriffen verwendet. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und Ansprüche, einschließlich des Umfangs, der solchen Begriffe beigemessen werden soll, zu ermöglichen, werden die folgenden Definitionen bereitgestellt.
Restriktionsendonuklease: eine Restriktionsendonuklease oder ein Restriktionsenzym ist ein Enzym, das eine spezifische Basensequenz (Zielort) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül erkennt und beide Stränge des DNA-Moleküls an jedem Zielort spaltet.
Restriktionsfragmente: die durch Verdauen mit einer Restriktionsendonuklease erzeugten DNA-Moleküle werden als Restriktionsfragmente bezeichnet. Ein jegliches gegebenes Genom wird durch eine spezielle Restriktionsendonuklease zu einem diskreten Satz von Restriktionsfragmenten verdaut werden. Die DNA-Fragmente, die aus einer Restriktionsendonukleasespaltung resultieren, werden durch Gelelektrophorese getrennt und nachgewiesen.
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP): die genomische DNA von zwei eng verwandten Organismen, beispielsweise, werden in ihrer Nukleotidsequenzzusammensetzung an vielen Stellen Unterschiede aufweisen. Wenn diese Unterschiede an dem Zielort für eine Restriktionsendonuklease auftreten, wird der modifizierte Zielort an diesem Punkt nicht gespalten. In ähnlicher Weise kann eine Nukleotidsequenzvariation einen neuen Zielort einführen, wo er in dem anderen Organismus nicht existiert, was verursacht, daß die DNA durch das Restriktionsenzym an diesem Punkt geschnitten wird. Alternativ werden Insertionen oder Deletionen von Nukleotiden, die in einem Organismus zwischen zwei Zielorten für eine Restriktionsendonuklease auftreten, den Abstand zwischen jenen Zielorten modifizieren. Aufgrunddessen wird ein Verdau der DNA dieser zwei Organismen Restriktionsfragmente, die unterschiedliche Längen aufweisen, erzeugen. Es wird ein Polymorphismus in der Länge von Restriktionsfragmenten, die durch Verdauen der DNA der zwei Organismen erzeugt werden, resultieren.
Gelelektrophorese: um Restriktionsfragmente nachzuweisen, wird ein analytisches Verfahren zum Auftrennen von doppelsträngigen DNA-Molekülen auf Grundlage der Größe benötigt. Die am üblichsten verwendete Technik zum Erzielen einer solchen Auftrennung ist Gelelektrophorese. Die Geschwindigkeit, mit der sich DNA- Fragmente in solchen Gelen bewegen, hängt von ihrer Größe ab; folglich nehmen die zurückgelegten Distanzen in dem Maße ab, wie die Fragmentlängen zunehmen. Die durch Gelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente können direkt durch ein Anfärbungsverfahren sichtbar gemacht werden, wenn die Anzahl von Fragmenten, die in dem Muster enthalten sind, klein ist.
Synthetische Oligonukleotide: die einzelsträngigen, vorzugsweise beinahe/ungefähr 10 bis beinahe/ungefähr 50 Basen aufweisen den DNA-Moleküle, die chemisch synthetisiert werden können, werden als synthetische Oligonukleotide bezeichnet. Im allgemeinen sind diese synthetischen DNA-Moleküle so gestaltet, daß sie eine einmalig vorkommende Nukleotidsequenz aufweisen, obwohl es möglich ist, Familien von Molekülen zu synthetisieren, die verwandte Sequenzen aufweisen und die unterschiedliche Nukleotidzusammensetzungen an speziellen Positionen innerhalb der Nukleotidsequenz haben. Der Begriff synthetisches Oligonukleotid wird verwendet werden, um auf DNA-Moleküle zu verweisen, die eine einmalig vorkommende Nukleotidsequenz aufweisen. Der Begriff gemischte synthetische Oligonukleotide wird verwendet werden, um auf Familien von verwandten synthetischen Oligonukleotiden zu verweisen.
Ligation: die enzymatische Reaktion, die durch das Enzym Ligase katalysiert wird, in welcher zwei doppelsträngige DNA-Moleküle kovalent miteinander verknüpft werden, wird als Ligation bezeichnet. Im allgemeinen werden beide DNA-Stränge kovalent miteinander verknüpft, aber es ist auch möglich, die Ligation von einem der zwei Stränge durch chemische oder enzymatische Modifizierung von einem der Enden zu verhindern. In jenem Fall wird die kovalente Verknüpfung nur bei einem der zwei DNA-Stränge auftreten.
Adaptoren: kurze doppelsträngige DNA-Moleküle mit einer begrenzten Anzahl von Basenpaaren, z. B. 10 bis 30 Basenpaare lang, die so gestaltet sind, daß sie an die Enden von Restriktionsfragmenten ligiert werden können. Adaptoren werden aus zwei synthetischen Oligonukleotiden gebildet, die Nukleotidsequenzen aufweisen, die teilweise komplementär zueinander sind. Beim Mischen der zwei synthetischen Oligonukleotide werden sie in Lösung unter geeigneten Bedingungen eine doppelsträngige Struktur bilden. Eines der Enden des Adaptormoleküls ist so gestaltet, daß es an das Ende eines Restriktionsfragments ligiert werden kann, das andere Ende ist so gestaltet, daß es nicht ligiert werden kann.
Polymerasekettenreaktion (PCR) die enzymatische Reaktion, in der DNA-Fragmente ausgehend von einer Substrat-DNA in vitro synthetisiert werden, wird als PCR bezeichnet. Die Reaktion umfaßt die Verwendung von zwei synthetischen Oligonukleotiden, die zu Nukleotidsequenzen in DNA-Molekülen, die um eine kurze Distanz von einigen Hundert bis einigen Tausend Hasenpaaren voneinander entfernt sind, komplementär sind, und die Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase. Die Kettenreaktion besteht beispielsweise aus einer Serie von 10 bis 30 Zyklen. In jedem Zyklus wird die Substrat-DNA zuerst bei hoher Temperatur denaturiert. Nach Herunterkühlen werden die synthetischen Oligonukleotide, die in enormem Überschuß vorhanden sind, doppelsträngige Strukturen mit den Substrat-DNA-Molekülen in Lösung an spezifischen Stellen auf dem Substrat-DNA-Molekül, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweisen, bilden. Die Oligonukleotid-Substrat-DNA-Komplexe werden dann als Initiationsstellen für die DNA-Synthesereaktion, die durch die DNA-Polymerase katalysiert wird, dienen, was zu der Synthese eines neuen DNA- Strangs führt, der zu dem Substrat-DNA-Strang komplementär ist. DNA-Amplifizierung: der Begriff DNA-Amplifizierung wird verwendet werden, um die Synthese von doppelsträngigen DNA-Molekülen in vitro unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zu bezeichnen. Die Produkte der PCR-Reaktion werden als amplifizierte DNA-Fragmente bezeichnet.
Primer: allgemein bezieht sich der Begriff Primer auf einen DNA-Strang, der die Synthese von DNA initiieren ("primen") kann. DNA-Polymerase kann DNA de novo ohne Primer nicht synthetisieren: sie können nur einen existierenden DNA-Strang in einer Reaktion, in der der komplementäre Strang als eine Matrize verwendet wird, um die Reihenfolge von Nukleotiden, die zusammengebaut werden sollen, zu dirigieren, verlängern. Wir werden auf die synthetischen Oligonukleotidmoleküle, die in der PCR- Reaktion verwendet werden, als Primer verweisen.
Southern-Hybridisierungs-Prozedur: der Zweck der Southern- Hybridisierungs-Prozedur, die auch als Southern-Blotting bezeichnet wird, besteht darin, durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennte DNA körperlich auf einen Träger, wie eine Nylonmembran oder Nitrocellulosefilterpapier, zu transferieren, wobei die relativen Positionen von DNA-Fragmenten, die aus der Auftrennungsprozedur resultieren, bewahrt werden. Die Methodik, die verwendet wird, um den Transfer von einem Agarosegel zu dem Träger zu bewerkstelligen, besteht darin, die DNA durch Kapillarwirkung aus dem Gel in den Träger zu ziehen.
Nukleinsäurehybridisierung: Nukleinsäurehybridisierung wird verwendet, um verwandte DNA-Sequenzen durch Hybridisierung von einzelsträngiger DNA auf Trägern, wie einer Nylonmembran oder Nitrocellulosefilterpapieren, nachzuweisen. Nukleinsäuremoleküle, die komplementäre Basensequenzen aufweisen, werden erneut die doppelsträngige Struktur ausbilden, wenn sie in Lösung unter den passenden Bedingungen gemischt werden. Die doppelsträngige Struktur wird zwischen zwei komplementären einzelsträngigen Nukleinsäuren ausgebildet, sogar wenn eine auf einem Träger immobilisiert ist. In der Southern-Hybridisierungs-Prozedur tritt die letztgenannte Situation auf.
Hybridisierungssonde: um eine spezielle DNA-Sequenz in der Southern-Hybridisierungs-Prozedur nachzuweisen, läßt man ein markiertes DNA-Molekül oder eine markierte Hybridisierungssonde mit der aufgetrennten DNA, die an einen Träger, wie eine Nylonmembran oder Nitrocellulosefilterpapier, gebunden ist, reagieren. Die Bereiche auf dem Filter, die DNA-Sequenzen tragen, die komplementär zu der markierten DNA-Sonde sind, werden ihrerseits als Folge der erneuten Doppelstrangbildungsreaktion markiert. Die Bereiche des Filters, die eine solche Markierung aufweisen, können dann gemäß dem verwendeten Markierungstyp nachgewiesen werden. Die Hybridisierungssonde wird im allgemeinen durch molekulare Klonierung einer speziellen DNA-Sequenz aus dem Maisgenom gebildet.
Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Amplifizierung von mindestens einem Restriktionsfragment, erhalten von einer Ausgangs-DNA, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) die Ausgangs-DNA mit mindestens einer Restriktionsendonuklease zu verdauen, um sie in Restriktionsfragmente zu fragmentieren,
(b) die erhaltenen Restriktionsfragmente mit mindestens einem doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotid-Adaptor, der ein Ende aufweist, das kompatibel ist, mit einem oder beiden der Enden der Restriktionsfragmente ligiert zu werden, zu ligieren, um dadurch mit einem "Tag" versehene Restriktionsfragmente zu erzeugen,
(c) die mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente unter Hybridisierungsbedingungen mit mindestens einem Oligonukleotidprimer in Berührung zu bringen, wobei der oder die Primer eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine Basenpaarung mit einem Teil der Zielsequenz der Restriktionsendonuklease, die in den mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten vorliegt, ausbildet und eine Basenpaarung mit einem Teil der Adaptorsequenz ausbildet, und wobei mindestens einer der Primer an seinem 3'-Ende eine ausgewählte, mindestens ein Nukleotid umfassende Sequenz, die sich unmittelbar benachbart zu den an der Bildung der Zielsequenz beteiligten Nukleotiden befindet, umfaßt;
(d) die mit dem Primer oder den Primern hybridisierten, mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente in Gegenwart der erforderlichen Nukleotide und von DNA-Polymerase zu amplifizieren oder die hybridisierten Primer entlang jenen mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten zu verlängern und
(e) amplifizierte oder verlängerte DNA-Fragmente, die in Schritt (d) erzeugt worden sind, zu identifizieren oder zu gewinnen.

5.2. Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Diese Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren und Mittel, die es ermöglichen, daß die Polymerasekettenreaktion (PCR) auf den Nachweis von Restriktionsfragmentpolymorphismen (RFPs), einschließlich Längenpolymorphismen, anwendbar ist. Diese Erfindung umfaßt Verfahren zum Nachweisen von RFPs, synthetische Oligonukleotide für eien Verwendung in den Verfahren der Erfindung, Kits, die Mittel zum Nachweisen von RFPs umfassen, und Anwendungen der Verfahren und Prozeduren der Erfindung für die Pflanzen- und Tierzüchtung, Diagnostik von genetisch vererbten Krankheiten, Identifizierung von Organismen und forensische Typisierung u. s. w.
Speziell stellt diese Erfindung Mittel für die Identifizierung von entweder individuellen genomischen Restriktionsfragmenten oder von Sätzen von genomischen Restriktionsfragmenten aus einem jeglichen Organismus, Mikroorganismus, Pflanze, Tier oder Mensch, bereit, die entweder individuell genetisch mit einem oder mehreren speziellen Merkmalen verknüpft sind oder die kollektiv einen Fingerprint des Genoms liefern, der verwendet werden kann, um einen Organismus, eine Sorte oder ein Individuum zu identifizieren.
Das allgemeine Verfahren der Erfindung für die Herstellung und für die Identifizierung von Restriktionsfragmenten umfaßt die Verwendung von Restriktionsendonukleasen, Ligation von synthetischen Oligonukleotiden an die Restriktionsfragmente und eine PCR- Amplifizierung von Restriktionsfragmenten (Fig. 1). Restriktionsendonukleasen spalten genomische DNA-Moleküle an speziellen Stellen, Zielorten, wodurch Restriktionsfragmente erzeugt werden.
Eine PCR-Amplifizierung von Restriktionsfragmenten kann, unabhängig davon, ob man die Nukleotidsequenz der Enden der Restriktionsfragmente kennt oder nicht, erfindungsgemäß erzielt werden, indem zuerst synthetische Oligonukleotide (Adaptoren) an die Enden von Restriktionsfragmenten ligiert werden, wodurch jedes Restriktionsfragment mit zwei gemeinsamen "Tags" versehen wird, die als Verankerungsbasis für die bei der PCR-Amplifizierung verwendeten Primer dienen werden.
Typischerweise produzieren Restriktionsenzyme entweder glatte Enden, bei denen die terminalen Nukleotide beider Stränge eine Basenpaarung aufweisen, oder überhängende Enden, bei denen einer der zwei Stränge hervorragt, wobei er eine kurze Einzelstrangverlängerung ergibt (Fig. 2). Im Falle von Restriktionsfragmenten mit glatten Enden werden Adaptoren mit einem glatten Ende verwendet. Im Falle von Restriktionsfragmenten mit überhängenden Enden werden Adaptoren verwendet, die eine einzelsträngige Verlängerung aufweisen, die komplementär zu der einzelsträngigen Verlängerung des Restriktionsfragments ist. Folglich werden für jeden Typ von Restriktionsfragment spezielle Adaptoren verwendet, die sich nur in einem der Enden unterscheiden, so daß ermöglicht wird, daß der Adaptor an das Restriktionsfragment ligiert wird. Typischerweise werden die verwendeten Adaptoren aus zwei synthetischen Oligonukleotiden gebildet, die zum Teil komplementär zueinander sind und die üblicherweise 10 bis 30 Nukleotide lang sind, vorzugsweise 12 bis 22 Nukleotide lang sind und die doppelsträngige Strukturen bilden, wenn sie in Lösung miteinander vermischt werden. Unter Verwendung des Enzyms Ligase werden die Adaptoren an die Mischung von Restriktionsfragmenten ligiert. Bei einer Verwendung eines großen molaren Überschusses von Adaptoren gegenüber Restriktionsfragmenten stellt man sicher, daß alle Re striktionsfragmente letztendlich Adaptoren an beiden Enden tragen werden. Durch diese Methode hergestellte Restriktionsfragmente werden als mit einem "Tag" versehene Restriktionsfragmente bezeichnet und das Verfahren wird im weiteren als Restriktionsfragment-Tagging bezeichnet.
Die Adaptoren können nun als Matrizen für die Primer, die die oben definierten Eigenschaften haben und in der nachfolgenden PCR- Amplifizierungsreaktion verwendet werden, dienen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung trägt das Restriktionsfragment den gleichen Adaptor an beiden seiner Enden und es kann ein einzelner PCR-Primer verwendet werden, um das Restriktionsfragment zu amplifizieren, wie in Fig. 3 veranschaulicht wird. Da in einem solchen Falle alle Restriktionsfragmente auf die gleiche Weise mit einem "Tag" versehen sind, ist es offensichtlich, daß eine PCR- Amplifizierung einer Mischung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten alle Restriktionsfragmente synchron amplifizieren wird. In einer anderen Ausführungsform unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Restriktionsenzymen, um die DNA zu spalten, werden zwei unterschiedliche Adaptoren an die Enden der Restriktionsfragmente ligiert. In diesem Falle können zwei unterschiedliche PCR- Primer verwendet werden, um solche Restriktionsfragmente zu amplifizieren. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen ist der Adaptor für eines der Enyzmenden biotinyliert. Dies ermöglicht, aus der komplexen Mischung von Restriktionsfragmenten jene Restriktionsfragmente herauszuselektieren, die mindestens ein Ende für dieses Restriktionsenzym tragen, wobei übliche Methoden zur Isolierung von biotinylierten Molekülen verwendet werden. Dieser Schritt verringert die Komplexität der Ausgangsmischung von Restriktionsfragmenten und stellt einen Anreicherungsschritt vor der PCR-Amplifizierung dar, wodurch in bestimmten Fällen der Hintergrund verringert wird. Die gleichzeitige Amplifizierung von mehreren unterschiedlichen Fragmenten wird oftmals als Multiplex-PCR bezeichnet. Das Prinzip der Multiplex-Restriktionsfragmentamplifizierung ist in Fig. 4 veranschaulicht.
Die Erfindung beruht ferner auf der Definition von speziell gestalteten Primern und speziellen Methoden, um die PCR- Amplifizierungsreaktion so zu steuern, daß eine kontrollierte Amplifizierung möglich ist, und in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung auf solche Weise, daß nur eine kleine Untergruppe von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten amplifiziert wird.
Im allgemeinen erzeugen Restriktionsendonukleaseverdaue von genomischer DNA und insbesondere von tierischer, pflanzlicher oder menschlicher genomischer DNA sehr große Zahlen von Restriktionsfragmenten. Die Anzahl von Restriktionsfragmenten hängt von der Größe des Genoms und von der Häufigkeit des Auftretens des Zielorts der Restriktionsendonuklease in dem Genom ab, die ihrerseits hauptsächlich durch die Anzahl von Nukleotiden in dem Zielort bestimmt wird. Die Anzahl von Nukleotiden in den Zielorten von üblicherweise verwendeten Restriktionsendonukleasen reicht von 4 bis 8. Die Genomgrößen von Organismen variieren in weitem Umfang von einigen wenigen Millionen Basenpaaren im Falle von Mikroorganismen bis zu mehreren Milliarden Basenpaaren für Tiere und Pflanzen. Folglich kann die Anzahl von Restriktionsfragmenten, die nach eine Spalten von Molekülen genomischer DNA mit einem Restriktionsenzym erhalten werden, von einigen Hundert bis zu mehreren Millionen variieren. Im allgemeinen ist die Anzahl von Restriktionsfragmenten so groß, daß es nicht möglich ist, individuelle Restriktionsfragmente in Verdauen von genomischer DNA, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt worden sind, zu identifizieren. Solche Verdaue erzeugen üblicherweise einen Schmier ("smear") von Banden.
Eine PCR-Amplifizierung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten sollte folglich ebenfalls einen Schmier von Banden erzeugen, da alle Fragmente synchron in der PCR-Reaktion coamplifiziert werden sollten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die auf genomische DNAs großer Größen anwendbar ist, haben wir ein allgemeines Prinzip verwendet, um die Anzahl von Restriktionsfragmenten, die zu amplifizieren sind, zu begrenzen. Dies erfolgt durch vorab erfolgendes Auswählen einer Untergruppe von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten, so daß nur eine relativ kleine Anzahl von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten während der PCR-Amplifizierungsreaktion amplifiziert wird.
Das in dieser Ausführungsform der Erfindung definierte Selektionsprinzip beruht auf der Gestaltung der Oligonukleotide, die als Primer für die PCR-Amplifizierung verwendet werden, wie in Fig. 5 veranschaulicht wird.
Mit einem "Tag" versehene Restriktionsfragmente haben die folgende allgemeine Struktur: eine variable DNA-Sequenz (entsprechend dem Restriktionsfragment vor dem Anfügen des "Tag"), flankiert auf beiden Seiten durch eine umgekehrte/invertierte DNA-Sequenz (konstante Sequenz). Die umgekehrte/invertierte DNA-Sequenz (konstante DNA-Sequenz) wird aus einem Teil der Zielsequenz der Restriktionsendonuklease und aus der Sequenz des Adaptors, der an beide Enden des Restriktionsfragments angeheftet worden ist, gebildet. Die variablen Sequenzen der Restriktionsfragmente, die zwischen den konstanten DNA-Sequenzen enthalten sind, sind üblicherweise unbekannt und werden folglich eine zufällige Sequenzzusammensetzung haben. Folglich werden die Nukleotidsequenzen, die die konstante DNA-Sequenz flankieren, in einer großen Mischung von Restriktionsfragmenten vollständig zufällig sein.
Die Erfindung stellt dementsprechend auch spezielle PCR-Primer bereit, die einen Teil mit einer konstanten Nukleotidsequenz und, in der Ausführungsform der Erfindung, die sich auf die Amplifizierung einer begrenzten Untergruppe der erhaltenen Restriktionsfragmente bezieht, einen Teil mit einer variablen Sequenz umfassen. In dem Teil mit der konstanten Sequenz ist die Nukleotidsequenz so gestaltet, daß der Primer eine perfekte Basenpaarung mit der konstanten DNA-Sequenz von einem der DNA-Stränge an dem Ende des Restriktionsfragments ausbilden wird. Der Teil mit der variablen Sequenz umfaßt eine zufällig gewählte Nukleotidsequenz, die von 1 bis 10 ausgewählten Basen reicht.
Der Begriff "variable Sequenz" bezeichnet genauer eine Sequenz, die aus ausgewählten Nukleotiden besteht, die eine Sequenz bilden, die dann zum Zweck einer Amplifizierung einer Untergruppe von Restriktionsfragmenten konstant bleiben wird. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können mehrere Sequenzen von ausgewählten Basen verwendet werden, um mehrere voneinander verschiedene Primer zu definieren. In einem solchen Falle können Primer die gleiche konstante Sequenz und variable Sequenzen, die aus ausgewählten Basen hergestellt werden, die sich zwischen den so gebildeten Primern unterscheiden, haben.
Es ist die Hinzufügung dieser variablen (ausgewählten) Sequenzen an das 3'-Ende der Primer, die die Vorauswahl von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten, die in dem PCR-Schritt am plifiziert werden, dirigiert: wenn die PCR-Reaktion unter geeigneten Bedingungen ausgeführt wird, werden die Primer eine DNA-Synthese nur an jenen mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten initiieren, in denen die variable DNA-Sequenz eine perfekte Basenpaarung mit dem Matrizenstrang des mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragments ausbilden kann, wie in Fig. 5 veranschaulicht wird.
Die Auswahl wird durch die Anzahl von Nukleotiden, die in dem Teil des Primers mit der variablen Sequenz vorliegen, bestimmt: die Selektivität der Primer nimmt mit der Anzahl von Nukleotiden in dem Teil mit der variablen (ausgewählten) Sequenz zu. Wir werden auch den Begriff selektive Basen verwenden, um die Nukleotide in dem Teil mit der variablen Sequenz zu bezeichnen, was zeigt, daß die Auswahl dieser Basen den Primer selektiv macht. Es muß realisiert werden, daß ein mit einem "Tag" versehenes Restriktionsfragment nur amplifiziert werden wird, wenn die selektiven Basen der verwendeten Primer beide komplementäre Sequenzen an den Enden des Fragments erkennen. Wenn der Primer eine perfekte Basenpaarung nur mit einem Ende ausbildet, wird die Amplifizierung linear anstelle von exponentiell sein und das Produkt wird undetektiert bleiben.
Es ist möglich, vorab das Ausmaß von Selektivität, das mit variablen Sequenzen mit unterschiedlichen Anzahlen von selektiven Basen erhalten wird, unter Verwendung der allgemeinen Formel 42n, worin n gleich der Anzahl von selektiven Basen ist, abzuschätzen: bei Verwendung von 1 selektiven Base wird 1 von 16 mit einem "Tag" versehenen Fragmenten amplifiziert werden, bei Verwendung von 2 selektiven Basen wird 1 von 256, bei Verwendung von 3 selektiven Basen wird 1 von 4.096, bei Verwendung von 4 selektiven Basen wird 1 von 65.536 u. s. w. amplifiziert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ermöglicht es folglich, selektiv eine zufallsbedingte Untergruppe von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten aus einem jeglichen Verdau genomischer DNA heraus unabhängig von der Anzahl von durch das verwendete Restriktionsenzym erzeugten Fragmenten zu amplifizieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Anzahl von selektiven Nukleotiden so gewählt, daß die Anzahl von Restriktionsfragmenten, die amplifiziert wird, auf 5 bis 200 begrenzt ist. Obwohl diese Anzahl berechnet werden kann, indem die Anzahl von Fragmenten durch 42n geteilt wird, ist eine präzise Vorhersage nicht möglich, da nicht alle Restriktionsfragmente mit gleicher Effizienz amplifiziert werden können. Folglich findet man in der Praxis weniger Fragmente der Amplifizierung als theoretisch erwartet. Es sollte auch betont werden, daß Mischungen von zwei (oder mehreren) Primern verwendet werden können. Dies wird die Amplifizierung der Fragmente, die durch jeden Primer erkannt werden, und zusätzlich der Fragmente, die von den zwei Primern erkannt werden, ermöglichen. Schließlich sollte betont werden, daß die Auswahl, die auf der Ausbildung einer Basenpaarung zwischen den selektiven Nukleotiden des Primers und der komplementären Matrize beruht, stark durch die Temperatur, die für den Hybridisierungs/Reassoziierungs/Annealingschritt in der PCR-Reaktion gewählt wird, beeinflußt wird; wenn diese Temperatur unterhalb oder zu nahe an der Schmelztemperatur des Primer/Matrizen-Komplexes liegt, werden Primer durch Annealing einen Doppelstrang mit den eine unperfekte Basenpaarung ausbildenden Matrizensequenzen bilden, was es ermöglicht, daß eine Fehlpaarung in dem Komplex auftritt. Dies sollte vermieden werden, da es zu der Amplifizierung von viel mehr Fragmenten, als vorhergesagt, führen wird, wodurch stärker variierende Ergebnisse erzeugt werden.
Die gemäß der Erfindung erhaltenen PCR-Produkte können unter Verwendung von Standard-Auftrennungsmethoden zum Trennen von DNA- Molekülen gemäß der Größe, gefolgt von Anfärben der DNA-Moleküle mit geeigneten Mitteln, identifiziert werden. Alternativ können die Primer, die für die PCR-Amplifizierung verwendet werden, mit einer geeigneten radioaktiven Markierung oder einem geeigneten fluoreszierenden Chromophor markiert werden, wodurch die Identifizierung der Reaktionsprodukte nach einer Auftrennung nach der Größe ermöglicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die PCR-Produkte durch Gelelektrophorese unter Verwendung von Standard- Gelmatrices, wie beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, Agarose, Polyacrylamid oder Agarose/Polyacrylamid gemischt, aufgetrennt. Die gemäß der Erfindung erhaltenen PCR-Produkte werden im weiteren durch den Begriff Amplifizierte Restriktionsfragmente (ARF) bezeichnet.
Die Mittel und das Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um Sätze von ARF aus Restriktionsverdauen eines jeglichen komplexen Genoms zu erzeugen. Die Erfindung erlaubt es, die Anzahl von Restriktionsfragmenten, die erhalten werden, entsprechend der Auflösung des zur Auftrennung der ARFs verwendeten Gelauftrennungssystems einzustellen. In einer besonderen Ausführungsform werden die selektiven Primer so gestaltet, daß 5 bis 10 ARFs erzeugt werden, die dann durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt werden. Eine andere besondere Ausführungsform umfaßt die Verwendung von selektiven Primern, die so gestaltet sind, daß 20 bis 50 ARFs erzeugt werden, die dann in einem hochauflösenden Gelelektrophoresesystem, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Polyacrylamidgelen oder gemischten Polyacrylamid-Agarose-Gelen, aufgetrennt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden das Restriktionsenzym oder die Restriktionsenzyme so ausgewählt, daß Restriktionsfragmente im Größenbereich von 20 bis 1000 Basenpaaren erhalten werden, da, wie dies für die PCR-Amplifizierung allgemein bekannt ist, dieser Fragmentgrößenbereich am effektivsten amplifiziert wird. Obwohl viele Fragmente auf verschiedenen Standard-Gelmatrices aufgetrennt werden können, werden die besten Ergebnisse durch Auftrennung auf denaturierenden Polyacrylamid-Gelsystemen, wie sie gegenwärtig für eine DNA-Sequenzierung verwendet werden, erhalten.
Gemäß der Erfindung werden mit jedem unterschiedlichen selektiven Primer unterschiedliche Sätze von ARFs in der PCR-Amplifizierungsreaktion erhalten. Die Muster von ARFs, die nach einer Auftrennung identifiziert werden, bilden einzigartige und perfekt reproduzierbare Fingerprints der genomischen DNA. Solche Fingerprints können mehrere Anwendungen haben, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, forensische Typisierung, die diagnostische Identifizierung von Organismen und die Identifizierung von Spezies, Rassen, Sorten oder Individuen. Der Identifizierungsgrad wird durch das Ausmaß der Ähnlichkeit (das Variabilitätsausmaß), das von unterschiedlichen Mitgliedern einer speziellen Gruppe gezeigt wird, bestimmt. Die Variabilität oder Ähnlichkeit wird durch das Ausmaß von Variationen in der Nukleotidzusammensetzung der verwandten Genome bestimmt. Das zugrundeliegende Prinzip der Erfindung besteht darin, daß in jedem Amplifizierten Restriktionsfragment zwei Nukleotidsequenzen nachgewiesen werden, die voneinander durch einen gegebenen Abstand getrennt sind, wie in Fig. 9 veranschaulicht wird. Jede der zwei Nukleotidsequenzen wird aus zwei Teilen gebildet: (a) dem Zielort für die Restriktionsendonuklease und (b) der dem Zielort benachbarten Nukleotidsequenz, die in dem selektiven Primer enthalten ist.
Bei verwandten Organismen, Spezies, Sorten, Rassen oder Individuen werden diese Sequenzelemente und deren relative Abstände in einem größeren oder geringeren Ausmaß konserviert sein. Folglich bilden die Fingerprints eine Grundlage für die Bestimmung des Ausmaßes von Sequenzverwandtschaften zwischen Genomen. Andererseits können Unterschiede in den ARF-Mustern verwendet werden, um Genome voneinander zu unterscheiden. Die besonderen Vorteile der Erfindung gegenüber anderen Methoden zum Fingerprinting von Genomen ist die hohe Auflösung, die mit dem Verfahren erzielt werden kann: mehrere zehn oder sogar Hunderte von ARFs können gleichzeitig verglichen werden.
Eine andere besondere Anwendung der Erfindung umfaßt das Screening und die Identifizierung von Restriktionsfragmentpolymorphismen (RFP). Veränderungen in der Nukleotidzusammensetzung von genomischer DNA führen oftmals zu Polymorphismen von Restriktionsfragmenten: Insertionen oder Deletionen beeinflussen die Größe der Restriktionsfragmente, die sie enthalten (Fig. 10), Nukleotidveränderungen können zu der Beseitigung von Restriktionsendonuklease-Zielorten oder der Erzeugung von neuen Restriktionsendonuklease-Zielorten führen (Fig. 11). Die am häufigsten verwendeten Techniken für die Identifizierung solcher Veränderungen sind Southern-Blotting-Experimente unter Verwendung von klonierten DNA-Sonden, eine Technik, die üblicherweise als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) - Nachweis bezeichnet wird. Diese Technik umfaßt das intensive Screening von zufallsbedingt klonierten DNA-Fragmenten in Southern- Blotting-Experimenten auf assoziierte RFLPs zwischen unterschiedlichen Genomen. Gemäß dem Verfahren der Erfindung können RFPs direkt durch Vergleichen der ARFs, die ausgehend von unterschiedlichen Genomen erhalten werden, identifiziert werden. Im Prinzip ist das Verfahren der Erfindung empfindlicher zum Nachweisen von RFPs, da nicht nur Unterschiede in den Zielorten der Restriktionsendonuklease nachgewiesen werden, sondern auch Unterschiede in den benachbarten Nukleotidsequenzen, die in den selektiven PCR-Primern enthalten sind. Folglich bildet das Verfahren der Erfindung eine weit überlegene Methode zum Nachweisen von RFLPs.
RFLPs werden jetzt momentan für mehrere Anwendungen, einschließlich forensischer Typisierung, Monitoring von genetisch vererbten Krankheiten bei Menschen und Monitoring der Vererbung von agronomischen Merkmalen bei der Pflanzen- und Tierzucht, verwendet.
Das zugrundeliegende Prinzip besteht darin, daß bestimmte DNA- Polymorphismen, die eng mit speziellen genetischen Merkmalen verknüpft sind, verwendet werden können, um die Gegenwart oder das Fehlen von speziellen genetischen Merkmalen zu überwachen.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann die Analyse von ARF- Mustern verwendet werden, um die genetische Verknüpfung von polymorphen ARFs mit speziellen genetischen Merkmalen zu definieren. Solche polymorphen ARFs werden im weiteren als Amplifizierte Fragmentlängenpolymorphismen ("Amplified Fragment Length Polymorphisms"; AFLP®) bezeichnet werden, um diese von DNA-Polymorphismen vom RFLP-Typ, die in Southern-Blotting-Experimenten unter Verwendung von klonierten DNA-Sonden nachgewiesen werden, zu unterscheiden.
Eine besondere Anwendung der Erfindung umfaßt den Nachweis von AFLPs, die mit speziellen genetischen Merkmalen verknüpft sind. Die Anwendung umfaßt die Analyse von ARF-Mustern, die mit unterschiedlichen selektiven Primern in Restriktionsverdauen von genomischer DNA von eng verwandten Individuen, die Unterschiede in dem speziellen genetischen Merkmal aufweisen, erhalten werden, und die Verwendung von Analysetechniken, die Korrelationen zwischen der Vererbung von einem oder mehreren AFLP® und dem Phänotyp, der aufgrund der speziellen genetischen Merkmale auftritt, auffinden können.
Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Verwendung des Verfahrens der Erfindung, um ein oder mehrere spezielle Restriktionsfragmente zu identifizieren. Ein spezielles Restriktionsfragment kann aus einer komplexen Mischung von mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten amplifiziert werden, indem zuerst die Nukleotidsequenz der ersten 8-12 Basen an jedem Ende des Restriktionsfragments bestimmt werden. Basierend auf diesen Sequenzen kann man zwei Primer mit jeweils 5 bis 10 selektiven Nukleotiden, die eine Sequenz komplementär zu jener der die Restriktionsstelle des komplementären Strangs des Restriktionsfragments flankierenden Sequenz zeigen, gestalten. Unter Verwendung von solchen Sätzen von Primern kann man nach einer PCR-Amplifizierung ein einzelnes amplifiziertes Fragment erhalten. Das in diesem Verfahren verwendete Restriktionsfragment kann entweder ein kloniertes Restriktionsfragment oder ein amplifiziertes Restriktionsfragment sein. Da nicht viele Restriktionsfragmente nicht sehr effizient amplifiziert werden können, umfaßt das bevorzugte Verfahren der Erfindung zur Identifi zierung von polymorphen DNA-Markern zuerst eine Amplifizierung eines zufallsbedingt ausgewählten Satzes von Fragmenten und eine Identifizierung von AFLPs, die nach einer PCR-Amplifizierung starke Banden ergeben. Diese AFLP® können durch Sequenzieren charakterisiert werden, um Restriktionsfragment-spezifische Primer zu entwickeln. Typischerweise werden die AFLP® durch Herausschneiden der entsprechenden DNA-Bande aus dem Gel und Bestimmen der Nukleotidsequenzen an beiden Enden, um die Sequenz der ersten 5 bis 10 Nukleotide, die den Restriktionsendonukleasezielorten benachbart sind, zu ermitteln, isoliert. Sind diese Nukleotidsequenzen einmal bekannt, können Restriktionsfragment-spezifische Primer gestaltet werden, die nur ein einzelnes Restriktionsfragment aus einem Verdau genomischer DNA amplifizieren werden. In dieser besonderen Ausführungsform der Erfindung kann ein Satz von zwei unterschiedlichen selektiven Primern verwendet werden, um ein spezielles Restriktionsfragment nachzuweisen. In jedem der zwei selektiven Primer eines Satzes werden die selektiven Basen so gewählt, daß sie komplementär zu der Nukleotidsequenz angrenzend an den Restriktionsendonukleasezielort sind, wie dies in Fig. 8 veranschaulicht wird. Die Anzahl von selektiven Basen, die in jeden Primer aufzunehmen ist, hängt von der Komplexität der Restriktionsendonukleasefragmentmischung ab.
Die PCR-Technik hat sich über die letzten Jahre hinweg überwältigend entwickelt und wird schnell eine der am weitverbreitetsten verwendeten diagnostischen Methoden in der Gesundheitsfürsorge des Menschen. Ihre Anwendung umfaßt unter anderem den Nachweis von Infektionskrankheiten und den Nachweis von genetisch vererbten Krankheiten. Jeder diagnostische Test beruht auf der Verwendung von zwei spezifischen synthetischen Oligonukleotiden, die als Primer in der PCR-Reaktion verwendet werden, um ein oder mehrere DNA-Fragmente von speziellen Längen zu erhalten. Bei dem Krankheitsnachweis wird der Test die Anwesenheit von so wenig wie einem DNA-Molekül pro Probe, welches das charakteristische DNA-Fragment liefert, nachweisen. Im Falle von genetisch vererbten Krankheiten sind die Primer so gestaltet, daß ihre Produkte zwischen normalen und Krankheitsallelen unterscheiden können. Die Unterscheidung beruht entweder auf Sequenzunterschieden in dem DNA-Abschnitt in dem Genom, der komplementär zu dem Primer ist, oder auf Abstandsunterschieden zwischen den zwei Primern.
Da die Primer ein extrem hohes Ausmaß von Spezifität zeigen, ist es möglich, unterschiedliche Krankheiten gleichzeitig zu überwachen, ein Verfahren, das oftmals als Multiplex-PCR bezeichnet wird. Die Multiplex-PCR-Methode leidet jedoch unter der Einschränkung, daß im allgemeinen nur wenige, 5 bis 8, unterschiedliche Merkmale gleichzeitig überwacht werden können. Die wissenschaftliche Grundlage für diese Einschränkung liegt darin, daß die optimalen Bedingungen für eine PCR-Amplifizierung (Hybridisierungs/Annealingtemperatur, Mg+-Konzentration, Primerkonzentration) abhängig von dem verwendeten Paar von Primern beträchtlich variieren. Bei der Multiplex-PCR müssen einen Kompromiß darstellende Bedingungen ermittelt werden, unter welchen alle Primerpaare nachweisbare Produkte liefern. Zusätzlich wird dieses Phänomen überlagert durch das Phänomen starker Unterschiede in der Amplifizierungseffizienz von unterschiedlichen Fragmenten. Folglich wurde man oftmals mit dem Problem konfrontiert, daß Produkte von bestimmten Primerpaaren bei Multiplex-PCR- Reaktionen nicht nachweisbar sind.
Die Verfahren der Erfindung überwinden im wesentlichen diese Einschränkungen der Multiplex-PCR, da alle Primer, die in der Erfindung verwendet werden, einen substantiellen Teil ihrer Nukleotidsequenz gemein haben. Darüber hinaus wählen wir, indem wir AFLP® auswählen, DNA-Marker aus, die mit gleicher Effizienz amplifiziert werden. Folglich zeigen die Optima der PCR-Amplifizierungsbedingungen für die unterschiedlichen selektiven Primer viel weniger Variation, als diese bei herkömmlicherweise verwendeten Sequenz-spezifischen Primern beobachtet wird. Im wesentlichen ein idealer Kompromiß zwischen der Anzahl von Basen in dem synthetischen Oligonukleotid, die erforderlich ist, um die benötigte Spezifität zum Nachweisen eines einzelnen DNA-Fragments einer gegebenen Größe in einem komplexen Genom zu erhalten, die oben berechnet wird, und der Länge und Zusammensetzung des Oligonukleotids, das für eine effiziente PCR- Amplifizierung optimal ist. Das Verfahren der Erfindung stellt folglich ein weit überlegenes Verfahren für die Multiplex-PCR zur Verfügung.
Die Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren zum Isolieren von DNA-Markern aus einem beliebigen Genom und zur Verwendung von solchen DNA-Markern in allen möglichen Anwendungen eines DNA- Fingerprinting bereit.
Die folgenden Beispiele und Figuren veranschaulichen die Erfindung, die nichtsdestotrotz nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.

BEISPIELE

BEISPIEL 1: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPLIFIZIERUNG VON TOMATEN-DNA UNTER VERWENDUNG VON PSTI

A) Isolierung und Modifizierung der DNA
Tomaten-Gesamt-DNA (Lycopersicon esculentum c.v. Moneymaker) wurde aus jungen Blättern, wie von Bernatzski und Tanksley beschrieben (Theor. Appl. Genet. 72, 314-321), isoliert. Die typische Ausbeute war 50-100 ug DNA pro Gramm frischen Blattmaterials. Die DNA wurde einer Restriktion mit PstI (Pharmacia) unterworfen und doppelsträngige (ds) PstI-Adaptoren wurden an die Restriktionsfragmenteligiert, wobei der nachfolgend beschriebenen Vorgehensweise gefolgt wurde. Diese Adaptoren hatten die folgende Struktur:
5-CTCGTAGACTGCGTACATGCA- 3
3- CATCTGACGCATGT -5
Der 3'TGCA-Überhang in diesen Adaptoren bildet durch Annealing einen Doppelstrang mit den überhängenden Enden, die durch PstI erzeugt werden. Die PstI-Erkennungssequenz CTGCAG wird bei Ligation dieses Adaptors nicht wiederhergestellt, da der 5'-C-Rest durch A ersetzt wird. Die Ligationsreaktion wurde so gestaltet, daß das Endergebnis nahezu ausschließlich DNA-Fragment-an-Adaptor-Moleküle sind. Dies wurde erzielt durch: 1. Verwendung von nichtphosphorylierten Adaptoren, was eine Adaptor-an-Adaptor-Ligation ausschließt, 2. Ausführen der Ligation und der Restriktionsreaktion zur gleichen Zeit. Die letztgenannte Vorgehensweise führt zu einer Restriktion eines jeglichen Fragment-an-Fragment-Ligationsprodukts, wodurch diese Produkte nahezu vollständig eliminiert werden. Adaptor-an-Fragment-Ligationsprodukte können durch das Restriktionsenzym nicht geschnitten werden, da die PstI-Erkennungssequenz in diesen Produkte nicht wiederhergestellt ist. Die für die Adaptorligation verwendeten Reaktionsbedingungen waren:
2 ug Tomaten-DNA
0,2 ug Adaptoren
20 Einheiten PstI
1 Einheit T4-DNA-Ligase
10 mM Tris.HAc pH 7,5, 10 mM MgAc, 50 mM KAc,
2 mM Dithiotreitol, 0,5 mM ATP
Die Ligationsreaktion wurde in einem Reaktionsvolumen von 20 ul für 3 h bei 37ºC ausgeführt. Nach der Adaptorligation wurden nichtligierte Adaptoren durch selektive Fällung entfernt. Zu diesem Zweck wurde die Reaktionsmischung auf 100 ul erhöht und NH4Ac wurde bis zu einer Endkonzentration von 2,5 M zugesetzt. 100 ul Ethanol von -20ºC wurden zugesetzt und die Mischung 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation für 10 min bei 14000 Upm in einer gekühlten Eppendorf-Zentrifuge bei 4ºC gesammelt. Das DNA- Pellet wurde einmal mit 0,5 ml 70%-igem Ethanol bei Raumtemperatur gewaschen und in 40 ul TO. 1E (10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) gelöst. Die DNA wurde bei -20ºC gelagert. Das selektive Fällungsverfahren, das hier beschrieben wird, entfernt die nicht-ligierten Adaptoren effizient aus der Reaktionsmischung, aber es gehen auch kleine DNA-Fragmente (≤ 200 bp) verloren.
B) Die Amplifizierungsreaktion
Die oben hergestellte DNA wurde als Matrize für eine Amplifizierung der PstI-Fragmente verwendet. Die Reaktionsmischung für die PCR enthielt:
1 ng Matrizen-DNA
150 ng Primer
1 Einheit Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer)
200 uM aller 4 dNTPs
10 mM Tris.HCl, pH 8,5, 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl
H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 50 ul.
Die Reaktionsmischung wurde mit 20 ul leichtem Mineralöl bedeckt, um ein Verdampfen während der Amplifizierungsreaktion zu verhindern. Die PCR wurde an einem Perkin Elmer DNA Thermal Cycler unter Verwendung des folgenden Zyklusprofils ausgeführt: 1 min bei 94ºC, 1 min bei 60ºC, ein Temperaturanstieg von 60ºC auf 72ºC mit einer Geschwindigkeit von 1ºC/5 s und 2 ¹/&sub2; min bei 72ºC. Insgesamt wurden 33 Zyklen ausgeführt. Nach der Umsetzung wurden 20 ul Chloro form zugesetzt und 10 ul Beladungspuffer, in diesem Falle 50% Sucrose mit 0,1% (Gew./Vol.) des Farbstoffs Orange G (Merck). Dies wurde dann gut mit der Reaktionsmischung gemischt und kurz zentrifugiert, um die organische Phase (Mineralöl und Chloroform) von der Reaktionsmischung, ergänzt durch den Beladungsfarbstoff, abzutrennen. 20 ul dieser Reaktionsmischung wurden auf einem 1,0%-igen Agarosegel analysiert.
C) Amplifizierung von Tomaten-DNA mit Primern von ansteigender Selektivität
Tomaten-DNA, die einer Restriktion mit PstI unterworfen und mittels des PstI-Adaptors mit einem "Tag" versehen worden war, wurde unter Anwendung der oben angegebenen Bedingungen amplifiziert. Es wurden vier verschiedene Primer ausgewählt mit den Sequenzen:
1. 5-CTCGTAGACTGCGTACA- 3
2. 5-GACTGCGTACAtgcagA- 3
3. 5-GACTGCGTACAtgcagAC- 3
4. 5-GACTGCGTACAtgcagACC- 3
Primer 1 ist Teil des oberen Strangs des Adaptors, der zur Modifizierung der DNA verwendet wurde, und sollte dementsprechend alle PstI-Fragmente amplifizieren. Primer 2 enthält einen Teil der Adaptorsequenz, die PstI-Erkennungssequenz (kleine Buchstaben) und ein selektives Nukleotid (fett) und sollte theoretisch ungefähr einen Anteil von 1/16 aller PstI-Fragmente amplifizieren. Die Primer 3 und 4 sind ähnlich zu Primer 2, enthalten aber 2 bzw. 3 selektive Nukleotide und dementsprechend wird erwartet, daß sie ungefähr 1/256 und 1/4096 der PstI-Fragmente amplifizieren. Ein Teil der Reaktionsmischungen wurde auf einem 1,0%-igen Agarosegel, das in Fig. 11 gezeigt ist, analysiert. Die Bahnen 1 und 6 dieser Figur enthalten DNA-Marker, von denen die Größen links angegeben sind. Die Bahnen 2, 3, 4 und 5 enthalten die PCRs, die mit den Primern 1, 2, 3 bzw. 4 erhalten wurden. Die Ergebnisse zeigen, daß nur im Falle des Primers mit 3 selektiven Nukleotiden die Anzahl von amplifizierten Fragmenten so war, daß ein klares Bandenmuster erhalten wurde. Die anderen 3 Primer ergaben Bandenmuster, die auf Agarosegelen nicht aufgelöst werden konnten, da zu viele PCR-Produkte erzeugt worden waren. Innerhalb von diesen vielen PCR-Produkten dominieren stets einige Fragmente und werden als Banden auf einem Hintergrund-Schmier aus den anderen PCR-Produkten wahrgenommen. Wahrscheinlich liegen diese stärkeren Produkte in höheren Kopienzahlen auf dem Tomatengenom vor oder werden effizienter als die anderen Produkte amplifiziert. Es war erwartet worden, daß aufgrund der Gesamtanzahl von PstI- Fragmenten von genomischer Tomaten-DNA (20.000 bis 100.000) Primer mit 3 selektiven Nukleotiden verwendet werden mußten, um ein klares Bandenmustern auf Agarosegelen zu erzeugen.
D) Analyse von amplifizierten Fragmenten auf Southern-Blots Die amplifizierten Fragmente wurden auf Southern-Blots getestet, um zu verifizieren, daß diese Fragmente wahren Restriktionsfragmenten der gleichen Größe entsprachen. Zu diesem Zweck wurden vier individuelle Fragmente, die mit Primer 4 erhalten worden waren, aus dem Agarosegel ausgeschnitten. Aus diesen Gelausschnitten wurde die DNA mittels Adsorption an Glaskörnchen (Gene Clean, Hersteller Bio101) gereinigt und ein Teil der gereinigten DNA wurde reamplifiziert, um ungefähr 1 ug von jedem der vier DNA-Fragmente zu erhalten. Die Reamplifizierungsreaktionsmischungen wurden nachfolgend einer Elektrophorese auf einem präparativen 1,0%-igen Agarosegel unterworfen und die gewünschten DNA-Fragmente wurden gereinigt. 200 ng jedes Fragments wurden mit (α-32P)dATP unter Verwendung eines "Random Hexamer Labelling Kits" (Markierungskit mit Hexameren mit zufallsbedingter Sequenz) gemäß den Vorgehensweisen, die von dem Hersteller (Boehringer Mannheim) angegeben wurden, markiert. Tomaten- Gesamt-DNA wurde einer Restriktion mit PstI unterworfen und einer Elektrophorese auf einem 1,0%-igen Agarosegel unterzogen. Es wurden vier klar getrennte Bahnen, die jeweils ungefähr 3 ug einer Restriktion unterworfene DNA enthielten, verwendet. Als nächstes wurde das Agarosegel auf eine Genescreen+-Hybridisierungsmembran geblottet, wie von dem Hersteller (New England Nuclear) angegeben. Nach dem Blotten wurde das Gel in vier Stücke geschnitten, wobei jedes eine Bahn der Tomaten-DNA, die einer Restriktion mit PstI unterworfen worden war, enthielt. Diese vier Stücke wurden jeweils mit einer der vier DNA-Sonden hybridisiert, indem der Vorgehensweise, die von Klein-Lankhorst et al. (Theor. Apll. Genet. 81, 661-667) beschrieben worden ist, gefolgt wurde. Die hybridisierten Blots wurden 40 h einer Autoradiographie unter Verwendung von Kodak XAR5-Filmen unterzogen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß alle Fragmente genomi scher DNA, die von den vier DNA-Sonden erkannt wurden, die gleiche Länge wie diese Sonden hatten. Dies zeigte, daß die amplifizierten Fragmente, die als Sonden verwendet wurden, von den Fragmenten, die auf den Blots nachgewiesen wurden, stammten.
E) Selektive Amplifizierung eines einzelnen Restriktionsfragments
Es wurden drei Sätze von Primern für drei entsprechende zufallsbedingte PstI-Fragmente aus genomischer Tomaten-DNA, von denen die Sequenz unmittelbar benachbart zu der PstI-Erkennungssequenz bekannt war, gestaltet. Es wurden Sätze von Primern mit 5 selektiven Nukleotiden hergestellt, wie unten gezeigt:
Primersatz 1:
Sequenz 1:
Primersatz 2:
Sequenz 2:
Primersatz 3:
Sequenz 1:
Tomaten-DNA wurde mit PstI verdaut und Adaptoren wurden an die Enden der Restriktionsfragmente ligiert, wie oben beschrieben. Diese DNA wurde als Matrize in PCRs mit den Primersätzen 1 oder 2 oder 3 unter Einsatz der Bedingungen, wie sie in einem der vorangegangenen Abschnitte beschrieben worden sind, verwendet. Die Reaktionsprodukte jeder PCR wurden auf einem 1,0%-igen Agarosegel analysiert. Dieses Gel ist in Fig. 12 gezeigt. Fig. 12 zeigt 13 Bahnen, von denen die Bahnen 1, 2, 12 und 13 DNA-Marker sind. Die Größen dieser Marker in Kilobasen sind an beiden Seiten des Gels angegeben. Die Bahnen 3, 6 und 9 zeigen Plasmid-DNA, wobei jedes der drei PstI-Fragmente einer Restriktion mit PstI unterworfen worden ist, was das Vektorfragment, pUClB (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119), und das insertierte PstI-Fragment liefert. Die Bahnen 4 und 5 zeigen eine Amplifizierung von 5 fg der entsprechenden Plasmid-DNA bzw. von 1 ng genomischer Gesamt-DNA mit dem Primersatz 1. Die Bahnen 7 und 8 zeigen eine Amplifizierung von Plasmid-DNA und genomischer Gesamt-DNA mit dem Primersatz 2 und die Bahnen 10 und 11 zeigen eine Amplifizierung mit dem Primersatz 3. Diese Ergebnisse zeigen, daß es möglich ist, ein einzelnes PstI-Fragment aus einer Mischung von mindestens 20.000 Fragmenten heraus unter Verwendung der selektiven Restriktionsfragmentamplifizierungstechnik mit Primern, die 5 selektive Nukleotide aufweisen, zu amplifizieren.
F) Identifizierung von DNA-Polymorphismen unter Verwendung von SRFA
In den vorangegangenen Abschnitten wurde klar gezeigt, daß es mit der selektiven Restriktionsfragmentamplifizierungstechnik möglich ist, Restriktionsfragmente zu amplifizieren, entweder zufallsbedingt oder spezifische Fragmente, wenn Sequenzinformation verfügbar ist. Folglich sollte es möglich sein, nach Restriktionsstellenpolymorphismen zwischen zwei Individuen der gleichen Spezies zu suchen. Dies wird unten für zwei Tomaten-Linien, die sehr eng verwandt sind, sich aber hinsichtlich des Vorliegens des Wurzelknotennematoden- Resistenzgens, Mi, in einer der Linien unterscheiden, beschrieben. Dieses Mi-Gen stammt aus Lycopersicon peruvianum, einer Spezies, die entfernt mit der eßbaren Tomate L. esculentum verwandt ist. Es ist in die L. esculentum-Linie durch Kreuzung und nachfolgende zwölffache Rückkreuzung zu der L. esculentum-Elternpflanze und Selektierung der Nachkommenschaft hinsichtlich des Vorhandenseins des Mi-Gens eingeschleust worden. Dementsprechend unterscheiden sich die zwei Tomaten-Linien nur in einem kleinen Abschnitt ihres genetischen Materials, d. h. dem Mi-Gen und dem umgebenden Bereich. Es wurde unter Verwendung klassischer genetischer Methoden berechnet, daß der Mi- Bereich < 1% des Genoms dieser Linie bildet.
DNA wurde aus den zwei Tomaten-Linien (Linie 83M-71392, Miempfindlich, und Linie 83M-71398, Mi-resistent, erhalten von De Rui ter Seeds, Bleiswijk, Niederlande) isoliert und nachfolgend einer Restriktion mit PstI unterworfen und mit Adaptoren, wie oben beschrieben, versehen. Eine große Anzahl von Amplifizierungsreaktionen wurde ausgeführt unter Verwendung von Primern, die sich hinsichtlich ihrer Verlängerung aus selektiven Nukleotiden unterschieden. Es wurden drei selektive Nukleotide verwendet und abgesehen von einzelnen Primern wurden auch Kombinationen von zwei unterschliedlichen Primern verwendet. Die Reaktionsmischungen wurden auf gemischten Polyacrylamid/Agarose-Gelen analysiert: es wurden 2,5% Polyacrylamid und 1,0% Agarose verwendet bei einem Verhältnis von Acrylamid zu Bisacrylamid von 20 : 1. Gele wurden auf einer Protean IT Gel Unit (Biorad) unter Verwendung von Spacern von 1,5 mm einer Elektrophorese unterworfen. Insgesamt wurden 16 unterschiedliche Primer verwendet, was 16 Reaktionen mit einem einzelnen Primer und 120 Reaktionen mit allen möglichen Kombinationen von zwei Primern ergab. Ein typisches Beispiel eines Gels mit sechs dieser Kombinationen ist in Fig. 13 gezeigt. Die Bahnen 1 und 14 dieses Gels enthalten DNA- Marker, von denen die Größen in Kilobasen an der rechten Seite des Gels angegeben sind. Die Bahnen 2 und 3, 4 und 5, 6 und 7 u.s.w enthalten Amplifizierungen der zwei Tomaten-Linien mit einem speziellen Primer oder Primerpaar. Das Screening auf Restriktionsstellenpolymorphismen ergab eine Anzahl von Fragmenten, von denen drei sehr dominierend waren und die in den Bahnen 9, 11 und 12 von Fig. 13 gezeigt sind (angezeigt durch einen kleinen Kreis). Es wurde erwartet, daß die polymorphen Banden in den Bahnen 9 und 11 die gleichen waren, da der gleiche Primer bei beiden Reaktionen anwesend war (der Unterschied ist die Anwesenheit eines zweiten Primers in Bahn 11). Die zwei polymorphen Fragmente der Bahnen 11 und 12 wurden aus dem Gel ausgeschnitten, die Gelstücke wurden zerdrückt, indem man sie durch eine 18 Gauge-Nadel trieb und die DNA wurde aus den Gelstücken durch Elution über eine Diffusion in 200 ul 100 mM Tris. HCl, pH 8,0, 10mM EDTA, eluiert. 2 ul wurden für eine Reamplifizierung dieser Fragmente, wie oben beschrieben, verwendet. 200 ng jedes Fragments wurden unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen und nachfolgend an 100 ng Plasmidvektor pUC18 (Yanisch-Perron et al., Gene 33, 103-119), der einer Restriktion mit SmaI unterworfen worden war, ligiert. E. coli wurde mit der Ligationsmischung transformiert und für jedes Fragment wurde ein rekombinanter E. co li-Klon für eine Sequenzanalyse ausgewählt. Alle diese Manipulationen wurden unter Verwendung von Standardprozeduren, wie von Sambrook, Fritsch und Maniatis in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) beschrieben, ausgeführt.
Es wurden zwei Sätze von Primern mit 6 selektiven Nukleotiden basierend auf den Sequenzen der zwei Fragmente, wie oben beschrieben, synthetisiert. Wir waren in der Lage, jedes Fragment spezifisch unter Verwendung dieser Primersätze zu amplifizieren. Fragmente wurden nur aus der Tomaten-Linie, aus dar sie stammten, amplifiziert. Folglich wiesen diese Primersätze den gleichen Polymorphismus auf, der anfänglich mit den Primern mit 3 selektiven Nukleotiden, die verwendet worden waren, um diesen Polymorphismus aufzufinden, gefunden worden war.

BEISPIEL 2: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPLIFIZIERUNG VON TOMATEN-DNA MIT ZWEI RESTRIKTIONSENZYMEN

In Beispiel 1 wird das Prinzip einer selektiven Restriktionsfragmentamplifizierung (SRDA) unter Verwendung von Tomaten-DNA und dem Restriktionsenzym PstI exemplifiziert. In diesem Beispiel wird eine SRFA unter Verwendung zweier unterschiedlicher Restriktionsenzyme, PstI und MseI, veranschaulicht.
Isolierung und Modifizierung der DNA
Tomaten-Gesamt-DNA wurde aus jungen Blättern, wie in Beispiel 1 beschrieben, isoliert. Zwei Paare von sogenannten isogenen Linien, die als GemR und Gems bzw. GCR26 und GCR151 bezeichnet wurden, wurden als Quelle der DNA verwendet (Diese Linien sind in den folgenden Referenzen beschrieben: Denby und Williams, [1962], Can. J. Plant Sci. 42 681-685, Smith und Ritchie, [1983], Plant Mol. Biol. Rep. 1, 41- 45). Die zwei Individuen jedes Paars von isogenen Linien sind genetisch sehr ähnlich, unterscheiden sich aber hinsichtlich der Anwesenheit eines Merkmals, das eine Resistenz gegenüber dem pilzlichen Pathogen Verticillium albo-atratum verleiht.
Der erste Schritt der Modifizierung der DNAs umfaßte die Restriktion der DNAs mit den zwei Enzymen PstI und MseI. Die Restriktion der DNA und auch die nachfolgende Ligation der Adaptoren an die DNA-Fragmente wurden in demselben Puffer, der als RL-Puffer (Re striktions-Ligations-Puffer) bezeichnet wurde und der enthielt: 10 mM Tris.HAc/10 mM MgAc/50 mM KAc/5 mM DTT, pH 7,5, ausgeführt.
Restriktion der DNAs mit PstI und MseI
2,5 ug DNA
12,5 Einheiten PstI (Pharmacia, 10 Einheiten/ul)
12,5 Einheiten MseI (N. E. Biolabs, 4 Einheiten/ul)
5 ul 10 · RL-Puffer
H2O auf 50 ul.
Es wurde 1 h eine Inkubation bei 37ºC ausgeführt.
Der nächste Schritt bei der Modifizierung der DNAs war die Ligation von Adaptormolekülen an die Enden der DNA-Fragmente. Zuerst mußten passende doppelsträngige Adaptormoleküle hergestellt werden. Herstellung von Adaptoren
Für die Herstellung einer Lösung von 50 umol/ul dieses Adaptors wurden 8 ug (1430 umol) des 16-Mers 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 mit 7 ug (1430 umol) des 14-Mers 5-TACTCAGGACTCAT-3 in einem Gesamtvolumen von 28,6 ul H&sub2;O gemischt.
Für die Herstellung einer Lösung von 5 umol/ul dieses Adaptors wurden 5,25 ug (715 umol) des biotinylierten 21-Mers 5-bio- CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3 mit 3,5 ug (715 umol) des 14-Mers 5- TGTACGCAGTCTAC-3 in einem Gesamtvolumen von 143 ul H&sub2;O gemischt.

Ligation der Adaptormoleküle

Zu der einer Restriktion unterworfenen DNA wurde eine Mischung von 10 ul zugesetzt, die enthielt:
1 ul PstI-bio-Adaptor ( = 5 umol)
1 ul MseI-Adaptor ( = 50 umol)
1,2 ul 10 mM ATP
1 ul 10 · RL-Puffer
1 Einheit T4-DNA-Ligase (Pharmacia, 5 Einheiten/ul) H&sub2;O auf 10 ul.
Die resultierende Reaktionsmischung von 60 ul wurde 3 h bei 37ºC inkubiert.
Die Adaptoren waren so gestaltet, daß die Restriktionsstellen nach einer Ligation nicht wiederhergestellt wurden. Auf diese Weise wurde eine Fragment-an-Fragment-Ligation verhindert, da Fragment- Konkatamere geschnitten werden, da die Restriktionsenzyme während der Ligationsreaktion nach wie vor aktiv waren. Eine Adaptor-an- Adaptor-Ligation war nicht möglich, da die Adaptoren nicht phosphoryliert waren (siehe auch Beispiel 1)
Selektion von biotinylierten DNA-Fragmenten
Die Herstellung der Matrizen-DNAs für eine SRFA unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen umfaßt im allgemeinen einen zusätzlichen Schritt, der nicht verwendet wurde, wenn eine SRFA miteinem einzelnen Enzym verwendet wurde. In diesem Schritt wurden die DNA-Fragmente, an die ein biotinylierter Adaptor ligiert worden war, von allen anderen Fragmenten getrennt.
Biotinylierte Fragmente wurden in diesem Schritt von nichtbiotinylierten Fragmenten (Msel-Msel-Fragmenten) getrennt, indem sie an paramagnetische Streptavidin-Körnchen (paramagnetische Streptavidin-Beads) (Dynal) gebunden wurden. 10 ul Körnchen wurden einmal in 100 ul STEX (100 mM NaCl/10 mM Tris.HCl/l mM EDTA/ 0,1% Triton X- 100, pH 8,0) gewaschen und in 140 ul STEX resuspendiert. Die Körnchen wurden nachfolgend der Ligationsmischung zugesetzt, um ein Endvolumen von 200 ul zu ergeben. Dies wurde 30 min unter sanfter Bewegung bei Raumtemperatur inkubiert, um eine korrekte Bindung der biotinylierten DNA-Fragmente an die Körnchen sicherzustellen. Die Körnchen wurden gesammelt, indem man die Röhrchen, die die Körnchen enthielten, dicht an einen Magnet hielt. Dies hinderte die Körnchen daran, pipettiert zu werden, wenn der Überstand zu einem anderen Röhrchen transferiert wurde. Die Körnchen wurden einmal gewaschen und nachfolgend zu einem frischen Röhrchen transferiert. Dann wurden die Körnchen dreimal mit 200 ul STEX gewaschen. Schließlich wurden die Körnchen in 200 ul T01.E (10 mM Tris/0,1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert und zu einem frischen Röhrchen transferiert. Die DNA wurde bei 4ºC aufbewahrt.
Die mit den Restriktionsenzymen geschnittenen DNAs, die mit Adaptoren versehen, an die paramagnetischen Streptavidin-Körnchen angeheftet und von den MseI-MseI-Fragmenten gereinigt worden waren, hergestellt wie oben beschrieben, werden in den folgenden Schritten als Matrizen-DNAs bezeichnet.
Amplifizierung von PstI-MseI-Fragmenten
Die wie oben beschrieben hergestellten Matrizen-DNAs sollten alle PstI-Msel-Fragmente aus den erwähnten Tomaten-Linien und zusätzlich eine kleine Menge von PstI-PstI-Fragmenten ohne interne MseI-Fragmente enthalten. In diesem Experiment wurde eine Anzahl dieser PstI-MseI-Fragmente durch Amplifizierung, im wesentlichen, wie in Beispiel 1 beschrieben, sichtbar gemacht. Gelanalysen der Amplifizierungsprodukte wurden auf denaturierenden Acrylamidgelen (Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 560-564) ausgeführt, da die Art von Fragmenten, die durch die in diesem Beispiel beschriebene Vorgehensweise erhalten wurde, viel kleiner war als diejenigen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Zusätzlich erlaubten diese Typen von Gelen die Auftrennung von bis zu 100 Banden pro Bahn, was ungefähr zehnmal mehr war als die in Beispiel 1 beschriebenen Agarosegele. Die Fragmente wurden durch Markieren von einem der PCR-Primer am 5'-Ende mit (γ-³²P)ATP und Polynukleotidkinase sichtbar gemacht.
Markierung der PCR-Primer
Der für eine Markierung ausgewählte Primer war das 19-Mer 5- GATGAGTCCTGAGTAAgaa-3, das als MseI-Primer-1 bezeichnet wurde und in dem die selektiven Nukleotide mit kleinen Buchstaben angegeben sind. Die Markierung wurde auf die folgende Weise ausgeführt:
3,0 ul 18-Mer (aus einer Lösung von 50 ng/ul = 150 ng)
5,0 ul (γ-³²P)ATP (aus einer Lösung von 10 uCi/ul = 50 uCi)
3,0 ul 250 mM Tris.HCl/100 mM MgCl&sub2;/50 mM DTT, pH 7,5
0,5 ul T4-Kinase (Pharmacia, 10 Einheiten/ul) 18,5 ul H2O.
Dies ergab ein Gesamtvolumen von 30 ul, das bei 37ºC 30 min inkubiert wurde, Für jede PCR wurde 1 ul dieses 5'-markierten Primers zugesetzt.
Insgesamt wurden 28 PCRs ausgeführt, in denen jede von 4 Matrizen-DNAs mit 7 Primerkombinationen amplifiziert wurde. Jede Primerkombination enthielt den gleichen Msel-Primer (MseI-Primer-1, oben beschrieben), variierte aber in der Auswahl des PstI-Primers. Insgesamt wurden 7 unterschiedliche Primer ausgewählt (wie bei dem MseI- Primer sind die selektiven Nukleotide mit kleinen Buchstaben angegeben):
Alle PCR-Primer wurden in H&sub2;O zu einer Konzentration von 50 - ng/ul gelöst. Die Amplifizierungsreaktion
Alle Komponenten dieser Reaktion wurden zugesetzt und gut gemischt, ein essentieller Bestandteil der PCR, im allgemeinen das Enzym, wurde zuletzt zugesetzt. Nachfolgend wurde die Reaktion so bald wie möglich gestartet.
Die Amplifizierungen wurden an einem Perkin Elmer 9600 Thermal Cycler ausgeführt. Das Zyklusprofil war, wie folgt:
1 Zyklus: Denaturierung: 30s bei 94ºC
Hybridisierung/Annealing: 30s bei 65ºC
Verlängerung: 60 s bei 72ºC
11 Zyklen: Denaturierung: 30s bei 94ºC
Verringern der Hybridisierungs/Annealing-Temperatur in jedem Zyklus um 0,7ºC:
64,3ºC, 63,6ºC, 62,9ºC, 62,2ºC, 61,5ºC,
60,8ºC, 60,1ºC, 59,4ºC, 58,7ºC, 58,0ºC,
57,3 W. Inkubiere 30s bei jeder Temperatur.
Verlängerung: 60 s bei 72ºC.
23 Zyklen: Denaturierung: 30s bei 94ºC
Hybridisierung/Annealing: 30s bei 56ºC
Verlängerung: 60 s bei 72ºC.
Gelanalyse von amplifizierten Fragmenten
Die Reaktionsprodukte wurden auf denaturierenden 4,5%-igen Polyacrylamidgelen analysiert. 50 · 38 cm-Gele wurden verwendet, von denen die Gelkassetten zur Herstellung dieser Gele von Biorad erworben worden waren. Es wurden 100 ml Gellösung verwendet, die 4,5% (Gew./Vol.) Acrylamid/0,225% (Gew./Vol.) Bisacrylamid/7,5 M Harnstoff/50 mlM Tris/50 mlvi Borsäure/l mM EDTA, pH 8,3, enthielt. 100 ml Gellösung wurden mit 500 ul 10%-igem Ammoniumpersulfat und 100 ul TEMED unmittelbar vor dem Gießen des Gels gemischt. Ein Tris/Borsäure/EDTA-Puffer wurde als Elektrophoresepuffer verwendet und enthielt: 100 mM Tris/100 mM Borsäure/2 mlvi EDTA, pH 8,3. Die Reaktionsmischungen wurden mit einem gleichen Volumen (20 ul) 98% Formamid/ 10 mM EDTA/0,01% (Gew./Vol.) Bromphenolblau/0,01% (Gew./Vol.) Xylencyanol gemischt. Die resultierenden Mischungen wurden 3 min bei 95ºC erwärmt und dann schnell auf Eis gekühlt. 2 ul jeder Probe wurden auf das Gel aufgeladen. Gele wurden bei konstanter Leistung von 110 Watt einer Elektrophorese unterworfen, um eine konstante Wärmeentwicklung während der Elektrophorese zu erhalten. Unter diesen Bedingungen entsprach die Feldstärke der Gele 40 bis 50 Volt/cm.
Die Ergebnisse der SRFA-Reaktionen sind in Fig. 14 gezeigt.
Die Bahnen sind von 1 bis 28 numeriert und enthalten jedes Mal die vier Tomaten-Linien mit einer der 7 Primerkombinationen. Die Reihenfolge der Tomaten-Linien auf dem Gel ist: 1. GCR26, 2. GCR151, 3. GemR, 4. GemS. Die Bahnen 1 bis 4 enthalten diese DNAs, die mit MseI- Primer-1 und PstI-Primer-1 amplifiziert worden waren, die Bahnen 5 bis 8 enthalten diese DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-2 amplifiziert worden waren, die Bahnen 9 bis 12 enthalten diese DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-3 amplifiziert worden waren, die Bahnen 13 bis 16 enthalten diese DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-4 amplifiziert worden waren, die Bahnen 17 bis 20 enthalten diese DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-5 amplifiziert worden waren, die Bahnen 21 bis 24 enthalten diese DNAs, die mit MseI-Primer-1 und PstI-Primer-6 amplifiziert worden waren, und die Bahnen 25 bis 28 enthalten diese DNAs, die mit Msel-Primer-1 und PstI-Primer-7 amplifiziert worden waren. Das Gel enthält keine Größenmarker, aber die sichtbar gemachten DNA-Fragmente entsprechen ± 200 Nukleotiden am Boden der Figur bis ± 500 Nukleotiden an der Spitze.

BEISPIEL 3: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPLIFIZIERUNG VON DNA VON VERSCHIEDENEN LACTUCA-SPEZIES MIT ZWEI RESTRIKTIONSENZYMEN

In Beispiel 2 wird das Prinzip einer selektiven Restriktionsfragment (SRFA)-Amplifizierung unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen für Tomaten-DNA exemplifiziert. In diesem Beispiel werden wir veranschaulichen, daß ähnliche Ergebnisse erhalten werden, wenn DNAs von verschiedenen Lactuca-Spezies unter Verwendung der gleichen zwei Restriktionsenzyme PstI und MseI verwendet werden.
Isolierung und Modifizierung der DNA
DNAs wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von jungem Blattmaterial von verschiedenen Lactuca-Spezies isoliert. Wie unten angegeben, umfassen diese Pflanzen eine kommerziell erhältliche Salat (L. sativa) -Sorte und mehrere Individuen von zwei wilden Lactuca-Spezies, L. saligna und L. virosa. Den Pflanzen wurden willkürlich die folgenden Namen zugewiesen:
10. L. sativa, eine kommerziell erhältliche "Butterhead"-Sorte Das analysierte genetische Material repräsentierte so 6 unterschiedliche Pflanzentypen einschließlich zweier unterschiedlicher Individuen von 4 dieser Pflanzen.
Eine Modifizierung der Lactuca-DNAs, um die Matrizen für die SRFA zu erzeugen, wurde identisch zu der. in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise ausgeführt.
Amplifizierung von PstI-MseI-Fragmenten
Die wie oben beschrieben hergestellten DNAs wurden als Matrizen für SRFA-Reaktionen verwendet. Es wurden zwei Primerkombinationen verwendet, wobei ein einzelner MseI-Primer und zwei unterschiedliche PstI-Primer eingesetzt wurden. Diese Primer (selektive Nukleotide angegeben in kleinen Buchstaben) waren:
Eine Amplifizierung von PstI-MseI-Fragmenten unter Verwendung der oben angegebenen Primer wurden genau, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt und die erzeugten Fragmente wurden auf denaturierenden Polyacrylamidgelen, wie in Beispiel 2 beschrieben, sichtbar gemacht. Die erhaltenen Bandenmuster sind in Fig. 15 gezeigt. Die Bahnen 1 bis 10 zeigen DNAs 1 bis 10, die mit dem MseI-Primer in Kombination mit PstI-Primer-1 amplifiziert worden sind, die Bahnen 11 bis 20 zeigen DNAs 1 bis 10, die mit dem MseI-Primer in Kombination mit dem PstI-Primer-2 amplifiziert worden sind. Größenmarker (in dieser Figur nicht zu sehen) in Nukleotiden sind rechts vom Gel angegeben. Die Unterschiede in den Bandenmustern reflektieren die Unterschiede in der Verwandtschaft der verschiedenen Pflanzen.

BEISPIEL 4: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPLIFIZIERUNG VON MAISINZUCHTLINIEN MIT VERSCHIEDENEN RESTRIKTIONSENZYMKOMBINATIONEN

In Beispiel 2 und 3 ist das Prinzip einer selektiven Restriktionsfragment (SRFA)-Amplifizierung unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen unter Verwendung von Tomaten-DNA bzw. Salat (Lactuca- Spezies)-DNAs exemplifiziert. In diesem Beispiel wird veranschaulicht, daß ähnliche Ergebnisse mit Mais (Zea mais)-Linien erhalten werden. Zusätzlich wird veranschaulicht, daß verschiedene Restrikti onsenzymkombinationen verwendet werden können, um DNA-Fingerprints von in diesem Fall Mais-Linien zu erhalten.
Isolierung und Modifizierung der DNA
Es wurden zwei Maisinzuchtlinien, die als 1 und 2 bezeichnet wurden, verwendet. Die Herkunft dieser Linien ist irrelevant, da nach unserer Erfahrung eine jede ausgewählte Linie gute DNA- Fingerprints bei Verwendung von SRFA lieferte. DNA von diesen Linien wurde aus jungem Blattmaterial, wie von Saghai-Mahoofet al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81, 8014-8018) beschrieben, isoliert. Es wurden die folgenden Restriktionsenzymkombinationen (EKs) verwendet, um die Matrizen-DNAs herzustellen: PstI/TagI, EcoRI/TagI, AseI/TagI, Sse8387-I/TagI. Alle Enzyme wurden von Pharmacia erworben mit Ausnahme von AseI, das von New England Biolabs erworben wurde, und Sse8387-I, das von Amersham erworben wurde. Matrizen-DNAs wurden im wesentlichen, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, hergestellt mit den folgenden Ausnahmen:
Eine Restriktion der DNA wurde ausgeführt, indem zuerst eine Stunde mit TagI bei 65ºC inkubiert wurde und danach mit dem zweiten Enzym, PstI, AseI, EcoRI oder Sse8387-I, für eine weitere Stunde bei 37ºC inkubiert wurde. Eine Ligation von Adaptoren erfolgte, wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung der folgenden Adaptoren:
Amplifizierung von Restriktionsfragmenten
Eine Amplifizierung von Restriktionsfragmenten wurde ausgeführt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Primer, die zum Markieren der Amplifizierungsprodukte ausgewählt wurden, waren die folgenden TagI-Primer, die 3 selektive Nukleotide (angegeben durch kleine Buchstaben) aufwiesen:
Diese vier Primer wurden für einen Nachweis von Amplifizierungsprodukten mit allen vier Enzymkombinationen verwendet. Für jede Enzymkombination wurden 4 Primer für das andere Enzym ausgewählt, was eine Gesamtzahl von 16 Kombinationen für jedes Enzym ergab. Diese Primer sind unten angegeben (selektive Nukleotide angegeben in kleinen Buchstaben). Für EcoRI und AseI wurden Primer mit 3 selektiven Nukleotiden ausgewählt, für PstI wurden Primer mit 2 selektiven Nukleotiden gewählt und für SseI wurden Primer mit einem einzelnen ausgewählten (selektiven) Nukleotid gewählt. Für Enzyme, die weniger häufig in der genomischen Mais-DNA schnitten, wurden Primer ausgewählt, die Verlängerungen mit weniger selektiven Nukleotiden enthielten.
Insgesamt wurden 128 PCRs ausgeführt (2 · DNAs · 4 Enzymkombinationen · 16 Primerkombinationen), indem dem in Beispiel 2 beschriebenen Protokoll gefolgt wurde. Die Reaktionsprodukte dieser PCRs wurden auf 3 Gelen (die 48 Bahnen/Gel enthielten), wie in Beispiel 2 beschrieben, analysiert. Alle Primerkombinationen lieferten DNA-Fingerprints von 50 bis 100 Banden pro Bahn mit Ausnahme der Kombination SseI/TagI, die nur 10 bis 15 Banden pro Bahn lieferte. Ein Beispiel von einem der Gele ist in Fig. 16 gezeigt. Diese Figur zeigt einen Teil des Gels mit der Analyse von DNA-Fingerprints, die mit den Enzymkombinationen PstI/TagI und EcoRI/Tacrl erhalten worden sind. Die Bahnen 1 bis 8 zeigen DNA-Fingerprints der zwei Mais-DNAs, erhalten durch SRFA mit TagI-Primer-3 und den PstI-Primern-1, -2, -3 bzw. -4, die Bahnen 9 bis 16 zeigen DNA-Fingerprints der zwei Mais- DNAs, erhalten durch SRFA mit Tacrl-Primer-4 und den PstI-Primern-1, - 2, -3 bzw. -4, die Bahn 17 zeigt den Größenmarker lambda-DNA, geschnitten mit PstI, von dem die Größen von einigen der Fragmente in Nukleotiden rechts angegeben sind, und die Bahnen 18 bis 25 zeigen DNA-Fingerprints der zwei Mais-DNAs, erhalten durch SRFA mit TagI- Primer-1 und den EcoRI-Primern-1, -2, -3 bzw. -4.

BEISPIEL 5: SELEKTIVES RESTRIKTIONSFRAGMENT VON BAKTERIELLEN DNAs

In Beispiel 2, 3 und 4 wird das Prinzip einer selektiven Restriktionsfragment (SRFA)-Amplifizierung unter Verwendung von zwei Restriktionsenzymen für Tomaten-, Salat (Lactuca-Spezies)- bzw. Mais-DNAs exemplifiziert. In diesen Beispiel wird veranschaulicht, daß diese Technik auch verwendet werden kann, um bakterielle DNAs zu charakterisieren. Eine Anzahl von Xanthomonas campestris-Stämmen wurde vom Laboratory of Microbiology in Gent, Belgien, erhalten, um die Anwendbarkeit der Technik in Bakterien zu veranschaulichen.
Isolierung und Modifizierung der DNA
Alle DNAs wurden aus Xanthomonas campestris-Stämmen, die aus verschiedenen Quellen, hauptsächlich aus infizierten Pflanzen, isoliert worden waren, hergestellt. Diese Stämme, numeriert von 1 bis 26, sind nachfolgend aufgelistet und können von dem Laboratory of Microbiology in Gent, Belgien, erhalten werden.
DNA von diesen Bakterienstämmen wurde isoliert, wie von Marmur (J. Mol. Biol. 3, 208-218) beschrieben. Die DNAs wurden im wesentlichen, wie in Beispiel 4 beschrieben, einer Restriktion unterworfen mit der Ausnahme, daß TagI und ApaI als Restriktionsenzyme gewählt wurden. Eine Ligation von Adaptoren erfolgte, wie in Beispiel 4 beschrieben, unter Verwendung der folgenden Adaptoren:
Eine Amplifizierung von Restriktionsfragmenten wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, ausgeführt. Die für eine SRFA ausgewählten Primer waren der TagI-Primer 5-CGATGAGTCCTGACCGAg-3 (der ein selektives Nukleotid, angegeben in kleinem Buchstaben, aufweist) und der Apal-Primer 5-GACTGCGTACAGGCCCg-3 (der ein selektives Nukleotid, angegeben in kleinem Buchstaben, aufweist). Der Anal-Primer wurde an dem 5'-Ende für einen Nachweis der amplifizierten Fragmente, wie in Beispiel 2 beschrieben, markiert.
Jede der 26 DNAs wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Primersatzes amplifiziert. Amplifizierungsbedingungen waren, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die letzten 9 Zyklen der PCR ausgelassen wurden aufgrund der geringeren Komplexität der DNAs verglichen mit der Pflanzen-DNA in den Beispielen 2, 3 und 4. Die mit den bakteriellen DNAs wie in diesem Beispiel beschrieben erhaltenen DNA-Fingerprints sind in Fig. 17 gezeigt. Die Bahnen 1 bis 26 repräsentieren bakterielle DNAs 1 bis 26. Die Größen von Marker-DNAs (auf dem Gel nicht zu sehen) in Nukleotiden sind rechts von dem Gel angegeben. Diese Figuren zeigen klar, daß die Verwandtschaft der Bakterienstämme durch die Ähnlichkeit der Bandenmuster reflektiert wird.

BEISPIEL 6: SELEKTIVE RESTRIKTIONSFRAGMENTAMPLIFIZIERUNGEN VON DNA VON VERSCHIEDENEN TIEREN MIT ZWEI RESTRIKTIONSENZYMEN

In den vorigen Beispielen wurde eine selektive Restriktionsfragmentamplifizierung (SRFA) für Pflanzen-DNA aus verschiedenen Quellen exemplifiziert. Hier veranschaulichen wir die Wirksamkeit der Vorgehensweise unter Verwendung von zufallsbedingten DNA-Proben, die aus verschiedenen Haustieren erhalten wurden. Die untersuchten Tierspezies sind: Gallus domesticus (Huhn); Susscrofa domestica L. (Schwein); Bos taurus (Kuh); Eauus caballus (Pferd). Die verwendeten Restriktionsenzyme sind Sse83871 und MseI.
Isolierung und Modifizierung der DNA
DNAs wurden aus Blutproben isoliert, indem Vorgehensweisen, die von Maniatis et al. (1982) beschrieben worden sind, gefolgt wurde. DNA-Proben 1 bis 3 (Huhn), 4 bis 7 (Schwein), 8 bis 11 (Kuh) und 12 bis 15 (Pferd) wurden durch die Restriktionsenzyme Sse83871 und Msel verdaut. Die DNA-Fragmente wurden an Adaptoren, wie in Beispiel 2 beschrieben, ligiert. Da die Restriktionsenzyme Sse83871 und PstI kompatible 3'-Überhänge erzeugen, konnten wir die in Beispiel 2 beschriebenen PstI- und MseI-Adaptoren verwenden.
Amplifizierung von Restriktionsfragmenten
Oben benannte und wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellte Matrizen-DNAs dienten als Matrizen in SRFA-Reaktionen. Die verwendeten Primerkombinationen bestanden aus einem einzelnen MseI-Primer und unterschiedlichen SseI-Primern:
Eine Amplifizierung von Sse83871-MseI-Fragmenten unter Verwendung der oben beschriebenen Primerpaare wurde ausgeführt, indem das in Beispiel 2 beschriebene Protokoll verwendet wurde. Reaktionsprodukte wurden einer Elektrophorese auf denaturierenden Polyacrylamidgelen, die ebenfalls in Beispiel 2 beschrieben wurden, unterworfen. Ein Autoradiogramm, das Fingerprints der obigen Proben zeigt, ist in Fig. 18 gezeigt. Die Bahnen 1 bis 15 zeigen Fingerprints von DNAs 1 bis 15, die mit dem MseI-Primer gepaart mit Sse83871-Primer-1 amplifiziert wurden, die Bahnen 16 bis 30 zeigen ähnliche Muster, die mit dem MseI-Primer kombiniert mit dem Sse83871-Primer-2 erhalten wurden. Unterschiede in den Fingerprints zwischen Tieren einer Spezies reflektieren Heterogenität in Tierpopulationen; Gesamtmuster sind für eine spezielle Spezies charakteristisch.
In einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontrollierten Amplifizierung von mindestens einem Teil einer Ausgangs-DNA, die eine Mehrzahl von Restriktionsstellen für eine bestimmte spezifische Restriktionsendonuklease enthält und von der zumindest ein Teil von deren Nukleinsäuresequenz unbekannt ist, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) die Ausgangs-DNA mit der spezifischen Restriktionsendonuklease zu verdauen, um sie in die entsprechende Serie von Restriktionsfragmenten, die jeweils 5'-Enden und 3'-Enden umfassen, zu fragmentieren;
(b) sofern die nachfolgend definierten 5'- und 3'-Adaptoren nicht bereits in separaten Formen vorliegen, mit der spezifischen Endonuklease auch einen festgelegten doppelsträngigen Oligonukleotid-Linker zu verdauen, der selbst innerhalb seiner eigenen Nukleotidsequenz eine einzelne Stelle für die spezifische Endonuklease aufweist, um dadurch den Linker in solche 5'- bzw. 3'- Adaptoren zu spalten;
(c) die aus der Ausgangs-DNA erhaltenen Restriktionsfragmente an ihren 5'- und 3'-Enden mit den erwähnten 3'- bzw. 5'-Adaptoren zu ligieren, um dadurch mit einem "Tag" versehene Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA zu erzeugen, welche Fragmente dann an ihren jeweiligen 5'- und 3'-Enden "Tags" umfassen, deren Nukleotidsequenzen dann jene der 3'- und 5'-Adaptoren einschließlich der Nukleotide, die an der speziellen Restriktionsstelle beteiligt sind, umfassen;
(d) sofern, wo passend, um geeignete Matrizen für Primer bereitzustellen, die 5'- und 3'-Adaptoren vor der vorangehenden Ligation nicht verlängert worden sind, indem hierzu Oligonukleotidabschnitte mit festgelegten konstanten Sequenzen an deren jeweiligen 5'- und 3'-Enden hinzugefügt worden sind, die entsprechenden entsprechenden Enden der mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente mit den genannten Oligonukleotidabschnitten, wo für den gleichen Zweck geeignet, zu verlängern, wodurch mit einem "Tag" versehene Restriktionsfragmente, die an beiden Enden mit den genannten konstanten Sequenzen verlängert worden sind, erhalten werden;
(e) die mit einem "Tag" versehenen oder, wenn passend, verlängerten Restriktionsfragmente unter Hybridisierungsbedingungen mit zwei Oligonukleotidprimern in Berührung zu bringen;
(f) wobei die Primer Sequenzen umfassen, die die gleiche Nukleotidsequenz aufweisen wie die terminalen Teile der Stränge der 5'- und 3'-Enden der mit einem "Tag" versehenen oder, wenn passend, verlängerten Restriktionsfragmente, die ihrerseits komplementär sind zu den Strängen, die als Matrizen für die Primer wirken, wobei die Primer jeweils die Nukleotide, die komplementär zu jenen, die an der Bildung der Zielstelle für die bestimmte spezifische Restriktionsendonuklease in dem Matrizenstrang beteiligt sind, sind, umfassen;
(g) die mit den Primern hybridisierten, verlängerten Restriktionsfragmente durch PCR oder ähnliche Techniken in Gegenwart der benötigten Nukleotide und Polymerase zu amplifizieren, um eine weitere Verlängerung der hybridisierten Primer entlang jenen Restriktionsfragmenten der Ausgangs-DNA, an die die Primer anfänglich über ihre gesamte Länge hybridisierten, zu bewirken, und
(h) die zuletzt erwähnten Restriktionsfragmente zu identifizieren oder zu gewinnen.
In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens entspricht das terminale Nukleotid von mindestens einem der Primer in der Richtung der angestrebten Verlängerung dem letzten der Nukleotide, die an der Restriktionsstelle für die spezifische Endonuklease beteiligt sind, und wobei das Verfahren umfaßt, die Restriktionsfragmente der Ausgangs-DNA, die amplifiziert worden sind, zu identifizieren oder zu gewinnen.
In einer anderen besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens umfaßt mindestens einer der Primer eine ausgewählte Sequenz, die eine bestimmte Anzahl (ein oder mehrere Nukleotide) umfaßt, die sich über das letzte der Nukleotide, die an der Restriktionsstelle für die spezifische Endonuklease beteiligt sind, in der Richtung von dessen eigener Verlängerung innerhalb der entsprechenden Restriktionsfragmente während des Amplifizierungsschritts hinaus erstreckt. In einer speziellen Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens enthält ein doppelsträngiger DNA-Linker mehrere Stellen für unterschiedliche spezifische Endonukleasen, die sich allesamt voneinander unterscheiden, welche Verfahren umfassen, an einer gleichen Ausgangs-DNA die Schritte des oben mit einer dieser Restriktionsendonukleasen definierten Verfahrens mit noch einer anderen dieser unterschiedlichen spezifischen Endonukleasen und bei einer Verwendung von Primern, deren Nukleotidsequenzen, wie in der obigen Beschreibung definiert, allerdings in Hinblick auf diese andere spezifische Endonuklease ausgewählt werden, zu wiederholen.
Das oben beschriebene Verfahren oder von dem Oligonukleotid der Erfindung ist geeignet für die Identifizierung von Polymorphismen in bestimmten DNAs, die aus der gleichen lebenden Spezies stammen, z. B. genomischen DNAs einer Mikrobe, einer Pflanze oder eines Tiers, einschließlich von Menschen, oder von Fragmenten davon, entweder untereinander oder bezogen auf einen entsprechend bestimmten DNA- Standard, welche Verwendung umfaßt, die in Untersuchung befindlichen DNAs dem Verfahren oder dem Kontakt des Oligonukleotids unter Bedingungen, die eine Amplifizierungs- oder Verlängerungsreaktion erlauben, zu unterwerfen, die ausgehend von jeder der DNAs und gegebenenfalls von der Standard-DNA erhaltenen Restriktionsmuster zu vergleichen und die Existenz und, wo passend, die Lage von jenem DNA- Polymorphismus mit den Unterschieden, die zwischen den Größen der Restriktionsfragmente der unterschiedlichen DNAs beobachtet werden, in Beziehung zu bringen.
Die Erfindung betrifft auch eine fragmentierte DNA, deren unterschiedliche Fragmente Sequenzen aufweisen, die allesamt anfänglichen Verdauen der unfragmentierten Ausgangs-DNA, aus der sie mit einer gleichen festgelegten spezifischen Endonuklease erzeugt werden, entsprechen, dadurch gekennzeichnet, daß alle dieser Fragmente an ihren 5'- bzw. 3'-Enden mittels bestimmter 3'- oder 5'-Adaptoren, die dem durch Spaltung erzeugten Teil eines gleichen Ausgangs-DNA- Linkers, det anfänglich eine einzelne Restriktionsstelle für die spezifische Endonuklease umfaßte, entsprechen, mit einem "Tag" versehen und gegebenenfalls durch bestimmte konstante Sequenzen verlängert wurden. Die fragmentierte DNA kann in Form eines Musters von Migrationsbanden auf einem geeigneten Träger, z. B. Gelträger, in dem man deren Fragmente anfänglich unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes hatte wandern lassen, vorliegen.
Die fragmentierte DNA kann auch Endabschnitte umfassen, die Oligonukleotide umfassen, die durch die folgende Zusammensetzung beginnend von dem 5'-Ende gekennzeichnet sind:
(i) eine Nukleotidsequenz (konstante Sequenz) von mindestens 10 Basen, aber nicht länger als 30 Basen, die komplementär zu einer bestimmten DNA-Sequenz, die als Adaptor verwendet wird, ist, unmittelbar gefolgt von:
(ii) einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem Zielort einer spezifischen Restriktionsendonuklease, die in Schritt (a) verwendet wird, ist, insoweit, als jene Nukleotidsequenz oder ein Teil davon nicht in (ii) enthalten ist, gefolgt von:
(iii) einer Nukleotidsequenz von mindestens einem ausgewählten Nukleotid, aber kürzer als 10 ausgewählte Nukleotide, die z. B. 1 bis 5 Nukleotide lang ist.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit für die Fragmentierung von bestimmten DNAs durch mindestens eine spezifische Restriktionsendonuklease in Fragmente und eine Analyse dieser Fragmente, welcher umfaßt:
- die spezifische Restriktionsendonuklease;
- einen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid-Linker, der selbst eine einzelne Stelle für die spezifische Endonuklease innerhalb von seiner eigenen Nukleotidsequenz umfaßt, um dadurch den Linker in entsprechende 5'- bzw. 3'-Adaptoren zu spalten, wobei der doppelsträngige DNA-Linker eine ausreichende Größe hatte, um 5'- und 3'-Teile bereitzustellen, die nachfolgend Matrizen für die PCR-Primer dieses Kits bereitstellen können;
- PCR-Primer, die jeweils einerseits die gleichen Sequenzen wie die Stränge der 5'- bzw. 3'-Adaptoren komplementär zu den Strängen, die nachfolgend als Matrizen für die Primer wirken, umfassen, wobei die Primer ferner die Nukleotide, die komplementär zu jenen, die an der Bildung der Stelle für die bestimmte spezifische Restriktionsendonuklease in den Matrizensträngen beteiligt sind, sind, umfassen;
- sofern passend, Oligonukleotidabschnitte von bestimmten (konstanten) Sequenzen zum Erzeugen von Stellen von ausreichender Länge für eine Hybridisierung mit den Primern für die Verlängerung der 5'-Enden der 5'-Adaptoren oder der 3'-Enden der 3'- Adaptoren oder von beiden vor einem Verdau der Linker durch die spezifische Restriktionsendonuklease, um die 5'- bzw. 3'- Adaptoren zu erzeugen, oder alternativ für die Verlängerung der mit einem "Tag" versehenen Fragmente, die nachfolgend an die Ligation der 5'- und 3'-Adaptoren an die Enden der Fragmente der Ausgangs-DNA erhalten werden;
gegebenenfalls einen fragmentierten DNA-Standard entsprechend der bestimmten DNA, die Gegenstand einer Fragmentierungsstudie ist, wobei die Fragmente des DNA-Standards durch Verdauen von diesem mit der spezifischen Endonuklease erhalten wurden.
Eine besondere Ausführungsform dieses Kits ist so, daß die Oligonukleotidabschnitte für die Verlängerung von beiden der 5'- und 3'-Adaptoren oder von beiden der 5'- und 3'-Enden der mit einem "Tag" versehenen DNA-Fragmente identische Nukleotidsequenzen aufweisen.
In einer anderen Ausführungsform enthält der Linker des Kits mehrere jeweilige einmalig vorkommende Stellen für spezifische Endonukleasen, die sich alle voneinander unterscheiden, wobei der Kit ferner Primer entsprechend jedem der 3'- und 5'-Adaptoren, die jeweils durch Spaltung des genannten Linkers mit den unterschiedlichen spezifischen Endonukleasen gebildet werden, umfaßt, wobei die Primer jeweils wie in Anspruch 8 definiert sind hinsichtlich der 3'- und 5'-Adaptoren, die in dem Linker durch Spaltung von diesem durch jede der spezifischen Endonukleasen erzeugt werden.
Auch kann in einer besonderen Ausführungsform der Kit fragmentierte DNA-Standards, wie oben definiert, in Hinblick auf die entsprechenden spezifischen Restriktionsendonukleasen enthalten, wobei jeder der fragmentierten DNA-Standards in Hinblick auf jedes der bestimmten spezifischen Restriktionsenzyme vorhanden ist.

Claims

1. Verfahren zur Amplifizierung von mindestens einem Restriktionsfragment, erhalten von einer Ausgangs-DNA, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) die Ausgangs-DNA mit mindestens einer Restriktionsendonuklease zu verdauen, um sie in Restriktionsfragmente zu fragmentieren,

(b) die erhaltenen Restriktionsfragmente mit mindestens einem doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotid-Adaptor, der ein Ende aufweist, das kompatibel ist, mit einem oder beiden der Enden der Restriktionsfragmente ligiert zu werden, zu ligieren, um dadurch mit einem "Tag" versehene Restriktionsfragmente zu erzeugen,

(c) die mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente unter Hybridisierungsbedingungen mit mindestens einem Oligonukleotidprimer in Berührung zu bringen, wobei der oder die Primer eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine Basenpaarung mit einem Teil der Zielsequenz der Restriktionsendonuklease, die in den mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten vorliegt, ausbildet und eine Basenpaarung mit einem Teil der Adaptorsequenz ausbildet, und wobei mindestens einer der Primer an seinem 3'-Ende eine ausgewählte, mindestens ein Nukleotid umfassende Sequenz, die sich unmittelbar benachbart zu den an der Bildung der Zielsequenz beteiligten Nukleotiden befindet, umfaßt;

(d) die mit dem Primer oder den Primern hybridisierten, mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente in Gegenwart der erforderlichen Nukleotide und von DNA-Polymerase zu amplifizieren oder die hybridisierten Primer entlang je nen mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmenten zu verlängern und

(e) amplifizierte oder verlängerte DNA-Fragmente, die in Schritt (d) erzeugt worden sind, zu identifizieren oder zu gewinnen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) der oder die Primer Sequenzen mit der gleichen Nukleotidsequenz wie die terminalen Teile der Stränge an den Enden der mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente einschließlich der Nukleotide, die an der Bildung der Zielsequenz für die Restriktionsendonuklease beteiligt sind, und einschließlich mindestens eines Teils der in den ligierten Adaptoren vorliegenden Nukleotiden umfassen, wobei mindestens einer der Primer an seinem 3'-Ende eine ausgewählte, mindestens ein Nukleotid umfassende Sequenz, die sich unmittelbar benachbart zu den an der Bildung der Zielsequenz für die Restriktionsendonuklease beteiligten Nukleotiden befindet, umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in Schritt (c) der oder die Primer mit einer konstanten DNA-Sequenz, gebildet aus einem Teil der Zielsequenz der Restriktionsendonuklease und der Sequenz des Adaptors, eine perfekte Basenpaarung ausbilden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens ein Primer eine ausgewählte Sequenz von 1 bis 10 Nukleotid(en) umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Primer 10 bis 50 Nukleotide umfassen und wobei die Zielsequenz der Restriktionsendonuklease 4 bis 8 Nukleotide umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleotidsequenz der Primer, die eine Basenpaarung mit dem Adaptor ausbildet, 10 bis 30 Nukleotide umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Adaptoren so gestaltet sind, daß die entsprechende Zielsequenz der Endonuklease nicht wiederhergestellt wird, wenn der Adaptor mit dem oder den mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragment(en) hybridisiert und wobei der oder die Primer Oligonukleotide sind, die eine konstante Sequenz umfassen, die eine perfekte Basenpaarung mit mindestens einem Ende der Sequenz von mindestens einem mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragment aus einer Mischung ausbildet, welche konstante Sequenz Nukleotide umfaßt, die eine Basenpaarung zu einem Teil der Zielsequenz für die Restriktionsendonuklease ausbilden, und mindestens einer der Primer angrenzend an das 3'-Ende der an der Bildung der Zielsequenz beteiligten Nukleotide 1 bis 10 zusätzliche ausgewählte Nukleotide umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Nukleinsäuresequenz der Ausgangs-DNA mindestens teilweise unbekannt ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zwei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen verwendet werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei alle Primer die gleiche konstante Nukleotidsequenz aufweisen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei eine Mischung unterschiedlicher Primer verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei mindestens ein Primer 1, 2 oder 3 ausgewählte Nukleotide an ihrem 3'-Ende enthält.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei zwei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen in Schritt (a) verwendet werden und wobei mindestens ein doppelsträngiger synthetischer Oligonukleotidadaptor für eine der Endonukleasen biotinyliert ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei mindestens ein Primer markiert ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Anzahl von selektiven Nukleotiden so ausgewählt wird, daß die Anzahl von Restriktionsfragmenten, die amplifiziert werden, auf 5 bis 200 begrenzt ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines Satzes von amplifizierten Restriktionsfragmenten, umfassend:

a) eine Untergruppe von Restriktionsfragmenten aus einer Mischung von erzeugten Restriktionsfragmenten, erhalten von einer Ausgangs-DNA unter Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, zu amplifizieren,

b) die amplifizierten, mit einem "Tag" versehenen Restriktionsfragmente aufzutrennen,

c) die amplifizierten Restriktionsfragmente zu identifizieren.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die zu amplifizierende Ausgangs-DNA genomische DNA aus einer menschlichen oder tierischen biologischen Probe, speziell einem Gewebe oder einer Blutprobe, ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die zu amplifizierende Ausgangs-DNA genomische DNA aus einer Pflanze oder einem Pflanzengewebe ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die zu amplifizierende Ausgangs-DNA DNA eines Mikroorganismus ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Identifizierung von Polymorphismen zwischen verschiedenen Ausgangs-DNAs, die von der gleichen lebenden Spezies stammen, welches umfaßt, Unterschiede, die zwischen den amplifizierten Restriktionsfragmenten der verschiedenen Ausgangs- DNAs beobachtet werden, zu identifizieren.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Identifizierung von Polymorphismen in genomischen DNAs eines Mikroorganismus, einer Pflanze oder eines Tiers, einschließlich eines Menschen, oder von Fragmenten davon entweder untereinander oder in Bezug auf einen entsprechend bestimmten DNA-Standard.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zum Identifizieren von mit genetisch vererbten Merkmalen bei Menschen assoziierten DNA-Polymorphismen, mit genetisch vererbten Merkmalen bei Tieren assoziierten DNA-Polymorphismen oder zum Identifizieren von mit genetisch vererbten Merkmalen bei Pflanzen assoziierten Polymorphismen und zum Identifizieren von DNA-Markern basierend auf solchen DNA-Polymorphismen.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, welches ferner umfaßt, zwei oder mehr amplifizierte oder verlängerte DNA-Fragmente, die in Schritt (e) des Verfahren identifi ziert oder gewonnen wurden, zum Nachweisen von Ähnlichkeiten zwischen Pflanzensorten oder Tierarten, -Spezies, - Kultivaren, Mikroorganismen oder zum Auswerten von genetischen Abständen und Charakterisieren solcher Pflanzensorten oder Tierarten, -Spezies, -Kultivare, Mikroorganismen.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die amplifizierten oder verlängerten DNA-Fragmente wie erzeugt in Schritt (e) als DNA-Fingerprints identifiziert oder gewonnen werden.

25. Verfahren zur Identifizierung von DNA-Markern, die mit einem genetischen Merkmal assoziiert sind, wobei das Verfahren umfaßt, Polymorphismen zwischen Ausgangs-DNAs, die von der gleichen lebenden Spezies stammen und Unterschiede in diesem genetischen Merkmal aufweisen, gemäß Anspruch 23 zu identifizieren und diese Polymorphismen mit dem von diesem genetischen Merkmal bewirkten Phänotyp zu korrelieren.

26. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 15, umfassend ferner die Schritte:

(f) mindestens ein in Schritt (e) identifiziertes oder gewonnenes DNA-Fragment zu isolieren,

(g) die Nukleotidsequenz der ersten 8 bis 10 Nukleotidreste, die im Inneren an die Zielsequenz der Restriktionsendonuklease an beiden Enden der DNA-Fragmente angrenzen, zu bestimmen,

(h) Oligonukleotidprimer, die eine Nukleotidsequenz gemäß den Primern von Schritt (c) von Anspruch 1 aufweisen, zu gestalten, wobei die ausgewählte Nukleotidsequenz 5 bis 10 Nukleotidreste umfaßt, die den ersten 8 bis 12 Nukleotidresten, die im Inneren an die Restriktionsstellen an beiden Enden des DNA-Fragments angrenzen, entsprechen.