Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

DE10013847A1 - Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA - Google Patents

Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA

Info

Publication number
DE10013847A1
DE10013847A1 DE10013847A DE10013847A DE10013847A1 DE 10013847 A1 DE10013847 A1 DE 10013847A1 DE 10013847 A DE10013847 A DE 10013847A DE 10013847 A DE10013847 A DE 10013847A DE 10013847 A1 DE10013847 A1 DE 10013847A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
dna
cytosine
thymine
bases
oligonucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
DE10013847A
Other languages
English (en)
Inventor
Kurt Berlin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Priority to DE10013847A priority Critical patent/DE10013847A1/de
Priority to US10/221,714 priority patent/US20040048254A1/en
Priority to PCT/EP2001/002955 priority patent/WO2001068912A2/de
Priority to PCT/DE2001/001089 priority patent/WO2001068910A2/de
Priority to EP01927582A priority patent/EP1292707A2/de
Priority to PCT/EP2001/002945 priority patent/WO2001068911A2/en
Priority to EP01923666A priority patent/EP1268855A2/de
Priority to US10/221,613 priority patent/US20040029123A1/en
Priority to US10/221,878 priority patent/US20050202420A1/en
Priority to AU2001250381A priority patent/AU2001250381A1/en
Priority to DE20121977U priority patent/DE20121977U1/de
Priority to AU2001254601A priority patent/AU2001254601A1/en
Priority to JP2001567391A priority patent/JP2004507214A/ja
Priority to AU2001248352A priority patent/AU2001248352A1/en
Priority to JP2001567390A priority patent/JP2004507213A/ja
Priority to EP01921343A priority patent/EP1283905A2/de
Priority to DE20121973U priority patent/DE20121973U1/de
Publication of DE10013847A1 publication Critical patent/DE10013847A1/de
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren und ein Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA. Zuerst wird die DNA Bisulfit behandelt und diese chemisch modifizierte DNA anschließend fragmentiert. Man amplifiziert im nächsten Schritt unterschiedliche Fragmente mit synthetischen Primern. Die Amplifikate werden mit Oligonukleotiden bekannter Sequenz hybridisiert und anschließend detektiert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiolo­ gie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung die­ ser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Ent­ wicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelier­ bar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylie­ rungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Stand der Technik sind Verfahren, welche das Studium von Methylierungsmustern einzelner Gene gestatten. Jüngere Fortentwicklungen dieser Methode erlauben auch die Analyse kleinster Mengen an Ausgangsmaterial. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes ge­ nomischer DNA Proben, wobei ausgehend von einer Probe gleichzeitig zahlreiche verschiedenene Fragmente aus an der Genregulation beteiligten oder/und transkri­ bierten und/oder translatierten Sequenzen amplifiziert werden und anschließend der Sequenzkontext in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide untersucht wird.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryoti­ scher Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti­ on, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5- Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigeneti­ sche Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5'-Methylcytosin stellt den bis heute wichtigsten und bestuntersuchten epigenetischen Parameter dar. Trotzdem gibt es bis heute zwar Methoden, umfassende Genotypen von Zellen und Individuen zu ermitteln, aber noch keine vergleichbaren Ansätze auch in großem Maße epige­ notypische Information zu generieren und auszuwerten.
Es sind im Prinzip drei verschiedene Methoden bekannt, den 5-Methyl-Status eines Cytosins im Sequenzkontext zu bestimmen.
Die erste prinzipielle Methode beruht auf der Verwendung von Restriktionsendonu­ kleasen (RE), welche "methylierungssensitiv" sind. REs zeichnen sich dadurch aus, daß sie an einer bestimmten DNA-Sequenz, meist zwischen 4 und 8 Basen lang, einen Schnitt in die DNA einführen. Die Position solcher Schnitte kann dann durch Gelektrophorese, Transfer auf eine Membran und Hybridisierung nachgewiesen werden. Methylierungssensitiv bedeutet, daß bestimmte Basen innerhalb der Er­ kennungssequenz unmethyliert vorliegen müssen, damit der Schnitt erfolgen kann. Das Bandenmuster nach einem Restriktionsschnitt und Gelektrophorese ändert sich also je nach Methylierungsmuster der DNA. Allerdings befinden sich die wenigsten methylierbaren CpG innerhalb von Erkennungssequenzen von REs, können also nach dieser Methode nicht untersucht werden.
Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist extrem niedrig (Bird, A. P., and Southern, E. M., J. Mol. Biol. 118, 27-47). Eine Variante kombiniert PCR mit dieser Methode, eine Amplifikation durch zwei auf beiden Seiten der Erkennungssequenz liegende Primer erfolgt nach einem Schnitt nur dann, wenn die Erkennungssequenz methy­ liert vorliegt. Die Empfindlichkeit steigt in diesem Fall auf theoretisch ein einziges Molekül der Zielsequenz, allerdings können mit hohem Aufwand nur einzelne Posi­ tionen untersucht werden (Shemer, R. et al., PNAS 93, 6371-6376). Wiederum ist Voraussetzung, daß sich die methylierbare Position innerhalb der Erkennungsse­ quenz einer RE befindet.
Die zweite Variante beruht auf partieller chemischer Spaltung von Gesamt-DNA, nach dem Vorbild einer Maxam-Gilbert Sequenzierreaktion, Ligation von Adaptoren an die so generierten Enden, Amplifikation mit generischen Primern und Auftren­ nung auf einer Gelektrophorese. Mit diesem Verfahren können definierte Bereiche bis zur Größe von weniger als tausend Basenpaaren untersucht werden. Das Ver­ fahren ist allerdings so kompliziert und unzuverlässig, daß es praktisch nicht mehr verwendet wird (Ward, C. et al., J. Biol. Chem. 265, 3030-3033).
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Un­ tersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulphit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil um­ gewandelt wird, welches in seinem Basen-Paarungsverhalten dem Thymidin ent­ spricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig ver­ bliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Se­ quenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basen­ paarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann.
Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulphit reagiert nur an einzel­ strängiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 24, 5064-5066). Mit die­ ser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Me­ thode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignissen ist nicht möglich.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nach­ zuweisen, kann auch dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 26, 2255 (1998).
Die Bisulphit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 5, 94-98; Kubota T. et al., Nat. Genet. 16, 16-17) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines be­ kannten Gens nach einer Bisulphit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. and Walter, J., Nat. Genet. 17, 275-276) oder einzelne Cyto­ sin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. and Jones, P. A., Nucl. Acids. Res. 25, 2529-2531) oder Enzymschnitt (Xiong, Z. and Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nach­ weis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al. WO 99/28498 A1).
Für die Korrelation zwischen Genaktivität und Methylierungsgrad ist vor allem die Methylierungsanalyse in Promotoren von Bedeutung.
Gemeinsamkeiten zwischen Promotoren bestehen nicht nur im Vorkommen von TATA- oder GC-Boxen sondern auch darin, für welche Transkriptionsfaktoren sie Bindestellen besitzen und in welchem Abstand diese sich zueinander befinden. Die existierenden Bindestellen für ein bestimmtes Protein stimmen in ihrer Sequenz nicht vollständig überein, es finden sich aber konservierte Folgen von mindestens 4 Basen, die durch das Einfügen von "Wobbles", d. h. Positionen, an denen sich je­ weils unterschiedliche Basen befinden, noch verlängert werden können. Des weite­ ren liegen diese Bindestellen in bestimmten Abständen zueinander vor.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), der dort zitierten Literatur und dem US-Patent 5994065 über Methoden zur Herstellung von festen Trägern für Zielmoleküle wie Oligonukleotide bei vermindertem nichtspezifischem Hintergrund­ signal entnehmen.
Als Sonden, die in einem Oligomer-Array auf einer Oberfläche fixiert werden, kom­ men Oligonukleotide in Frage, jedoch bietet sich auch jede Modifikation von Nu­ kleinsäuren an, z. B. Peptide Nucleic Acids (PNA), (Nielsen, P. E., Buchardt, O., Eg­ holm, M. and Berg, R. H. 1993. Peptide nucleic acids. US Patent. 5,539,082; Buchardt, O., Egholm, M., Berg, R. H. and Nielsen, P. E. 1993. Peptide nucleic acids and their potential applications in biotechnology. Trends in Biotechnology, 11: 384- 386), Phosphorothioatoligonukleotide oder Methylphosphonatoligonukleotide.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) ist eine neue, sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analytmolekül wird in eine im UV absorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix ins Vakuum verdampft und das Analyt so unfrag­ mentiert in die Gasphase befördert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Io­ nen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere und die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Refe­ renzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent mar­ kierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet sind für die Fluoreszenzmar­ kierung ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'OH der je­ weiligen Probe. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Proben erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, ne­ ben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren und einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren bereitstellen, welche sich zur parallelen Detektion des Me­ thylierungszustandes von genomischer DNA eignen. Es sollen bevorzugt genom­ weit repräsentative CpG-Positionen auf Methylierung hin abgetastet werden unter Verwendung bestimmter, besonders geeigneter Oligomersonden. Zudem sollen unterschiedliche Fragmente gleichzeitig aus einer genomischen DNA-Probe amplifi­ ziert werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und einen Satz von Oligonu­ kleotiden oder PNA-Oligomeren zur parallelen Detektion des Methylierungszustan­ des genomischer DNA. Die Oligonukleotide oder PNA-Oligomere entstammen dem folgenden Satz, wobei ein Oligonukleotid eine der folgenden Basensequenzen um­ faßt:
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
ist.
Ein PNA-Oligomer umfaßt eine der folgenden Sequenzen:
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
ist.
Dabei sollen mehrere Cytosin-Methylierungen in einer DNA-Probe und bevorzugt der obere und untere DNA-Strang gleichzeitig analysiert werden. Dazu werden die folgenden Verfahrensschritte nacheinander ausgeführt:
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zelllinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.
Bevorzugt erzeugt man die Fragmente der DNA durch Verdau mit einer oder meh­ rerer Exo- oder Endonukleasen.
Im ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA Probe derart chemisch be­ handelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base ver­ wandelt werden.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bi­ sulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.
In einem zweiten Verfahrensschritt werden aus der vorbehandelten genomischen DNA mehr als zehn unterschiedliche Fragmente gleichzeitig durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden als Primer amplifiziert.
Diese Fragmente umfassen bevorzugt Sequenzen aus an der Genregulation betei­ ligten und/oder transkribierten und/oder translatierten genomischen Sequenzen, wie sie nach einer chemischen Behandlung wie oben beschrieben vorliegen würden.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch, wobei eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wird.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird die thermostabile DNA Polymerase aus folgender Gruppe auswählt: Taq DNA Polymerase, AmpliTaq FS DNA Polymerase, Deep Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase, Vent DNA Polymerase, Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase und Deep Vent DNA Polymerase, Thermo Se­ quenase, exo(-) Pseudococcus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, AmpliTaq, Ultman, 9 degree Nm, Tth, Hot Tub, Pyrococcus furiosus (Pfu) und Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase.
In einer wiederum bevorzugten Variante wird die Größe der amplifizierten Frag­ mente in der PCR auf weniger als 30 s verkürzte Kettenverlängerungsschritte be­ grenzt.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthält mindestens eines der für die Amplifikation verwendeten Oligonukleotide weniger Nukleobasen als es für eine sequenzspezifische Hybridisierung an die chemisch behandelte genomi­ sche DNA Probe erforderlich wäre.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens ist mindestens ein Oligonukleotid kürzer als 18 Nukleobasen. In einer wiederum besonders bevor­ zugten Variante des Verfahrens ist mindestens ein Oligonukleotid kürzer als 15 Nu­ kleobasen.
In einer wiederum bevorzugten Variante des Verfahrens werden für die Amplifikati­ on mehr als 4 Oligonukleotide mit unterschiedlicher Sequenz gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß verwendet.
In einer besonders bevorzugten Varianten werden zur Herstellung eines komplexen Amplifikates mehr als 26 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig verwendet.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden zur Amplifikation der beschriebenen Fragmente zwei Oligonukleotide oder zwei Klassen von Oligonukleotiden verwendet, von denen eines oder eine der Klassen außer im Kontext CpG die Basen C, A und T enthalten kann, nicht aber die Base G und von denen das andere oder die andere Klasse außer im Kontext CpG die Basen G, A und T, nicht aber die Base C enthalten kann.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die nach der Amplifikation erhaltenen Produkte durch Gelektrophorese aufgetrennt und die Fragmente, die kleiner als 2000 Basenpaare oder kleiner als ein beliebiger Grenzwert unterhalb von 2000 Basenpaaren sind, durch Ausschneiden von den anderen Produkten der Amplifikation vor der Auswertung abgetrennt. Besonders bevorzugt werden diese Amplifikate bestimmter Größe vor der Durchführung der Hybridisierung nochmals amplifiziert.
In einem dritten Verfahrensschritt werden nun die in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide vollständig oder teilweise durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehenen Fragmente an einen Satz von Oligonukleotiden untersucht, der mindestens zwei der folgenden Sequenzen umfasst:
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
ist.
Nach dem dritten Verfahrensschritt werden ferner die in den amplifizierten Frag­ menten enthaltenen CpG Dinukleotide vollständig oder teilweise durch Hybridisie­ rung der bereits in der Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehe­ nen Fragmente an einen Satz von PNA-Oligomeren untersucht, der mindestens zwei der folgenden Sequenzen umfasst:
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
ist.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die besagten Fragmente an einem Oligonukleotid-Array (DNA Chip) untersucht. Die Trägermaterialen werden vorzugsweise aus einer Gruppe ausgewählt, die aus folgenden Komponenten be­ steht: Beads, Kapillaren, ebene Trägermaterialen, Membranen, Wafers, Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Markierungen aus einer Gruppe ausgewählt, bestehend aus Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden und ablösbaren Massenmarkierungen.
In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden die amplifizierten Fragmente auf einer Oberfläche immobilisiert und anschließend eine Hybridisierung mit einer kombinatorischen Bibiliothek von unterscheidbaren Oligonukleotid- oder PNA-Oligomer-Sonden durchgeführt. Sonden können beliebige Nukleinsäuresequenzen sein. Diese Sonden oder die oben erwähnten, ablösbaren Massenmarkie­ rungen werden vorzugsweise mittels Matrix-assistierter Laser- Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (Maldi-MS) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen. Die besagten Sonden oder Massenmarkierungen tragen bevorzugt jeweils eine einzelne positive oder negative Nettoladung.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit, der mindestens zwei Primerpaare, Reagenzien und Hilfsstoffe für die Amplifikation und/oder Reagenzien und Hilfsmit­ tel für die chemische Behandlung und/oder eine kombinatorische Sondenbibliothek und/oder einen Oligonukleotid-Array (DNA-Chip) enthält, soweit er für die Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich oder dienlich ist.
Verzeichnis der Abkürzungen
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (28)

1. Oligonukleotid oder PNA-Oligomer zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend eine der folgenden Basensequenzen:
Oligonukleotide:
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
ist,
PNA-Oligomere:
worin
H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
ist.
2. Verwendung eines Satzes von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei der Sequenzen der Liste 1, gemäß Anspruch 1 zur Detektion von Cytosin- Methylierungen in DNA-Proben.
3. Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von geno­ mischer DNA, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:
  • a) in einer genomischen DNA Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um;
  • b) aus dieser chemisch behandelten genomischen DNA amplifiziert man mehr als zehn unterschiedliche Fragmente, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide als Primer;
  • c) man hybridisiert die Amplifikate an einen Satz von Oligonukleotiden oder PNA- Oligomeren, der mindestens zwei der folgenden Sequenzen umfasst:
    • 1. Oligonukleotide:
      worin
      H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
      D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
      W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
      S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
      ist,
    • 2. PNA-Oligomere:
      worin
      H eine der Basen Adenin (A), Cytosin (C) oder Thymin (T)
      D eine der Basen Adenin (A), Guanin (G) oder Thymin (T)
      W eine der Basen Adenin (A) oder Thymin (T)
      S eine der Basen Cytosin (C) oder Guanin (G)
      ist,
  • d) man detektiert die hybridisierten Amplifikate.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemi­ sche Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 dadurch gekennzeichnet, dass man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 5 dadurch gekennzeichnet, dass die in der Amplifikation verwendeten Primer jeweils Sequenzen aus an der Genregulation beteiligten und/oder transkribierten und/oder translatierten genomischen Sequen­ zen enthalten, wie sie nach einer Behandlung gemäß Schritt a) vorliegen würden;
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der in Schritt b) verwendeten Oligonukleotide weniger Nukleoba­ sen enthält als es für eine sequenzspezifische Hybridisierung an die chemisch be­ handelte genomische DNA Probe erforderlich wäre.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der in Schritt b) des Anspruchs 3 verwendeten Oligonukleotide kürzer als 18 Nukleobasen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7 dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der in Schritt b) des Anspruchs 3 verwendeten Oligonukleotide kürzer als 15 Nukleobasen ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt b) des Anspruchs 3 mehr als 4 verschiedene Oligonukleotide gleich­ zeitig für die Amplifikation verwendet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man in Schritt b) des Anspruchs 3 mehr als 26 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig für die Amplifikation verwendet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Amplifikation der in Schritt b) des Anspruchs 3 beschriebenen DNA zwei Oligonukleotide oder zwei Klassen von Oligonukleotiden verwendet, von denen eines oder eine der Klassen außer im Kontext CpG die Basen C, A und T enthalten kann, nicht aber die Base G und von denen das andere oder die andere Klasse außer im Kontext CpG die Basen G, A und T, nicht aber die Base C enthalten kann.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung der in den amplizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide vollständig oder teilweise gemäß Anspruch 3d) durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einer nachweisbaren Markierung versehenen Fragmente an einen Oligonukleotid-Array (DNA Chip) erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierun­ gen Fluoreszenzmarkierungen sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierun­ gen Radionuklide sind.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierun­ gen ablösbare Massenmarkierungen sind, die in einem Massenspektrometer nach­ gewiesen werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass die amplifizierten Fragmente auf einer Oberfläche immobilisiert sind.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass die Hybridisierung mit einer kombinatorischen Bibliothek von unterscheidbaren Oligonukleotid- oder PNA-Oligomersonden durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden mittels Matrix-assistierter Laser-Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI-MS) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen werden.
20. Verfahren nach Anspruch 17 oder 19 dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden jeweils eine einzelne positive oder negative Nettoladung tragen.
21. Verfahren nach Anspruch 17 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass die ver­ wendeten Sonden PNA, Alkylphosphonat-DNA, Phosphorothioat-DNA oder alky­ lierte Phosphorothioat-DNA sind.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation wie beschrieben in Schritt b) des Anspruchs 1 durch eine Polymerase Kettenreaktion ausgeführt wird, in der die Größe der amplifizierten Fragmente auf weniger als 30 s verkürzter Kettenverlängerungsschritte begrenzt wird.
23. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 12 und 17 dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger aus einer Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus: Beads, Kapillaren, ebenen Trägermaterialen, Membranen, Wafers, Silizium, Glas, Polysty­ rol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Amplifikation gemäß Schritt b) des Anspruchs 3 die Produkte durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden und die Fragmente, die kleiner als 2000 Ba­ senpaare oder kleiner als ein beliebiger Grenzwert unterhalb von 2000 Basenpaa­ ren sind, durch Ausschneiden von den anderen Produkten der Amplifikation vor der Auswertung gemäß Schritt c) des Anspruchs 1 abgetrennt werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24 dadurch gekennzeichnet, dass nach der Ab­ trennung von Amplifikaten bestimmter Größe diese vor der Durchführung des Schrittes c) des Anspruchs 1 nochmals amplifiziert werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 25 dadurch gekennzeichnet, dass Methylierungsanalysen des oberen und unteren DNA-Stranges gleichzeitig durchgeführt werden.
27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekenn­ zeichnet, dass man eine thermostabile DNA Polymerase aus folgender Gruppe auswählt: Taq DNA Polymerase, AmpliTaq FS DNA Polymerase, Deep Vent (exo.sup.-) DNA Polymerase, Vent DNA Polymerase, Vent (exo.sup.-) DNA Poly­ merase und Deep Vent DNA Polymerase, Thermo Sequenase, exo(-) Pseudococ­ cus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, AmpliTaq, Ultman, 9 degree Nm, Tth, Hot Tub, Pyrococcus furiosus (Pfu) und Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase.
28. Kit, enthaltend mindestens zwei Primerpaare, Reagenzien und Hilfsstoffe für die Amplifikation und/oder Reagenzien und Hilfsmittel für die chemische Behand­ lung gemäß Anspruch 3a) und/oder eine kombinatorische Sondenbibliothek und/oder einen Oligonukleotid-Array (DNA-Chip), soweit sie für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich oder dienlich sind.
DE10013847A 2000-03-15 2000-03-15 Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Ceased DE10013847A1 (de)

Priority Applications (17)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10013847A DE10013847A1 (de) 2000-03-15 2000-03-15 Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA
US10/221,714 US20040048254A1 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnosis of diseases associated with tumor supressor genes and oncogenes
PCT/EP2001/002955 WO2001068912A2 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnosis of diseases associated with tumor suppressor genes and oncogenes
PCT/DE2001/001089 WO2001068910A2 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Oligonukleotide oder pna-oligomere und verfahren zur parallelen detektion des methylierungszustandes genomischer dna
EP01927582A EP1292707A2 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Oligonukleotide oder pna-oligomere und verfahren zur parallelen detektion des methylierungszustandes genomischer dna
PCT/EP2001/002945 WO2001068911A2 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnosis of diseases associated with the cell cycle
EP01923666A EP1268855A2 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnose von krankheiten, welche mit tmorsuppressorgenen assoziiert sind
US10/221,613 US20040029123A1 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnosis of diseases associated with the cell cycle
US10/221,878 US20050202420A1 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Oligonucleotides or pna oligomers and a method for detecting the methylation state of genomic dna in a parallel manner
AU2001250381A AU2001250381A1 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnosis of diseases associated with tumor suppressor genes and oncogenes
DE20121977U DE20121977U1 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Nukleinsäuren für die Diagnose von mit Tumor-Suppressorgenen und Onkogenen assoziierten Krankheiten
AU2001254601A AU2001254601A1 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Oligonucleotides or pna oligomers and a method for detecting the methylation state of genomic dna in a parallel manner
JP2001567391A JP2004507214A (ja) 2000-03-15 2001-03-15 腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断
AU2001248352A AU2001248352A1 (en) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnosis of diseases associated with the cell cycle
JP2001567390A JP2004507213A (ja) 2000-03-15 2001-03-15 細胞周期に関連する疾患の診断
EP01921343A EP1283905A2 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Diagnose von krankheiten, welche mit dem zellzyklus assoziiert sind
DE20121973U DE20121973U1 (de) 2000-03-15 2001-03-15 Nukleinsäuren für die Diagnose von mit dem Zellzyklus assoziierten Krankheiten

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10013847A DE10013847A1 (de) 2000-03-15 2000-03-15 Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE10013847A1 true DE10013847A1 (de) 2001-09-27

Family

ID=7635678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE10013847A Ceased DE10013847A1 (de) 2000-03-15 2000-03-15 Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20050202420A1 (de)
EP (1) EP1292707A2 (de)
AU (1) AU2001254601A1 (de)
DE (1) DE10013847A1 (de)
WO (1) WO2001068910A2 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1312685A2 (de) * 2001-11-16 2003-05-21 Nisshinbo Industries, Inc. Oligonukleotidarray zum Nachweis von Methylierungszuständen
EP1693468A1 (de) 2005-02-16 2006-08-23 Epigenomics AG Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure
US7932027B2 (en) 2005-02-16 2011-04-26 Epigenomics Ag Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid
EP2481810A1 (de) 2005-04-15 2012-08-01 Epigenomics AG Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Fragmenten, die von einer dezentralen Probe abgeleitet sind

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7820385B2 (en) 2006-03-22 2010-10-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Method for retaining methylation pattern in globally amplified DNA
US8084734B2 (en) * 2006-05-26 2011-12-27 The George Washington University Laser desorption ionization and peptide sequencing on laser induced silicon microcolumn arrays
US8110796B2 (en) 2009-01-17 2012-02-07 The George Washington University Nanophotonic production, modulation and switching of ions by silicon microcolumn arrays
US9490113B2 (en) * 2009-04-07 2016-11-08 The George Washington University Tailored nanopost arrays (NAPA) for laser desorption ionization in mass spectrometry

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0409299A2 (de) * 1989-06-29 1991-01-23 Gist-Brocades N.V. Mutiertes Enzym mit reduzierter Stabilität unter industriellen Anwendungsbedingungen
WO1999028498A2 (de) * 1997-11-27 1999-06-10 Epigenomics Gmbh Verfahren zur herstellung komplexer dna-methylierungs-fingerabdrücke
WO1999055914A1 (en) * 1998-04-29 1999-11-04 Trustees Of Boston University Methods and compositions pertaining to pd-loops
WO2000032817A1 (en) * 1998-12-03 2000-06-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of g-alpha-16 expression
WO2000058512A1 (en) * 1999-03-26 2000-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of interleukin-5 signal transduction

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6017704A (en) * 1996-06-03 2000-01-25 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
AU8229598A (en) * 1998-07-02 2000-01-24 Imperial Cancer Research Technology Limited Tumour suppressor gene dbccr1 at 9q32-33

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0409299A2 (de) * 1989-06-29 1991-01-23 Gist-Brocades N.V. Mutiertes Enzym mit reduzierter Stabilität unter industriellen Anwendungsbedingungen
WO1999028498A2 (de) * 1997-11-27 1999-06-10 Epigenomics Gmbh Verfahren zur herstellung komplexer dna-methylierungs-fingerabdrücke
WO1999055914A1 (en) * 1998-04-29 1999-11-04 Trustees Of Boston University Methods and compositions pertaining to pd-loops
WO2000032817A1 (en) * 1998-12-03 2000-06-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of g-alpha-16 expression
WO2000058512A1 (en) * 1999-03-26 2000-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of interleukin-5 signal transduction

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem.Abstr. 127(1997)304363 (Nucleosides Nucleo- tides 16 (1997) 609-615). *
Chem.Abstr. 128(1998)213917 (Virology 240 (1998) 366-375). *
Chem.Abstr. 132(2000)246897 (Appl.Environ.Mico- biol. 66(2) (2000) 549-557). *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1312685A2 (de) * 2001-11-16 2003-05-21 Nisshinbo Industries, Inc. Oligonukleotidarray zum Nachweis von Methylierungszuständen
EP1312685A3 (de) * 2001-11-16 2003-11-12 Nisshinbo Industries, Inc. Oligonukleotidarray zum Nachweis von Methylierungszuständen
EP1693468A1 (de) 2005-02-16 2006-08-23 Epigenomics AG Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsmusters einer Polynukleinsäure
US7932027B2 (en) 2005-02-16 2011-04-26 Epigenomics Ag Method for determining the methylation pattern of a polynucleic acid
EP2481810A1 (de) 2005-04-15 2012-08-01 Epigenomics AG Verfahren zur Bereitstellung von DNA-Fragmenten, die von einer dezentralen Probe abgeleitet sind
US10731215B2 (en) 2005-04-15 2020-08-04 Epigenomics Ag Method for determining the presence or absence of methylation in a sample

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001068910A2 (de) 2001-09-20
WO2001068910A3 (de) 2003-01-03
EP1292707A2 (de) 2003-03-19
US20050202420A1 (en) 2005-09-15
AU2001254601A1 (en) 2001-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1232287B1 (de) Oligomer-array mit pna- und/oder dna-oligomeren auf einer oberfläche
DE69105959T2 (de) Verfahren zur unterscheidung von nukleinsäuren auf basis von nukleotidverschiedenheiten.
DE10056802B4 (de) Verfahren zur Detektion von Methylierungszuständen zur toxikologischen Diagnostik
EP1268856A2 (de) Detektion von snp's und cytosin-methylierungen
DE10010280B4 (de) Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
DE10151055B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in CpG Inseln
DE69830395T2 (de) Iterative resequenzierung
DE10010281A1 (de) Ligase/Polymerase-Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
WO2001042493A2 (de) Verfahren zur parallelen detektion des methylierungszustandes von genomischer dna
DE10154317B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen in immobilisierten DNA Proben
DE10010282B4 (de) Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
DE10132212B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten
DE10050942B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen
Rogstad [20] Surveying plant genomes for variable number of tandem repeat loci
DE10013847A1 (de) Oligonukleotide oder PNA-Oligomere und Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA
DE19951189C2 (de) Verfahren zur Unterscheidung von 5-Position-Methylierungsänderungen von Cytosin-Basen und Cytosin-zu-Thymin-Mutationen und zum Nachweis von single nucleotide polymorphisms (SNPs) oder Punktmutation in genomischer DNA
EP1320632B1 (de) Verfahren zur altersbestimmung von individuen
EP1339873B1 (de) Diagnose von mit humos assoziierten krankheiten
DE10160983B4 (de) Verfahren und Integrierte Vorrichtung zum Nachweis von Cytosinmethylierungen
WO2004022779A2 (de) Verfahren zum nachweis von nukleinsäuresequenzen mittels spaltbarer sondenmoleküle
DE10044543A1 (de) Verfahren zur Bestimmung des Methylierungsgrades von bestimmten Cytosinen in genomischer DNA im Sequenzkontext 5'-CpG-3'
DE602005005333T2 (de) Verfahren zum Nachweis von homologen Sequenzen, welche sich durch eine Base unterscheiden, auf einem Mikroarray
DE20121978U1 (de) Nukleinsäuren für die Analyse von Astrocytomen
DE10051714A1 (de) Verfahren zur kontrollierbaren Durchführung komplexer PCR-Amplifikationen

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8131 Rejection