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DE60116146T2 - Konjugate definierter stöchiometrie - Google Patents

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DE60116146T2 DE60116146T DE60116146T DE60116146T2 DE 60116146 T2 DE60116146 T2 DE 60116146T2 DE 60116146 T DE60116146 T DE 60116146T DE 60116146 T DE60116146 T DE 60116146T DE 60116146 T2 DE60116146 T2 DE 60116146T2
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Description

  • Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Biomolekül-Linker Konjugats mit einheitlicher Stöchiometrie. Insbesondere betrifft sie ein Konjugat, das aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül besteht, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD hat und zwischen 4 und 60 geladene Reste aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Konjugat eine vorbestimmte Menge von mindestens einem Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie enthält.
  • Bindungsassays finden heutzutage in der Forschung sowie auch im klinischen Alltag eine breite Anwendung, besonders zur Diagnose von Infektionen, in der Verlaufskontrolle von Arzneimitteln oder zur Bewertung normaler oder abnormer Stoffwechsel.
  • Bindungsassays werden schon seit 30 Jahren verwendet (Engvall, E. und Perlman, P., „Immunochemistry" 8 (1971) 871–4; van Weemen, B. K. und Schuures A. H. W. M. (1971), „FEBS Letters" 15, 232). Seitdem wurden viele Fortschritte gemacht und Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungsassays sowie deren praktische Anwendungen sind dem Fachmann inzwischen allgemein bekannt. Methoden und Verfahren sind in den betreffenden Fachbüchern zusammengefasst auf die hiermit Bezug genommen wird und nur wenige Beispiele werden gesondert erwähnt: „Practice and theory of enzyme immunoassays" by Tijssen – in „Methods in Enzymology" (1992) Academic Press; und verschiedene Ausgaben von „Methods in Enzymology", Colowick S. P., Caplan N. O., Herausgeber, Academic Press, die sich mit immunologischen Nachweismethoden beschäftigen, insbesondere Band 70, 73, 74, 84, 92 und 121.
  • Mit Ausnahme sehr weniger homogener oder Fällungsmethoden, benötigen alle diese Nachweismethoden Konjugate zwischen einem Biomolekül z.B. einem Antikörper und einem zweiten Molekül, das gebraucht wird, um die Messung des zu untersuchenden Analyten zu ermöglichen. Bekannte Beispiele dieses zweiten Moleküls sind Markierungsgruppen wie Enzyme, Radioisotopen, Luminophoren, Fluorophoren usw. oder Haptene.
  • Konjugate zwischen einem Biomolekül und z.B. einer Markierungs- oder Haptengruppe können durch direkte chemische Kopplung zweier verschiedener molekularer Einheiten oder unter Verwendung eines Linkers oder Brückenmoleküls gemäß den Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt werden (z.B Tijssen oder „Methods in Enzymology" supra).
  • Abhängig von der gewählten Kopplungs- oder Linkerchemie werden in vielen Fällen weitere Gruppen modifiziert, wie z.B. Aminosäuregruppen von Polypeptiden, die letztendlich keine Markierungsgruppe tragen. Dies führt zu unvorhersehbaren Ergebnissen und durch Veränderungen der physiko-chemischen Eigenschaften des Biomoleküls zu Problemen wie z.B. Instabilität, Bildung von Aggregaten oder unspezifischer Bindung in Immunoassays.
  • Die verschiedenen Bestandteile eines solchen Konjugats z.B. Biomolekül, Linkermolekül und Markierungsmolekül sowie die daraus resultierenden Kopplungsprodukte liegen in statistischen Mengen vor. Man erhält eine rein statistische Mischung mit einem durchschnittlichen Markierungsgrad. Der durchschnittliche Markierungsgrad kann in gewissem Maße durch die Anpassung der gewählten Reaktionsbedingungen und der Verhältnisse der einzelnen molekularen Einheiten gesteuert werden.
  • Solche statistischen Mischungen enthalten viele verschiedene Konjugationsprodukte verschiedener Stöchiometrien. Biomoleküle völlig ohne Linker- oder Markierungsstruktur, Konjugate mit einer Stöchiometrie von 1:1, Stöchiometrie von 1:2 (d.h. ein Biomolekül, das 2 Linker oder Markierungsmoleküle trägt), einer Stöchiometrie von 1:3 und noch höhere Stöchiometrien können in solchen Konjugaten vorhanden sein. Offensichtlich sind nicht alle diese Produkte wünschenswert und verursachen Probleme z.B. im Hinblick auf die Reproduzierbarkeit der Konjugatbildung. Ausserdem werden markierte Biomoleküle durch nicht-markierte Moleküle gestört. Es ist auch bekannt, dass das „übermarkieren", also die Markierung von Biomolekülen mit zu vielen Hapten- oder Markierungsstrukturen, die Hauptursache für Probleme, bekannt als unspezifische Wechselwirkungen wie Hintergrund Phänomene, ist.
  • US 5,958,783 offenbart die Möglichkeit eine hydrophile Linkereinheit zu verwenden, um Hintergrundprobleme verursacht durch einen Metallchelat Komplex als Markierungsgruppe, zu vermindern. Die Konjugate gemäß US 5,958,783 stellen jedoch noch immer statistische Mischungen verschiedener Biomolekül-Linker-Markierungsprodukte dar. Die Reproduzierbarkeit dieser statistischen Konjugate bleibt noch ein Problem.
  • DE-A-44 30 972 offenbart die Herstellung und anschließende Reinigung durch Gelfiltration (Sephacryl S200) von Konjugaten sowie ihre Anwendung in Immunoassays. US-A-6 120 768 betrifft Metallchelat Konjugate. US-A-5 047 324 offenbart eine Methode zur Gewinnung eines weitgehend reinen Präparates eines Konjugates, bestehend aus einem Antikörper und einem Enzym mittels Elektrophorese.
  • WO 96/03423 und WO 96/03651 beschreiben die Möglichkeit während der Synthese an vorher festgelegten Stellen Markierungsgruppen einzuführen. So ist es möglich ein Peptid-Linker-(Markierungs-)Produkt mit einheitlicher Stöchiometrie zu synthetisieren. Die Grenzen der Peptidsynthese liegen jedoch im Bereich von 40 bis 50 Aminosäuren, was Peptiden mit einem molekularen Gewicht unter 5 kD (kD = Kilo Dalton) entspricht. Polypeptide mit mehr als 5 kD werden üblicherweise durch rekombinante Expression in geeigneten Wirtssystemen hergestellt und benötigen chemische Kopplung, wodurch ein Konjugat mit statistischer Zusammensetzung erhalten wird. Die Linker gemäß WO 96/03423 und WO 96/03657 liegen unter 1 kD und enthalten keine geladenen Reste.
  • Große Biomoleküle z.B. Polypeptide mit 40 bis 50 Aminosäuren umfassen üblicherweise mehr als eine reaktive Gruppe, die für eine der üblichen Kopplungschemien zugänglich ist.
  • Die Art und Strategie der chemischen Kopplung kann je nach Bedarf gewählt werden. Für den Fall, dass das Biomolekül ein Polypeptid ist, verfügt man über Kopplungschemien, die auf die -SH, -NH2 oder -COO– Reste sowie die -OH Gruppe von Tyrosin, die Imidazolgruppe der Histidine oder die heterozyklischen Iminogruppen von Tryptophanen abzielen. Mehrere geeignete Kopplungschemien sind für jede dieser funktionellen Gruppen aus dem Stand der Technik bekannt (Aslam, M. Dent, A. „The preparation of protein-protein conjugates" in „Bioconjugation" (1998) 216–363, London, McMillan).
  • Wenn mehr als eine reaktive Gruppe auf einem Biomolekül vorhanden ist, führt chemische Kopplung mit einem Linker oder einer Markierung zu einer statistischen Mischung von verschiedenen Biomolekül-Linker- oder Biomolekül-Markierungsprodukten.
  • Selbst mit den fortschrittlichsten Linkern und Kopplungschemien, ist das erhaltene Konjugat eine statistische Mischung aus vielen verschiedenen Konjugaten und das Gesamtergebnis solch einer Konjugation ist höchst variabel und unvorhersehbar. Als Folge ist es sehr schwierig alle Eigenschaften dieser Konjugate von Charge zu Charge zu reproduzieren.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb zu untersuchen, ob ein Konjugat zwischen einem Biomolekül und einem Linkermolekül in reproduzierbarer und definierter Weise erhalten werden kann. Untersucht wurde ausserdem, ob Verfahren gefunden und beschrieben werden können, mit denen ein Konjugat erhalten werden kann, das mindestens ein vorgewähltes Biomolekül-Linker Produkt mit einheitlicher Stöchiometrie umfasst.
  • Überraschenderweise stellte sich heraus, dass Probleme des Standes der Technik mit Hilfe der erfindungsgemäßen Konjugate überwunden werden können, deren Herstellungsverfahren und ihre Verwendung in geeigneten Reagenzien, Kits und Arbeitsweisen.
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats wird offenbart, das mindestens ein Biomolekül-Linker Produkt mit einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge enthält, wobei besagtes Konjugat aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül besteht, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD hat und zwischen 4 und 60 geladene Reste aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Biomolekül und Linkermolekül kovalent miteinander gekoppelt sind, b) die verschiedenen Biomolekül-Linkerprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie durch Chromatographie fraktioniert werden und c) die Fraktionen, die ein Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten, gesammelt werden.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft zudem ein Konjugat bestehend aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und ein hydrophiles Linkermolekül wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 und 15 kD hat und zwischen 4 und 60 geladene Reste aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Konjugat mindestens ein Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge enthält.
  • Die Konjugate werden besonders bevorzugt zur Durchführung eines biochemischen oder immunologischen Assays zum Nachweis eines Analyten in der Probe verwendet. Daher betrifft die Erfindung auch eine Reagenzzusammensetzung, die beschriebenen Konjugate enthaltend, ein Testkit ein solches Konjugat als Teil einer Reagenzmischung umfassend und ein Immunoassay basierend auf einem solchen Konjugats.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Eine bevorzugte Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, welches mindestens ein Biomolekül-Linker Produkt mit einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge enthält, wobei besagtes Konjugat aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül besteht, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD hat und zwischen 4 und 60 geladene Reste aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Biomolekül und Linkermolekül kovalent miteinander gekoppelt sind, b) die verschiedenen Biomolekül-Linkerprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie durch Chromatographie fraktioniert werden und c) die Fraktionen, die ein Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten, gesammelt werden.
  • Der Begriff „Konjugat" beschreibt ein Kopplungsprodukt zwischen einem Biomolekül und einem Linkermolekül. Ein Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung enthält mindestens ein Biomolekül-Linker Produkt mit einheitlicher Stöchiometrie in vorbestimmter Menge.
  • Biomoleküle im Sinne der vorliegenden Erfindung können alle natürlich vorkommenden oder synthetisch hergestellten Moleküle mit einem Molekulargewicht zwischen 5 und 500 kD bestehend aus biologischen Molekülen wie Aminosäuren, Nukleotiden, Nukleosiden, Lipiden und/oder Zucker sein. Das Biomolekül wird vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, Polysacchariden und Lipopolysacchariden ausgewählt. Das Biomolekül weist vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von 10 kD bis 500 kD auf. Noch bevorzugter hat das Biomolekül ein Molekulargewicht im Bereich von 15 kD bis 400 kD und am meisten bevorzugt im Bereich von 20 kD bis 200 kD.
  • Das Biomolekül weist vorzugsweise mindestens zwei Gruppen auf, die für Standard Kopplungschemie zugänglich sind. Beispiele solcher Gruppen, die im Stand der Technik als reaktive Gruppen, funktionelle Gruppen oder Kopplungsstellen bekannt sind, werden weiter unten beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Biomolekül ein Polypeptid. Solche Polypeptide umfassen vorzugsweise 50 bis 5000 Aminosäuren oder mehr bevorzugt 100 bis 4000 Aminosäuren.
  • Der Linker gemäß der vorliegenden Erfindung hat ein Molekulargewicht von 1 kD bis 15 kD und trägt mindestens vier geladene Reste. Der genannte Molekulargewichtsbereich gilt für das zugrundeliegende Linkermolekül ohne aktive Gruppen oder Markierungsgruppen.
  • Das Molekulargewicht des Linkers beträgt mindestens 1000 Da, weil dann die Vorteile des Linkers besonders offensichtlich werden. Vorzugsweise liegt das Molekulargewicht des Linkers im Bereich von 1000 bis 15000 Da, besonders bevorzugt im Bereich von 1000 bis 12000 Da und am meisten bevorzugt im Bereich von 1000 bis 10000 Da. Bevorzugterweise liegen die Bereiche des Molekulargewichts für das Linkermolekül zwischen 1500 und 15000 Da und auch zwischen 1500 und 10000 Da.
  • Der zur Herstellung des Konjugats gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Linker enthält bevorzugt ein peptidisches Grundgerüst.
  • Der Begriff „Ladungsträger" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Gruppe, die bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 8 überwiegend in ionischer Form vorliegt. Der Linker enthält vorzugsweise 4 bis 60, besonders bevorzugt 6 bis 50 und am meisten bevorzugt 9 bis 40 solcher Ladungsträger.
  • Alle Ladungsträger sind vorzugsweise entweder positiv oder negativ geladen. Es können jedoch auch Linkermoleküle verwendet werden, die sowohl positiv als auch negativ geladene Reste tragen. In einem solchem Fall ist die Anzahl der positiv geladenen Reste um mindestens vier entweder höher oder niedriger, verglichen mit der Anzahl der negativ geladenen Reste.
  • Bevorzugt enthält der Linker mindestens vier negative Ladungsträger. Beispiele für geeignete negative Ladungsträger sind Phosphat-, Phosphonat-, Sulfinat-, Sulfonat-, Sulfat- und Carboxylatgruppen, wobei Carboxylatgruppen und Phosphatgruppen am meisten bevorzugt sind.
  • Weiterhin enthält der Linker vorzugsweise mindestens vier positiv geladene Reste. Beispiele für positive Ladungsträger sind Amino- und einfach- oder mehrfach-substituierte Aminogruppen wie z.B. Monoalkyl-, Dialkyl- oder Trialkylaminogruppen, wobei Alkyl einen geraden oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 6 C Atomen oder einen zyklischen Alkylrest mit 3 bis 6 C Atomen bedeutet, Guanidinylgruppen z.B. von Arginin oder positiv geladene heteroaromatische Stickstoffgruppen wie man sie z.B. in Histidin findet. Bevorzugt werden die positiven Ladungsträger aus basischen Aminosäuren wie etwa Lysin oder substituierte Aminosäuren wie Diethyllysin ausgewählt.
  • Alternativ oder zusätzlich zu den Ladungsträgern können die Linker auch ungeladene hydrophile Gruppen enthalten. Bevorzugte Beispiele für ungeladene hydrophile Gruppen sind Ethylenoxid- oder Polyethylenoxidgruppen mit vorzugsweise mindestens drei Ethylenoxideinheiten, Sulfoxid-, Sulfon-, Carbonsäureamid-, Carbonsäureester-, Phosphonsäureamid-, Phosphonsäureester-, Phosphorsäureamid-, Phosphorsäureester-, Sulfonsäureamid-, Sulfonsäureester-, Schwefelsäure amid-, Schwefelsäureestergruppen. Die Amidgruppen sind vorzugsweise primäre Amidgruppen, besonders bevorzugt Carbonsäureamidreste in Aminosäureseitengruppen z.B. der Aminosäuren Asparagin und Glutamin. Die Ester stammen vorzugsweise von hydrophilen Alkoholen, insbesondere C1-C3 Alkoholen oder Di- oder Triolen.
  • Der Linker gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise modifiziert, um zusätzliche chemische Strukturen zu tragen. Am meisten bevorzugt weisen die modifizierten Linker die Formel (Z-L-Xn) auf und enthalten eine Gruppe Z und eine oder mehrere Gruppen X (n = 1–10), wobei L die Kernstruktur des besagten Linkers ist.
  • Die reaktive Gruppe Z wird verwendet um den Linker chemisch an das Biomolekül zu koppeln. Vorzugsweise ist die Gruppe Z eine aktivierte Carbonsäuregruppe wie etwa ein Carbonsäurehalogenid, ein Carbonsäureanhydrid, ein Carbonsäurehydrazid, ein Carbonsäureazid oder ein Aktivester z.B. ein N-Hydroxysuccinimid-, ein p-Nitrophenyl-, Pentafluorphenyl-, Imidazolyl- oder N-Hydroxybenzotriazolylester, ein Amin, ein Maleiimid, ein Thiol, eine Paraminobenzoylgruppe oder eine photoaktivierbare Gruppe wie z.B. ein Azid.
  • Die Gruppe X ist entweder eine reaktive Gruppe wie oben für Z beschrieben oder X ist eine Markierungsgruppe. Wenn X eine reaktive Gruppe ist, kommt sie nur einmal vor und der Linker ist ein heterobifunktioneller Linker. Ein Fachmann kann ohne weiteres geeignete Kombinationen von reaktiven Gruppen für X und Z auswählen. Beispiele für geeignete aktive Gruppen in heterobifunktionellen Linkern sind bei Aslam, M. Dent. A. „The preparation of protein-protein conjugates" in „Bioconjugation" (1998), 216–363, London, McMillan oder in Tijssen Laboratory Techiniques in „Macromolecule Conjugation" (1985), 258–268 angegeben. Wenn X eine Markierungsgruppe ist, ist es bis zu zehnmal enthalten, bevorzugt bis zu viermal. Die Markierungsgruppe ist vorzugsweise einmal oder zweimal enthalten.
  • Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Linker kann ein linearer oder verzweigter Linker sein. Lineare geladene Linker sind aus US 5,958,783 bekannt. Solch ein linearer Linker hat vorzugsweise eine Kettenlänge von 15–350 Atomen und ist eine durch Einbau von Heteroatomen z.B. Amidfunktionen modifizierte Alkylenkette. Vorzugsweise ist der lineare Linker der die freien Ladungsträger enthält, zumindest teilweise aus Aminocarbonsäureeinheiten aufgebaut, die vorzugsweise über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Der Linker kann natürlich vorkommende sowie synthetische Aminosäureeinheiten enthalten. Vorzugsweise enthält der Linker wiederholt das Dipeptid β-Alanin-Glutaminsäure. Eine bevorzugte Linkerstruktur enthält zwischen 5 und 70, mehr bevorzugt zwischen 10 und 60 und am meisten bevorzugt zwischen 15 und 50-mal das Dipeptid β-Alanin-Glutaminsäure.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Linker ein verzweigter Linker.
  • Der verzweigte Linker enthält vorzugsweise eine Hauptkette, die eine oder mehrere ungeladene hydrophile Gruppen wie zuvor angegeben, insbesondere Carbonsäureamidgruppen oder/und Polyethylenglycolfunktionen enthält, während sich mindestens vier Ladungsträger in einer oder mehreren Seitenketten befinden. Dabei können pro Seitenkette beispielsweise 1 bis 10 Ladungsträger und insbesondere 1 bis 5 Ladungsträger vorhanden sein.
  • Alternativ kann der verzweigte Linker auch in der Hauptkette Ladungsträger und ungeladene hydrophile Gruppen in einer oder mehreren Seitenketten enthalten. Ausserdem sind auch Ausführungsformen denkbar, in denen die Hauptkette und die Seitenkette ungeladene hydrophile Gruppen sowie Ladungsträger enthalten.
  • Der verzweigte Linker hat den weiteren Vorteil, dass er hergestellt werden kann, um mehrere Markierungsgruppen zu tragen. Kovalente Kopplung einer solchen Linker-(Markierungs-)struktur führt dazu, dass mehrere Markierungsgruppen pro Biomolekül und pro Kopplungsereignis eingeführt werden. Bevorzugte Linker-(Markierungs-)strukturen tragen zwei bis vier Markierungsgruppen.
  • Der verzweigte Linker hat eine Hauptkettenlänge von vorzugsweise 7 bis 200 Atomen, besonders bevorzugt 7 bis 100 Atomen, wobei die Hauptkette eine durch Einbau von Heteroatomen z.B. O-Atomen oder Amidfunktionen modifizierte Alkylenkette ist, die mindestens eine Verzweigung enthält, wobei die durch Verzweigungen gebildeten Seitenketten vorzugsweise eine Länge von 4 bis 100 Atomen aufweisen. Die Ladungsträger sind im Linker vorzugsweise derart angeordnet, dass ein H-Atom einer Alkyleneinheit der Hauptkette oder/und in einer Seitenkette durch eine einen Ladungsträger, z.B. NH3 + oder CO2 – enthaltende Gruppe oder Guadinylgruppe ersetzt ist.
  • Vorzugsweise ist der verzweigte Linker, der die freien Ladungsträger oder/und hydrophilen Gruppen enthält, zumindest teilweise aus Aminocarbonsäure Einheiten aufgebaut, die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Bei einem derartigen Linker können die Verzweigungspunkte von polyfunktionellen Aminocarbonsäuren stammen, die mindestens drei funktionelle Gruppen, z.B. Amino- oder Carboxylatgruppen enthalten, sodass nach Einbau in die Hauptkette noch eine funktionelle Gruppe vorhanden ist, die als Ausgangspunkt zum Aufbau der Seitenkette verwendet werden kann. Besonders bevorzugt werden die Verzweigungen mit Diaminocarbonsäuren, wie etwa Lysin, Ornithin, Hydroylysin, α,β-Diaminopropionsäure usw. erzeugt.
  • Die Ladungsträger des verzweigten Linkers können vorzugsweise aus freien positiv oder/und negativ geladenen Gruppen von polyfunktionellen Aminocarbonsäuren stammen, die insgesamt mindestens drei geladene Gruppen, z.B. Amino-, Carboxylat- oder Phosphatgruppen enthalten, so dass nach Einbau in den Linker und damit verbundener Reaktion von zwei der geladenen Gruppen noch mindestens ein freier Ladungsträger vorhanden ist. Beispielsweise können die Ladungsträger von trifunktionellen Aminocarbonsäuren stammen, die (a) eine Aminogruppe und zwei Carboxylatgruppen oder (b) zwei Aminogruppen und eine Carboxylatgruppe enthalten. Beispiele für derartige trifunktionelle Aminocarbonsäuren sind Lysin, Ornithin, Hydroxylysin, α,β-Diaminopropionsäure, Arginin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, Carboxyglutaminsäure und symmetrische trifunktionelle Carbonsäuren wie sie in EP-A-0 618 192 bzw. US-A-5,519,142 beschrieben sind. Alternativ kann bei den trifunktionellen Aminocarbonsäuren (a) eine der Carboxylatgruppen durch eine Phosphat-, Sulfonat- oder Sulfatgruppe ersetzt sein. Ein Beispiel einer solchen trifunktionellen Aminosäure ist Phosphoserin.
  • Alternativ kann der verzweigte Linker auch mindestens teilweise aus Phosphat-Zucker-Einheiten z.B. einem DNA-Rückgrat ohne Nukleobasen oder aus glykopeptidischen Strukturen aufgebaut sein. Darüber hinaus kann der Linker auch mindestens teilweise aus Saccharid-Einheiten bestehen. In jedem Fall liegt die Seitenkette des Linkers vorzugsweise an einer Verzweigung der Hauptkette, die durch eine trifunktionelle Einheit gebildet wird und die Länge einer Seitenkette beträgt mindestens zwei Synthesebausteine, z.B. natürliche oder synthetische Aminosäuren oder sonstige Bausteine wie Ethylenglykol.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Linkermolekül mit einem Molekulargewicht von 1 bis 15 kD an ein Biomolekül von 5 bis 500 kD gekoppelt werden und Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie isoliert oder ausgewählt werden. Die isolierten Fraktionen können dann in optimaler Weise verwendet werden, um ein zweites Molekül an das erste Konjugat zu koppeln.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt das zur chemischen Kopplung an ein Biomolekül verwendete geladene Linkermolekül eine oder mehrere Markierungsgruppen. Beispiele für Markierungsgruppen sind Markierungsgruppen und Effektorgruppen. An einigen Stellen wird zusätzlich durch die Beschriftung Linker (Markierung) darauf hingewiesen, dass die Markierungsgruppe bereits an den Linker gekoppelt ist.
  • Je kleiner die Markierungsgruppe, desto schwieriger ist die Trennung der Konjugationsprodukte einheitlicher Stöchiometrie zwischen einem Biomolekül und einer Markierung gemäß den Verfahren des Standes der Technik.
  • Die Markierungsgruppe (Effektorgruppe) hat vorzugsweise ein Molekulargewicht unter 15000 Da, mehr bevorzugt weniger als 10000 Da. Am meisten bevorzugt ist die Markierungsgruppe sogar kleiner als 5000 Da. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die, an den Linker gekoppelte Markierungsgruppe ein Molekulargewicht von 3000 Da oder weniger.
  • Das gesamte Molekulargewicht eines/r solchen Linkers (Markierung) d.h. ein Linker zusammen mit einer oder mehreren Markierungsgruppen, beträgt vorzugsweise 20 kD oder weniger, mehr bevorzugt 15 kD oder weniger und am meisten bevorzugt 10 kD oder weniger.
  • Die Markierungsgruppe kann aus beliebigen nachweisbaren bekannten Gruppen ausgewählt werden, beispielsweise aus Farbstoffen, Lumineszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Chemilumineszenzgruppen z.B. Acridiniumestern oder Dioxetanen oder Fluoreszenzfarbstoffen z.B. Fluorescein, Cumarin, Rhodamin, Oxazin, Resorufin, Cyanin und Derivaten davon. Weitere Beispiele für Markierungsgruppen sind lumineszierende Metallkomplexe wie Ruthenium- oder Europiumkomplexe, Enzyme wie für CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay z.B. EP-A-0 061 888) und Radioisotope.
  • Effektorgruppen bestehen z.B. aus einem Partner eines bioaffinen Bindungspaares. Während der Durchführung eines Assays kann die Effektorgruppe eine spezifische, vorzugsweise nicht-kovalente Wechselwirkung mit dem anderen Partner des bioaffinen Bindungspaares eingehen. Beispiele für geeignete Bindungspaare sind Hapten bzw. Antigen/Antikörper, Biotin bzw. Biotinanaloga wie etwa Aminobiotin, Iminobiotin oder Desthiobiotin/Avidin oder Streptavidin, Zucker/Lectin, Nukleinsäure bzw. Nukleinsäureanalogon/komplementäre Nukleinsäure, Rezeptor/Ligand z.B. Steroidhormonrezeptor/Steroidhormon. Bevorzugt wird das Mitglied des Bindungspaares mit dem niedrigeren Molekulargewicht an den Linker gekoppelt, bevor der Linker (Markierung) an das Biomolekül gekoppelt wird. Die bevorzugten Molekulargewichtsbereiche wie sie für Markierungsgruppen beschrieben sind, gelten auch für Effektorgruppen.
  • Bevorzugte Mitglieder von Bindungspaaren sind Hapten, Antigen und Hormon. Haptene wie Digoxin und Biotin sowie Biotinanaloge sind besonders bevorzugt.
  • Geladene lineare Linkermoleküle – oder Linkerstrukturen, die bereits eine Markierung tragen – werden wie im Wesentlichen in US 5,958,783 beschrieben – hergestellt.
  • Verzweigte geladene Linkermoleküle oder Linker-(Markierungs-)moleküle werden z.B. durch Festphasensynthese erhalten. Im ersten Schritt der Festphasensynthese wird eine Aminosäure über ihre Carboxylatgruppe an den Festphasenträger gekoppelt und dann durch sukzessive Kopplung weiterer Aminosäuren der gewünschte Linker aufgebaut. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Linkers wird dabei mindestens eine Aminosäure verwendet, die als Seitengruppe eine geladene Gruppe z.B. eine Amino- oder eine Carboxylatgruppe und mindestens eine Aminosäure, die als Verzweigungsstelle dient, gegebenenfalls in geschützter Form enthält. Nach Fertigstellung der gewünschten Linkersequenz wird der Linker entweder vom Festphasenträger abgespalten oder eine aktivierte Markierung z.B. eine einen aktiven Ester tragende Markierung kann an die freie N-terminale Aminogruppe des Festphasen gebundenen Peptids gekoppelt werden. Nach Abspaltung von der Festphase kann eine reaktive Gruppe Z an den Carboxyterminus des Peptidlinkers gekoppelt werden oder der Carboxyterminus selber fungiert als eine reaktive Gruppe Z. Gegebenenfalls vorhandene Schutzgruppen werden abgespalten.
  • In einer anderen Ausführungsform der Festphasensynthese kann ein Aminosäure-Markierungskonjugat, das eine geschützte Aminogruppe und eine Carboxylatgruppe enthält, z.B. Fmoc-Lys(Ru(bipyridyl)3-OH) über die freie Carboxylatgruppe an eine Festphase verankert werden und nach Freisetzung der blockierten Aminogruppe ein Peptidlinker aufgebaut werden. Nach Fertigstellung der gewünschten Linkersequenz wird der Komplex von der Festphase abgespalten. Die reaktive Gruppe Z kann an den Aminoterminus des resultierenden Peptidlinkers gekoppelt werden oder der Aminoterminus selber dient als die reaktive Gruppe Z.
  • Chemische Kopplung des Biomoleküls an ein Linkermolekül resultiert jedoch in einer statistischen Mischung verschiedener Biomolekül-Linkerprodukte. Mit anderen Worten, solch ein Rohkonjugat enthält viele verschiedene Kopplungprodukte in statistischen Mengen wie z.B. Biomoleküle, die überhaupt nicht konjugiert sind, Biomoleküle mit einer Linkerstruktur, Biomoleküle mit zwei Linkerstrukturen usw. Jede dieser Biomolekül-Linkerprodukt Untergruppen ist durch eine einheitliche Stöchiometrie charakterisiert. Das heißt, dass z.B. die Untergruppe bestehend aus einer Linkerstruktur pro Biomoleküle eine einheitliche Stöchiometrie von 1:1 aufweist.
  • Zum Beispiel können Hapten-Protein Konjugate durch Inkubation eines chemisch aktivierten Haptens mit einem Protein in einem vorbestimmten molaren Verhältnis synthetisiert werden. Spezifische Kopplungschemien, die verschiedene funktionelle Aminosäuregruppen (-SH; -NH2; -COO–; -OH; Iminogruppen von Tyrosin, Imidazolgruppen von Histidin) zum Ziel haben, sind bekannt. Normalerweise sind diese Gruppen wiederholt im Protein vorhanden. Als Folge ist die Verteilung des Haptens nicht einheitlich, sondern das Hapten wird an das Protein gebunden in einer Poisson-Verteilung. Die Poisson-Verteilung kann wie folgt dargestellt werden: P(r) = mrxe–m/r!
  • P(r) ist die Fraktion der Proteinmoleküle mit r (0, 1, 2, 3, usw.) gebundenen Haptenen pro Molekül; m ist das durchschnittliche molare Verhältnis zwischen Hapten und Protein in der Reaktionsmischung; e = die Euler'sche Zahl und r! stellt die Fakultät von r (z.B. im Fall r = 3, r! = 3 × 2 × 1) dar. Für eine Rohmischung von Kopplungsprodukten, die im Durchschnitt 1 gebundenes Haptenmolekül pro Proteinmolekül enthalten, bedeutet das zum Beispiel, dass statistisch ungefähr 36.7% der Proteinmoleküle unmarkiert sind, 36.7% tragen ein Haptenmolekül, 18.3% tragen zwei Haptenmoleküle, 6.1% tragen drei Haptenmoleküle und der Rest weist einen noch höheren Markierungsgrad auf.
  • Ein sehr attraktives Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass zum Beispiel Konjugate zwischen einem Biomolekül und einer kleinen Markierungsgruppe die durch ein Linkermolekül gekoppelt sind – das zusätzlich selber vorteilhafte Wirkungen auf z.B. Reduzierung des Hindergrunds in Immunoassays hat – nun in vorbestimmter und vordefinierter Zusammensetzung verfügbar sind.
  • Aus dem Stand der Technik bekannte Konjugate sind üblicherweise durch einen Markierungsgrad charakterisiert. Dieser Markierungsgrad bezeichnet die durchschnittliche Menge von Markierungen (oder Linker-(Markierungs-)gruppen) pro Biomolekül. Ein Markierungsgrad von 2,3 bedeutet daher, dass in der gesamten Mischung der Biomolekül-Markierungsprodukte 2,3 Markierungen pro Biomolekül vorhanden sind. Hochentwickelte Methoden können angewendet werden, um die relativen Mengen der Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie durch aufwendige Verfahren wie z.B. MALDI-TOF („matrix assisted laser desorption ionization-time of flight") Massenspekroskopie zu bestimmen. Solche Methoden sind jedoch nicht geeignet, um Fraktionen mit einheitlicher Stöchiometrie zu trennen. Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Herstellung eines Konjugats, das mindestens ein vorgewähltes Biomoleküle-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie in nicht-statistischen Mengen enthält.
  • Der Begriff „vorgewählt" wird verwendet um darauf hinzuweisen, dass das erfindungsgemäße Konjugat nicht bloß das statistische Ergebnis einer chemischen Konjugation zwischen einem Biomolekül und einem Linkermolekül ist, sondern das Ergebnis der Vorauswahl geeigneter Fraktionen. Ein Kopplungsprodukt oder wenn nötig mehrere Kopplungsprodukte einheitlicher Stöchiometrie können nun beliebig (je nach Bedarf) ausgewählt werden und das Konjugat kann für die beabsichtigte Anwendung die geeignete Zusammensetzung haben.
  • Die Art und Strategie der chemischen Kopplung kann nach Bedarf ausgewählt werden. Wenn das Biomolekül ein Polypeptid mit -SH, -NH2 oder -COO– Resten als funktionelle Gruppen ist, sind für jede dieser funktionellen Gruppen mehrere geeignete Kopplungschemien aus dem Stand der Technik bekannt, wobei hier nur einige erwähnt werden. Der sorgfältige Leser findet alle notwendigen Einzelheiten in Aslam, M. Dent, A. „The preparation of protein-protein conjugates" in „Bioconjugation" (1982) 216–363, London, McMillan.
  • Aminogruppen von Biomolekülen (die terminale -NH2 Gruppe oder die NH2 Gruppe einer Lysin Seitenkette, als auch ω-Aminogruppen von Diaminocarbonsäuren) können zur chemischen Kopplung einer Markierungsgruppe daran auf Grundlage der Aminochemie angewendet werden. Bekannte Beispiele der Aminochemie umfassen unter anderem die Reaktion von Aminogruppen mit sogenannten aktivierten Gruppen wie NHS Estern, andere aktivierte Ester, saure Chloride und Azide.
  • Carboxylgruppen an Biomolekülen (die terminale COO– Gruppe, die Carboxyfunktionen von Glutaminsäure oder Asparaginsäure) werden für chemische Kopplungen basierend auf Carboxychemie angewendet. Bekannte Beispiele der Carboxychemie umfassen unter anderem die Aktivierung dieser Carboxygruppen, um die obengenannten aktivierten Gruppen zu tragen. Kopplung an z.B. Aminogruppen der Markierung kann dann einfach durchgeführt werden.
  • Alternativ werden Sulfhydrylgruppen an Biomoleküle (z.B. freie -SH Gruppen von Cystein oder -SH Gruppen die durch Reduktion von Disulfhydrylbrücken erhalten werden) zur chemischen Kopplung verwendet basierend auf „Sulfhydrylchemie". Bekannte Beispiele der Sulfhydrylchemie umfassen unter anderem die Reaktion von -SH Gruppen mit Maleimidgruppen oder die Alkylierung mit der α-Halogencarbonsäuregruppe oder Thioether.
  • Die Hydroxylgruppe von Tyrosinresten oder die Imidazolgruppe von Histidin kann auch zur kovalenten Bindung einer Markierung an ein Biomolekül verwendet werden, z.B. mit Hilfe von Diazoniumgruppen.
  • Die chemische Reaktion zur Kopplung des Biomoleküls an den Linker oder Linker (Markierung) wird durchgeführt und, wenn nötig gestoppt, wie aus dem Stand der Technik bekannt. Während im Stand der Technik üblicherweise nur nicht-konjugierte kleine Linker oder Linker-(Markierungs-)moleküle aus der hochmolekularen Biomolekül-Linkerfraktion getrennt werden, ist die Trennung der freien Biomoleküle von konjugierten Biomolekülen sehr schwierig oder unmöglich. Diese Trennung und auch die Trennung und Auswahl der Kopplungsprodukte gemäß ihrer Stöchiometrie ist nun möglich und wird durch chromatographische Verfahren durchgeführt. Die Konjugationsprodukte werden in Fraktionen einheitlicher Stöchiometrie aufgetrennt, auf Grundlage von Eigenschaften die von der Linkerstruktur beigetragen werden.
  • Besonders attraktive Eigenschaften der neuartigen Biomolekül-Linkerprodukte sind Unterschiede im apparenten Molekulargewicht, Hydrophobizität und in der Ladung. Die Unterschiede der verschiedenen Kopplungsprodukte mit unterschiedlicher Stöchiometrie hängen einfach von der Anzahl der Linkerstrukturen pro Biomolekül ab.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die chromatographische Fraktionierung durch ein auf dem (apparenten) Molekulargewicht beruhenden Trennungsverfahren durchgeführt. Überraschenderweise konnten die unterschiedlichen Kopplungsprodukte mit einheitlicher aber unterschiedlicher Stöchiometrie aufgrund ihres Molekulargewichts fraktioniert werden, oder besser gesagt, diese Trennung basiert auf Unterschieden im apparenten Molekulargewicht. Obwohl die absoluten Unterschiede im Molekulargewicht zwischen Kopplungsprodukten mit unterschiedlicher Stöchiometrie relativ klein sind, sind die Unterschiede im apparenten Molekulargewicht ziemlich ausgeprägt. Dies wird durch die Linkermoleküle, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden bewirkt. Obwohl diese Moleküle ein Molekulargewicht von 1 bis 15 kD aufweisen, wandern sie als hätten sie ein sehr unübliches und sehr hohes apparentes Molekulargewicht.
  • Gemäß der Erfindung können nun z.B. Fab' Antikörperfragmente mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50 kD, die ein Linker-(Markierungs-)molekül tragen von Fab' Fragmenten, die keine, zwei, drei oder mehr Linker-(Markierungs-)moleküle tragen, in einfacher Weise getrennt und gegebenenfalls fraktioniert werden. Dies wird in den Beispielen 4 und 5 und in den 10 und 11 veranschaulicht. Eine solche Trennung ist möglich, da für die Linkerstrukturen der Biomolekül-Linkerkonjugate gemäß der vorliegenden Erfindung ein apparentes Molekulargewicht festgestellt wurde, das viel höher liegt als ihr tatsächliches Molekulargewicht.
  • Es ist möglich die Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie von noch größeren Biomolekülen wie z.B. F(ab')2 Fragmente (ungefähr 100 kD), RSA oder Immunoglobulin G und einem Linker oder Linker-(Markierungs-)molekül zu trennen, wenn sie an einen geeigneten Linker oder Linker (Markierung) gekoppelt sind.
  • Das apparente Molekulargewicht eines Biomoleküls kann leicht durch Verfahren aus dem Stand der Technik bestimmt werden. Molekular-Sieb Chromatographie wird z.B. routinemäßig angewendet. Das Molekül von Interesse wird chromatographiert und das apparente Molekulargewicht durch einen Vergleich der Retentionszeit für dieses Molekül mit der/den Retentionszeit/-en für eines oder mehrere Molekulargewichtsmarker bestimmt.
  • Da das apparente Molekulargewicht erheblich durch die verwendeten Bestimmungsverfahren beeinflusst wird, werden das apparente Molekulargewicht des Biomoleküls und das apparente Molekulargewicht des Linkers oder der Linker-(Markierungs-)struktur mit den gleichen Verfahren bestimmt.
  • Um die Trennung durch Molekulargewichts Chromatographie zu vereinfachen, werden Linker gewählt, die dem apparenten Molekulargewicht des Biomoleküls entsprechen. Das apparente Molekulargewicht des Linkers (Markierung) liegt vorzugsweise bei mindestens 20% und höchstens bei 500% des Molekulargewichts des Biomoleküls. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates mindestens bestehend aus einem Biomolekül-Linkerprodukt von einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge, wobei besagtes Konjugat aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD, zwischen 4 und 60 geladene Resten und ein apparentes Molekulargewicht zwischen 20% und 500% des apparenten Molekulargewichts des besagten Biomoleküls besteht dadurch gekennzeichnet, dass
    • a) das Biomolekül und das Linkermolekül kovalent aneinander gekoppelt sind,
    • b) die verschiedenen Biomolekül-Linkerprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie durch Chromatographie fraktioniert werden basierend auf den Unterschieden des apparenten Molekulargewichts besagter Biomolekül-Linkerprodukte, und
    • c) Fraktionen, die ein Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten gesammelt werden.
  • Mehr bevorzugt liegt das apparente Molekulargewicht des Linkers oder Linker (Markierung) zwischen 25% und 400% und am meisten bevorzugt zwischen 30% und 330% des apparenten Molekulargewichts des Biomoleküls.
  • Trennung nach (apparentem) Molekulargewicht wird vorzugsweise durch Molekular-Sieb Chromatographie unter Verwendung von Chromatographie Materialien wie Sephadex X 200 HR® durchgeführt.
  • Ein weiteres bemerkenswertes und charakteristisches Merkmal der Linkerstrukturen gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass sie mindestens vier geladene Reste pro Molekül tragen. Die hohe Anzahl geladener Reste innerhalb des Linkers führt auch zu Unterschieden in der Nettoladung der Biomolekül-Linkerprodukte, wobei diese Ladungsunterschiede von der Anzahl der Linker pro Biomolekül abhängen. Biomolekül-Linkerprodukte mit einem Linker pro Biomolekül (mit einheitlicher Stöchiometrie von 1:1) können nun überraschenderweise einfach von Biomolekül-Linkerprodukten mit verschiedener Stöchiometrie oder von Biomolekülen ohne angefügte Linker mit Hilfe von Ladungsunterschieden getrennt werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konjugates bestehend mindestens aus einem Biomolekül-Linkerprodukt von einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge, wobei besagtes Konjugat aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül besteht, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD und zwischen 4 und 60 geladene Resten aufweist dadurch gekennzeichnet, dass
    • a) das Biomolekül und das Linkermolekül kovalent aneinander gekoppelt sind,
    • b) die verschiedenen Biomolekül-Linkerprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie durch Chromatographie fraktioniert werden basierend auf den Unterschieden in der Ladung besagter Biomolekül-Linkerprodukte, und
    • c) Fraktionen, die ein Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten gesammelt werden.
  • Übliche Chromatographie Materialien und Verfahren wie Ionenaustausch Chromatographie z.B. unter Verwendung von Mono Q®, Mono S®, Source Q® oder Source S® der Firma Amersham-Pharmacia Biotech werden vorzugsweise zur Trennung von Biomolekül-Linkerprodukten mit einheitlicher Stöchiometrie auf Grund von Ladungsunterschieden benutzt. Fraktionen, die die gewünschten Produkte enthalten, werden gesammelt. Man erhält einzelne Biomolekül-Linkerprodukte mit vorbestimmter Stöchiometrie oder Mischungen mehrerer Produkte mit vorbestimmter Stöchiometrie in vorbestimmten relativen Mengen. Wenn erwünscht werden hohe Reinheitsgrade durch wiederholte Chromatographie erreicht. Jedes beliebige vorbestimmte Konjugatverhältnis wird durch Vereinigung der geeigneten Fraktionen erhalten.
  • Wie oben beschrieben sind die Kopplungsprodukte mit unterschiedlicher Stöchiometrie auch bezüglich ihrer Hydrophilie verschieden. Die hydrophilen Linkerstrukturen beeinflussen die gesamte Hydrophilie oder Hydrophobie der Kopplungsprodukte. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Produkte mit unterschiedlicher Stöchiometrie auch durch hydrophobe Interaktionschromatographie mit Hilfe von Harzen aus dem Stand der Technik wie Phenyl Sepharose HP®, Butyl Sepharose 4 fast flow oder andere getrennt. Wichtige Materialien und Verfahren sind bei Aslam, M. Dent, A. „The preparation of protein-protein conjugates in „Bioconjugation" (1998) 216–363, London, McMillan beschrieben. Umkehrphasenchromatographie kann auch benutzt werden.
  • Das gemäß der hierin beschriebenen Verfahren hergestellte Konjugat enthält mindestens ein einheitliches Kopplungsprodukt zwischen einem Biomolekül und einem Linkermolekül in den gewünschten Mengen. Die relativen Mengen jeden Kopplungsprodukts mit einheitlicher Stöchiometrie können nach Bedarf vorbestimmt werden. Vorbestimmte, gewünschte relative Mengen individueller Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie können genau und reproduzierbar eingestellt werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das vorbestimmte Konjugat im Wesentlichen frei von nicht-konjugierten Biomolekülen.
  • Es ist auch bevorzugt auf Grund der nun möglichen Fraktionierung, dass das erfindungsgemäße Konjugat keine Biomolekül-Linkerprodukte in einer Stöchiometrie von 1:5 und höher enthält.
  • Die vorliegende Offenbarung betrifft auch ein Konjugat bestehend aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD und zwischen 4 und 60 geladene Rest aufweist dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Konjugat mindestens ein Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie in vorbestimmter Menge enthält.
  • Jede beliebige Reinheit der einzelnen Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie kann nun hergestellt und reproduziert werden. Mischungen die verschiedene Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie im erforderlichen Verhältnis (relative Mengen) enthalten, können leicht hergestellt und reproduziert werden. Deshalb enthält das Konjugat mindestens ein Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten relativen Menge im Vergleich zu mindestens einem anderen Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie.
  • Je weniger Biomolekül-Linkerprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie einen Teil des Konjugats bilden, desto einfacher kann es hergestellt oder reproduziert werden. Ein bevorzugtes Konjugat umfasst im Wesentlichen ein bis drei einzelne Biomolekül-Linkerprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie. Noch bevorzugter enthält das Konjugat im Wesentlichen zwei verschiedene Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie. In einer meist bevorzugten Ausführungsform enthält das Konjugat im Wesentlichen ein Biomolekül-Linkerprodukt mit einer Stöchiometrie von 1:1.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Konjugat im Wesentlichen nur ein Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie.
  • Von den verschiedenen Kopplungsprodukten sind die mit einheitlicher Stöchiometrie von 1:1 und 1:4 bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Biomolekül-Linkerprodukte mit einer Stöchiometrie von 1:2 und 1:1, wobei letzteres das am meisten bevorzugte Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie darstellt.
  • Der Begriff „enthält im Wesentlichen" bezieht sich auf die relative Menge eines Kopplungsproduktes (oder einer Mischung aus bis zu drei Kopplungsprodukten) (je) mit einheitlicher Stöchiometrie im Vergleich zu der relativen Menge anderer Kopplungsprodukte. Mit anderen Worten haben mindestens 80% aller Kopplungsprodukte in einem solchen Konjugat die vorbestimmte Stöchiometrie. Der Begriff „enthält im Wesentlichen" bezieht sich bevorzugt auf Konjugate, die mindestens 80% des einheitlichen Kopplungsprodukts (oder der gewünschten Mischung der Kopplungsprodukte) enthalten. Konjugate sind mehr bevorzugt, die 90% des vorbestimmten Kopplungsprodukts oder eine Mischung der Kopplungsprodukte enthalten. Am meisten bevorzugt ist eine relative Reinheit von 95% für das/die gewählte/n Konjugat/e verglichen mit anderen Kopplungsprodukten.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Konjugat mindestens 80% von zwei und am meisten bevorzugt mindestens 80% von nur einem Biomolekül-Linkerprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie in einer relativen Menge verglichen mit anderen Kopplungsprodukten.
  • Ein sehr bevorzugtes Konjugat enthält das Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie von 1:1 zwischen einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül, wobei besagter Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 und 15 kD und zwischen 4 und 60 geladene Reste aufweist, in einer relativen Reinheit von 80% oder mehr. Das bedeutet, dass dieses 1:1 Konjugat in einer relativen Menge von 80% oder mehr vorhanden ist bezogen auf die Summe der anderen Biomolekül-Linkerprodukte.
  • Bevorzugter ist ein Konjugat bestehend aus dem Kopplungsprodukt mit 1:1 Stöchiometrie in einer relativen Menge von 90% oder mehr, Konjugate sind noch mehr bevorzugt bestehend aus dem Kopplungsprodukt mit 1:1 Stöchiometrie in einer relativen Menge von 95% oder mehr verglichen mit Kopplungsprodukten unterschiedlicher Stöchiometrie.
  • Heutzutage werden kommerzielle Assays so hergestellt, dass sie so wenige Handhabungsschritte wie möglich benötigen. Das ist praktisch und reduziert das Risiko von Handhabungsfehlern. Natürlich kann das erfindungsgemäße Konjugat dem Kunden als solches angeboten werden, z.B. gefroren oder lyophilisiert.
  • Das Konjugat ist vorzugsweise Teil einer Reagenzzusammensetzung. In vielen Fällen liegt das Konjugat in gelöster und flüssiger Form vor und deshalb sind Stabilisatoren, wie z.B. Rinderserumalbumin und/oder verschiedene Zucker und wahlweise auch Konservierungsmittel und/oder Detergenzien vorhanden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Offenbarung auf eine Zusammensetzung von Reagenzien aus Pufferkomponenten, einem stabilisierenden Reagenz sowie einem Konjugat, das mindestens ein Biomolekül-Linkerprodukt einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge enthält.
  • Vorzugsweise wird das nach der vorliegenden Erfindung hergestellte Konjugat in einer Teststreifenartigen immunologischen Vorrichtung verwendet.
  • Normalerweise werden dem Kunden nicht ein einzelnes Reagenz, sondern vollständige Kits, die mindestens die für den Analyten spezifischen Nachweisreagenzien enthalten, zur Verfügung gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich die Offenbarung auf ein Testkit für den biochemischen und immunologischen Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei das besagte Kit Puffer und Reagenzien sowie mindestens eine Zusammensetzung von Reagenzien, die ein nach der vorliegenden Erfindung hergestelltes Konjugat umfasst, enthält.
  • Immunoassays, die auf den neuen Konjugaten basieren, haben im Vergleich zu Nachweisen, die auf nach herkömmlichen Methoden hergestellten Konjugaten basieren, überragende Eigenschaften. Dieser positive Effekt auf den Nachweis selbst wird im Beispielteil aufgezeigt. Bemerkenswerterweise wird das Hintergrundproblem signifikant verringert, wenn das Konjugat unter vergleichbaren Testbedingungen verwendet wird. Die Verwendung eines Konjugates, das als Biomolekül wie beschrieben ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares umfasst, in einem Immunoassay stellt deshalb eine weitere bevorzugte Ausführungsform dar.
  • Vorzugsweise verwendet man das Konjugat zum Nachweis eines Analyten, die auf der Reaktion zwischen einem analytenspezifischen Bindungspartner und dem Analyten, sowie der Bestimmung des entstehenden Analytbindungspartnerkomplexes beruht.
  • Die bekanntesten Beispiele für Nachweismethoden, die auf spezifischer Bindung basieren, sind Immunoassays. Bei Immunoassays, die auf einem Biomolekül-Linker (Markierungs) Konjugat basieren, tragen die neuen Verfahren und Reagenzien zur Reproduzierbarkeit der Konjugate bei. In je höherem Maße die Konjugate reproduzierbar sind, desto besser reproduzierbar sind die auf ihnen basierenden Analysen.
  • Wie schon erwähnt können sowohl die Qualität als auch die Reproduzierbarkeit eines Konjugates mit den Verfahren gemäß dem Stand der Technik nur in einem begrenzten Ausmaß beeinflusst werden. Es ist z.B. möglich Aggregate oder Prezipitate vom endgültigen Konjugat zu entfernen. Es ist mit den Verfahren gemäß dem Stand der Technik nicht möglich die relativen Mengen der Kopplungsprodukte mit unterschiedlicher Stöchiometrie zwischen dem Biomolekül und dem Linkermolekül einzustellen. Es ist sehr schwierig oder nicht möglich die Fraktion(en), die das/die Kopplungsprodukte) mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten, welches/welche sich am besten für die gewünschte Anwendung eignet/eignen, auszuwählen. Diese Nachteile konnten mit der vorliegenden Erfindung überwunden werden.
  • Die folgenden Beispiele, Literaturangaben und Abbildungen werden zur Verfügung gestellt, um das Verständnis für die vorliegende Erfindung zu fördern, deren wahrer Umfang in den im Anhang befindlichen Ansprüchen weiter ausgeführt wird.
  • Legende zu den Abbildungen
  • 1: Schematische Darstellung der Kopplung von RSA und dem hy-BPRu-Linker
  • Aus der schematischen Abbildung von RSA ist ersichtlich, dass mehrere -NH2-Gruppen für die Bindung am hy BPRu-Linker (Markierung) zur Verfügung stehen.
  • 2: Superdex 200 HR® Chromatograph eines RSA-hy-BPRu-Konjugates
  • Dieser Chromatograph zeigt, dass die Kopplungsprodukte mit unterschiedlicher Stöchiometrie als ein einziger einheitlicher Peak wandern. Dieser einzige Peak stellt eine statistische Mischung von Kopplungsprodukten dar.
  • 3: Schematische Abbildung von BPRu-(UE)25K und BPRu(UE)50K
  • Diese Linkerstrukturen enthalten wiederholt das Dipeptid β-Alanin-Glutaminsäure (UE).
  • 4: Verzweigter Linker mit kurzer Hauptkette
  • Dieser verzweigte Linker enthält geladene Reste in der kurzen Hauptkette, sowie auch in den Seitenketten.
  • 5: Verzweigter Linker mit langer Hauptkette
  • Dieser verzweigte Linker enthält geladene Reste in der langen Hauptkette, sowie auch in den Seitenketten.
  • 6: Verzweigter Linker ohne geladene Reste
  • Dieser Linker ist dem Linker aus der 4 sehr ähnlich, enthält aber keine geladenen Glutaminsäurereste, stattdessen wird Glutamin verwendet. Das apparente Molekulargewicht wurde mit 3,6 kD festgestellt verglichen mit dem des Linkers aus 4 mit 18 kD.
  • 7: Schematische Abbildung von biotinylierten Linkermolekülen
  • Diese N-terminal biotinylierten (Bi-)Linkermoleküle tragen am C-Terminus-MH- bzw. DSS-Gruppen, die für die Kopplung an ein Biomolekül verwendet werden.
  • 8: Vielfach verzweigte Linker
  • Diese schematische Abbildung zeigt einen vielfach verzweigten Linker mit verzweigten Seitenketten, die zwei Rutheniummarkierungen (BPRu) tragen.
  • 9: Superdex 200 HR® Chromatographie von verschiedenen Linkermolekülen
  • RSA und die verschiedenen Linkermoleküle wurden unter identischen Bedingungen chromatographiert. Das obere Diagramm zeigt Linkerstrukturen gemäß den 4 und 6. Das untere Diagramm zeigt Linkerstrukuren gemäß der 3.
  • 10: Mono Q® Chromatograph eines RSA-Ru(SK)4-MH-Rohkonjugats
  • Das Chromatograph zeigt eine Grundtrennung von RSA (1) und Konjugationsprodukten einheitlicher 1:1 (2) bzw. 1:2 (3) Stöchiometrie.
  • 11: Source 15 Q® Chromatograph eines RSA-Ru(UE)25-MH-Rohkonjugats
  • Drei Konjugate einheitlicher Stöchiometrie 1:1, 1:2 und 1:3 (2, 3 bzw. 4) sind eindeutig von einander, sowie von nicht konjugiertem RSA (1) getrennt.
  • 12: Superdex 200 HR® Chromatograph eines ersten Fab'-Ru(UE)25-MH-Kopplungsproduktes
  • Das Rohkonjugat wird in drei Hauptpeaks aufgetrennt. Der Peak III, der mit einem apparenten Molekulargewicht von 50 kD wandert enthält sowohl nicht umgesetztes Fab' als auch den nicht umgesetzten Linker (Ru(UE)25-MH). Peak II, der mit einem apparenten Molekulargewicht von 100 kD wandert, enthält das im Wesentlichen reine 1:1 Kopplungsprodukt zwischen Fab' und Linker (Markierung). Der Peak I enthält das 1:2 Kopplungsprodukt (apparentes Molekulargewicht von 150 kD). Die Zusammensetzung jeden Pools wurde durch MALDI-TOF MS bestätigt.
  • 13: Superdex 200 HR® Chromatograph eines zweiten Fab'-Ru(UE)25-MH-Kopplungsproduktes
  • Die Peaks 1, 2 und 3 entsprechen jeweils Fraktionen, die Konjugate mit 1:3, 1:2 bzw. 1:1 Stöchiometrie enthalten. Die Peaks 4 und 5 enthalten die nichtkonjugierten Ausgangsmaterialien (Linker- und Fab'-Fragmente). Alle Strukturen wurden durch MALDI-TOF MS bestätigt.
  • 14: Reinigung von F(ab')2-BPRu-(UE)25-DSS-Kopplungsprodukten
  • Das Rohkonjugat wird durch Superdex 200 HR® Chromatographie aufgetrennt. Die Peaks, die 1:2 und 1:1 Kopplungsprodukte enthalten werden getrennt gesammelt und rechromatographiert. Die Zusammensetzung dieser Kopplungsprodukte wurde durch MALDI-TOF MS bestätigt.
  • 15: Reinigung von F(ab')2-BPRu-UEEK-DSS-Kopplungsprodukten
  • Das Rohkonjugat wird durch Superdex 200 HR® Chromatographie aufgetrennt. Man findet nur einen symmetrischen „Produktpeak", der eine statistische Mischung von Kopplungsprodukten unterschiedlicher Stöchiometrien enthält.
  • 16: Reinigung von IgG-(Bi-(UE)25-DSS-Kopplungsprodukten
  • Das Rohkonjugat wird durch Source 30® Chromatographie gereinigt. Nicht-konjugiertes IgG (Pool 1) wird leicht von der Säule eluiert. Mono-biotinyliertes IgG wird gesammelt (Pool 2) und eindeutig vom di-biotinylierten IgG (Pool 3) getrennt.
  • Beispiel 1: Ruthenylierung von Rinderserumalbumin nach dem Stand der Technik
  • Rinderserumalbumin und ein im Stand der Technik bekannter Linker (siehe 1) wurden verwendet um Konjugationsansätze zu erstellen. Alle Variablen, wie Ansatzmenge, Konzentrationen der Reagenzien, Pufferzusammensetzungen, Reaktionszeit, Temperatur der Reagenzien sowie die chromatographische Trennung wurden konstant gehalten.
  • RSA wurde in 100 mM Kaliumphoshatpuffer (pH 8,0) in einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. Der hy-BPRu-Linker (Markierung; vgl. 1, oben) wurde in DMSO in einer Konzentration von 47 mg/ml gelöst. Es wurde ein 5facher molarer Überschuss an hy-BPRu zur RSA-Lösung hinzugegeben, die Reagenzien wurden gründlich gemischt und die Reaktion wurde für 75 min bei 25°C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Lysin zu einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt und unter Rühren für weitere 30 min bei 25°C inkubiert.
  • Freie nichtgebundene Derivatisierungsreagenzien wurden durch Dialyse (20 Stunden bei 4°C) gegen Phosphat gepufferte Salzlösung mit 50 mM Phosphat, 150 mM Natriumchlorid bei pH 7,5 (PBS) in 500fachem Überschuss vollständig entfernt.
  • Die aktiven Gruppen, der O-Hydroxysuccinimid Ester in 1, reagieren statistisch mit den verschiedenen NH2-Gruppen des RSA. Das entstandene Rohkonjugat wurde mit Superdex 200 HR® Chromatographie unter Pufferbedingungen von 0,05 mmol/l Natriumphosphat, 0,05 mmol/l Natriumchlorid und 5% Methanol bei einem pH von 6,5 chromatographiert. Die Elution wird überwacht. Entsprechende Fraktionen werden gesammelt. Der Produktpeak wurde durch Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) analysiert. Die Ergebnisse einer solchen Analyse sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengefasst.
  • Tabelle 1: Verteilung von RSA-Ruthenium-Konjugaten nach Molekulargewicht
    Figure 00280001
  • Tabelle 2: Relative Mengen der verschiedenen Kopplungsprodukte (das in höchster Menge vorkommende Kopplungsprodukt wurde gleich 1 gesetzt und die anderen werden als relative Mengen dazu angegeben)
    Figure 00290001
  • Aus den Tabellen 1 und 2 wird ersichtlich, dass alle 5 Chargen, obwohl sie unter identischen Bedingungen erstellt wurden, sich doch klar von einander unterscheiden. Chargen 1 und 2 haben den gleichen gesamten Markierungsgrad von 2,3 (das heißt, dass im Durchschnitt 2,3 Ruthenium-Markierungen pro RSA-Molekül gefunden werden). Trotzdem unterscheiden sich die beiden Präparate signifikant in den relativen Mengen der jeweiligen Kunjugationsprudukte wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist. Es gibt auch recht deutliche Schwankungen im Gesamtmarkierungsgrad. Aus 2 ist ersichtlich, dass durch herkömmliche chromatographische Verfahren unter Verwendung einer Superdex 200 HR® Säule alle Reaktionsprodukte als ein homogener Peak eluieren. Die Fraktionierung von Kopplungsprodukten, z.B. in eine Fraktion, die einheitlich ein 1:1 Konjugat enthält, ist nicht möglich.
  • Beispiel 2: Synthese von Linkerstrukturen
  • Synthese von verzweigten Linkerstrukturen
  • Herstellung von verzweigten Linkern durch Festphasenpeptidsynthese
  • Die verzweigten Linker wurden mittels Fluorenylmethyloxycarbonyl-(Fmoc)-Festphasenpeptidsynthese an einem diskontinuierlichen Peptidsynthesizer, z.B. von der Firma Applied Biosystems A433, hergestellt. Dazu wurden jeweils 4,0 Äquivalente der in Tabelle 3 dargestellten Aminosäurenderivate verwendet.
  • Tabelle 3:
    Figure 00300001
  • Die Aminosäuren und Aminosäurederivate wurden in N-Methyl-Pyrrolidon gelöst. Das Peptid wird an Wang Harz (S.-S. Wang, J. Am. Chem. Soc. 95(1973) 1328) aufgebaut. Das Harz wird mit 0,2 bis 0,4 mmol/g beladen. Die Kopplungsreaktionen wurden bezüglich des Fmoc-Aminosäurederivats mit 4 Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und 4 Äquivalenten N-Hydroxybenzotriazol in Dimethylformamid als Reaktionsmedium während 20 min durchgeführt. Die Fmoc-Gruppe wurde nach jedem Syntheseschritt mit 20%-igem Piperidin in Dimethylformamid in 20 Minuten abgespalten. Die Menge an Harz wurde so gewählt, dass nach der letzten Verzweigung 4 Äquivalente Fmoc-Aminosäure bezogen auf die Aminogruppen eingesetzt werden. Für die Verzweigung und die anschließende Synthese von zwei identischen Armen wird Fmoc-Lys(Fmoc)-OH verwendet. Die unsymmetrischen Verzweigungen werden über Aminosäurederivate mit orthogonalen Seitenkettenschutzgruppen, wie z.B. Fmoc-Lys(Dde) oder Fmoc-Lys(Alloc) erzielt. Die Abspaltung dieser orthogonalen Schutzgruppen erfolgt nach den in der Literatur bekannten Methoden am Harz (B. W. Bycroft et al. (1993), J. Chem. Soc. Chem. Commun., 778; A. Mezouk et al., (1992) Tetrahedron Lett. 33, 477). Gegebenenfalls werden endständige terminale Aminogruppen an der Festphase mit Essigsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid acetyliert oder succinyliert.
  • Die Einführung des Haptens, der Markierung oder der funktionellen Gruppe erfolgte wenn das Derivat stabil ist, während der Festphasensynthese, bereits am Harz, z.B. an der N-terminalen Aminosäure des Peptids.
  • Die Einführung z.B. einer Metallchelat Markierung erfolgte über entsprechende Aktivesterderivate an die freie N-terminale Aminogruppe des trägergebundenen Peptids. Hierzu wurden pro freie primäre Aminofunktion vier Äquivalente Ruthenium(bipyridyl)3-Komplex (BPRu) aktiviert mit N-Hydroxybenzotriazol/Dicyclohexyl-Carbodiimid und in einer kleinen Menge DMSO gelöst, tropfenweise hinzugefügt und 2 h bei Raumtemperatur gerührt.
  • Die Einführung der Markierung kann auch am C-Terminus bereits während der Festphasensynthese, durch den direkten Einbau von zum Beispiel Metallchelat oder Biotin-gekoppelten Aminosäurederivaten erfolgen (beschrieben in WO 96/03409).
  • Die Freisetzung des Peptids vom Träger und die Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppen erfolgt mit 20 ml Trifluoressigsäure, 0,5 ml Ethandiol, 1 ml Thioanisol, 1,5 g Phenol und 1 ml Wasser innerhalb von 40 Minuten bei Raumtemperatur. Abhängig von den verwendeten Aminosäurederivaten, ist es auch möglich Mischungen mit weniger Radikalfängern einzusetzen. Anschließend wurden 300 ml gekühlter Diisopropylether zu der Reaktionslösung gegeben und die Mischung wurde für 40 min bei 0°C gehalten, um das Peptid vollständig zu präzipitieren. Der Niederschlag wurde gefiltert, mit Diisopropylether gewaschen und in einer kleinen Menge 50% Essigsäure gelöst und lyophilisiert. Das erhaltene Rohmaterial wurde mittels präparativer HPLC an Delta-PAK RP C18 (Säule 50 × 300 mm, 100 Å; 15 μ) über einen entsprechenden Gradienten (Eluierungsmittel A: Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure, Eluierungsmittel B: Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) in ca. 120 min aufgereinigt. Das eluierte Material wurde durch Massenspektrometrie identifiziert.
  • Alternativ kann die Markierungsgruppe auch nach der Abspaltung vom Harz eingeführt werden. Hierzu werden eventuell weitere Gruppen, die nicht derivatisiert werden sollen, mit einer Schutzgruppe blockiert, die sowohl während der Festphasenpeptidsynthese als auch während der Abspaltung stabil ist. Es kann z.B. Phenylacetyl (Phac) verwendet und die Schutzgruppe enzymatisch mit PenG-Amidase entfernt werden (beschrieben in WO 96/03423).
  • b) Synthese von linearen geladenen Linkerstrukturen
  • Lineare geladene Linkerstrukuren wurden im Wesentlichen, wie in US 5,958,783 beschrieben, synthetisiert.
  • c) Beispiele für untersuchte Linkerstrukturen
  • Tabelle 4 gibt einen Überblick über einige der verwendeten Linkerstrukturen. Die Strukturen 1 und 10 sind aus dem Stand der Technik bekannte Strukturen, während alle anderen Strukturen zusätzliche Eigenschaften, wie z.B. ein bemerkenswert hohes apparentes Molekulargewicht aufweisen.
  • Wo vorhanden, wurden auch Labornamen angegeben. Es wird auf die Abbildungen verwiesen, in denen diese Strukturen (oder die für die MH- oder DSS-Aktivierung verwendete Grundstrukturen) zu finden sind. Tabelle 4: Übersicht über Linkerstrukturen (linear oder verzweigt)
    Figure 00330001
    • (a)
    apparentes Molekulargewicht
    n.b.
    nicht bestimmt
    n.g.
    nicht gezeigt
    MH
    Maleimid aktiviert
    DSS
    N-Hydroxysuccinimidsuberat
    Bi
    Biotin
    []
    Grundstruktur in Abbildung [] gezeigt
  • In 9 sind Superdex 200 HR® Chromatogramme von Linker-(Markierungs-)Strukturen im Vergleich zu RSA gezeigt. Der schwerwiegende Einfluss von geladenen Resten wird aus dem obersten Feld ersichtlich, während der ungeladene Linker mit einem Molekulargewicht von etwa 3500 Da wandert, findet man den geladenen Linker mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 18000 Da. Das untere Feld der 9 zeigt den großen Einfluss, den eine lange geladene Hauptkette eines Linkermoleküls auf Unterschiede im apparenten Molekulargewicht, ausübt. Die Struktur 2 (BPRu-(UE)25), die ein Molekulargewicht von 5802 aufweist, wandert zum Beispiel mit einem apparenten Molekulargewicht von circa 50000 Da.
  • Wie schon in 4 angedeutet, können Linkermoleküle aktiviert werden. Ein Beispiel für Aktivierung ist die Einführung einer Maleinimid Funktion. Um die Maleinimid Funktion einzuführen, wird ein z.B. nach dem Beispiel 2 hergestellter Linker in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7 gelöst, mit einem Äquivalent Maleinimidhexansäure und N-Hydroxysuccinimidester (gelöst in DMSO) versetzt und für 16 h bei 25°C gerührt. Das Präparat wird durch präparative HPLC unter Verwendung einer RPC18 Säule (siehe oben) gereinigt. Die Identität des eluierten Materials wird mit Hilfe von Massenspektrometrie überprüft.
  • Beispiel 3: Neuartige Rinderalbumin-Linker Konjugate
  • Wie in WO 96/03652 beschrieben, sind Trägermoleküle, die multimere Antigene umfassen, von großem Vorteil für den Nachweis von anti-viralen Antikörpern. Zur Herstellung eines Polyhaptens, werden die Aminogruppen eines Trägermoleküls zuerst mittels einer Aktivestergruppe aktiviert. Diese Aktivestergruppe wird passend zur korrespondierenden aktiven Gruppe an der verwendeten Markierungsgruppe ausgewählt. Bevorzugte Gruppen sind die Maleinimidhexyl-(MHS) oder Maleinimidopropyl-N-hydroxysuccinimid-Ester (MPS). Daraus resultiert die partielle Derivatisierung der primären Aminogruppen am Träger (zum Beispiel der ε-Aminoseitenketten der Lysinreste), um die gewünschten Maleinimidgruppen zu tragen. Nach Kopplung der Markierungsgruppe an den aktivierten Träger, liegen die NH2-Gruppen des Trägers entweder in unmodifizierter Form vor oder sie tragen eine MHS-Gruppe oder eine Markierung über einem MHS-Linker.
  • Die Linker-(Markierungs-)strukturen wie in den 3 (DSS-aktiviert) und 8 schematisch gezeigt, wurden unter identischen Bedingungen an RSA gekoppelt.
  • RSA wird in 0,1 mmol/l Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 zu einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Der/Die Linker (Markierung) wird in einem Molverhältnis von 4,5 pro Mol RSA zugesetzt. Die Reaktion wird 3 Std. bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wird einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen. Die Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie werden mit Hilfe einer Source 15 Q® oder einer Mono Q® Säule getrennt.
  • Das Rohkonjugat der mehrfach-verzweigten Linker (siehe 8 und Struktur 13 aus Tabelle 1) wurde mittels Mono Q® Chromatographie fraktioniert. Die Elution erfolgte mit einem Salzgradient von 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) (= Eluent A) zu 1 M Natriumchlorid in 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) (= Eluent B) eluiert. Die Elution wird bei 280 nm kontrolliert. Der in 10 gezeigte Gradient deckt den Bereich von 25 bis 54% Eluent B ab und entspricht 30 min Elution. Entsprechende Fraktionen werden vereinigt. Fraktionen werden durch MALDI-TOF-MS analysiert. MS Daten bestätigten, dass jeder der drei Peaks RSA (1 in 10) und 1 bzw. 2 Linker (Markierungs) Gruppen-tragende RSA Moleküle (2 bzw. 3 in 10) in reiner Form enthielten.
  • Das mit den langen und stark-negativ geladenen linearen Linkern erhaltene Rohkonjugat (siehe Struktur 12 aus Tabelle 4 und 3) wurde mittels Source 15 Q® Chromatographie getrennt. Die Elution erfolgte mit einem Salzgradient von 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) (= Eluent A) zu 1 M Natriumchlorid in 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) (= Eluent B) eluiert. Die Elution wird bei 280 nm kontrolliert. Der in 10 gezeigte Gradient deckt den Bereich von 30 bis 40% Eluent B ab und entspricht 30 min Elution. Entsprechende Fraktionen werden vereinigt. Fraktionen werden durch MALDI-TOF-MS analysiert. MS Daten bestätigten, dass jeder der drei Peaks RSA (1 in 11) und 1, 2 bzw. 3 Linker (Markierungs) Gruppen-tragende RSA Moleküle (2, 3 bzw. 4 in 11) in reiner Form enthielten.
  • Beisiel 4: Herstellung eines ersten neuartigen Fab'-Linker Konjugats
  • 1. Beschreibung des Verfahrens
  • 1.1. Herstellung des Fab' aus IgG
  • Ein monoklonaler Antikörper gegen Digoxin (anti-Dig) wurde mittels Pepsin zu F(ab')2 gespalten. Nach quantitativer Spaltung wurde das Pepsin durch pH Erhöhung und zugesetztes Pepstatin inaktiviert. Das F(ab')2 wurde zu Fab' durch Cysteamin reduziert ohne vorhergehende Reinigung. Cysteamin spaltet nahezu selektiv die Disulfidbrücken in der Hinge Region. Danach wurde dialysiert. Hierbei wurden die durch Pepsin erzeugten Fc Spaltprodukte größtenteils entfernt, da sie klein genug sind um die Poren des Dialyseschlauchs zu passieren (> 10000 Dalton).
  • 1.2. Fab'-BPRU Linkerkonjugat
  • Die Konjugatsynthese wurde mit Hilfe von -SH Gruppenchemie durchgeführt, indem Fab' mit einem Überschuss von BPRu-Linker-MH umgesetzt wurde. Dabei wurde hauptsächlich eine SH Gruppe in der Hinge Region umgewandelt. Als Nebenreaktion entstanden kleine Mengen mehrfach ruthenylierter Fab' als Folge von reduzierten intramolekularen Disulfidbrücken in der leichten und in der Fd-Kette.
  • 1.3. Reinigung des Rohkonjugats
  • Das Rohkonjugat wurde durch ein Molekularsieb gereinigt. Dabei wurde das monoruthenylierte Material vom mehrfach ruthenyliertem Material getrennt.
  • 2. Verfahren
  • 2.1. Spaltung des Antikörpers zu von F(ab')2
  • Das Lyophilisat des monoklonalen Antikörpers anti-DIG-M19,11 IgG wurde mit H2O rekonstituiert, um eine Konzentration von 20 mg/ml zu erhalten. 20 μl 1 M Citrat pH 3,5 wurden pro ml Lösung zugegeben (Endkonzentration Citrat = 20 mM). Der pH wurde mit HCl auf 3,60 eingestellt. Es wurde durch einen 0,45 μm Filter filtriert. Die Konzentration wurde bei OD 280 nm (1 OD 280 nm = 1,4 mg/ml) bestimmt. Mit 20 mM Citrat pH 3,60 wurde auf 10 mg/ml eingestellt. Die Lösung wurde in einem Wasserbad auf 37°C erwärmt. 100 μl Pepsinlösung (3 mg/ml) wurde pro ml Antikörperlösung zugegeben und bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Nach vollständiger Spaltung wurde die Reaktion durch Erhöhung des pH Wertes und Zugabe von Pepstatin gestoppt.
  • 2.2. Reduktion zu Fab'
  • 52,6 μl 0,1 M Dithiothreitol (DTT) wurden pro ml Spaltmischung zugegeben und 30 min bei 25°C im Wasserbad inkubiert. Das Fab' wurde gegen 0,1 M NaH2PO4/NaOH pH 6,5, 30 mM NaCl, 2 mM EDTA dialysiert.
  • 2.3. Synthese des Fab'-BPRu Linker-Konjugats
  • Der BPRu Linker-MH (der verzweigte Linker aus 8, jedoch ein DSS anstelle von einer MH Gruppe tragend) wurde in DMSO gelöst. Die Stöchiometrie Fab':BPRu-Linker-MH betrug 1:3 (Mol/Mol). Die Endkonzentration von Fab' in der Mischung betrug 3,9 mg/ml. Die maximale DMSO Konzentration in der Mischung betrug 10%. Die Reaktionszeit war 1 Std. bei Raumtemperatur.
  • 2.4. Reinigung
  • Das Rohkonjugat wurde 2 bis 3-fach mit Hilfe eines Amicon PM 10 konzentriert und durch Superdex 200 HR gereinigt (Puffer: 25 mM MOPS/NaOH pH 6,5, 50 mM NaCl, 10% DMSO; aufgetragene Menge: max. 1,5% der Gelbettes, Fraktionen: 0,5% vom Gelbett). Die das Fab'-BPRu-Linkerkonjugat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. Wenn nötig kann chromatographiert werden.
  • Das Rohkonjugat enthält vor allem Kopplungsprodukte bestehend aus Fab' Fragmenten, an denen ein Linker an einer der -SH Gruppen in der Hinge Region gebunden ist. Auch mehrfach markierte Fab' Fragmente sind in kleiner Menge vorhanden (siehe Peaks III, II bzw. I in 12).
  • Beispiel 5: Herstellung eines zweiten neuartigen Fab'-BPRu(UE)25 Konjugats
  • 1. F(ab')2 und Fab' Fragmente wurden aus einem Anti-HIV p24 monoklonalen Antikörper hergestellt
  • Die Fragmentierung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die F(ab')2 Lösung wird gegen 50 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchlorid Puffer pH 7,5 dialysiert. Cysteamin in einer Endkonzentration von 25 mM wird einer F(ab')2 Lösung mit 5 mg/ml F(ab')2 Fragmenten zugesetzt. Die Lösung wird 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Pufferwechsel unter Anwendung eines PD10 Säulenpuffer auf pH 6,0 mit 50 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid Puffer gestoppt.
  • 2. Ruthenylierung des Fab' Fragments
  • Der Linker BPRu-(UE)25-MH wird in DMSO in einer Konzentration von 25 mg/ml gelöst. Das Molverhältnis von Fab' Fragmenten zu BPRu-(UE)25-MH Linker (Markierung) wird auf 1 bis 2 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird 90 Minuten bei 25°C in 50 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchloridlösung (pH 7,1) inkubiert. Die Reaktion wird durch Zusatz von 2 mM Cystein und Inkubation der Lösung für 30 Minuten bei 25°C gestoppt. 5 mM N-Methyl-Maleinimid wird zugegeben und es wird 60 Minuten bei 55°C inkubiert.
  • 3. Reinigung
  • Das Rohkonjugat wurde mit Hilfe von einem CENTRICON 10 etwa 3-fach konzentriert und mittels einer, auf mit 50 mM Kaliumphosphat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,5 gepufferten Superdex 200 HR® Säule gereinigt. Wie aus 11 ersichtlich, enthält die Rohmischung nicht konjugiertes Fab' Fragment, nicht konjugierte Linker (Markierung) sowie Konjugate mit einheitlichen Stöchiometrien von 1:1 und 1:3 (siehe jeweils Peaks 5, bzw. 4, 3, 2 und 1 in 13).
  • Beispiel 6: Ruthenylierung von F(ab')2 Fragmenten
  • 1. Beschreibung des Verfahrens
  • 1.1. Herstellung von F(ab')2 Fragmenten aus IgG
  • Zur Herstellung von F(ab')2 Fragmenten wurde der gleiche monoklonale Antikörper wie aus Beispiel 5 bekannt benutzt. IgG wurde durch Pepsin verdaut wie in Beispiel 5 beschrieben. Nach quantitativer Spaltung wird Pepsin durch eine Erhöhung des pH Wertes und durch Zusatz von Pepstatin inaktiviert. F(ab')2 Fragmente werden durch Säulenchromatographie an Superdex 200 HR® gereinigt.
  • 1.2. Synthese von F(ab')2-BPRu-(UE)25-DSS
  • Die Konjugation erfolgte durch Kopplung der aktiven Gruppe von BPRu-(UE)25-DSS (der eine DSS Gruppe tragende Linker von 3) an Aminogruppen des F(ab')2 Fragments. In Abhängigkeit von der Anfangskonzentration der Reagenzien sowie der gewählten Stöchiometrie zwischen den F(ab')2 Fragmenten und den Linker-(Markierungs-)Molekülen, wurde ein Rohkonjugat mit einem höheren oder niedrigeren durchschnittlichen Markierungsgrad erhalten. Mit anderen Worten, man erhält eine beliebige Poisson-Verteilung der Fab' Moleküle, die verschiedene Mengen an Linkerstrukturen tragen.
  • 1.3. Reinigung der Rohkonjugate
  • Das Rohkonjugat wird durch Standard Molekularsiebchromatographie konzentriert und gereinigt.
  • Aufgrund des unüblich hohen apparenten Molekulargewichts, zu dem jedes einzelne Linkermolekül beiträgt, können die Kopplungsprodukte mit verschiedenen Stöchiometrien von einander getrennt werden.
  • 2. Verfahren
  • 2.1. Spaltung von IgG zu F(ab')2
  • Spaltung von Mab<p24>M-6D9-IgG zu Mab<p24>M-6D9-F(ab')2. Lyophilisiertes IgG eines monoklonalen Antikörpers gegen p24 von HIV wird mit H2O auf eine Endkonzentration von 20 mg/ml rekonstituiert. Die Spaltung wird wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt.
  • 2.2. Reinigung der F(ab')2 Fragmente durch Superdex 200 HR® Chromatographie
  • Das wie beschrieben hergestellte F(ab')2 Fragment wird mit Hilfe von den folgenden Puffern und Bedingungen gereinigt:
    Säulenmaterial Superdex 200 HR®
    Puffer 10 mM Natriumphosphat Puffer auf pH 7,5 eingestellt, 30 mM Natriumchlorid
    Fluss 10 ml/cm2/Std.
    Probenvolumen 1,5% des Säulenvolumens
    Konzentration der Probe 20 mg/ml
    Kontrolle des Eluates Photometer 280 nm
  • Die Fraktionen, die F(ab')2 Fragmente enthalten werden vereinigt, konzentriert und unter gleichen Bedingungen rechromatographiert.
  • 2.3. Markierung der F(ab')2 Fragmente mit BPRu-(UE)25-DSS
  • BPRu-(UE)25-DSS wird in DMSO zu 5 mg/ml gelöst. Die gewählte Kopplungsstöchiometrie beträgt 1:5 (mol/mol) = F(ab')2 Fragmente:Linker
  • Die Reaktionsmischung wird für 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Lysin auf eine Endkonzentration von 10 mM gestoppt.
  • 2.4. Kopplung von F(ab')2 Fragmenten mit BPRu-UEEK-DSS
  • Der Linker (Markierung) BPRu-UEEK-DSS wird in DMSO bei einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst. Die gewählte Stöchiometrie für die Kopplung beträgt 1:5 (mol/mol) = F(ab')2 Fragmente:BPRu-UEEK-DSS.
  • Die Reaktionsmischung wird 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von Lysin auf eine Endkonzentration von 10 mM gestoppt.
  • 2.5. Reinigung der Rohkopplungsprodukte
  • Die Reinigung erfolgte durch Superdex 200 HR® Chromatographie. Chromatographie beider F(ab')2 Konjugate wird in einem auf pH 7,5 eingestellten 100 mM Hepes Puffer durchgeführt, der 1 mM EDTA und 5% DMSO enthält. Die Flussrate wird auf 5 ml/cm2/Std. eingestellt. Die Detektion wird bei 280 nm durchgeführt. Das Probevolumen beträgt 1,5% des Säulenvolumens.
  • Aus den 14 und 15 ist offensichtlich, dass nur die mit dem stark negativ geladenen Linker hy-BPRu-(UE)25-DSS hergestellten Kopplungsprodukte (14) in Fraktionen, die Kopplungsprodukte mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten getrennt werden können, wohingegen alle mittels des herkömmlichen Linkers hergestellten Kopplungsprodukte (15) als Peak eluieren. Die vereinigte Fraktion, die die Mehrheit der Kopplungsprodukte mit einer Stöchiometrie von 1:1 (ca. 107 Min. bis 125 Min; Peak bei 111 Min. in 14) enthält wurde einmal rechromatographiert und sowohl die Reinheit als auch das Molekulargewicht wurde durch MALDI-TOF MS bestätigt.
  • Beispiel 7: Immunoassay unter Anwendung verschiedener Antikörper-Linker-Konjugate
  • Ein Doppelantigentest der z.B. zum Nachweis spezifischer Antikörper gegen HIV verwendet wird, wurde als Modelsystem benutzt. Die Probe (in der Antikörper gegen HIV vermutet werden) wird mit einem biotinylierten Antigen und einem Digoxigen-markierten Antigen in Gegenwart einer Streptavidin-beschichteten Festphase und einem BPRu-markierten Antikörper gegen Digoxin inkubiert. Beim Vorhandensein von Anti-HIV-Antikörpern in der Probe, bildet sich ein Nachweiskomplex bestehend aus der Streptavidinbeschichteten Festphase, dem biotinylierten Antigen, dem nachzuweisenden Antikörper, dem digoxigenilierten Antigen und dem Digoxin reaktiven Ruthenium-markierten Antikörper. Anti-HIV Antikörper werden durch Messung des an der Festphase gebundenen Elektochemilumineszenz Signals nach Standard Elektrochemilumineszenz Verfahren nachgewiesen.
  • In diesem Modelsystem wurde ein N-terminal-markiertes HIV Peptid aus dem gp41-Bereich von HIV1 verwendet. Einzelheiten dieses Peptid betreffend und zur Markierung dieses Peptids sind in WO 96/03423 beschrieben. Beide Antigene wurden in einer Konzentration von 20 ng/ml verwendet.
  • Alle Komponenten des Systems wurden konstant gehalten und nur das Nachweissystem d.h. das Ruthenium-markierte Anti-Digoxinreagenz wurde variiert. Für alle in Tabellen 5 und 6 aufgeführten Konjugate wurde ein Fab' Fragment eines Anti-DIG-Antikörpers in der gleichen Konzentration wie die Rutheniummarkierung verwendet.
  • Tabelle 5: Absolut gemessene Counts
    Figure 00420001
  • Tabelle 6: Reaktion auf negative Proben vereinheitlicht
    Figure 00430001
  • Konjugate E und F wurden nach EP 720 614 unter Anwendung von Molverhältnissen von 1:2 und 1:6 (Fab' zu Linker) hergestellt. Der verwendete Linker war KEEU-BPRu.
  • Konjugate G und H enthielten nach der vorliegenden Erfindung hergestellte und gereinigte 1:1 Kopplungsprodukte, die die in 3 ((UE)25 und MH-aktiviert) bzw. 4 gezeigten Linker-(Markierungs-)Strukturen enthalten.
  • Die neuartigen 1:1 Konjugate ermöglichen eine bessere Trennung positiver von negativen Proben. Dies ist aus Tabelle 6 am Besten ersichtlich, wo die erhaltenen Signale der positiven Seren auf das negative Serum genormt sind.
  • Beispiel 8: Konjugation des monoklonalen Antikörpers (MAK)<ferritin>M-4.184 an einen biotinylierten Linker (Bi-/UE)25-DSS
  • In diesem Beispiel wurde ein kompletter MAK der IgG Klasse (MG ca. 150 kD) für die Konjugation verwendet. Die Grundstruktur des verwendeten Linkers (Markierung) (Bi(UE)25-DSS) ist in 3 angegeben. Anstelle eines Ruthenium-Chelatkomplexes trägt dieser Linker eine Biotinylgruppe (Bi-) und er wurde modifiziert, um am C-terminalen Ende eine DSS Gruppe zu tragen.
  • Konjugationsprinzip
  • Bi/UE)25-DSS zu einer Konzentration von 15 mg/ml in DMSO gelöst wird gereinigtem IgG von MAK<Ferritin>M-4.184 (10 mg/ml in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,5) zugesetzt, um ein Endmolverhältnis von 1:1 (IgG zu Linker) zu erhalten. Die Reaktionsmischung wird 60 Minuten bei 25°C inkubiert und danach wird die Konjugation durch Zugabe von Lysin zu einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt.
  • Das Reaktionsprodukt wird gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 dialysiert.
  • Reinigung des MAK<Ferritin>M-4.184-IgG-Bi((UE)25-DSS)
  • Die Reinigung wurde durch Source 30 Q Chromatographie durchgeführt. Die Elution erfolgte mittels eines Salzgradienten mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) als Puffer (A) und 20 mM Kaliumphosphatpuffer mit 1 M NaCl (pH 6,5) als Puffer (B). Die erhaltenen Ergebnisse sind in 16 gegeben. Es ist ersichtlich, dass durch dieses Verfahren und durch entsprechende Vereinigung, Immunoglobulin das nur einen Linker (Markierung) trägt (mono-biotinyliertes IgG) in einfacher Weise erhalten werden kann.
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    • Tijssen – in „Methods in Enzymology" (1992) Academic Press
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    • Van Weemen, B. K. und Schuures A. H. W. M. (1971), FEBS Letters 15, 232
    • EP 0 061 888
    • US 5,958,783
    • WO 96/03409
    • WO 96/03423
    • WO 96/03651
    • WO 96/03652
    • WO 96/03657

Claims (9)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Konjugats, welches mindestens ein Biomolekül-Linker Produkt mit einheitlicher Stöchiometrie in einer vorbestimmten Menge enthält, wobei das besagte Konjugat aus einem Biomolekül mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kD und 500 kD und einem hydrophilen Linkermolekül besteht, wobei der besagte Linker ein Molekulargewicht zwischen 1 kD und 15 kD hat und zwischen 4 und 60 geladene Reste aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Biomolekül und Linkermolekül kovalent miteinander gekoppelt sind; b) die verschiedenen Biomolekül-Linker Produkte mit einheitlicher Stöchiometrie durch Chromatographie fraktioniert werden und c) die Fraktionen, die ein Kopplungsprodukt mit einheitlicher Stöchiometrie enthalten, gesammelt werden.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter dadurch gekennzeichnet, dass der besagte hydrophile Linker zwischen 4 und 60 negativ-geladene Reste umfasst.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiter dadurch gekennzeichnet, dass der besagte hydrophile Linker zwischen 4 und 60 positiv-geladene Reste umfasst.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter dadurch gekennzeichnet, dass der hydrophile Linker 6 bis 60 geladene Reste umfasst.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, weiter dadurch gekennzeichnet, dass der besagte Linker ein peptidisches Grundgerüst umfasst.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, weiter dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Biomolekül ein Polypeptid ist.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter dadurch gekennzeichnet, dass die besagte chromatographische Trennung auf Unterschiede im apparenten Molekulargewicht des besagten Biomolekül-Linker Produkts beruht.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 7, weiter dadurch gekennzeichnet, dass der besagte hydrophile Linker ein apparentes Molekulargewicht zwischen > 20% und < 500% des scheinbaren Molekulargewichtes des besagten Biomoleküls aufweist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter dadurch gekennzeichnet, dass die besagte chromatographische Trennung auf Unterschiede in der Ladung besagter Biomolekül-Linker Produkte beruht.
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