JP2771900B2 - 荷電されたリンカーを含む金属錯体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は荷電されたリンカーを含む新規な金属錯体お
よびイムノアッセイにおける発光マーカーグループ（原
子団）としてのそれらの使用に関する。

発光金属錯体は従来技術により知られている。EP−Ａ
−0178450は、免疫活性物質に結合されているルテニウ
ム錯体を開示しており、この場合、ルテニウム錯体は少
なくとも２個の窒素含有複素環を含む三つの同一または
異なる二環式または多環式のリガンド（配位子）を含
み、そしてこれらのリガンドの少なくとも一つは−SO₃H
または−COOHの如き少なくとも一つの水可溶化基で置換
されており、そしてこれらのリガンドの少なくとも一つ
は少なくとも一つの反応性基で直接に、またはスペーサ
ー基を介して置換されており、そしてこれらのリガンド
は窒素原子を介してルテニウムに結合されている。

結合可能な基は、リガンドの可溶化基に対する活性化
および連続反応により非常に複雑な様式で導入される。
また、架橋なしで抗体の如き生物学的物質への結合を可
能にするモノ活性化化合物の生成は特に複雑であること
が判明している。

EP−Ａ−0580979は、電気化学発光のためのマーカー
グループとしてのオスミウム錯体およびルテニウム錯体
の使用を開示している。ビピリジンの如き窒素含有複素
環がこれらの錯体のリガンドとして記載されている。WO
87/06706は電気化学発光測定のためのマーカーグルー
プとして適している更に別の金属錯体を開示している。

従来技術の既知の金属錯体の更なる欠点は、酸素クエ
ンチングおよび光解離および／またはタンパク質への高
度の非特異的結合による電気化学発光測定における不十
分な量子収率である。

それ故、本発明の目的は従来技術の欠点を少なくとも
部分的に排除することであった。

驚くことに、金属錯体の反応性結合基をリガンドの一
つに連結するリンカーへの遊離の正電荷および／または
負電荷キャリヤーの導入は、免疫反応性物質とこれら錯
体との結合体の吸着を低下させ、こうしてまたイムノア
ッセイにおける結合体の安定性および回収を高めること
がわかった。更に、増大された量子収率が得られる。

更に、荷電されたリンカーを含む発光金属錯体は驚く
程簡単な方法で製造し得ることがわかった。

こうして、本発明の一つの主題は一般式（Ｉ）： ［Ｍ（L₁L₂L₃）］_ｎ−X_mA （Ｉ） （式中、Ｍは稀土類金属イオンまたは遷移金属イオンか
ら選ばれた２価または３価の金属陽イオンであり、L₁、
L₂およびL₃は同じであるか、または異なり、そして少な
くとも２個の窒素含有複素環を含むリガンドを表し、
L₁、L₂およびL₃は窒素原子を介して金属陽イオンに結合
されており、ＸはリガンドL₁、L₂およびL₃の少なくとも
一つに共有結合されている反応性官能基であり、ｎは１
〜10の整数であり、ｍは１〜６の整数であり、１〜３で
あることが好ましく、かつＡは電荷を釣り合わせるのに
必要とされ得る対イオンを表し、そのリンカーは少なく
とも一つの正電荷および／または負電荷キャリヤーを含
む）の金属錯体である。

金属錯体は発光金属錯体、即ち、検出可能な発光反応
を生じ得る金属錯体であることが好ましい。この発光反
応は、例えば、蛍光または電気化学発光測定により検出
し得る。この錯体中の金属陽イオンは、例えば、遷移金
属または稀土類金属である。金属はルテニウム、オスミ
ウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジ
ウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、ク
ロムまたはタングステンであることが好ましい。ルテニ
ウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウム
が特に好ましい。ルテニウムが最も好ましい。

リガンドL₁、L₂およびL₃は、少なくとも２個の窒素含
有複素環を含むリガンドである。芳香族複素環、例え
ば、ビピリジイル、ビピラジル、ターピリジルおよびフ
ェナントロリルが好ましい。リガンドL₁、L₂およびL₃は
ビピリジン環系およびフェナントロリン環系から選ばれ
ることが好ましい。

錯体の反応性官能基Ｘは免疫活性物質に結合し得る反
応性基である。基Ｘは活性化カルボン酸基、例えば、カ
ルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸無水物または活性エ
ステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェ
ニルエステル、イミダゾリルエステルもしくはＮ−ヒド
ロキシベンゾトリアゾリルエステル、マレイミドまたは
光活性化可能な基、例えば、アジドであることが好まし
い。錯体は単一の官能基Ｘを含むことが好ましい。

加えて、錯体は必要により電荷を釣り合わせるために
１個または数個の対イオンＡを含むことができる。好適
な負に荷電された対イオンの例はハロゲン化物イオン、
OH^-、炭酸基、アルキルカルボン酸基、例えば、トリフ
ルオロ酢酸基、硫酸基、ヘキサフルオロリン酸基および
テトラフルオロホウ酸基である。ヘキサフルオロリン酸
基、トリフルオロ酢酸基およびテトラフルオロホウ酸基
が特に好ましい。好適な正に荷電された対イオンの例は
１価の陽イオン、例えば、アルカリ金属イオンおよびア
ンモニウムイオンである。

本発明の金属錯体は、それがリガンドと結合可能な反
応性基Ｘとの間のリンカー中に少なくとも一つの電荷キ
ャリヤーを含む点で従来技術により知られている金属錯
体とは異なる。“電荷キャリヤー”という用語は、本発
明の観念の範囲内で、６〜８の範囲のpH値で主としてイ
オン形態で存在する基を表す。リンカーは10個まで、特
に好ましくは２〜８個、最も好ましくは２〜４個のこの
ような電荷キャリヤーを含むことが好ましい。

リンカーは少なくとも一つの負電荷キャリヤーを含む
ことが特に好ましい。好適な負電荷キャリヤーの例はリ
ン酸基、ホスホン酸基、スルホン酸基およびカルボン酸
基であり、その中でカルボン酸基が最も好ましい。

正電荷キャリヤーの例はアミノ基および一置換または
多置換アミノ基、例えば、モノ、ジまたはトリアルキル
アミノ基であり、この場合、アルキルは１〜６個のＣ原
子の直鎖もしくは分岐アルキル基または３〜６個のＣ原
子の環状アルキル基を表す。正電荷キャリヤーは塩基性
アミノ酸、例えば、リシンまたは置換アミノ酸、例え
ば、ジエチルリシンから選ばれることが特に好ましい。
また、アミンおよび置換アミンは電気化学発光による金
属錯体の検出において電子ドナーとして利用できる。

リンカーは４〜40個の原子の鎖長を有することが好ま
しく、アミド官能基の如きヘテロ原子をとり込みにより
修飾されたアルキレン鎖である。電荷キャリヤーは、ア
ルキレン単位のＨ原子が荷電された基、例えばNH₂ ⁺また
はCO₂ ^-、により置換されるようなやり方でリンカー中に
配置されることが好ましい。

遊離の電荷キャリヤーを含むリンカーは、ペプチド結
合を介して一緒に連結されているアミノカルボン酸単位
を少なくとも部分的に含むことが好ましい。このような
リンカーにおいて、電荷キャリヤーは合計少なくとも三
つの荷電された基（アミノ＋カルボキシレート）を含む
多官能性アミノカルボン酸の遊離アミノ基および／また
はカルボキシレート基から誘導でき、その結果、リンカ
ーへのとり込みおよび荷電された基の二つの同時反応後
に、少なくとも一つの遊離荷電キャリヤーが依然として
存在する。例えば、電荷キャリヤーは、（ａ）一つのア
ミノ基および二つのカルボキシレート基または（ｂ）二
つのアミノ基および一つのカルボキシレート基を含む三
官能性アミノカルボン酸から誘導し得る。このような三
官能性アミノカルボン酸の例はリシン、オルニチン、ヒ
ドロキシリシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸で
ある。

本発明の金属錯体はC₂−C₃アルキレンオキシ単位、C₂
−C₃アルキレンチオ単位、C₂−C₃アルキレンアミノ単位
およびポリヒドロキシ単位から選ばれた少なくとも一つ
の親水性基を更に含むことができる。

ポリヒドロキシ単位は式（II a）または（II b）： −NR−Ｗ （II a） −Ｏ−Ｗ （II b） （式中、Ｗは少なくとも二つのヒドロキシ基を含む有機
基を表し、Ｒは水素またはC₁−C₅アルキルを表す）の基
から選ばれることが好ましい。有機基Ｗは２〜６個、特
に２〜４個のヒドロキシ基を含むことが好ましい。更
に、Ｗは２〜10個、特に３〜６個の炭素原子を含むこと
が有利である。好適なポリヒドロキシ単位の特定の例は
ポリアルコール、例えば、グリセロールまたはアミノポ
リアルコールの残基である。好ましいアミノポリアルコ
ールはトリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）
−1,3−プロパントリオール）である。この場合、ポリ
ヒドロキシ単位は式NH−Ｃ（CH₂OH）_３を有する。ポリ
アルコールまたはアミノポリアルコールはエステルまた
はアミドの形態で金属錯体に結合されることが好まし
い。ポリアルコールまたはアミノポリアルコールのOH基
は必要により親水性基、例えばデンドリメリック（dend
rimeric）基、で置換されていてもよい。

本発明の金属錯体のC₂−C₃アルキレンオキシ単位、C₂
−C₃アルキレンチオ単位およびC₂−C₃アルキレンアミノ
単位はC₂単位、特に、エチレンオキシ単位であることが
好ましい。錯体は金属陽イオン当たり１〜30個、特に好
ましくは２〜20個のC₂−C₃アルキレンオキシ単位、C₂−
C₃アルキレンチオ単位またはC₂−C₃アルキレンアミノ単
位を含むことが好ましい。これらの単位は金属錯体の複
素環リガンドの置換基の成分である。それらはリガンド
の一つの反応性官能基Ｘの間のリンカー中および／また
は一置換基中に存在し得る。また、アルキレンオキシ単
位、アルキレンチオ単位またはアルキレンアミノ単位
は、必要により官能基Ｘをもつことができるブリッジヘ
ッド（橋頭）を介して一緒に連結し得る。他方、幾つか
の錯体単位をブリッジヘッドを介して一緒に連結するこ
ともできる。

本発明の一つの実施態様において、本発明の金属錯体
は一般式（III）： （式中、Ｍ、ＸおよびＡは先に定義されたとおりであ
り、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は同じであるかまたは
異なり、それぞれが１個または数個の置換基を表し、但
し、Ｘがリンカーとしての置換基R₁、R₂、R₃、R₄、R₅お
よびR₆の一つを介してリガンドの一つに連結されている
ことを条件とする）を有する。

また、錯体のリガンドは破線により示された基の存在
または不在に応じて置換フェナントロリン系またはビピ
リジン系であってもよい。

リガンドの置換基R₁、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は、そ
れらがリンカーの基Ｘを含まないことを条件として、水
素、C₁−C₅アルキル、特に、C₁−C₃アルキルまたは先に
定義されたような親水性基であることが好ましい。

特に好ましい実施態様において、金属錯体は一般式
（III a）： （式中、Ｍ、ＸおよびＡは先に定義されたとおりであ
り、R₁、R₂、R₃、R₄およびR₅は先に定義されたとおりで
あり、ｓは０〜６、好ましくは１〜４の整数であり、か
つＹは遊離の電荷キャリヤーを含むリンカーを表す）を
有する。

式（III）および（III a）の化合物の例が図１〜３に
示される。図１および図２は、それぞれの場合に一つの
遊離の負電荷キャリヤーを含むリンカーを有する錯体を
示す。それぞれの場合、リンカーは三官能性アミノ酸、
即ち、リシンを含み、そのアミノ基はリンカー中にペプ
チド結合を形成するのに利用でき、一方、カルボキシレ
ート基は遊離電荷キャリヤーを形成する。図３は４アミ
ノ酸単位、即ち、β−アラニン残基、リシン残基および
二つのグルタミン酸残基を含むリンカーを示す。リンカ
ーは三つの負電荷キャリヤー、二つのGlu残基のそれぞ
れから誘導される一つのカルボキシレート基およびLys
から誘導される一つのカルボキシレート基を含む。図１
および３中の官能基ＸはSH基への結合に適したマレイミ
ドであり、そして図２中で、それはNH₂基への結合に適
したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

また、本発明の金属錯体のリガンドは一緒に連結で
き、その結核、金属錯体はセミケージ（semicage）また
はケージの形態で存在する。セミケージまたはケージの
形態の本発明の金属錯体の好ましい実施態様は一般式
（IV）： （式中、Ｍ、Ｘ、ｎおよびＡは先に定義されたとおりで
あり、R₁、R₂およびR₃は同じであるかまたは異なり、そ
してそれぞれがビピリジンまたはフェナントロリンリガ
ンド上の、先に定義されたような、１個または数個の置
換基を表し、かつそれぞれの場合にＹは少なくとも一つ
の電荷キャリヤーを含むリンカーを表す）を有する。

式（IV）中の置換基R₁、R₂およびR₃が必要によりリン
カー基を介して一緒に共有結合されている場合、式（I
V）の錯体はケージの形態となる。

式（IV）の錯体はモノマーとして存在するだけでな
く、好ましくは５個までの個々の金属錯体を含むオリゴ
マーとして存在してもよい。この場合、結合可能な官能
基Ｘは、例えば、芳香族、例えば、フェニル核の置換基
であってもよく、この場合、芳香核の残りの置換位置の
二つまたは幾つかがセミケージまたはケージの形態の金
属錯体により置換され得る。

本発明の金属錯体は、金属塩、例えば、金属ハロゲン
化物を適当なリガンドと反応させ、続いて必要によりハ
ロゲン化物イオンをヘキサフルオロリン酸陰イオン、ト
リフルオロ酢酸陰イオンまたはテトラフルオロホウ酸陰
イオンで置換することにより製造し得る。このような方
法が従来技術、例えば、欧州特許第0178450号および同
第0255534号明細書に記載されている。この開示を参照
されたい。

荷電されたリンカーを含むＮ−複素環リガンドの荷電
されたリンカーの合成は一方で溶液中の結合反応として
行うことができ、この場合、必要により部分的に保護さ
れていてもよいアミノカルボン酸がリガンドの反応性
基、例えば、カルボン酸に結合される。この結合部分
は、所望の長さのリンカーが合成されるまで必要により
再度繰り返されてもよい。この方法において、一つまた
は幾つかの荷電された側鎖基を含む少なくとも一つの多
官能性アミノカルボン酸基が導入される。

続いて反応性基Ｘが導入され、そしてアミノカルボン
酸の側鎖基に存在してもよい保護基が開裂されて除かれ
る。溶液中のアミノ酸の連続結合によるこのリガンド合
成は一方では単一リガンドに対して行うことができ、他
方で金属錯体に既に結合されている出発物質としてのリ
ガンドに対して行うことができる。好適な出発物質は、
例えば、遊離カルボキシレート基を含む発光金属錯体で
ある。このような錯体が上記の文献により知られてお
り、また例えば、Igen Inc.Co.（Rockville、MD、米
国）から市販されている。

他方、錯体はまた固相ペプチド合成により合成し得
る。固相合成の第一の実施態様において、アミノ酸がそ
のカルボキシレート基を介して固相担体に結合され、次
に所望のリンカーが更に別のアミン酸の連続結合により
合成される。本発明のリンカーを製造するために、少な
くとも一種のアミノ酸がこの方法に使用され、そのアミ
ノ酸は側鎖基として荷電された基、例えば、必要により
保護されていてもよい形態のアミノ基またはカルボキシ
レート基を含む。所望のリンカー配列が完結された後
に、例えば、活性エステルの形態の活性化金属錯体を固
相結合ペプチドの遊離Ｎ末端アミノ基に結合し得る。固
相からの開裂後に、反応性基Ｘがペプチドリンカーのカ
ルボキシ末端に結合され、そして存在しうる保護基が開
裂される。

固相合成の別の実施態様において、保護されたアミノ
基およびカルボキシレート基を含むアミノ酸−金属錯体
結合体、例えば、Fmoc−Lys（BRu）−OH（図４）が遊離
カルボキシレート基を介して固相に固定され、そしてブ
ロックされたアミノ基を放出した後にペプチドリンカー
が合成され得る。所望のリンカー配列を仕上げた後に、
錯体が固相から開裂され、遊離電荷キャリヤーとして少
なくとも元のカルボキシレートアンカー基を含むリンカ
ーを得る。反応性基Ｘは得られるペプチドリンカーのア
ミノ末端に結合され得る。

固相合成の第三の実施態様では、電荷キャリヤーを含
むリンカー配列が選択されたペプチドエピトープ上で直
接合成され得る。

また、上記の合成変法の組み合わせが本発明の金属錯
体を製造するのに使用し得る。荷電されたリンカーを含
む本発明の錯体の固相合成に適しているアミノ酸−金属
錯体結合体がドイツ特許出願第4430998.8号明細書に記
載されている。この開示を参照されたい。

セミケージまたはケージ構造を有する式（IV）の金属
錯体の製造は、例えば、荷電されたリンカーをビピリジ
ンまたはフェナントロリンリガンドに結合し、これらの
単位をアミド結合を介してブリッジヘッドに連結するこ
とにより行い得る。二つのブリッジヘッドが使用される
場合、完全なケージ構造を得ることができる。３価のブ
リッジヘッド、例えばトリス、への三つのリガンドの連
結が好ましい。

本発明の更に別の主題は、本発明の少なくとも一つの
金属錯体が結合されている生物学的物質を含む結合体で
ある。好適な生物学的物質の例は細胞、ウイルス、細胞
下の粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク
質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ペプチド核酸（pe
ptidic nucleic acid:PNA）、オリゴ糖、多糖、リポ多
糖、細胞代謝産物、ハプテン、ホルモン、薬理活性物
質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸お
よび糖である。

金属錯体は、生物学的物質の官能基に共有結合し得る
金属錯体の反応性官能基を介して生物学的物質に結合さ
れる。官能基が活性エステルである場合、それは、例え
ば、生物学的物質の遊離アミノ基に結合し得る。官能基
がマレイミド基である場合、それは生物学的物質の遊離
SH基に結合し得る。

本発明の特に好ましい実施態様において、金属錯体
は、好ましくは50アミノ酸、特に好ましくは30アミノ酸
の最大長さを有するペプチドに結合される。金属錯体で
標識されたこれらのペプチドの製造は、所望のアミノ酸
配列を有するペプチドを固相で合成することにより行わ
れることが好ましく、この場合、ａ）その合成後に、活
性化金属錯体、好ましくは金属錯体−活性エステル誘導
体がペプチドのＮ末端アミノ基に結合され、かつ／また
はｂ）その合成中に、金属錯体に共有結合されているア
ミノ酸誘導体がペプチドの少なくとも一つの位置に導入
される。好ましくは、ペプチドのＮ末端アミノ酸への金
属錯体の結合を行い、その後にペプチドを固相から開裂
し、またその後にペプチド合成に使用されたアミノ酸誘
導体の反応性側鎖基の保護基を開裂するようにする。

ペプチドは免疫反応性エピトープ領域およびスペーサ
ー領域を含むことが好ましく、この場合、少なくとも一
つの金属錯体マーカーグループがスペーサー領域に結合
される。スペーサー領域は１〜10アミノ酸の長さを有
し、そしてペプチドのアミノ末端および／またはカルボ
キシ末端に配置される。

スペーサー領域は、電荷を有しかつ／または水素ブリ
ッジを形成できるアミノ酸を含むことが好ましい。スペ
ーサー領域のアミン酸はグリシン、β−アラニン、γ−
アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸、リシンおよび構造
式NH₂−［（CN₂）_yO］_ｘ−CH₂−CH₂−COOH（式中、ｙは
２または３であり、かつｘは１〜10である）の化合物を
含む群から形成されることが好ましい。

ペプチドのエピトープ領域は病原体生物、例えば、細
菌、ウイルスおよび原生動物または自己免疫抗原から誘
導されることが好ましい。エピトープ領域はウイルス抗
原、例えば、HIV I、HIV IIまたはＣ型肝炎ウイルス（H
CV）のアミノ酸配列から誘導されることが特に好まし
い。

生物学的物質の更に好ましい例はビオチン、核酸、抗
体または抗体断片、ポリペプチド抗原、即ち、免疫反応
性ポリペプチドまたはハプテン、即ち、150〜2000の分
子量を有する有機分子、特に、ステロイド骨格を有する
分子、例えば、カルデノリド、カルデノリド−グリコシ
ド（例えば、ジゴキシン、ジゴキシゲニン）、ステロイ
ドアルカロイド、性ホルモン（例えば、プロゲステロ
ン）、グルココルチコイド等である。ハプテンの更に別
の例はプロスタグランジン、ロイコトリエン、ロイコ−
エン−ジイン、トロンボキサン等である。

本発明の更に別の主題は、免疫学的検出方法または核
酸ハイブリダイゼーション方法、特に発光アッセイにお
ける本発明の金属錯体または本発明の結合体の使用であ
る。

これらの方法において、金属錯体はマーカーグループ
として使用され、その助けにより、サンプル液中の分析
物を定性的かつ／または低量的に測定することが可能で
ある。金属錯体は電気化学発光により検出されることが
好ましく、この場合、発光種が電極の表面で電気化学的
に発生される。金属錯体を使用して発光アッセイを行う
従来技術の例が、EP−Ａ−0580979、WO 90/05301、WO 9
0/11511およびWO 92/14138に見られる。そこに開示され
た発光アッセイの方法および装置を参照されたい。電気
化学発光アッセイは、好ましくは微粒子、特に反応性被
覆物、例えば、ストレプトアビジンを被覆されている磁
性微粒子を含む、固相の存在下で行われる。この方法で
は、マーカーグループとして金属錯体を含む免疫複合体
またはハイブリダイゼーション複合体が固相に結合され
て検出し得る。

電気化学発光測定は金属錯体の還元剤、例えばアミ
ン、の存在下で行われることが好ましい。脂肪族アミ
ン、特に、一級、二級および三級のアルキルアミン（こ
れらのアルキル基はそれぞれ１〜３個の炭素原子を有す
る）が好ましい。トリプロピルアミンが特に好ましい。
しかしながら、アミンはまたアニリンの如き芳香族アミ
ンまたは複素環アミンであってもよい。還元剤は錯体の
リガンド球体に既に組込まれていてもよい。

その他に、ノニオン系界面活性剤、例えばエトキシル
化フェノール、がまたアンプリファイアとして存在して
いてもよい。このような物質が、例えば、商品名トリト
ンX 100またはトリトンN401として市販されている。

他方、発光金属錯体はまた蛍光により検出でき、この
場合、金属キレートが適当な波長の光を照射することに
より励起され、そして得られる蛍光放射線が測定され
る。蛍光アッセイを行う例がEP−Ａ−0178450およびEP
−Ａ−0255534に見られる。この開示を参照されたい。

荷電されたリンカーを含む金属錯体を使用することの
既に記載された原理はまたその他のマーカーおよび／ま
たは固相結合グループに更に適用し得る。それ故また、
本発明はリンカーを介して共有結合された反応性官能基
Ｘを含むマーカーおよび／または固相結合グループに関
するものであり、この場合、リンカーは少なくとも一つ
の正電荷および／または負電荷キャリヤーを含む。リン
カーは、ペプチド結合を介して一緒に連結されているア
ミノカルボン酸単位を少なくとも部分的に含むことが好
ましい。

マーカーおよび／または固相結合グループは蛍光マー
カーグループ、例えば、フルオレセイン、クマリン、ロ
ーダミン、レゾルフィン、シアニンおよびこれらの誘導
体並びにビオチンおよびビオチン類似体、例えば、イミ
ノビオチンまたはデスチオビオチンから選ばれることが
好ましい。

また、本発明は、先に定義されたような生物学的物質
と前記マーカーおよび／または固相結合グループとの結
合体に関する。マーカーおよび／または固相結合グルー
プまたはこれらの結合体は免疫学的検出方法または核酸
ハイブリダイゼーション方法に使用し得る。これらの方
法において、溶解性の改良および二量体以上の凝集体の
形成によるシグナルクエンチングの減少または防止を達
成することが可能である。

本発明の更に別の主題は、遊離アミノ官能基、好まし
くは脂肪族、特に好ましくは一級脂肪族アミノ官能基を
有するペプチドまたはペプチド誘導体をスベリン酸−ビ
ス−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（DSS）と反
応させ、こうしてアミノ官能基をＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルに変換することを特徴とする、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル基をペプチドまたはペ
プチド誘導体に導入する方法である。Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル基を導入することにより活性化さ
れたペプチドまたはペプチド誘導体は続いて先に定義さ
れたように生物学的物質に結合し得る。

この方法の特別な利点は、少なくとも一つの遊離の酸
官能基、特にカルボン酸官能基、を有するペプチドまた
はペプチド誘導体を使用し得ることである。既知の方法
とは対照的に、酸官能基をブロックする必要がない。

ペプチドの他にまた、少なくとも一つのマーカーおよ
び／または固相結合グループ、例えば金属錯体、蛍光基
またはビオチン基、を有するペプチド誘導体を活性化す
ることができる。

活性化反応はジメチルホルムアミドの如き有機溶媒中
で塩基、例えばトリエチルアミンの如き三級アミン、の
存在下で行うことが好ましい。スベリン酸−ビス−ヒド
ロキシ−スクシンイミドエステルをペプチドまたはペプ
チド誘導体に対して2:1〜10:1のモル過剰で使用するこ
とが好ましい。

本発明を以下の実施例および図面により更に説明する
ことにする。

図１〜３は本発明の金属錯体を示し、 図４は本発明の金属錯体を合成するのに適したアミノ
酸金属錯体結合体を示し、そして 図５は活性化ペプチド−金属錯体結合体を示す。

実施例１ 荷電されたリンカーを含む金属錯体の製造 EP−Ａ−0580979に記載の金属錯体Ru（ビピリジン）
_２−（ビピリジン−CO−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル）６ミリモルをジメチルホルムアミド50mlに溶
解し、そしてジメチルホルムアミド中のFmoc−リシンの
溶液を滴下して添加する。溶媒を高真空で除去する。残
渣を少量のアセトンに溶解し、クロロホルム300mlと混
合し、そして沸点まで短時間加熱する。それを冷却し、
そして分離した油を溶媒から分離する。所望の化合物Ru
（bpy）_２（bpy−CO−（Fmoc）−Lys）を乾燥により固
体物質として得る。

Fmoc保護基をジオキサン／アセトン中で４倍過剰のピ
ペリジン中で80℃で２時間の反応により開裂する。冷却
後に、油状残渣を分離し、クロロホルム／水抽出を行
う。水相を単離し、化合物Ru（bpy）_２（bpy−CO−Ly
s）を赤色の固体として得る。

この化合物60mgをアセトン10mlに溶解し、マレイミド
プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
を添加し、それを室温で４時間撹拌する。残渣を分取HP
LCにより精製する。化合物Ru（bpy）_２（bpy−CO−Lys
−MP）17mgを得る。この化合物を図１に示す。

実施例２ 荷電されたリンカーを含む金属錯体の製造 実施例１に記載のRu（bpy）_２（bpy−CO−Lys）およ
び10倍モル過剰のスベリン酸−ビス−Ｎ−ヒドロキシ−
スクシンイミドエステルをジメチルホルムアミドに溶解
し、室温で２時間撹拌する。溶媒を高真空で除去し、残
渣を水で抽出し、ヘキサンによる処理後に凍結乾燥す
る。それをHPLC（100％のH₂Oから、20分で100％のアセ
トニトリルまで、C₁₈、３μｍのカラム、流量:1ml/分、
保持時間:10.00分）により精製する。得られた化合物を
図２に示す。

実施例３ 固相ペプチド合成による金属錯体の製造 荷電されたリンカーを含む金属錯体を、例えば、アプ
ライド バイオシステムズA431またはA433からのバッチ
式ペプチド合成装置でフルオレニルメチルオキシカルボ
ニル−（Fmoc）−固相ペプチド合成により製造した。そ
のために、表１に示されたアミノ酸誘導体４当量をそれ
ぞれの場合に使用した。表1: Ａ Fmoc−Ala−OH Ｃ Fmoc−Cys（Trt）−OH Ｄ Fmoc−Asp（OtBu）−OH Ｅ Fmoc−Glu（OtBu）−OH Ｆ Fmoc−Phe−OH Ｇ Fmoc−Gly−OH Ｈ Fmoc−His（Trt）−OH Ｉ Fmoc−Ile−OH K1 Fmoc−Lys（Boc）−OH K2 Boc−Lys（Fmoc）−OH K3 Fmoc−Lys（BPRu）−OH Ｌ Fmoc−Leu−OH Ｍ Fmoc−Met−OH Ｎ Fmoc−Asn（Trt）−OH Ｐ Fmoc−Pro−OH Ｑ Fmoc−Gln（Trt）−OH Ｒ Fmoc−Arg（Pmc）−OH Ｓ Fmoc−Ser（tBu）−OH Ｔ Fmoc−Thr（tBu）−OH Ｕ Fmoc−βアラニン−OH Ｖ Fmoc−Val−OH Ｗ Fmoc−Trp−OH Ｙ Fmoc−Try（tBu）−OH Ｚ Fmoc−ε−アミノカプロン酸−OH Nle Fmoc−ε−ノルロイシン−OH Abu Fmoc−γ−アミノ酪酸−OH 変法（ａ）−固相合成の完結後の金属錯体の導入−に
おいて、活性化ルテニウム（ビピリジル）_３錯体（BPR
u）、例えばRu（bpy）_２（bpy−CO−NHS）（実施例１を
参照のこと）、をペプチドのＮ末端アミノ酸に結合し
た。

変法（ｂ）によれば、金属キレート活性エステルでε
−誘導体化されたリシン残基、例えばリシン誘導体K3、
を介してペプチド配列のカルボキシル末端での金属キレ
ート結合されたアミノ酸誘導体（図４）の直接とり込み
によりペプチド配列に金属キレート基を導入した。

アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリド
ンに溶解した。ペプチドを0.4〜0.7ミリモル/gで装填さ
れた４−（２′,4′−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミ
ノメチル）−フェノキシ樹脂（Tetrahedron Letters 28
（1987）,2107）400−500mg上で合成し（JACS 95（197
3）,1328）。その結合反応は反応媒体としてのジメチル
ホルムアミド中でFmoc−アミノ酸誘導体に対し４当量の
ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４当量のＮ−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールを用いて20分間行った。ジ
メチルホルムアミド中20％のピペリジンを用いて、Fmoc
基をそれぞれの合成工程後の20分以内に開裂した。

システイン残基がペプチド配列中に存在した場合は、
合成の完了直後にヘキサフルオロイソプロパノール／ジ
クロロメタン中のヨウ素を使用して固相を酸化した。

ペプチドを担体から遊離させ、酸不安定性の保護基
を、トリフルオロ酢酸20ml、エタンジチオール0.5ml、
チオアニソール1ml、フェノール1.5gおよび水1mlを使用
して室温で40分間で開裂した。続いて反応溶液を冷却ジ
イソプロピルエーテル300mlと混合し、ペプチドが完全
に沈殿するまで０℃に40分間保った。沈殿を濾過し、ジ
イソプロピルエーテルで再度洗浄し、少量の50％酢酸に
溶解し、凍結乾燥した。得られた粗物質は相当する勾配
（溶離剤A:水、0.1％のトリフルオロ酢酸、溶離剤B:ア
セトニトリル、0.1％のトリフルオロ酢酸）で約120分間
にわたってデルタ−PAK RP C18材料（カラム50x 300m
m、100Å、15μ）による分取HPLCにより精製した。溶離
した物質の同一性をイオン噴霧質量スペクトルによりチ
ェックした。

金属キレート標識を適当な活性エステル誘導体を介し
て変法（ａ）に従って担体結合ペプチドの遊離Ｎ末端ア
ミノ基に導入した。このために、遊離一級アミノ官能基
当たり４当量のルテニウム（ビピリジル）_３錯体（BPR
u）をＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール／ジシクロヘ
キシルカルボジイミドで活性化し、少量のDMSOに溶解
し、滴下して添加し、室温で撹拌した。その反応を分析
HPLCにより監視した。担体から開裂した後、生成物を分
取HPLCにより精製した。溶離した物質の同一性をイオン
噴霧質量スペクトルによりチェックした。

ペプチドを変法（ａ）および（ｂ）の組み合わせ、即
ち、金属キレート結合したアミノ酸誘導体のペプチド配
列へのとり込み、Ｎ−末端Fmoc基の開裂そして遊離Ｎ−
末端アミノ基と金属キレート活性エステル誘導体との反
応により合成した。

金属キレート結合したアミノ酸誘導体が変法（ｂ）に
従って固相合成中に専ら直接にとり込まれた場合は、続
いて金属キレート活性エステルを導入することは最早や
必要ではなかった。

固相合成により製造した金属錯体の例を図３に示す。

マレイミド官能基を導入するために、ペプチドを0.1M
のリン酸カリウム緩衝液pH7.0に溶解し、DMSO中の１当
量のマレイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルと混合し、そして25℃で16時間撹拌し
た。その混合物を分取HPLCにより精製した（上記を参照
のこと）。溶離した物質の同一性をイオン噴霧質量スペ
クトルによりチェックした。反応性Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル官能基はDE−Ａ−4302241に従って
導入した。

実施例４ 免疫試験における荷電されたリンカーを含む金属錯体の
使用 二重抗原ブリッジ試験を行ってＣ型肝炎ウイルス（HC
V）に特異的な抗体を検出した。このために、サンプル
液をルテニウム標識抗原および測定すべき抗体に対する
ビオチニル化抗原と一緒にストレプトアビジンで被覆し
た固相の存在下でインキュベートした。サンプル液中の
抗HCV抗体の存在を、フラッシュシステムによる電気化
学発光により固相中の標識を測定することにより測定し
た。

HCVのアミノ酸1207−1488を含むHCVポリペプチドを抗
原として使用した。このようなポリペプチドのアミノ酸
配列および合成がDE−Ａ−4428705.4に記載されてい
る。

HCVポリペプチドをスクシンイミドエステルで活性化
したルテニウム錯体で誘導体化するために、ポリペプチ
ドを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、0.1％のSDS
中に10mg/mlのタンパク質濃度で溶解した。pH値を5MのN
aOHの添加により8.5に設定し、その溶液にジチオスレイ
トールを2mMの最終濃度まで補給した。所望の提案され
た化学量論量に相当する量のDMSO中のスクシンイミドエ
ステルで活性化されたルテニウム錯体をこの溶液に添加
し、続いてそれを撹拌しながら65℃で60分間インキュベ
ートした。その反応を、反応混合物にリシンを10mMの最
終濃度まで補給し、それを更に30分間インキュベートす
ることにより停止させた。続いてこの混合物を100mMの
リン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、0.1％のSDSに対し透析
した。得られたタンパク質溶液を蔗糖（最終濃度6.5％
（w/v））と混合し、小分けして凍結乾燥した。

マレイミドで活性化されたルテニウム錯体により誘導
体化されたHVCポリペプチドの製造のために、ポリペプ
チドを100mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH6.5、0.1％のS
DS中に取り上げた（タンパク質濃度10mg/ml）。所望の
提案された化学量論量に相当する量のDMSO中のマレイミ
ド活性化ルテニウム錯体をこの溶液に添加し、そしてこ
れを撹拌しながら25℃で60分間インキュベートした。そ
の反応を、反応混合物にシステインを10mMの最終濃度ま
で補給し、それを更に30分間インキュベートすることに
より停止させた。反応混合物を上記のようにして透析し
た後、蔗糖と混合し、小分けして凍結乾燥した。

三つの実験を行ったが、各回に異なるルテニル化抗原
を使用した。実験Ａ（比較例）では、ポリペプチドを、
実施例１および２で出発物質として使用したEP−Ａ−05
80979に記載のルテニウム錯体に1:3の化学量論比で結合
させた。実験Ｂでは、ポリペプチドを実施例１で製造さ
れた本発明のルテニウム錯体（図１）に1:1の化学量論
比で結合させた。実験Ｃでは、ポリペプチドを実施例３
で製造されたルテニウム錯体（図３）に1:1の化学量論
比で結合させた。三つの実験すべてにおいて、1:6の化
学量論比でマレイミド活性ビオチンに結合されたポリペ
プチドをビオチニル化抗原として使用した。ルテニル化
抗原およびビオチニル化抗原をそれぞれの場合に400ng/
ml試験液の濃度で使用した。

実験Ａ、ＢおよびＣの結果を表２中にECLカウント数
として示す。陰性血清サンプルと臨界的な陽性血清サン
プルの間の信頼できる差異は、マーカーグループとして
荷電されたリンカーを含む本発明の金属錯体を使用した
時にのみ得ることができる。これは高い陽性／陰性比に
より示される。 表２ 実験 Ａ（比較例） Ｂ Ｃ 陰性サンプル 323317 132288 14467 陽性サンプル 465769 1323338 319752 陽性／陰性比 1.4 10 22 実施例５ 免疫学的試験における荷電されたリンカーを含む金属錯
体およびビオチン基の使用 二重抗原ブリッジ試験を行って実施例４のプロトコル
に従ってHIV Iに特異的な抗体を検出した。

HIVポリペプチドgp32を抗原として使用した。

抗原とルテニウム錯体および／またはビオチンの間の
ペプチドリンカー配列“EEE"および"EEEUZU"のとり込み
は、リンカー配列を含まない抗原と比較して非特異的シ
グナルのかなりの減少をもたらし、一方、特異的シグナ
ルはHIV陽性サンプルにおいて実質的に維持された。こ
うして、分析物の測定におけるかなり改良された動力学
が、荷電されたリンカーを含むマーカーおよび／または
固相結合グループを使用することにより得られる。

実施例６ ペプチド誘導体へのＮ−ヒトロキシスクシンイミドエス
テル基の導入 スベリン酸−ビス−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（DSS）250mgをジメチルホルムアミドにトリエチ
ルアミン50μｌと一緒に溶解した。実施例３に記載され
た標準の方法に従って調製されたペプチド誘導体BPRu−
UEEK（DMF中100mg）の溶液をこれに滴下した。約15分後
に、DMFを高真空中で除去し、残渣を水に取り上げ、未
溶解のDSSを濾過により除去した。濾液を凍結乾燥し
た。

図５に示された生成物を得た。純度はHPLCによれば91
％であった。NMRおよびMSによる分析は予想された生成
物に一致した。

配列Ac−Ｋ（BPRu）UEUEUK−（DSS）−UEUEUK（BPR
u）UEを有する２重ルテニル化されたペプチド誘導体を
同様の方法で調製した。ビオチニル化ペプチドもしくは
その他のマーカーグループを備えたペプチドまたは未標
識のペプチドがルテニル化ペプチドに代えて同様の方法
でDSSで活性化し得る。驚くことに、その反応は遊離の
カルボン酸官能基の存在下で円滑に進行する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｆ 15/00 Ｃ０７Ｆ 15/00 Ｅ Ｃ０７Ｋ 14/16 Ｃ０７Ｋ 14/16 14/18 14/18 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｃ０９Ｋ 11/06 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/532 (31)優先権主張番号 Ｐ４４３９３４５．８ (32)優先日 1994年11月４日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 Ｐ４４３９３４７．４ (32)優先日 1994年11月４日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (72)発明者 オーフェンロッホ−ハーンレ，ビータス ドイツ連邦共和国 ディー―82407 ヴ ィーレンバッハ，クロイツベルクシュト ラーセ １番地 (72)発明者 サイデル，クリストフ ドイツ連邦共和国 ディー―82362 ヴ ァイルハイム，アーメルシュトラーセ 39番地 (72)発明者 アップマイアー，バーバラ ドイツ連邦共和国 ディー―82393 イ ッフェルドルフ，エゲルレンダーシュト ラーセ 12シー番地 (72)発明者 ヴィーンフース，ウルスラ−ヘンリケ ドイツ連邦共和国 ディー―82152 ク ライリング，ブルグフリーデンシュトラ ーセ ８番地 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/00 C07F 11/00,13/00,15/00 C09K 11/06 G01N 33/532 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（Ｉ）： ［Ｍ（L₁L₂L₃）］_ｎ−X_mA （Ｉ） （式中、 −Ｍは稀土類金属イオンまたは遷移金属イオンから選ば
   れた２価または３価の金属陽イオンであり、 −L₁、L₂およびL₃は同じであるかまたは異なり、そして
   少なくとも２個の窒素含有複素環を含むリガンドを表
   し、L₁、L₂およびL₃は窒素原子を介して金属陽イオンに
   結合されており、 −ＸはリガンドL₁、L₂およびL₃の少なくとも一つに共有
   結合されている反応性官能基であり、 −ｎは１〜10の整数であり、 −ｍは１〜６の整数であり、かつ −Ａは電荷を釣り合わせるのに必要とされ得る対イオン
   を表す） で表される金属錯体であって、リンカーが少なくとも一
   つの正電荷および／または負電荷キャリヤーを含むこと
   を特徴とする錯体。
2. 【請求項２】金属陽イオンＭがルテニウムイオン、レニ
   ウムイオン、オスミウムイオン、クロムイオンまたはイ
   リジウムイオンである請求項１に記載の錯体。
3. 【請求項３】リガンドL₁、L₂およびL₃がビピリジン環系
   および／またはフェナントロリン環系を含む請求項１〜
   ２の一項に記載の錯体。
4. 【請求項４】反応性官能基Ｘがカルボン酸ハロゲン化
   物、カルボン酸無水物、活性エステル、マレイミドまた
   は光活性化可能な基である請求項１〜３の一項に記載の
   錯体。
5. 【請求項５】対イオンＡがヘキサフルオロホスフェート
   基、トリフルオロアセテート基またはテトラフルオロボ
   レート基である請求項１〜４の一項に記載の錯体。
6. 【請求項６】リンカーがホスフェート基、ホスホネート
   基、スルホネート基およびカルボキシレート基から選ば
   れた少なくとも一つの負電荷キャリヤーを含む請求項１
   〜５の一項に記載の錯体。
7. 【請求項７】リンカーがアミノ基および置換アミノ基か
   ら選ばれた少なくとも一つの正電荷キャリヤーを含む請
   求項１〜５の一項に記載の錯体。
8. 【請求項８】リンカーがペプチド結合を介して一緒に連
   結されているアミノカルボン酸単位を少なくとも部分的
   に含む請求項１〜７の一項に記載の錯体。
9. 【請求項９】一般式（III）： （式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１に定義されたとおり
   であり、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は同じであるかま
   たは異なり、それぞれが１個または数個の置換基を表
   し、但し、Ｘがリンカーとしての置換基R₁、R₂、R₃、
   R₄、R₅およびR₆の一つを介してリガンドの一つに結合さ
   れていることを条件とする） で表される請求項１〜８の一項に記載の錯体。
10. 【請求項１０】一般式（III a） （式中、Ｍ、ＸおよびＡは請求項１に定義されたとおり
    であり、R₁、R₂、R₃、R₄およびR₅は請求項９に定義され
    たとおりであり、ｓは０〜６の整数であり、かつＹはリ
    ンカーを表す） で表される請求項９に記載の錯体。
11. 【請求項１１】一般式（IV）： （式中、Ｍ、Ｘ、ｎおよびＡは請求項１に定義されたと
    おりであり、R₁、R₂およびR₃は同じであるかまたは異な
    り、そしてそれぞれが１個または数個の置換基を表し、
    かつそれぞれの場合にＹは少なくとも一つの電荷キャリ
    ヤーを含むリンカーを表す） で表される請求項１〜８の一項に記載の錯体。
12. 【請求項１２】請求項１〜11の一項に記載の少なくとも
    一種の金属錯体が結合されている生物学的物質を含んで
    なる結合体。
13. 【請求項１３】生物学的物質がビオチン、抗体または抗
    体断片、核酸、ポリペプチド抗原、免疫反応性ペプチド
    またはハプテンである請求項12に記載の結合体。
14. 【請求項１４】免疫学的検出方法または核酸ハイブリダ
    イゼーション方法における請求項１〜11の一項に記載の
    金属錯体または請求項12または13に記載の結合体の使
    用。
15. 【請求項１５】発光方法における請求項14に記載の使
    用。
16. 【請求項１６】電気化学発光方法における請求項14また
    は15に記載の使用。