DE3910084A1

DE3910084A1 - Polypeptide mit wachstumsfaktor-aktivitaet und nukleinsaeuresequenzen

Info

Publication number: DE3910084A1
Application number: DE3910084A
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1989-11-16
Also published as: NZ228427A; PT90118B; ES2013408A6; GR890100185A; SE8901031D0; AU3169589A; GB2219799B; FI891308A0; LU87489A1; DK146789A; IT8919917A0; FR2632321A1; GB2219799A; NO891273D0; SE8901031L; PT90118A; GR1000876B; AU2990492A; JPH0279981A; HUT50501A

Description

Die Erfindung betrifft neue Polypeptide mit Wachstumsfaktor- Aktivität, einschließlich chimäre Polypeptide, und Verfahren zu ihrer Herstellung unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken.

Eine große Zahl von Polypeptiden, die von Säugetierzellen sekretiert werden, besitzen Wachstumsfaktor-Aktivität. Die Sequenz dieser Polypeptide wird bei vielen Säugetieren im wesentlichen beibehalten. Das Interesse an diesen Verbindungen steht im Zusammenhang mit ihrer Onkogenizität. Weiter besteht auch ein Interesse daran, zu wissen, wie die Produktion der Wachstumsfaktoren gesteuert wird und wie die Wachstumfaktoren wiederum die Zellaktivität steuern.

Es ist auch bekannt, daß die Infektion von Säugetierzellen mit Viren zu einer Proliferation des Wachstums infizierter Zellen führt. Für die vorliegende Erfindung von besonderem Interesse sind die Mitglieder der Poxvirus-Familien, wie Variola-Viren, Vaccinia-Viren und Viren, die mit bestimmten Erkrankungen im Zusammenhang gebracht werden, wie Shope Fibroma-Viren, Yaba-Tumorviren und Molluscum-contagiosum- Virus (MCV).

Es wäre von Interesse zu wissen, ob Viren, welche bei einer Infektion Zellproliferation hervorrufen, Polypeptide produzieren, die mit Wachstumsfaktoren im Zusammenhang stehen, als Wachstumsfaktor oder Wachstumfaktor-Rezeptor wirken.

Diese Verbindungen könnte man dann in Untersuchungen zur Virusaktivität, in Assays zur Bestimmung der Anwesenheit von Viren, in Nährmedium als Mitogene und bei der Entwicklung therapeutischer Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen verwenden. Es wäre weiter von Interesse, Verbindungen, die Agonisten oder Antagonisten der Wachstumsfaktoren sein können, zur in vitro-Anwendung in wachsenden Zellkulturen, zur Untersuchung mitotischer Prozesse und für die Therapie zu entwickeln.

Venkatesan et al., J. Virol. (1982) 44 : 637-646 beschreibt die DNA-Sequenzierung eines strukturierten Gens, das für Vaccinia-Virusproteine kodiert. Es liegen jedoch keine Erkenntnisse vor, daß eines dieser Proteine Wachstumsaktivität besitzt. Cooper et al., ibid (1981) 37 : 284-294 berichtet über die Translation von mRNA's, die innerhalb der invertierten terminalen Wiederholung des Vaccinia- Virusgenoms kodiert sind. Über proliferative Erkrankungen bei Mitgliedern der Poxvirus-Familie wurde für das Shope- Fibroma-Virus (Shope, J. Exp. Med. [1932], 56 : 793-822), Yaba-Tumorvirus (Niven et al., J. Path. Bacteriol. [1961] 81 : 1-14) und Molluscum-Kontagiosum-Virus (MCV) (Postlethwaite, Arch. Environ. Health [1970] 21 : 432-452) berichtet. Eine Beschreibung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) findet sich in Scott et al., Science (1983) 221 : 236-240 und Gray et al., Nature (1983) 303 : 722-725. Die Anwesenheit von drei Disulfidbrücken in EGF und Transforming Growth-Factor (TGF) wird von Savage et al., J. Biol. Chem. (1973) 248 : 7669-7692 beschrieben, man vergleiche auch Doolittle et al., Nature (1984) 307 : 558-560 und Australische Patentanmeldung 8 50 06 288. Die Rezeptorbindungsregion des EGF-Moleküls liegt in der Schleife zwischen dem dritten und vierten Cysteinrest (Komoriya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [1983] 81 : 1351-1355).

Neuere Beschreibungen des Vaccinia-Virus-Wachstumsfaktors (VGF) finden sich in Brown et al., Nature (1985) 313 : 491-492; Reisner, Nature (1985) 313 : 801-803 und Blomquist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81 : 7263-7367. Natürlicher Shope Fibroma-Virus-Wachstumsfaktor (SFGF) ist beschrieben von W. C. Chang et al., in Molecular and Cellular Biol. (1987) 7 : 535-540. Shope, J. Exp. Med. (1932) 56 : 793-802 berichtet, daß die Infektion erwachsender Kaninchen mit Shope-Fibroma-Viren eine rasche Proliferation der Fibroplasten verursacht, die zu einem gutartigen Fibrom führt. Die Infektion neugeborener oder immunsupplimierter erwachsener Kaninchen verursacht eine rasche Proliferation der Fibrolasten, die zu einem invasivem atyptischen Fibrosarkom führt, Allison, A. C., J. Natl. Cancer Inst. (1066) 36 : 869-876; Smith, et al., J. Natl. Cancer Inst. (1973) 50 : 1529-1539; Allison A. C., J. Natl. Cander Inst. (1966) 35 : 859-868.

Der natürliche Myxoma-Virus-Wachstumsfaktor (MGF) wird beschrieben von Upton et al., J. Virol. (1987) 61 : 1271- 1275. Die Infektion erwachsener Kaninchen mit Myxoma- Viren führt zu einem rasch proliferierenden, invasiven myxosarkomatosen Tumor, Strayer, D. S. und Sell, S., J. Natl. Cancer Inst. (1983) 71 : 105-116. Es wurde eine DNA-Sequenz gefunden, die in der Lage ist, für einen konservierten Wachstumsfaktor zu kodieren (natürlicher Molluscum contagiosum-Virus-Wachstumsfaktor [MCGF], Porter, C. D. und Archard L. C., J. Gen. Virol. (1987) 68 : 673-682. Die Infektion von Menschen mit Molluscum contagiosum-Viren induziert benigne Hauttumoren, die durch rasch proliferierende Zellen charakterisiert sind, Brown et al., Sex. Transm. Dis. (1981) 8 : 227-234. Yaba-Tumorviren verursachen subkutane Histocytoma bei Affen und Menschen, Bearcroft et al., Nature (London) (1958) 182 : 195-196. Aufgrund ihrer Verwandtschaft zu dem Shope-Fibrom-Virus, Myxoma-Virus und Molluscum contagiosum-Virus nimmt man an, daß der Yaba-Tumorvirus einen verwandten Wachstumsfaktor besitzt.

Mäuse-EGF (mEGF) (Scott et al., 1983, siehe oben; Gray et al., 1983, siehe oben) und Human-EGF (hEGF) (Gregory et al., Int. J. Pept. Protein Res. [1977] 9 : 107-118) sind als homolog zu Human-, Mäuse- und Ratten-TGF (Marquardt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [1983] 80 : 4684-4688) und den Resten 45 bis 85 eines Polypeptids mit 140 Resten, Vaccinia-Wachstumsfaktor (VGF), für den das Vaccinia-Virusgenom kodiert (Venkatesan et al., 1982, wie oben) bekannt.

Die Expression von Fremdpeptiden unter Verwendung eines Baculovirusvektors in Insektenzellen ist beschrieben von Maeda et al., Nature (1985) 315 : 592-594, und Carbonell et al., J. of Virology (1985) 56 : 153-160.

Auf die Offenbarung der obigen Publikationen wird hiermit bezug genommen.

Erfindungsgemäß werden neue Polypeptide und Polypeptidzusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die sich analog in Fragmenten viraler Proteine finden und die als Mitogene wirken und in Nährmedien, als Reagentien zur Detektion von Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder der Anwesenheit von Wachstumsfaktoren und als Kompetitoren für den Transforming- Wachstumsfaktor und epidermalen Wachstumsfaktor Anwendung finden. Die Polypeptide und Polypeptid-Zusammensetzungen finden auch therapeutische Anwendung, beispielsweise um die Epithelialisierung und die Heilung von Verbrennungen und Wunden zu fördern. Die neuen Peptide können synthetisiert werden. Sie können als Oligopeptide oder Fusionsproteine unter Anwendung rekombinianter Techniken in verschiedenen Wirten gebildet werden.

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenz des Vaccinia-Virusproteins mit bekannten Wachstumsfaktoren, wobei die erste Aminosäure des VGF's Asparaginsäure (D) in Position 20 vom Methionin ist, wobei dieses Position aa^-24 der erfindungsgemäßen Peptide entspricht.

Fig. 2 zeigt einen Strukturvorschlag für reifes VGF mit Asparagin (N)-Ersatzstellen. Potientelle Glykosilierungsstellen in MGF und SFGF werden durch Sterne angezeigt.

Erfindungsgemäß werden neue Peptide und Peptidzusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die als Agonisten oder Antagonisten des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) oder Transforming-Wachstumsfaktors (TGF) wirken können. Sie besitzen viele Anwendungsmöglichkeiten bei Zellkulturen, in der Diagnostik, in der in vivo-Therapie und in Kombination mit anderen Peptiden bei der Bildung von Hybrid-polypeptiden als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern. Polynukleotidsequenzen können isoliert oder herstellt und in einen Expressionsvektor zur Expression der erfindungsgemäßen Peptide eingeführt werden.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen finden ihre Entsprechung in Fragmenten viraler Proteine, insbesondere Poxvirus-Proteine. Wie in Fig. 1 gezeigt, besitzt VGF ungeladene und hydrophobe Reste in der Nähe des N-Terminus zwischen den Resten 5 und15 und in der Nähe des C-Terminus zwischen den Resten 100 und 124. In Analogie zu integralen Membranglykoproteinen kann man diesen Resten eine N- terminale hydrophobe Signalsequenz, die proteolytisch während und unmittelbar nach der Translation entfernt wird und eine C-terminale transmembranöse Substanz zuschreiben, die dazu dient, das reife Protein in der Membran zu verankern. Eine Spaltung des viralen Polypeptids bei arg-43 und arg-90 des reifen Peptids würde zur Freisetzung eines löslichen Polypeptids führen. Man nimmt an, daß das VV-Polypeptid mit 140 Resten zunächst zu einem Membran-assoziierten Protein von etwa 121 Resten nach Entfernung der 1 g Aminosäuresequenz führt. Nach intracellulärem Prozessieren erhält man ein lösliches Wachstumsfaktorpeptid von etwa 77 Resten, Cell (1985) 42 : 383-393.

Ein Vergleich des Myxoma-Wachstumsfaktors (MGF) und des Shope-Fibroma-Wachstumsfaktors (SFGF) mit anderen Mitgliedern der Wachstumsfaktor-Familie (siehe Fig. 1), zeigt mehrere bemerkenswerte Unterschiede. MGF und SFGF, synthetisiert als Prekursormoleküle, besitzen eine Signalsequenz am N-Terminus. Im Gegensatz zu den anderen Wachstumsfaktoren besitzen sie jedoch keine transmembrane Domäne am C-Terminus, was zeigt, daß sie sekretierte Moleküle sind. Eine Sequenzanalyse zeigt das signifikante Vorkommen der Aminosäure Asparagin in MGF und SFGF. In sechs Positionen ist bei MGF und SFGF Asparagin vorhanden, während die anderen Mitglieder der Familie kein Asparagin aufweisen. Von diesen Positionen ersetzt das Asparagin zwei hoch konservierte Glycinreste in Position 8 und 31, wobei das erste Cystein sich in Position 2 befindet. Beide Glycinreste treten in Kombination mit hoch konservierten Tyrosinresten in Positionen 9 und 32 auf. Aufgrund der hochkonservierten Natur der Aminosäuren in diesem Molekül an sich, nimmt man an, daß die darin vorhandenen Cysteinschleifen mit der Rezeptorbindung und Funktion der Wachstumsfaktoren in dieser Familie im Zusammenhang stehen.

Den Aminosäuren Glycin und Asparagin wird das höchste β-Turnpotential zugeschrieben (Chou und Fassman, Ann. Rev. Biochem. [1978] 47 : 251-276). Die Konservierung dieses Turnpotentials scheint daher äußerst wichtig für die Wachstumfaktoraktivität zu sein. Andere als die Myxoma- und Shope-Wachstumsfaktoren benutzen beinahe ausschließlich Glycin in wichtigen Turnregionen des Moleküls. Bei MGF und SFGF sind diese Glycine beinahe alle in Asparagin umgewandelt (siehe Fig. 2). Dies deutet auf eine wichtige biologische Funktion hin, die auf den Ersatz des hochkonservierten Glycinrestes durch den Asparaginrest zurückzuführen ist. Es besteht die Möglichkeit, daß der Ersatz des Glycins durch Asparagin in den konservierten Turnregionen in der Struktur des Wachstumsfaktors zu einer vergrößteren Funktionalität des Wachstumsfaktors führen kann, entweder durch Verstärkung der Bindung an den EGF- Rezeptor oder an einen verwandten Rezeptor unter Verstärkung des direkten Effekts des Wachstumsfaktors in den betroffenen Zellen oder durch Erhöhung der Stabilität des Moleküls.

Zwei der neuen Asparaginpositionen in MGF und SFGF ergeben potentielle N-verknüpfte Glykosilierungsstellen. Darüber hinaus sind diese Stellen in zwei Cysteinschleifen vorhanden, die eine variable Zahl an Aminosäuren ermöglichen. Die neuen Asparaginpositionen bieten dem Wachstumsfaktor somit neben der erhöhten Funktionalität zahlreiche Vorteile. Einer dieser Vorteile könnte die Stabilisierung des Proteins in vivo durch Schutz vor Abbau oder der immunogenen Stellen durch Glykosilierung sein.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine Schleife oder einen Kreis, üblicherweise drei Schleifen oder drei Kreise besitzen die von brückenbildenden Cysteinen herrühren, wobei der physiologisch aktive Teil des Moleküls mit einer wachstumsfaktorverwandten Aktivität etwa 12 bis 65 Aminosäuren, üblicherweise 15 bis 60 Aminosäuren umfaßt. Zwei der drei Schleifen bestehen aus etwa 12 bis 15 Aminosäuren (14 bis 17 annulare Aminosäuren), ausschließlich der Cysteinbrücke. Insbesondere besteht eine dieser Schleifen aus 12 oder 13 Aminosäuren (14 oder 15 annulare Aminosäuren) und die andere aus 15 Aminosäuren (17 annulare Aminosäuren), wobei die N-terminale proximale Schleife üblicherweise aus 12 bis 13 Aminosäuren, insbesondere 12 Aminosäuren und die Mittelschleife aus 15 Aminosäuren bestehen.

Die dritte oder C-proximale Schleife besteht aus 8 Aminosäuren (10 annularen Aminosäuren) und besitzt einschließlich der flankierenden Aminosäuren die folgende Formel:

worin

die Einbuchstabensymbole für Aminosäuren die übliche Bedeutung besitzen, wobei C für Cystein, G für Glycin, N für Asparagin, Y für Tyrosin und R für Arginin stehen;
aa²⁵ eine neutrale Aminosäure bedeutet, die aliphatisch, insbesondere mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, oder aromatisch, insbesondere mit 9 Kohlenstoffatomen sein kann und die 0 bis 1 Hydroxygruppe aufweisen kann, beispielsweise Alanin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Phenylalanin;
aa²⁷ eine neutrale oder basische Aminosäure mit insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, die, wenn es sich um eine neutrale Aminosäure handelt, 0 bis 1 Carboxyamidgruppen aufweisen kann, beispielsweise Arginin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Asparagin oder Glutamin;
aa²⁹ eine neutrale oder basische aliphatische oder aromatische Aminosäure bedeutet, wobei eine aromatische Aminosäure beispielsweise Histdin ist und eine aliphatische Aminosäure 2 bis 6, insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatome, mit 0 bis 1 Hydroxygruppen aufweist, beispielsweise Serin, Threonin, Leucin, Valin, Isoleucin oder Arginin;
aa³⁰ eine neutrale, aliphatische oder aromatische Aminosäure ist, wobei eine aromatische Aminosäure beispielsweise Histidin ist und eine aliphatische Aminosäure 3 bis 6 Kohlenstoffatome und 0 bis 1 Hydroxygruppen aufweist, wie insbesondere Serin, Isoleucin und Valin;
aa³³ eine neutrale aliphatische Aminosäure mit 2 bis 6, insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxygruppen bedeutet, wie insbesondere Serin, Threonin, Valin, Leucin oder Isoleucin oder eine saure Aminosäure bedeutet, beispielsweise Glutaminsäure und Asparaginsäure;
aa³⁵ eine neutrale oder saure Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, beispielsweise eine neutrale Aminosäure, wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin und Serin und eine saure Aminosäure, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure;
aa³⁸ eine aliphatische neutrale, mit einer Carboxamidgruppe substituierte Aminosäure mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen oder eine saure Aminosäure bedeutet, beispielsweise Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure oder Glutaminsäure;
aa³⁹ eine aromatische Aminosäure oder eine neutrale aliphatische Aminosäure mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, üblicherweise mit einem Hydroxysubstituenten, und vorzugsweise eine aromatische Aminosäure bedeutet, beispielsweise Phenylalanin, Histidin, Tyrosin, Serin oder Threonin;
aa⁴⁰ eine neutrale substituierte und unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine basische Aminosäure bedeutet, beispielsweise Alanin, Valin, Isoleucin, Glutamin oder Arginin;
m und n für 0 oder 1 stehen;
PP³ und PP⁴, die gleich oder verschieden sein können, entweder ein Wasserstoffatom bedeuten, was das Ende des Polypeptids ausdrückt, oder eine Polypeptidkette mit nicht mehr als insgesamt 1000 Aminosäuren, üblicherweise nicht mehr als insgesamt etwa 500 Aminosäuren bedeuten, wobei vorzugsweise wenigstens 90% der Aminosäuren, insbesondere wenigstens etwa 95% der Aminosäuren in einer der beiden Polypeptidketten vorhanden sind; wobei in einigen Fällen die Kette aus nur einer Aminosäure und nicht mehr als 100 Aminosäuren, häufig aus nicht mehr als ungefähr 50 Aminosäuren besteht, je nach Anwendung des Polypeptids und der Rolle, die die verlängerte Kette spielt; wobei die Polypeptidketten den natürlich vorkommenden Polypeptidketten, die mit natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren und Poxvirusproteinen in Zusammenhang stehen, verwandt sein können oder von den natürlich vorkommenden Ketten oder Fragmenten davon, die mit den in der Formel gezeigten spezifischen Polypeptidketten assoziiert sind, verschieden sein können und üblicherweise nicht verwandt sind.

Die Definitionen der Aminosäuren sind nachfolgend erläutert.

Neutral (Ne)
aliphatisch (Al)
unsubstituiert	G, A, V, L, I, P
substituiert @	oxy	S, T
thio	C, M
amido	N, Q
aromatisch (Ar) @	unsubstituiert	F
substituiert	Y
heterocyclisch	H, W

Geladen (bei pH 6,0)
basisch (Ba)
K, R
sauer (Ac)	D, E

Die Abkürzungen in Klammern beziehen sich auf bestimmte Aminosäuregruppen. Mit "unsubstituiert" sind keine weiteren Heterosubstituenten wie die in Glycin vorhandenen Carboxy- und Aminogruppen, gemeint. Die Aminosäuren sind natürlich vorkommende L-Aminosäuren.

Die neutralen Aminosäuren können auch nicht-polare oder polare (aber ungeladene) Gruppen R aufweisen. Aminosäuren, die unter diese Definition fallen, sind:

nicht-polare Aminosäuren
A, V, L, I, P, M, F, W
polare Aminosäuren	G, S, T, C, Y, N, Q

Die Schleife zwischen den Cysteinen in Positionen 28 und 37 in obiger Formel enthält 0 bis 1 saure Aminosäure (S). Die unmittelbar außerhalb der Schleife an die Cysteine anschließenden Aminosäuren (d. h. die Aminosäuren 27 und 38) umfassen wenigstens eine geladene Aminosäure und wenigstens eine Amido-substituierte aliphatische Aminosäure. Von den in der Schleife (28 bis 37) enthaltenen Aminosäuren sind 4 bis 6, üblicherweise 5 Aminosäuren, neutrale aliphatische Aminosäuren und nicht mehr als 2, üblicherweise 1, sind aromatische Aminosäuren.

Von besonderem Interesse sind Verbindungen, bei denen das Polypeptid weniger als 130 Aminosäuren, insbesondere weniger als 55 Aminosäuren, und wenigstens 44 Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens etwa 53 Aminosäuren, aufweist. Von besonderem Interesse sind auch Polypeptide, die die Aminosäuren 44 bis 88 und Fragmente davon von VGF (aa¹ bis aa⁴⁷, siehe Fig. 1) umfassen.

Vorzugsweise bedeutet

aa²⁹ eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxygruppe, insbesondere Serin oder Valin; oder eine aromatische Aminosäure, insbesondere Histidin;
aa³⁰ bedeutet vorzugsweise Histidin, Serin oder eine unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Isoleucin;
aa³³ bedeutet vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 0 bis 1 Hydroxygruppen und 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;
aa³⁵ bedeutet vorzugsweise eine aliphatische Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;
aa³⁸ bedeutet vorzugsweise Glutamin oder Glutaminsäure;
aa³⁹ bedeutet vorzugsweise eine aromatische Aminosäure, insbesondere Histidin oder Phenylalanin;
aa⁴⁰ bedeutet vorzugsweise eine neutrale oder basische Aminosäure.

Von besonderem Interesse ist die Anwesenheit von zwei Schleifen, wobei die C-proximale Schleife mit der zweiten Schleife verbunden ist und wobei die Aminosäuren der zweiten Schleife in einem weiten Bereich variieren können. Die zweite Schleife umfaßt vorzugsweise etwa 14 bis 16 Aminosäuren ohne die Cysteinbrücke, insbesondere etwa 15 Aminosäuren. Von diesen Aminosäuren sind 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 9 und insbesondere in etwa 8, aliphatische Aminosäuren, die substituiert oder unsubstituiert sein können, wobei vorzugsweise nicht mehr als etwa 3, insbesondere 1 bis 2 Aminosäuren, substituiert sind. Es sind 2 bis 4 aromatische Aminosäuren, insbesondere 3 aromatische Aminosäuren vorhanden, vorzugsweise Histidin und Tyrosin. Es sind 2 bis 4 saure Aminosäuren, vorzugsweise 3 saure Aminosäuren vorhanden, insbesondere Asparaginsäure. Weiter sind 0 bis 2, insbesondere 1 basische Aminosäure vorhanden, vorzugsweise Arginin. Zweckmäßigerweise ist das Cystein, das die Schleife bildet, die dem Cystein der anderen Schleife am nächsten liegt, durch 0 bis 2, üblicherweise 0 bis 1 Aminosäure und insbesondere durch Arginin, separiert.

Von besonderem Interesse für einige Anwendungsgebiete sind die Verbindungen der folgenden Formel:

worin

die Symbole aa²⁵ bis aa⁴⁰ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen;
PP¹ und PP², die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome bedeuten können und damit den Terminus des angegebenen Polypeptids bilden oder Polypeptide bedeuten können, die insgesamt bis zu etwa 1000 Aminosäuren, insbesondere bis zu etwa 500 Aminosäuren und insgesamt aber auch nur 1 Aminosäure umfassen können oder einzeln und getrennt Polypeptide mit 1 bis 100 Aminosäuren, insbesondere etwa 1 bis 75 Aminosäuren und besonders bevorzugt etwa 5 bis 50 Aminosäuren bedeuten können, wobei diese Polypeptide bestimmte Anwendungen bei der Modifizierung der konkret beschriebenen Sequenz für einen gegebenen Zweck finden können und wobei PP¹ und PP² gleich sein können wie oder verschieden sein können von dem natürlichen Poxvirus-Polypeptid, üblicherweise aber verschieden sind;
aa¹ eine Aminosäure sein kann, insbesondere eine aliphatische Aminosäure, basische Aminosäure oder saure Aminosäure, vorzugsweise eine unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, einschließlich Glycin, Leucin, Valin, Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure;
aa³ eine neutrale Aminosäure mit insbesondere 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, vorzugsweise Asparagin, Glycin und Prolin;
aa⁴ eine aliphatische oder aromatische Aminosäure bedeutet, insbesondere eine Aminosäure mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, die neutral oder sauer sein kann und die insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, einschließlich Prolin, Asparaginsäure, Histidin, Serin und Leucin;
aa⁵ eine saure oder neutrale, substituierte aliphatische Aminosäure, insbesondere Glutaminsäure oder Asparaginsäure, oder eine Hydroxy-substituierte Aminosäure mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, insbesondere Serin, bedeutet;
aa⁶ eine unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 2 bis 6, üblicherweise 2 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine aromatische Aminosäure bedeutet, insbesondere Glycin, Histidin oder Tyrosin;
aa⁷ eine saure, basische oder neutrale Aminosäure mit insbesondere 3 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, wie Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin und Threonin;
aa⁸ eine neutrale unsubstituierte aliphatische Aminosäure mit 2 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine mit einer Carboxamidgruppe substituierte Aminosäure mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeutet, beispielsweise Asparagin, Glutamin oder Glycin;
aa¹¹ eine aliphatische oder aromatische neutrale Aminosäure, insbesondere eine aliphatische Aminosäure, vorzugsweise mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt Leucin oder Phenylalanin bedeutet;
aa¹² eine aromatische Aminosäure oder eine Carboxamid- substituierte aliphatische Aminosäure mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Histidin oder Asparagin, bedeutet;
aa^12a eine neutrale aliphatische oder saure Aminosäure, insbesondere Glycin, Asparagin oder Asparaginsäure, bedeutet;
aa¹⁴ eine saure Aminosäure oder neutrale aliphatische, substituierte oder unsubstituierte Aminosäure mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxygruppen und insbesondere Asparaginsäure, Threonin oder Valin bedeutet;
aa¹⁶ eine Bindung oder eine neutrale oder basische aliphatische, substituierte oder unsubstituierte Aminosäure mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Isoleucin, Arginin oder Methionin, bedeutet;
Ar¹ eine aromatische Aminosäure, die einen carbocyclischen oder heterocyclischen Ring aufweisen kann, bedeutet, einschließlich Histidin, Phenylalanin oder Tyrosin;
aa^17a eine neutrale aliphatische, substituierte oder unsubstituierte Aminosäure mit 3 bis 6, insbesondere 3 bis 5 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxygruppen bedeutet, einschließlich Valin, Leucin, Isoleucin und Threonin;
aa^17b eine neutrale unsubstituierte Aminosäure mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen oder eine saure Aminosäure und insbesondere Valin, Isoleucin oder Glutaminsäure bedeutet;
aa¹⁸ eine neutrale aliphatische, substituierte oder unsubstituierte Aminosäure mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxygruppen und insbesondere Alanin, Serin oder Glutamin bedeutet;
aa¹⁹ irgendeine Aminosäure sein kann, insbesondere eine aliphatische saure oder basische Aminosäure mit insbesondere 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Arginin, Leucin, Valin und Glutaminsäure;
aa²⁰ eine saure Aminosäure oder aliphatische Carboxamid- substituierte Aminosäure bedeutet, einschließlich Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure oder Glutamin;
aa²¹ eine neutrale unsubstituierte aliphatische Aminosäure oder basische Aminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxy- oder Carboxamid-Gruppen bedeutet, einschließlich Isoleucin, Leucin, Asparagin, Serin, Threonin, Lysin und Arginin;
aa²² eine Bindung oder eine saure Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, oder eine neutrale aliphatische Aminosäure, insbesondere Valin, bedeutet;
aa^22a eine neutrale aliphatische Aminosäure mit 0 bis 1 Hydroxygruppen, insbesondere 1 Hydroxygruppe, und vorzugsweise Serin, bedeutet;
aa^22b eine neutrale aliphatische Aminosäure mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Leucin oder Isoleucin, bedeutet;
aa²³ eine Bindung oder eine neutrale aliphatische, substituierte oder unsubstituierte Aminosäure mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 0 bis 1 Hydroxysubstituenten bedeutet, einschließlich Glycin, Serin, Threonin und Asparagin;
aa²⁴ eine aliphatische Aminosäure, insbesondere eine thiosubstituierte aliphatische Aminosäure und vorzugsweise Methionin, Prolin, oder eine aromatische Aminosäure, insbesondere Tyrosin, bedeutet;
aa⁴¹ eine neutrale substituierte oder unsubstituierte aliphatische oder saure Aminosäure mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere Valin, Asparagin oder Asparaginsäure, bedeutet;
aa⁴³ eine neutrale aliphatische, saure oder basische substituierte oder unsubstituierte Aminosäure mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, einschließlich Valin, Leucin, Isoleucin, Arginin, Lysin und Asparaginsäure;
aa⁴⁴ irgendeine Aminosäure sein kann, insbesondere eine nicht-basische Aminosäure, wobei diese Aminosäure sauer, neutral oder aromatisch sein kann und, wenn es sich nicht um eine aromatische Aminosäure handelt, sie 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, insbesondere Asparaginsäure, Alanin, Leucin, Trypthophan oder Threonin; und
p für 0 oder 1 steht.

Besonders bevorzugt ist es, wenn PP¹ die folgende Sequenz besitzt:

worin

PP¹′ in Kombination mit den nachfolgenden Aminosäuresymbolen der obigen Sequenz ein Äquivalent von PP¹ ist. Die obige Sequenz liegt im Rahmen der Definition von PP¹; PP¹′ kann ein Wasserstoffatom oder eine Aminosäuresequenz sein. Eine Aminosäure oder mehrere Aminosäuren, symbolisiert durch aa^-x (x bedeutet eine Zahl) kann oder können eine Bindung bedeuten, um die Zahl der Aminosäuren in der N-terminalen Kette zu reduzieren. Es kann daher die gesamte angegebene Aminosäuresequenz oder ein Teil davon vorliegen. Wenn ein Teil dieser Sequenz vorliegt, umfaßt die Sequenz vorzugsweise benachbarte Aminosäuren, d. h. Aminosäuren in der numerischen Reihenfolge ohne Deletionen. Üblicherweise ist wenigstens eine Aminosäure, insbesondere sind wenigstens 3 und besonders bevorzugt wenigstens 6 Aminosäuren vorhanden, wobei die verbleibenden Upstream-Aminosäuren fehlen können, so daß PP¹′ an aa^-a, aa^-6 oder dergleichen gebunden sein kann;
aa^-1 kann irgendeine Aminosäure sein, insbesondere eine aliphatische Aminosäure mit etwa 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise neutral oder basisch und insbesondere bevorzugt Lysin, Arginin, Prolin, Asparagin oder Serin;
aa^-2 kann eine aliphatische oder aromatische Aminosäure sein, insbesondere eine aliphatische Aminosäure mit, besonders bevorzugt, etwa 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;
aa^-3 kann eine aliphatische oder aromatische, insbesondere eine aliphatische, polare oder nicht-polare Aminosäure mit 2 bis 6, üblicherweise 2 bis 5 Kohlenstoffatomen sein, die im allgemeinen 0 bis 1 Hydroxygruppe aufweist;
aa^-4 kann eine aliphatische, neutrale oder basische Aminosäure mit im allgemeinen 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise 5 bis 6 Kohlenstoffatomen sein, wie insbesondere Asparagin, Prolin ode Lysin;
aa^-5 kann eine aliphatische, insbesondere eine neutrale Aminosäure mit im allgemeinen 3 bis 6 Kohlenstoffatomen sein, insbesondere Valin oder Isoleucin;
aa^-6 bedeutet eine neutrale oder saure Aminosäure, die, wenn es sich um eine aliphatische Aminosäure handelt, etwa 3 bis 6, insbesondere 4 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, vorzugsweise Isoleucin, Valin oder Asparaginsäure;
aa^-7, aa^-8, aa^-9, aa^-12, aa^-14, aa^-15, aa^-16, aa^-17, aa^-19, aa^-20, aa^-21 und aa^-23 sind polare oder nicht-polare, aliphatische Aminosäuren mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere polare Aminosäuren mit 0 bis 1 Hydroxysubstituenten, oder aromatische Aminosäuren;
aa^-10 und aa^-25 sind nicht-polare aliphatische Aminosäuren oder saure Aminosäuren mit 2 bis 6, insbesondere 2 bis 3 Kohlenstoffatomen;
aa^-13, aa^-22 und aa^-24 sind polare aliphatische Aminosäuren oder saure Aminosäuren mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen, die insbesondere einen Carboxamido-Substituenten aufweisen;
aa^-11 und aa^-18 sind aliphatische, polare oder nicht-polare Aminosäuren oder saure Aminosäuren.

Von besonderem Interesse ist ein N-terminales Fragment aus aa^-1 bis aa^-24 oder aa^-1 bis aa^-7, insbesondere aa^-1 bis aa^-6. pp¹′ kann zweckmäßigerweise eine nicht-verwandte Aminosäuresequenz sein, die als Fusionsprotein dienen kann, insbesondere um ein immunogenes Peptid zur Herstellung von Anitkörpern gegen die Verbindung zur Verfügung zu stellen.

Der Hauptpunkt der erfindungsgemäßen Peptide ist die Sequenz aa²⁵ bis aa⁴⁰, insbesondere die Sequenz von dem Cystein in Position 28 bis zu dem Cystein in Position 37 und die Schleifen, die von den Cysteinen in Positionen 2 und 10 und den Cysteinen in Positionen 15 und 26 gebildet werden. Es ist wünschenswert, daß die durch die Cysteine in Positionen 28 und 37 gebildete Schleife in Verbindung mit der Schleife vorliegt, die durch die Cysteine in Positionen 15 und 26 gebildet wird.

Chimäre Polypeptidsequenzen kann man herstellen durch Kombination von Fragmenten verschiedener Polypeptide, die eine Sequenz besitzen, welche im wesentlichen den natürlich vorkommenden Polypeptidketten ähnlich sind, die mit natürlich vorkommenden Wachstumfaktoren und Poxvirus-Proteinen assoziiert sind. Die erhaltenen chimären Polypeptide haben etwa 40 bis 65 Aminosäuren, üblicherweise etwa 45 bis 60 Aminosäuren, insbesondere 49 bis 53 Aminosäuren. In jedem Fall bleibt die Rahmenstruktur der Cysteine erhalten, wobei die Cysteinbrücken Schleifen der zuvor beschriebenen Größe definieren. Man kann demnach ein Fragment eines Wachstumsfaktors, der im wesentlichen mit VGF (siehe beispielsweise Fig. 1) homolog ist, oder einen anderen Wachstumsfaktor, der die gleiche Rahmenstruktur wie die erfindungsgemäßen Peptide und ähnliche physiologische Aktivität besitzt, verwenden. Die Herkunft der Wachstumsfaktoren ist nicht auf Säugetiere beschränkt, sie können vielmehr stammen von Primaten, beispielsweise Menschen, Nagetieren, beispielsweise Ratten und Mäusen, Rindern, Vögeln, Schweinen und dergleichen.

Bis zu drei Verbindungsstellen (junctures) können erforderlich sein, je nach Herkunft der Fragmente und Länge des gewünschten Polypeptids. Wünschenswerterweise erfolgen die Verbindungen am gleichen Punkt zwischen aa^-6 und aa¹; aa¹¹ und aa¹⁵; aa²⁵ und aa²⁹; und aa⁴² und aa⁵³. Die Sequenz zwischen etwa aa^-6 und etwa aa¹⁵ wird als N- terminale Sequenz bezeichnet; diejenige zwischen etwa aa¹⁴ und etwa aa²⁹ wird als zentrales Fragment bezeichnet; und diejenige zwischen etwa aa²⁵ und dem Ende des Peptids (im allgemeinen aa⁴⁴ bis aa⁴⁷) wird als C-terminale Domäne bezeichnet. Der exakte Verbindungspunkt kann in Abhängigkeit von der Lokalisierung der Restriktionsstellen etc. variieren. Zusätzlich kann eine extreme N-terminale Sequenz, die etwa aa^-24 bis aa^-7, insbesondere aa^-23 bis aa^-7 umfaßt, mit dem chimären Polypeptid verbunden werden. Die Fragmente weisen im allgemeinen etwa 15 bis 50, üblicherweise 15 bis 45 Aminosäuren auf, da aa²⁰ nicht die 20. Aminosäure der Verbindung, sondern lediglich die spezifische Sequenz bezeichnet, die spezifisch definiert wurde (siehe Fig. 1).

Mehrere zweckmäßige Restriktionsstellen sind in den synthetischen Genen vorgesehen, welche zur Konstruktion der chimären Polypeptide verwendet werden. Soweit möglich, lassen die Restriktionsstellen die Aminosäuresequenzen des Wachstumsfaktorgens unverändert. In einigen Fällen jedoch ergibt die Inkorporation einer neuen Restriktionsstelle eine geänderte Aminosäuresequenz. Von besonderem Interesse ist es, wenn die für VGF kodierende Sequenz modifiziert wird, um eine KpnI-Restriktionsstelle einzuführen, und zwar durch Veränderung der Aminosäuresequenz bei aa¹³ bis aa¹⁵ von GDC zu GTC und um eine Sph I-Stelle bei aa²³ bis aa²⁸ einzuführen durch Veränderung der Sequenz GMYCRC zu GYACVC. Diese Veränderungen ergeben zweckmäßige Stellen, um Fragmente des VGF-Gens mit Fragmenten aus anderen Wachstumsfaktoren zu verknüpfen. Beispielsweise kann das Genfragment aa²⁶ bis aa⁴⁷ zweckmäßig mit einem Genfragment aus Aminosäuren, die für α-TGF kodieren, entsprechend den Resten aa^-6 bis aa²⁵, verbunden werden, um ein TGF/VGF- Hybridpolypeptid zu produzieren. Die Sequenz des chimären Peptids umfaßt demnach aa^-6 bis aa¹³ (N-Terminus) und aa¹⁴ bis aa²⁵ (Zentralfragment), abgeleitet von α-TGF, und aa²⁶ bis aa⁴⁷ (C-Terminus) abgeleitet von VGF und modifiziert wie oben angegeben.

Die Herstellung von Plasmiden, welche in der Lage sind, chimäre Proteine mit Aminosäuresequenzen zu exprimieren, die von Fragmenten aus mehr als einem Wachstumsfaktor oder Poxvirus-Polypeptid mit Sequenzänderungen soweit erforderlich, um eine zweckmäßige Restriktionsstelle einzuführen, abgeleitet sind, sind näher im experimentellen Teil beschrieben.

Fusionsproteine kann man ebenfalls herstellen, wenn ein Wachstumsfaktor oder ein chimäres Polypeptid, gebunden an die N-terminale Aminosäure einer Signalsequenz oder die N-terminale Aminosäure eines exprimierten Bakterien-, Bakteriophagen- oder eukaryontischen Gens, exprimiert wird. Zusätzlich kann man eine enzymatische oder chemische Spaltungsstelle im Anschluß an die Leadersequenz vorsehen, um eine Spaltung des reifen Polypeptids von der Leadersequenz zu ermöglichen. Die Herstellung von Plasmiden, welche in der Lage sind, diese Fusionspolypeptide zu exprimieren, sowie Verfahren zur Abspaltung und Isolierung der gewünschten Polypeptide sind im experimentellen Teil näher beschrieben.

Herstellung von Wachstumsfaktoren

Die erfindungsgemäßen Polypeptide und Zusammensetzungen kann man auf verschiedene Weise je nach ihrer Größe herstellen. Wenn die Peptide insbesondere weniger als etwa 80, und ganz besonders weniger als etwa 60 Aminosäuren umfassen, können sie nach üblichen Synthesen hergestellt werden, siehe beispielsweise Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, "The Peptides Analysis, Synthesis Biology", Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. , Vol. 2, Gross und Meinhofer (Hrsg. Academic Press, NY, 1980, Seiten 1-284, sowie US-PS 41 27 526.

Alternativ kann man Hybrid-DNA-Technologien anwenden, wenn DNA-Sequenzen benutzt werden können, die für das gewünschte Polypeptid oder einen Prekursor davon kodieren. DNA- Sequenzen, die für den gewünschten Wachstumsfaktor kodieren, können unter Anwendung herkömmlicher Techniken synthetisiert werden, beispielsweise mittels überlappender Einzelstränge, die ligiert werden können, um die gewünschte Kodierungssequenz zu bilden. Die Termini kann man so vorsehen, daß sie Restriktionsstellen bilden oder ein Terminus oder beide Termini können zur Ligierung an komplementäre Enden eines Expressionsvektors stumpf sein (blunt-ended). Zur Expression der Sequenz ist ein Initial-Methionin vorgesehen. Geeignete Expressionsvektoren stehen im allgemeinen zur Verfügung und sind zahlreich in der Literatur beschrieben.

Anstatt das gewünschte Gen zu synthetisieren, kann das Wachstumsfaktorgen auch anhand von verschiedenen Techniken isoliert werden. Wenn der Wachstumsfaktor beispielsweise ein viraler Wachstumsfaktor ist, kann die für das Polypeptid einschließlich des Wachstumsfaktors kodierende mRNA aus dem Virus isoliert, die mRNA revers transkribiert, die erhaltene Einzelstrang-(ss)-DNA als Templat zur Herstellung einer Doppelstrang(ds)-DNA verwendet und das ds-DNA-Gen isoliert werden. Eine weitere Technik besteht darin, ein Stück der viralen DNA zu isolieren und unter Verwendung einer in geeigneter Weise deqentierten Sonde, welche eine Region der am besten konservierten Sequenzen in einem Wachstumsfaktorgen umfaßt, die Sequenzen zu identifizieren, die für einen Faktor im viralen Genom kodieren. Die Sonde kann beträchtlich kürzer als die vollständige Sequenz sein, sie sollte aber eine Länge von wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 14 und insbesondere bevorzugt wenigstens 20 Nukleotide aufweisen. Längere Oligonukleotide bis zur vollen Länge des Wachstumsfaktorgens sind ebenfalls brauchbar. Man kann DNA- und RNA-Sonden verwenden.

Zur Anwendung werden die Sonden in typischer und detektierbarer Weise markiert (beispielsweise mit ³²P oder biotinylierten Nukleotiden) und mit einer Einzelstrang-DNA oder RNA aus dem Organismus, in welchem das Gen gesucht wird, inkubiert. Eine Hydridisierung wird mit Hilfe der markierten Sonden detektiert, nachdem die Einzelstrang- und Doppelstrang (hybridisiert)-DNA (oder DNA/RNA) getrennt wurden, beispielsweise unter Verwendung von Nitrocellulosepapier. Für den Gebrauch mit Oligonukleotiden geeignete Hybridisierungstechniken sind dem Fachmann bekannt.

Obwohl die Sonden üblicherweise mit einer detektierbaren Markierung verwendet werden, die eine leichte Identifizierung ermöglicht, sind auch unmarkierte Oligonukleotide brauchbar, und zwar sowohl als Prekursoren markierter Sonden als auch zur Anwendung bei Methoden, die eine direkte Detektion der Doppelstrang-DNA (oder DNA/RNA) ermöglichen. Der Ausdruck "Oligonukleotide" umfaßt daher sowohl markierte als auch unmarkierte Formen.

Nachdem man die gewünschte DNA-Sequenz erhalten hat, kann man sie dann auf verschiedene Weise manipulieren und für die Expression vorsehen; beispielsweise kann man chimäre Polypeptidsequenzen herstellen durch Kombination von Genfragmenten aus wenigstens zwei Polypeptiden, die Sequenzen aufweisen, die zu wenigstens 30% mit natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren, welche an den EGF-Rezeptor ("natürliche Liganden") binden, homolog sind. Es ist besonders wünschenswert, daß die dreidimensionale Struktur, insbesondere die Struktur der Schleifen des Polypeptids erhalten bleibt, insbesondere derjenige Teil (oder diejenigen Teile) der Struktur, der für die Bindung an den EGF-Rezeptor und für die biologische Aktivität der natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren, welche an den EGF-Rezeptor binden, verantwortlich ist.

Je nach Herkunft der Fragmente und Länge des gewünschten Polypeptids kann man in den synthetischen Genen, welche zur Konstruktion der chimären Polypeptide wie oben beschrieben verwendet werden, zweckmäßige Restriktionsstellen vorsehen. Soweit möglich, läßt (lassen) die Restriktionsstelle(n) die Aminosäuresequenzen des Polypeptids unverändert. In einigen Fällen jedoch kann die Inkorporation einer neuen Restriktionsstelle (oder neuere Restriktionsstellen) zu einer geänderten Aminosäuresequenz ohne Veränderung der Aktivität des Proteins führen.

Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert werden soll, welcher die Wildtyp-transkriptionalen und translationalen Regulatorregionen des Wachstumsfaktors erkennt, kann das gesamte Gen mit seinen Wildtyp-5′- und 3′-Regulatorregionen in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden. Es existieren zahlreiche Expressionsvektoren die von Replikationssystemen von Säugetierviren, wie Simian Virus 40, Adenovirus, Bovin-papilloma-Virus, Vaccinia-Virus, Insektenbaculovirus etc. Gebrauch machen. Diese Replikationssysteme sind entwickelt worden, um Marker zur Verfügung zu stellen, welche die Selektion von Transfektanten ermöglichen und zweckmäßige Restriktionsstellen zur Verfügung stellen, in welche das Gen insertiert werden kann.

Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert werden soll, welcher die natürlich vorkommenden Wildtyp-transkriptionalen und translationalen Regulatorregionen nicht erkennt, sind weitere Manipulationen erforderlich. Eine Vielzahl von 3′-transkriptionalen Regulatorregionen sind bekannt und können abwärts von den Stopkodons insertiert werden. Die nicht-kodierende 5′-Region aufwärts vom gewünschten Gen kann durch Endonukleaserestriktion, Ba131-Resektion oder dergleichen entfernt werden. Wenn eine zweckmäßige Restriktionsstelle nahe des 5′-Terminus des gewünschten Gens vorliegt, kann man dieses alternativ einer Restriktion unterziehen und einen Adaptor zur Verknüpfung des gewünschten Gens an die Promotorregion verwenden, wenn der Adaptor die verlorenen Nukleotide des gewünschten Gens bereitstellt. Man kann verschiedene Strategien verfolgen, um eine Expressionskassette zur Verfügung zu stellen, die in der 5′-3′-richtung der Transkription eine Transkriptions-Regulatorregion und eine Translations-Initiator-Region, die auch Regulatorsequenzen zur Induzierung der Regulation aufweisen kann; das gewünschte Gen unter der Transkriptions- und Translations- Kontrolle der Initiatorregion; und eine die Transkription und Translation beendete Region umfaßt.

Die Wahl geeigneter Regulatorsequenzen muß die folgenden Faktoren, welche die Expression beeinflußen, berücksichtigen. Bei der Transkriptions-Regulierung sind die Menge und die Stabilität der Messenger-RNA wichtige Faktoren, welche die Expression der Genprodukte beeinflussen. Die Menge an mRNA wird bestimmt durch die Kopienzahl des betreffenden Gens, die relative Effizienz ihres Promotors und die Faktoren, welche den Promotor regulieren, wie Enhancer oder Repressoren. Man nimmt an, daß die Initiierung in der Region erfolgt, die unmittelbar aufwärts vom Beginn der Kodierungssequenz liegt.

Der Promotor in prokaryontischen Zellen umfaßt Nukleotidsequenzen, die die Effiezienz der Transkription beeinflussen können. Die Sequenzen beinhalten die Regulatorregionen bei etwa -35 und -10 Nukleotiden vom Start der DNA-Kette. Effiziente Promotoren sind solche, bei denen die Nukleotidsequenz der -35 und -10-Regulatorregionen im wesentlichen gleich ist mit den Konsensussequenzen dieser Regionen in bakteriellen Promotoren aus sehr effizienten Genen. Im allgemeinen beträgt die Länge dieser Regionen etwa 5 Nukleotide bzw. 6 Nukleotide und jede Sequenz kann um etwa 1 Nukleotid in der Länge und/oder in der Sequenz variieren. Eine bevorzugte Sequenz für die -35-Konsensus- Regulatorsequenz stammt vom trp-Promotor, nämlich TGACA, und eine bevorzugte Sequenz für die -10-Konsensus- Regulatorsequenz stammt vom lac-Promotor, nämlich TATAAT.

Nicht nur die Nukleotidsequenzen, sondern auch der Abstand der Konsenussequenzen der -35 und -10-Regulatorregionen zueinander ist wichtig für die Erzielung optimaler Transkription des gewünschten Gens. Im allgemeinen sind die Konsensussequenzen der -35 und -10-Regulatorregionen durch etwa 16 bis 18 Nukleotide, vorzugsweise durch etwa 17 Nukleotide, getrennt. Jede Sequenz kann um etwa 1 Nukleotid variieren.

Geeignete Beispiele für Transkriptions-Regulatorregionen oder Promotoren sind für Bakterien der β-gal-Promotor, der linke und rechte λ-Promotor, trp- und lac-Promotor, trp-lac-Fusionspromotor, etc. Synthetische Promotoren mit Sequenzen, die diesen Sequenzen im wesentlichen ähnlich sind, können ebenfalls Anwendung finden. Ein bevorzugter Promotor für Bakterien ist ein Fusionspromotor, der die -35-Regulatorregion des trp-Promotors und die -10-Regulatorregion des lac-Promotors umfaßt. Bei dem am stärksten bevorzugten Promotor ist die -35-trp-Konsensussequenz etwa 17 Nukleotide aufwärts von der -10-lac-Konsensussequenz lokalisiert. Beispiele bei Hefen sind glykolytische Enzym- Promotoren, wie ADH-I- und II-Promotoren, GPK-Promotor und PGI-Promotor, trp-Promotor etc. Beispiele bei Säugetierzellen sind SV40-early und late-Promotoren, Adenovirus- major-late-Promotoren, I5-Promotor, oder Enhancersequenzen und dergleichen.

Die Transkriptions-Regulatorregion kann zusätzlich Regulatorsequenzen umfassen, welche eine Modulierung der Expressionszeit des gewünschten Gens ermöglichen, beispielsweise durch Anwesenheit oder durch Fehlen von Nährstoffen oder Expressionsprodukten im Nährmedium, Temperatur und dergleichen. Die Expression des gewünschten Gens kann beispielsweise durch die Temperatur des Wachstumsmediums für den Wirt, durch Anwendung einer Regulatorsequenz, umfassend den Bakteriophase-λ-P_L-Promotor, den Bakteriophage-λ- O_L-Operator und das Gen CI857, das für den temperaturempfindlichen C_I-Repressor im Expressionsvektor kodiert, reguliert werden. Dies ermöglicht die Regulierung des Promotors durch Wechselwirkung zwischen dem Repressor und dem Operator bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise etwa 30°C. Eine Erhöhung der Temperatur auf etwa 42°C würde den Repressor inaktivieren und die Expression des gewünschten Gens ermöglichen.

Zu einem Beispiel für eine Modulierung unter Anwendung von Wachstumsnährmedien zählt die Regulierung des lac- oder des trp-lac-Hybridpromotors, die durch Verwendung des Gens für den LacI-Repressors erfolgen kann, welcher an die lac-Promotorregion abwärts von der -10-Regulatorregion bindet. Das LacI-Repressorgen kann auf einem Episom, vorzugsweise dem LacI-enhanced Mutanten vorliegen oder es kann sich in der Expressionskassette selbst befinden. Das Vorliegen einer signifikanten Konzentration des Repressormoleküls im Wachstummedium inhibiert die Promotorfunktion in Abwesenheit von Induktoren. Die Zugabe von IPTG oder Lactose zu dem Zellwachstumsmedium des Wirts verstärkt demnach die Promotorfunktion. Bei Verwendung des Bakterienstammes Lac⁺ kann man Lactose als Induktor anstelle von IPTG verwenden. In eukaryontischen und prokaryontischen Systemen können die Terminationsregionen auch Sequenzen oder Strukturen enthalten, welche die Stabilität der mRNA-Spezies erhöhen und eine bessere Expression ermöglichen. Die transkriptionale Regulatorregion kann demnach zusätzlich Regulatorsequenzen enthalten, die die Transkription beenden und Sequenzen oder Strukturen zur Verfügung stellen, welche den Abbau der mRNA inhibieren und somit die Stabilität der mRNA-Spezies erhöhen und eine bessere Expression ermöglichen. Mehrere Beispiele prokaryontischer Sequenzen sind bekannt, beispielsweise der Trp-Terminator, der Gen 32(T4)-Terminator, oder synthetische Terminatoren, deren Sequenz dem Gen 32 ähnlich ist.

In eukaryontischen Systemen sorgen die transkriptionalen Terminations-, RNA- Spaltungs- und Polyadenylierungs- Regionen für die Reifung der mRNA-Transkripte und sind für eine effiziente Expression erforderlich. Die native 3′-untranslatierte Region kann genügen; das Polyadenylierungssignal von beispielsweise SV40, das insbesondere eine Spleißstelle enthält, welche zu einer effizienteren Expression führt, kann ebenfalls verwendet werden. Alternativ kann die 3′-untranslatierte Region, die sich von einem in einem bestimmten Zelltyp (z. B. Ig in Myelomzellen) stark exprimierten Gen ableitet, mit dem gewünschten Gen fusioniert werden. Derartige 3′-Sequenzen können auch mit den 5′-Regulatorsequenzen des gleichen hoch-exprimierten Gens gepaart werden und sie können sogar kodierende Regionen im Leserahmen umfassen, um Fusionsproteine wie unten beschrieben zu erzeugen.

Vom Standpunkt der Translations-Regulierung unter Anwesenheit von mRNA kann die Expression durch Beeinflussung der Initiationsrate (Ribosomenbindung an die mRNA), der Elongationsrate (Translokation der Ribosomen über die mRNA), der Rate der post-translationalen Modifikationen und der Stabilität des Genproduktes reguliert werden. Die Elongationsrate wird wahrscheinlich durch die Verwendung von Kodons beeinflußt. Die Verwendung von Kodons für seltene tRNA's kann die Translationsrate reduzieren. Vorzugsweise verwendet man daher Kodons, die häufig in Genen vorkommen, welche üblicherweise durch die Wirtszelle exprimiert werden, um die Translationsrate zu erhöhen.

Bei Prokaryonten liegt abwärts von den -35 und -10- Regulatorregionen eine Konsensus-Nukleotidsequenz vor, im allgemeinen AGGA und als Shine-Dalgarno-Sequenz bezeichnet, von der man annimmt, daß sie an der ribosomalen Bindung beteiligt ist. Das Optimum der ribosomalen Bindung und die Initiierung der Translation kann durch Verwendung einer Ribosomen-Bindungsstelle erreicht werden, die in der Wirtszelle für ein hoch-exprimiertes Gen in Funktion tritt. Es liegen auch Anzeichen für die Anwesenheit von Nukleotidsequenzen, welche die Shine-Dalgarno-Sequenz umgeben, und Sequenzen innerhalb der Kodierungsregion vor, welche die Ribosomenbindung beeinflussen können, möglicherweise durch die Bildung von Struktureinheiten, durch welche das Ribosum die Initiierungsstelle erkennt. Die Veränderung der Nukleotidsequenzen der Kodierungsregion kann daher dazu benutzt werden, eine optimale Bindung und Initiierung der Translation zu erreichen. Die Sequenz der ersten etwa 7 bis 30 Kodons nach dem Initiierungskodon ATG kann auch die Bindung und Expression beeinflussen. Vorzugsweise erhält man die Leadersequenz und die Shine-Dalgarno-Sequenz vom gleichen Gen oder man kann, wenn sie von verschiedenen Genen erhalten worden sind, die Kodons der Leadersequenz modifizieren, z. B. durch Degenerierung der Kodons um die Nukleotidsequenz des natürlichen Gens, das der Leadersequenz folgt, zu approximieren.

Die Position der AGGA-Sequenz in bezug auf das Initiierungs- ATG-Kodon kann die Expression beeinflussen. Im allgemeinen ist die Shine-Dalgarno-Sequenz etwa 5 bis 9 Nukleotide vom Initiierungskodon lokalisiert. Es ist jedoch auch unerwarteterweise eine hohe Expression unter Verwendung von Expressionskassetten zu erzielen, wobei die Shine- Dalgarno-Sequenz etwa 10 bis 13 Nukleotide, vorzugsweise 11 bis 12 Nukleotide, vom Initiierungskodon lokalisiert ist.

Die Stabilität der mRNA wird bestimmt durch die Empfindlichkeit der mRNA gegenüber Ribonuklease-Enzymen. Im allgemeinen wird eine Exonukleaseverdauung durch die Anwesenheit struktureller Einheiten an den Enden der mRNA-, Palindrom-Strukturen, veränderten Nukleotiden oder spezifischen Nukleotiden verhindert. Man nimmt an, daß die Endonuklease-Verdauung an spezifischen Erkennungsstellen innerhalb der mRNA erfolgt und daß eine stabile mRNA diese Stellen nicht aufweist. Es gibt auch Hinweise, daß mRNA's mit hoher Translation auch durch die Anwesenheit von Ribosomen auf der mRNA vor Abbau geschützt werden.

Die Stabilität des Expressionsproduktes kann erreicht werden, indem man ein Fusionsprotein synthetisiert, in welchem das gewünschte Polypeptid in Verbindung mit einem zweiten Polypeptid oder Fragment davon exprimiert wird. Vorzugsweise erreicht man die Stabilität des Expressionsproduktes, indem man ein Fusionsprotein synthetisiert, in welchem das gewünschte Polypeptid an eine Leadersequenz gebunden exprimiert wird. Eine für eine N-terminale Aminosäuresequenz kodierende DNA-Sequenz von einem hoch exprimierten Bakterien- oder Bakteriophagen-Gen, wie dem Bakteriophagen-λ-N-Proteingen, cro-Gen oder β-Galactosidase- oder einem eukaryontischen Gen, wird aufwärts und im Leserahmen mit dem gewünschten Gen verbunden. Die Leadersequenz umfaßt üblicherweise etwa 8 bis etwa 50, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 45, insbesondere 18 bis 25, N- terminale Aminosäuren.

Die Expression des gewünschten Polypeptides als Fusionsprotein mit einer Leadersequenz von einem anderen Gen hat mehrere Vorteile, neben der Tatsache, daß dem Expressionsprodukt Stabilität verliehen wird. Die Anwesenheit der N-terminalen Aminosäuren ermöglicht beispielsweise die Anwendung üblicher Reinigungstechniken zur Reinigung jedes Polypeptides. Die N-terminalen Aminosäuren besitzen beispielsweise besondere antigene Eigenschaften und die spezifischen Antikörper gegen die N-terminalen Aminosäuren des N-Proteins kann man daher als Mittel zur Reinigung der Fusionsproteine, die den N-Terminus des N-Proteins enthalten, benutzen. Darüber hinaus hat der N-Terminus des N-Proteins eine stark positive Ladung, was die Reinigung des gewünschten Proteins durch Ionenaustausch-Chromatographie und dergleichen erleichtert.

Die Leadersequenz kann auch eine hydrophobe Aminosäuresequenz sein, die zusätzlich als Signalsequenz für die Sekretion wirken kann. Eine für die Signalsequenz kodierende DNA-Sequenz wird aufwärts und im Leserahmen mit dem gewünschten Gen verbunden. Üblicherweise umfaßt die Signalsequenz eine Spaltungsstellen, die durch eine Signalsequenz- Peptidase erkannt wird. Die Anordnung des gewünschten Polypeptids unmittelbar nach der Signalsequenz-Spaltungsstelle ermöglicht es daher, das gewünschte Polypeptid spezifisch von der Signalsequenz abzuspalten und als reifes Polypeptid zu sekretieren. Beispiele hydrophober Aminosäure- Sequenzen sind die bakterielle alkalische Phosphatase- Signalsequenz; die OMP-A-B-C-D-E- oder F-Signal-Sequenzen, die LPP-Signalsequenz, β-Lactamase-Signalsequenz; und Toxin-Signalsequenzen und Mutanten davon. Bei eukaryontischen Zellen können die Signalsequenzen auch die Signalsequenzen von Simian-TGF-β, P97-Gen (Human-Melanom-Antigen), K. lactis-Killertoxinsequenz, α-mating type-Faktor und andere Killertoxin-Signalsequenzen oder die normale Signalsequenz, welche mit dem gewünschten Gen assoziiert ist, zusammen mit den Mutanten der Signalsequenzen umfassen.

Andere brauchbare Leadersequenzen sind hydrophile Sequenzen, beispielsweise die N-terminalen 41-Aminosäurereste des Amphiregulins, die für die Modifikation der Funktion des gewünschten Polypeptids sorgen. Zusätzlich kann ein cytotoxisches Mittel, wie ein Toxin A-Kettenfragment, Ricin-A-Kette, das die Bildung des Schlangengifts verhindernde Peptid (snake venow growth arresting peptide) oder ein Targetmolekül, wie ein Hormon oder Antikörper, kovalent mit der Leadersequenz verbunden werden, wobei in den meisten Fällen nur ein minimaler Effekt auf die biologische Aktivität des gewünschten Genproduktes zu beobachten ist. Wie für die anderen Leadersequenzen beschrieben, wird eine für die Leadersequenz kodierende DNA-Sequenz aufwärts von und im Leserahmen mit den gewünschten Gen verbunden.

Wenn die Leadersequenz keine Signalsequenz ist oder keine natürliche Spaltungsstelle enthält, kann man zusätzliche Aminosäuren insertieren, um eine enzymatische oder chemische Spaltungsstelle für die Abspaltung des Leaderpeptids nach der Reinigung des Fusionsproteins zur Verfügung stellen, so daß das maturierte Polypeptid anschließend gereinigt werden kann. Beispielsweise erleichtert die Einführung der säurelabilen Aspartyl-Prolin-Brücken zwischen den zwei Segmenten des Fusionsproteins ihre Abtrennung bei niedrigem pH-Wert. Diese Methode ist nicht geeignet, wenn das gewünschte Polypeptid säure-labil ist. Weiterhin kann man das Fusionsprotein beispielsweise mit Cyanogenbromid, das spezifisch auf die Carboxygruppen der Methioninreste ist, abspalten. Die Anordnung eines Methionins zwischen der Leadersequenz und dem gewünschten Polypeptid ermöglicht die Freisetzung des gewünschten Polypeptides. Diese Methode ist nicht geeignet, wenn das gewünschte Polypeptid Methioninreste enthält.

Wenn die Leadersequenz eine Signalsequenz umfaßt, kann man die gewünschten Gene mit Sekretions-Leadersequenzen mit oder ohne die Leadersequenz so exprimieren, daß die Sequenz erhalten bleibt oder gespalten wird. Um zusätzlich einen hohen Anteil des gewünschten Polypeptids als reifes, gespaltenes und wiedergefaltetes, in das Medium sekretiertes Peptid zu erhalten, ist es bevorzugt, einen Promotor anzuwenden, wie den pac-Promotor, der bei niedriger Temperatur, beispielsweise bei etwa 30°C, wirkt. Unerwarteterweise kann bei niedrigen Temperaturen eine hohe Sekretion erzielt werden. Eine äußerst hohe Expression kann die vollständige translationale Modifikation des Proteins verhindern, was zu einer Aggregation und Akkumulierung des ungespaltenen Prekursors (d. h. Strukturprotein und Sekretorleader) führt. In ähnlicher Weise führt ein Wachstum bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise 42°C, ebenfalls zu Aggregation und Akkumulation des ungespaltenen Prekursors.

Die Herstellung von Fusionsproteinen mit Methoden zur Spaltung und Wiederfaltung der gewünschten Polypeptide ist näher in der bereits oben erwähnten US-Anmeldung 2 64 098 (PCT/US 88/03 972) beschrieben.

Nach jeder DNA-Manipulation bei der Einwirkung der Kassette, wird das Plasmid geklont und isoliert. Soweit erforderlich, wird die jeweilige Kassettenkomponente auf ihre Sequenz analysiert, um sicherzustellen, daß die richtige Sequenz erhalten worden ist. Je nach Art der Manipulation kann die gewünschte Sequenz aus dem Plasmid herausgeschnitten und in einen anderen Vektor eingeführt werden, oder das Plasmid kann einer Restriktion unterworfen werden und die Expressionskassettenkomponente kann entsprechend manipuliert werden. In einigen Fällen wird ein Shuttle-Vektor benutzt, dann nämlich, wenn der Vektor zur Replikation in anderen Wirten, die unterschiedliche Replikationssysteme erfordern, in der Lage ist. Dies kann gegebenenfalls weitere Marker erfordern, welche in den beiden Wirten ihre Funktionalität entfalten. Wenn derartige Marker erforderlich sind, können sie im Vektor enthalten sein. Das die Kassette enthaltende Plasmid, zwei Replikationssysteme und der (die) Marker können nach Bedarf von einem Wirt in den anderen transferiert werden. Für die Selektion kann man jeden brauchbaren Marker verwenden. Zweckmäßigerweise ist eine Restistenz gegenüber Neomycin oder Tetramycin erwünscht. Obwohl jedoch ein Selektionsmarker besonders zweckmäßig ist, kann man auch andere Screening- Verfahren für transformierte Zellen einsetzen, siehe G. Reipin et al., Current Genectics, 1982, 189-193. Transformierte Zellen kann man auch mittels der von ihnen produzierten spezifischen Produkte screenen, beispielsweise kann die Synthese des gewünschten Produkts durch immunologische oder enzymatische Methoden bestimmt werden.

Die Expressionskassette kann innerhalb eines Replikationssystems für den Episomenerhalt in einer geeigneten Wirtszelle enthalten sein. Sie kann auch ohne ein Replikationssystem vorliegen, wobei sie in das Wirtsgenom integriert werden kann. Die DNA kann in den Wirt anhand bekannter Techniken eingeführt werden, wie durch Transformation unter Verwendung von Calciumphosphat-gefällter DNA, Transfektion durch Kontaktieren der Zellen mit dem Virus, Mikroinjektion der DNA in Zellen oder dergleichen. Sobald das gewünschte Gen in einen geeigneten Wirt eingeführt ist, kann man den Wirt zur Expression des gewünschten Gens kultivieren.

Eine Vielzahl von Wirtszellen kann verwendet werden. Beispiele prokaryontischer Wirtszellen sind gram-negative Organismen, wie E. Coli, beispielsweise, JM109, JM101 und JM107; HB101, DH1 oder DH5. Besonders geeignet sind gram-positive Organismen, wie B. Subtilis, welche keinen periplasmatischen Raum besitzen und die Polypeptide direkt in das Wachstumsmedium sekretieren können. Zu eukaryontischen Wirtszellen zählen Hefezellen, Insektenzellen und Säugetierzellen, beispielsweise COS-Zellen, CHO-Zellen, Affennierenzellen und Seidenraupenzellen (sf9).

Das Konstrukt, das das gewünschte Gen und die für die Regulierung der Expression sorgenden flankierenden Regionen enthalten, kann man anhand geeigneter Methoden einführen, beispielsweise durch Transformation mit z. B. Calciumphosphatgefällter DNA, Transfektion, Transduktion, Konjugation, Mikroinjektion etc. Man kann den Wirt dann in einem geeigneten Nährmedium kultivieren, bis er in großer Menge vorliegt. Wenn der Promotor nicht induzierbar ist, kann man permissive Bedingungen anwenden, beispielsweise eine Veränderung der Temperatur, den Verbrauch eines metabolitischen Produktes oder Nährmittels oder deren Anwendung im Überschuß und dergleichen.

Wenn die Regulatorsequenz beispielsweise den Bakteriophage- λ-P_L-Promotor, den Bakteriophage-λ-O_L-Operator und den CI857-temperaturempfindlichen Repressor umfaßt, kann man die Wirtszellen bei permissiven Temperaturen, im allgemeinen bei etwa 30°C kultivieren, wobei die Transkription aus dem P_L-Promotor reprimiert wird und die Wirtszellen ungehindert durch die Synthese des Fremdgenproduktes, die zusätzlich toxisch gegenüber dem Wirtsorganismus sein können, wachsen können. Wenn die Wirtszellen die optimale Dichte erreicht haben, kann man die Temperatur erhöhen, beispielsweise auf etwa 42°C, wobei der CI-Repressor inaktiviert wird, so daß die Transkription aus dem P_L-Promotor ermöglicht wird. Maximale Sekretion erhält man durch Anwendung des lac-Promotors oder eines trp-lac-Promotors und durch Induktion mit einem metabolitischen Induktor, wie Lactose, für einen lac⁺-Wirtsstamm und indem man lac I^q auf einem Vektor vorsieht. Beispiele für Wirtszellen, die mit einem derartigen System verwendet werden können, sind DH1, DH5 oder HB101.

Wenn das Produkt in der Wirtszelle erhalten bleibt, werden diese Zellen geernet, lysiert und das Produkt wird isoliert und durch Extraktion, Prezipitation, Chromatographie, Elektrophorese und dergleichen gereinigt. Wenn das Produkt sekretiert ist, wird das Nährmedium gesammelt und das Produkt wird mittels üblicher Methoden beispielsweise durch Affinitätschromatographie, isoliert. Um ein aktives Protein zu produzieren, kann es erforderlich sein, dem Protein die Wiederfaltung zu ermöglichen. Wenn das Protein als Fusionsprotein mit der Leadersequenz exprimiert wird, kann die Leadersequenz durch Behandlung mit beispielsweise Ameisensäure oder Cyanogenbromid entfernt werden. Die Leadersequenz wird vorzugsweise nach Wiederfaltung des Proteins entfernt.

Die rekombinanten Produkte können glykosiliert (Wildtyp- Glykosierung oder eine andere Glykosilierung) oder nichtglykosiliert sein. Die Glykosilierung unterscheidet sich im allgemeinen um nicht mehr als etwa 50%, üblicherweise nicht mehr als etwa 20%, von der Wildtyp-Glykosilierung. Das Ausmaß der Glykosilierung hängt ab sowohl von der Sequenz des betreffenden Peptids als auch von dem Organismus, in welchem es produziert wurde. Die Expression des Produktes in E. coli-Zellen führt demnach zu einem unglykosilierten Produkt und die Expression des Produktes in Insektenzellen führt demnach im allgemeinen zu einem Produkt mit geringerer Glykosilierung als die Expression in Säugetierzellen.

Anwendung der Wachstumsfaktoren

Die erfindungsgemäßen Peptide finden breite Anwendung in vitro und in vivo als Agonisten oder Antagonisten für Wachstumsfaktoren, wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und transforming-Wachstumsfaktor, insbesondere α-TGF. Die Verwendung der Wachstumsfaktoren per se oder in Kombination mit anderen Mitteln, insbesondere Polypeptiden, zur Regulierung des Zellwachstums und für andere Aktivitäten ist beispielsweise in Handbook of Experimental Pharmacology, Tissue Growth Factors, Hrsg. Baseraga, Bd. 57, Springer-Verlag, Berlin, 1981, Kap. 3, insbesondere S. 98- 109, und Carpenter, Ann. Rev. Biochem. (1979) 48 : 193-216 beschrieben.

Human-EGF scheint mit Human-Urogastron identisch zu sein und übt mehrere Effekte auf das prenatale und neonatale Gewebewachstum aus. Zu diesen Effekten zählen das vorzeitige Öffnen der Augen, Wundheilung, das Durchbrechen der Schneidzähne und die beschleunigte Reifung der Lunge. EGF-Rezeptoren finden sich bei vielen Geweben der Erwachsenen. Es wurde gefunden, daß EGF die Phosphorylierung seines eigenen Rezeptors stimuliert und außerdem mit der verstärkten Knochenresorption in Zusammenhang steht.

Der Transforming-Wachstumsfaktor, insbesondere α-TGF, besitzt viele Aktivitäten, die denjenigen des EGF analog sind. TGF bindet an den EGF-Rezeptor, was zur Phosphorylierung des Rezeptors, Verstärkung der Tyrosin-spezifischen Kinaseaktivität und Stimulierung des Zellwachstums führt, siehe Cohon in Biological Response Mediators und Modulators (Hrsg. August J. T.), Academic, New York, 1983 S. 7-12; Tam et al., Nature (1984) 309 : 376-378; Ibbotson et al., Science (1983) 221 : 1292-1294.

Myxoma- und Shope Fibroma-Viren induzieren eine signifikante Erhöhung des proliferativen Potentials von Zellen in dem befallenden Gebiet. Während Vaccinia-Viren nur zu geringer Proliferation an der Infektionsstelle führen, induzieren Shope-Fibroma-Viren eine starke Proliferation, so daß es zur Tumorbildung kommt, die bei erwachsenen Kaninchen gutartig ist, bei immunsupprimierten Erwachsenen oder Neugeborenen aber proliferativ und invasiv ist. Myxoma-Viren induzieren einen sich rasch disseminierenden Myxosarkoma- Tumor. Obwohl diese Proliferation auch anderen viralen Faktoren zugeschrieben werden könnte, scheinen die viralen Wachstumsfaktoren an der durch eine Virusinfektion induzierten Zellproliferation in starkem Maße beteiligt zu sein.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden insbesondere Anwendung als Agonisten für EGF, zur Wundheilung, wie zur Epithelialisierung von Wunden, beispielsweise Verbrennungen, Augenwunden, chirugischen Schnitten und dergleichen. Die Wirkstoffe kann man in einem zweckmäßigen Träger verwenden, z. B. Silvadene, und in einer Menge, die ausreicht, um die Epithelialisierung und/oder die Wundheilung zu fördern. Im allgemeinen liegt diese Menge im Bereich von etwa 0,01 bis 10,0 µg/ml, üblicherweise etwa 0,075 bis 5,0 µg/ml und vorzugsweise 0,5 bis 5 µg/ml EFG-Äquivalenten. Die Formulierung wird so über die Wunde verteilt, daß die Wunde vollständig damit bedeckt ist. Die Behandlung kann 4× pro Tag oder auch nur 1× pro Tag oder seltener erfolgen, je nach der Art der Wunde, dem Ansprechen der Wunde auf die Behandlung, der Konzentration des Wirkstoffes und dergleichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Mittel kann man auch als Reagentien in Diagnose-Assays oder zur Herstellung von Reagentien, wie polykonalen oder monoklonalen Antikörpern, verwenden. Sie können als Reagentien auch zur Detektion analoger Wachstumsfaktoren oder zur Detektion von Antikörpern gegen die Wachstumsfaktoren in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, verwendet werden.

Je nach Anwendungszweck der Reagentien kann man die Polypeptide markieren oder unmarkiert einsetzen. Zahlreiche Markierungen sind bekannt, die direkt oder indirekt zu detektierbaren Signalen führen. Derartige Markierungen (labels) sind Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Mittel, Partikel, chemilumineszierende Mittel, Enzymsubstrate oder -kofaktoren, Enzyminhibitoren, magnetische Teilchen etc., siehe beispielsweise US-PS 36 54 090, 38 17 837, 39 35 074, 39 96 345, 42 77 437, 43 74 925 und 43 66 241.

Es gibt zahlreiche Methoden zur Verknüpfung der Markierungen mit den Polypeptiden. Dazu zählen die Verwendung einer N-terminalen Aminogruppe zur Funktionalisierung unter Bildung eines Pyrazolons, wobei andere freie Aminogruppen geschützt sind. Das Pyrazolon kann dann mit verschiedenen Reagentien, beispielsweise Aminogruppen, in Kontakt gebracht werden, um eine Verbindung zu der Einheit herzustellen, die ein detektierbares Signal liefert. Durch Schützen der Argininaminosäuren, die mit der dritten Schleife assoziiert sind oder proximal dazu vorliegen, können weitere Arginine in bekannter Weise zur Konjugation an Aminogruppen oder Thiogruppen funktionalisiert werden. Alternativ kann man das Polypeptid mit einem aktiven Agens, beispielsweise einer aktivierten Carbonsäure, in Kontakt bringen und statisch substituierten, wobei biologisch aktives Material als Ergebnis der statistischen Substitution von biologisch inaktivem Material getrennt werden kann. Je nach Synthesemethode kann das Polypeptid schließlich modifiziert werden, um die gewünschte Funktionalität im Rahmen des Syntheseverfahrens zur Verfügung zu stellen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Mittel können auch zur Kontrolle der EGF-Rezeptoren verwendet werden. Sie können außerdem zur Kontrolle der Zellantwort auf EGF und/ oder TGF verwendet werden, indem man für eine Kompetition zwischen diesen natürlich vorkommenden Materialien und den erfindungsgemäßen Verbindungen sorgt. Auf diese Weise kann man einen Wechsel in der Rezeptorkonformation verfolgen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Mittel kann man auch für viele therapeutische Zwecke, zu denen die Stimulierung des Wachstums oder Kontrolle der Knochenbildung zählen, verwenden. Man kann die Verbindungen in geeigneten physiologischen Trägern intraperitoneal, subkutan, intravenös, intraarteriell oder durch Applikationen an die betreffende Stelle verabreichen. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Mittel in Form von Liposomen, wobei gegebenenfalls Antikörper verwendet werden können, um die Mittel an den gewünschten Ort zu bringen, einsetzen. Zu geeigneten Trägern zählen Phosphat-gepufferte Saline, Saline, Wasser oder dergleichen. Die Konzentration des Additivs kann in einem weiten Bereich je nach Anwendung und Zweck variieren.

Die Formulierungen können auch weitere Additive enthalten, wie EGF, TGF, andere Wachstumsfaktoren, Bakteriozide, beispielsweise Antibiotika, bakteriostatische Mittel, Puffer etc.

Zur Herstellung von Antikörpern für die Injektion in Säugetiere bindet man solche erfindungsgemäße Polypeptide, bei denen PP^1-4 für ein Wasserstoffatom oder kurzkettige Oligopeptidketten (mit weniger als fünf Aminosäuren) stehen, an antigene Polypeptide oder Proteine. Das Antigenprotein hat weniger als etwa 60 Aminosäuren und üblicherweise ein Molekulargewicht von nicht mehr als 100 Kilodaltons (kDal). Es gibt zahlreiche Methoden zur Bindung an Polypeptide, entweder an einer bestimmten Stelle oder statistisch, unter Verwendung bifunktioneller Reagentien, wie p-Maleimidobenzoesäure, Glutaraldehyd, p,p′-Benzidin etc. Übliche Antigenproteine sind Rinderserumalbumin, Keyhole-limpethemocyanin, Tetanustoxoid etc. Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden an das Antigenproteine in ausreichender Zahl gebunden, so daß für eine gewünschte Immunogenantwort Sorge getragen ist. Üblicherweise erfolgen zwei oder mehrere Boosterinjektionen nach der ersten Injektion. Für die Gewinnung der Antisera wird Blut aus dem immunisierten Wirt entfernt und die Immunoglobulinfraktion isoliert. Zur Gewinnung von monoklonalen Antikörpern wird die Milz isoliert und die Splenocyten werden mit einem geeigneten Fusionspartner anhand üblicher Methoden fusioniert. Die erhaltenen Hybridome unterwirft man dann einem Screening auf Antikörper, die an die epitopen Stellen des Polypeptids binden. Diese Antikörper kann man für viele Zwecke verwenden, beispielsweise als diagnostische Reagentien, in der Therapie etc. Wenn man die Antikörper als Reagentien verwendet, können sie markiert oder unmarkiert vorliegen, wie oben im Zusammenhang mit den Polypeptiden beschrieben.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Inhaltsverzeichnis des experimentellen Teils Beispiel I Herstellung der gewünschten synthetischen Gene

A. Synthetische TGF-Oligonukleotide
B. Synthetische VGF-Oligonukleotide
C. Synthetische EGF-Oligonukleotide

Beispiel II Klonierung eines Expressions-Plasmids

A. Plasmid pLEBam
B. Plasmid pBM11
C. Plasmid pBM11M4
D. Plasmid pBM11M5
E. Plasmid pBM11/NDP
F. Plasmid pBM11/PAD
G. Plasmid pBM11/PAK
H. Plasmid pTCPt
I. Plasmid plac/cro-βgal
J. Plasmid ptac/cro-βgal
K. Plasmid pRSV
L. Plasmid pAc610
M. Plasmids pTox1 and pTox2
N. TakPak

Beispiel III Bildung der Wachstumsfaktorgrenze zur Expression in prokaryontischen Zellen

A. Herstellung des Plasmids pLEBam/TVV,
B. Herstellung des Plasmids pLEBam/TVV und der Fragmente davon.

Beispiel IV Expression der gewünschten Polypeptide als Fusionsprotein mit dem N-Protein

A. Modifizierter synthetischer TGF
B. Modifiziertes synthetisches TGF-VGF-Hybrid

Beispiel V Herstellung des gewünschten Polypeptids als Fusionsprotein mit dem N-Protein und einer Spaltungsstelle

A. Modifizierter synthetischer VGF
B. Modifizierter synthetischer TGF-VGF-Hybride
C. Synthetischer EGF

Beispiel VI Herstellung des gewünschten Polypeptids als Fusionsprotein mit der modifizierten alkalischen Phosphatase-Signal- Sequenz

A. Herstellung von pBM11/PAD/EGF
B. Herstellung von pBM11/PAD/nVGFa

Beispiel VII Expression des gewünschten Polypeptids als Fusionsprotein mit einem alkalischen Phosphatase-Signal

A. Herstellung von pBM11/PAK/nVGFa (Alkalische Phosphatase- Signalsequenz/nVGFa mit natürlichem VGF N-Terminus und Sequenz GTC und GYACRC)
B. Herstellung von pBM11/PAK/EGF
C. Herstellung von TacPak/EGF (alkalische Phosphatase- Signalsequenz/Human-EGF

Beispiel VIII Expression des gewünschten Polypeptids als Fusionsprotein mit der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz unter Verwendung einer Expressionskassette, die eine transkriptionale Terminationsregion umfaßt

A. Herstellung von pTCPt/EGF ((trp-35)16bp(lac10) (lacSD)11bp(ATC)/alkalische Phosphatase-Signal/Human- EGF/trans. term.-NEO
B. Herstellung von pTCPt/nVGFa ((trp-35)16bp(lac-10) (lacSD)(croSD)11pb(ATG)/alkalische Phosphatase-Signal/ N-terminale VGFa mit Sequenz GTC und GYAGRC)/trans, term.-NEO)
C. Herstellung von pTNPt/EGF ((trp-35)17bp(lac-10)(nSD) 8bp(ATG)/alkalische Phosphatase-Signal/Human EGF/ trans. term.-NEO)

Beispiel IX Bildung von Wachstumsfaktor-Genen zur Expression in eukaryontischen Zellen

A. Herstellung des Plasmids PRSV/VGF
B. Herstellung des Plasmids pAc/VGF
C. Herstellung von pAc/SFGF

Beispiel X Herstellung von Polypeptiden

A. Festphasen-Synthese von BGF und TGF
B. Isolierung rekombinanter in prokaryontischen Zellen hergestellter Polypeptide
C. Isolierung von VGF und SFGF, hergestellt durch eukaryontische Expression in natürlichen Genen
D. Natürlicher EGF

Beispiel XI Aktivitäts-Assays

A. Mitogen-Assay
B. Assay zur Stimulierung des Wachstums von Kolonien auf Softagar
C. EGF-Rezeptorbindungs-Inhibitions-Assay
D. Radioimmuno-Assay
E. Wundheilung

Beispiel XII Biologische Aktivität rekombinanter, in prokaryontischen Zellen hergestellter Wachstumsfaktoren

A. EGF-Rezeptorbindung
B. Mitogen-Aktivität
C. Wundheilung

Beispiel XIII Biologische Aktivität von VGF, hergestellt in eukaryontischen Zellen

A. VGF hergestellt in Affennierenzellen (BSC-1)
B. VGF hergestellt in CHO-Zellen
C. VGF hergestellt in Seidenraupen
D. Immunologischer Vergleich von VGF und TGF

Hinterlegung von Mikroorganismen

Die folgenden Expressionsplasmide, alle transformiert in E. Coli HB101, wurden zum angegebenen Datum bei der Amcerican Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20 852 hinterlegt, sie haben den nachfolgend angegebenen ATCC-Hinterlegungsnummern erhalten:

Methoden

Es wurden die in Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, New York beschriebenen allgemeinen Klonierungstechniken verwendet. Alle DNA-modifizierenden Enzyme wurden von Handelsfirmen erhalten. Sie wurden entsprechend des Anweisungen des Herstellers eingesetzt. Die Materialien und Vorrichtungen zur DNA-Reinigung und -Trennung wurden ebenfalls entsprechend den Anweisungen der Hersteller eingesetzt.

Beispiel I Herstellung der gewünschten synthetischen Gene

Es wurden synthetische Wachstumsfaktor-Gene hergestellt, welche von Gastzellkodons Gebrauch machen, die für eine hohe Expression optimiert sind. Zusätzlich wurden mehrere zweckmäßige Restriktionsstellen in den synthetischen Genen vorgesehen. Soweit möglich, ließen die neuen Restriktionsstellen die Aminosäuresequenz des Wachstumsfaktorgens unverändert. In einigen Fällen jedoch, führten die neuen Restriktionsstellen zu einer veränderten Aminosäuresequenz. Diese Stellen unterteilen die synthetischen Gene in etwa drei Teile, nämlich die N-terminale, mittlere und C- terminale Domäne.

Das natürliche VGF-Genprodukt enthält eine extreme N-terminale Domäne, die kein Gegenstück im reifen TGF hat. VGF-Fragmente, die diese Domäne nicht besitzen, werden als verkürzt bezeichnet. Die Restriktionsstellen wurden zur ersten Konstruktion der endgültigen Gene aus teilweise synthetischen Oligonukleotidfragmenten verwendet, welche von einer Restriktionsstelle zu der anderen sich erstrecken. Die Oligonukleotide wurden an einem Oligonukleotid-Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert und an einem Acrylamidgel gereinigt. Die Oligonukleotide wurden am 5′-Ende unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert. Jedes Oligonukleotid wurde dann mit dem Komplement verbunden.

A. Synthetische TGF-Oligonukleotide

1. Human-TGF-N-terminale Domäne
2. Modifizierte, mittlere Human-TGF-Domäne, wobei die Humansequenz QEDK in QEEK, die sich in Ratten-TGF findet, abgeändert wurde:
3. Human-TGF-C-terminale Domäne:

B. Synthetische VGF-Oligonukleotide

1. VGF-extreme-N-terminale Domäne:
2. Modifizierte VGF-N-terminale Domäne mit der Asp-Pro-Spaltungsstelle, wobei die Sequenz HGT die natürliche Sequenz HGD ersetzt:
3. Modifizierte VGF-mittlere Domäne, wobei die Sequenz GYAC die natürliche Sequenz GMYC ersetzt:
4. VGF C-terminale Domäne, 5′-Ende:
5. Modifizierte VGF C-terminale Domäne, 5′-Ende, wobei die Sequenz VCS die natürliche Sequenz RCS ersetzt:
6. VGF C-terminale Domäne, 3′-Fragment, endend bei YQR anstelle von PNT, dem abgeleiteten C-Terminus von natürlich sekretiertem VGF:

C. Synthetische EGF-Oligonukleotide

Drei Sätze überlappender, synthetischer, für Human- EGF kodierender Oligonukleotide 1 (A, B), 2 (A, b) und 3 (A, B) wurden an einem Oligonukleotid-Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert und an einem Acrylamidgel gereinigt. Die Oligonukleotide wurden am 5′-Ende unter Verwendung von T4-Polynukleotid-Kinase phosphoryliert. Jedes Oligonukleotid wurde dann mit seinem Komplement verbunden.

Beispiel II Beschreibung der Klonierungs- und Expressionsplasmide

A. Plasmid pLEBam wurde aufgrund seiner geeigneten BssHII und BamHI-Restriktionsstellen dazu verwendet, synthetische Oligonukleotidfragmente zu klonieren. Ein Plasmid mit NcoI- und BamHII-Restriktionsstellen, wie pBM11 oder pBM11/ NDP (wie unten beschrieben), kann zur Klonierung der synthetischen Nukleotidfragmente und anderer gewünschter DNA-Sequenzen verwendet werden.

B. Plasmid pBM11 ermöglicht die Klonierung des gewünschten Gens an einer BamHI-Restriktionsstelle abwärts von den für die 33 N- terminalen Aminosäuren des Bakteriophagen-λ-N-Gens kodierenden DNA-Sequenzen. Nach Induktion des λ-P_L-Promotors durch Inaktivierung des temperaturempfindlichen C1857-Repressors bei 42°C, wird das fremde Genprodukt als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins exprimiert, das die N-terminale Sequenz des N-Gens besitzt.

C. Plasmid pBM11M4 ist von pBM11 abgeleitet und ermöglicht die Klonierung des gewünschten Gens an einer BamHI-Restriktionsstelle direkt nach dem ersten Methionin des N-Gens. Das Plasmid pBM11/M4 enthält auch eine NcoI- Stelle im Neomycingen.

D. Plasmid pBM11M5 ist von pBM11 abgeleitet, in dem eine NcoI-Stelle, die in dem Neomycin-Resistenz-Gen vorhanden ist, durch eine auf die Stelle gezielte Mutagenese entfernt worden ist. Die Klonierung des gewünschten Gens in pBM11/M5 erfordert keine teilweise Verdauung des Vektors mit NcoI.

E. Plasmid pBM11/NDP ist von pBM11 abgeleitet und besitzt DNA- Sequenzen, die für ein säurelabiles Asparagin-Prolindipeptid kodieren, welches zwischen den Sequenzen insertiert ist, die für das N-Gen und ein gewünschtes Gen kodieren. Das Plasmid enthält eine NcoI-Stelle und eine ClaI-Stelle zur Klonierung eines gewünschten Gens abwärts vom P_L-Promotor.

F. Plasmid pBM11/PAD ist vom Plasmid pBM11M4 abgeleitet und ermöglicht die Klonierung eines gewünschten Gens an HindIII, SmaI oder BamHI abwärts von einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz.

G. Plasmid pBM11/PAK, ist vom Plasmid pBM11M4 abgeleitet und ermöglicht die Klonierung eines gewünschten Gens an HindIII, SmaI oder BamHI abwärts von einer alkalischen Phosphatase- Signalsequenz.

H. Plasmid pTCPt, ist so konstruiert, daß es die tac- Promotorelemente aufweist und die cro-SD zur Expression des gewünschten Gens hinter der alkalischen Phosphatase- Signalsequenz verwendet. Ein Beispiel für die Konstruktion dieses Plasmids ist nachfolgend im Zusammenhang mit der Konstruktion von pTCPt/EGF beschrieben.

Konstruktion von pTNPt ((trp-35)17bp(lac-10)(nSD)8bp(ATC)/ alkalisches Phosphatase-Signal/Linker/trans. term.-NEO)

Dieses Plasmid ist so konstruiert, daß es die tac-Promotorelemente aufweist und das N-Gen SD zur Expression eines gegebenen Gens hinter der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz verwendet. Es hat einen pBR322-H 87468 00070 552 001000280000000200012000285918735700040 0002003910084 00004 87349intergrund mit dem Neomycin-Resistenz-Gen. Das Plasmid pTNPt wurde folgendermaßen konstruiert:

a) Herstellung des 2,8-kb-EcoRI-BamHI-Fragments von pBM16t/VGFa, dem die HindIII-Stelle fehlt

Das Plasmid pbM16t/VGFa wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und das 2,8-kb-Fragment wurde isoliert. Das 2,8-kb-Fragment wurde an einen EcoRI-BamHI-Linker ligiert und ein korrektes Konstrukt wurde durch Restriktionsanalyse isoliert, es wird als Zwischenprodukt I bezeichnet.

Die HindIII-Stelle nahe dem Neomycin-Resistenz-Gen wurde von dem Zwischenprodukt I-Plasmid durch Verdauung mit HindIII unter Bildung stumpfer Enden und unter Verwendung eines Klenow-Fragmentes entfernt und erneut ligiert. Dies ergab ein Zwischenprodukt II-Plasmid, dem die HindIII-Stelle fehlte.

Das 2,8-kb-EcoRI-BamHI-Fragment von pBM16t/VGFa, dem die HindIII-Stelle fehlte, wurde durch Verdauung des p-Zwischenproduktes-II mit EcoRI und BamHI isoliert. Das erhaltene 2,8-kb-Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert.

b) Herstellung des 150-bp-BamHI-BsmI-Fragments von pBM11/PAK

Das Plasmid pBM11/PAK ist identisch mit pBM11/PAK/EGF, außer daß es eine Linkerregion mit HindIII, SamI und BamHI-Stellen abwärts von der alkalischen Phosphatase- Signalsequenz anstelle des EGF-Gens enthält. pBM11/PAK wurde mit BsmI und BamHI verdaut und das 150-bp- Fragment, das das N-Gen SD, die alkalische Phosphatase- Signalsequenz und die Linkerregion enthält, wurde isoliert.

c) Herstellung der Oligonukleotide TacA⁺ und TacA^-

Die Oligonukleotide TacA⁺ und TacA^- wurden an einem Oligonukleotid-Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert und so konstruiert, daß sie einen EcoRI-Überhang am 5′-Ende aufweisen, wobei die trp-35- Konsensussequenz von der lac-10-Konsensussequenz durch 17 Nukleotide innerhalb derer eine SstI-Stelle angeordnet ist, getrennt ist. Die Sequenz enthielt auch das 5′-Ende von lac mRNA, die lac-Repressor-Bindungsstelle und einen BsmI-Überhang.

d) Ligierung und Isolierung von pTNPt

Das 2,8-kb-EcoRI-BamHI-Fragment, das 150-bp-BsmI-BamHI- Fragment und die Oligonukleotide TacA⁺ und TacA^- wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die DNA wurde dazu verwendet, kompetentes JM109 (lacIq) zu transformieren. Ein korrektes Konstrukt wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung isoliert.

I. Plasmid plac/cro-β gal besteht aus der Operator- Promotor-Region von E. Coli Lactose (lac)-Operon, sowie den ribosomalen Bindungsstellen von lac und cro. Die von diesem Vektor exprimierten Fusionsproteine bestehen aus dem N-Terminus des Bakteriophagen- β-cro-Proteins, der Aminosäuresequenz, für die die insertierte DNA kodiert, und dem C-Terminus der β-Galactosidase. Die Kontrollelemente dieses Vektors bestehen aus der Operator-Promotor-Region des E. Coli Lactose (lac)-Operons, sowie den ribosomalen Bindungsstellen von lac und cro.

J. Plasmid ptac/cro-β-gal ermöglicht die Klonierung des gewünschten Gens abwärts von den N-terminalen 21 Aminosäuren des bakteriellen Cro-Proteins. Das Plasmid wurde wie in der US-Anmeldung 2 64 098 beschrieben, konstruiert. Der Expressionsvektor ptac/cro-β-gal ist ähnlich plac/cro-β-gal, mit der Ausnahme, daß der Promotor von ptac/cro-β-gal aus der -35-Region des Promotors des Tryptophanoperons und der Pribnow-Box des lac-Operons besteht. Dieser Hybridpromotor ermöglicht eine höhere Expressions als plac/cro-β-gal.

K. Plasmid pRSV ermöglicht die Expression eines gewünschten Gen in eukaryontischen Zellen mit dem RSV LTR-Promotor, siehe Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79 : 6777-6781.

L. Plasmid pAc610, siehe Smith et al., Molec Cell. Biol. (1983) 12 : 2156-2165, ermöglicht die Expression eines Fremdgens in Insektenzellen.

M. Die Plasmide pTox1 und pTox2 ermöglichen die Expression eines gewünschten Gens in Hefezellen unter Verwendung der X. Lactis-Killertoxin-Signalsequenz (EMBO 6, 229-234 [1987]; Biochem, Biophys. Res. Comm. 144, 613-619 [1987]. Dieses Konstrukt weist das URA3-Gen zur Selektion in Hefen und das AMP-Gen zur Selektion in Bakterien auf. Die Transkription beginnt mit dem CYCl-Promotor und der GAL "Aufwärts- Aktivierungssequenz" (Methods Enzymol., 101, 181-191 [1983]), und endet innerhalb des 3′-Endes des FLP-Gens (Mol. Cell. Biol., 5, 2770-2780 (1985). Das Konstrukt weist sowohl den 2 Mikron-Ursprung und den 2 pBR322-Ursprung für die Replikation in Hefe und E. Coli auf. Die Killertoxin N-terminale Region mit der Signalsequenz und die Kex2-Spaltungsstelle wurden in die Ligonukleotide eingeführt, sie enthielten die A-T-reiche Region unmittelbar im Anschluß an das Initiatorkodon, um optimale Translationsinitiierungs- und Elongationssignale aufrechtzuerhalten. Mehrere Restriktionsstellen wurden konstruiert, um die Insertion der gewünschten Gene abwärts von der Signal-Spaltungsstelle und der Kex2-Spaltungsstelle zu ermöglichen.

1. Herstellung des 3-kb-EcoRI-EspI-Fragments von pBR322, enthaltend den Ursprung und das AMP-Resistenz-Gen

Plasmid plGSD5(-ATG), ein Hefe-Expressionsvektor (Methods Enzymol. 101 : 181-191 [1983], wurde mit EcoRI und EspI verdaut und das 3,0-kb-Fragment wurde isoliert.

2. Herstellung des 2,1-kb-EcoRi-EspI-Fragments des 2 Mikronplasmids, das das 3′-Ende des FLP-Gens und den Beginn enthält

Plasmid pLGSD5(-TAG) wurde mit EcoRI und EspI verdaut und das 2,1-kb-Fragment wurde isoliert.

3. Ligierung und Isolierung des IntermediateI-Plasmids

Die 2,1-kb- und 3-kb-EcoRI-EspI-Fragmente wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die DNA wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Ein korrektes Konstrukt wurde durch Restriktionsanalyse isoliert.

4. Herstellung des 1,8-kb-EcoRI-BamHI-Fragments pLGSD5(-ATG), enthaltend das URA3-Gen, GAS UAS und den CYCl-Promotor

Das Plasmid pLGSD5(-ATG) wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und das 1,8-kb-Fragment wurde isoliert. Die BamHI-Stelle liegt innerhalb eines Linkers vor, der 4 bp aufwärts des CYCl-Initiators insertiert wurde.

5. Herstellung der Oligonukleotide pToxlA⁺, 2A-, 1B+, 2B-

Die Oligonukleotide wurden konstruiert, um die Kodons für die Signalsequenz von K. Lactis-Killertoxin an die BamHI-Bindungsstelle abwärts des CYCl-Initiators zu binden. Um optimale Translationsinitiierung zu erhalten, wurden 13 bp der A-T-reichen Sequenz aufwärts des Killertoxin-Initiatorkodons mitaufgenommen. Diese Sequenz entspricht der für Hefe-Initiierungskodons bestimmten Konsensussequenz. Eine BglII-Stelle wurde direkt aufwärts der A-T-Region vorgesehen, um eine Mutagenese der Initiierungsregion und der Signalsequenz zu ermöglichen. Eine HindIII-Stelle wurde 10 Nukleotide aufwärts der Signalspaltungsstelle angeordnet, um die Mutagenese von abwärts gelegenen Sequenzen die Ligierung eines gewünschten Gens zu ermöglichen. In pTox1 wurde eine AvaI, XhoI-Stelle direkt abwärts des Signalspaltungsstelle angebracht, während in pTox2 eine NaeI-Stelle an der Signalspaltungsstelle zur Blunt-end- Klonierung direkt über der Signalspaltung, die von Gly-Leu in Ala-Glys umgewandelt wurde, angebracht wurde. Auflösung des Heteroduplex an der Spaltungsstelle sollte zur Bildung von Klonen, die die pToxI-Sequenz enthalten und zur Bildung von solchen Klonen führen, welche die pTox2-Sequenz enthalten. In beiden Konstrukten kodieren die anschließenden Sequenzen für den Rest der Killertoxin-Prektursorsequenz bis zur Kex2- Lys-Arg-Spaltungsstelle. An diesem Punkt wurden mehrere Restriktionsstellen (StuI, SalI, AccI, HincII und BamHI) angeordnet, um die Klonierung des gewünschten Gens zu erleichtern. Die StuI-Stelle ermöglicht eine Blunt-ended-Klonierung direkt nach dem Arg-Kodon der Kex2-Spaltungsstelle. Die Oligonukleotide haben einen BamHI-Überhang am 5′-Ende und einen HindIII-Überhang am 3′-Ende, um die Klonierung in den Intermediatel-Vektor zu ermöglichen. Die erhaltene Sequenz hat keine der beiden Stellen mehr.

Diese Oligonukleotide wurden an einem Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert und durch Gelelektrophorese gereinigt. Anschließend wurden sie unter Verwendung von T4-Kinase phosphoryliert und die komplementären Paare wurden verbunden (annealed), ligiert und Gel-gereinigt.

6. Herstellung des EcoRI-HindIII-IntermediateI-Vektors

Der IntermediateI-Vektor wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend mit alkalischer Kälberphosphatase behandelt. Durch diese Behandlung wurde ein kleines EcoRI-HindIII-Fragment entfernt und es blieb eine HindIII-Stelle aufwärts der FLP-3′-Sequenz zurück.

7. Ligierung und Isolierung von pTox1 und pTox2

Das 1,8-kb-EcoRI-BamHI-Fragment wurde mit dem Oligonukleotid- Fragment unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und das erhaltene Fragment wurde Gel-gereinigt und anschließend an den EcoRI-HindIII-IntermediateI- Vektor ligiert. Die DNA wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Korrekte Konstrukte wurden unter Anwendung der Restriktionsanalyse und einer DNA- Sequenzierung identifiziert und ein Klon mit der Sequenz von pTox1 und ein anderer mit der Sequenz von pTox2 wurden isoliert. Beiden Klonen fehlte die BamHI- Stelle an der Verbindungsstelle der Oligonukleotide und des IntermediateI-Vektors.

Beispiel III Bildung von Wachstumsfaktoren zur Expression in pro- karyontischen Zellen A. Herstellung des Plasmids PLEBam/TTV

Der synthetische chimäre als TTV oder (TGF/TGF/VGF) bezeichnete Wachstumsfaktor wurde im Klonierungsvektor pLEBam zusammengefügt. Dieser Hybridwachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in den amino-terminalen zwei Dritteln des Gens mit der Ausnahme, daß die natürliche Humansequenz QEDK in die Sequenz QEEK geändert wurde. Der Carboxy-Terminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR aufwärts von der natürlichen Sequenz PNT terminiert. Das Plasmid pLEBam wurde mit BssHII und BamHI verdaut. BssHII-BamHI pLEBam wurde anschließend mit den Oligonukleotiden TGF101, 102, 103 und 104 und VGF1, 2, 3 und 4 unter Verwendung der DNA-Ligase liegiert und die erhaltenen Plasmide wurden zur Transformierung kompetenter HB101 verwendet. Die Transformanten wurden an Ampicillin selektiert und einem Screening durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI, NcoI und BamHI und durch Nukleotid-Sequenzierung unter Verwendung der Maxam-Gilbert-Vorschrift unterzogen. Es wurde ein korrektes Konstrukt isoliert und als pLEBam/TTV bezeichnet.

B. Herstellung des Plasmids pLEBam/TVV

Der synthetische, chimäre als TVV oder (TGF/VGF/VGF) bezeichnete Wachstumsfaktor wurde im Klonierungsvektor pLEBam zusammengefügt. Dieser Hybridwachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in der N-terminalen Domäne des Gens. Die mittlere und C-terminale Domäne sind von der verkürzten VGF-Sequenz abgeleitet und enden mit der Sequenz YQR aufwärts von der natürlichen Sequenz PNT. Zusätzlich besitzt das Gen GYACVC anstelle von GMYCRC.

a) Herstellung eines 4,3-kb-KpnI-SphI-Fragments von pLEBam/TTV

Das Plasmid pLEBam/TTV wurde mit KpnI und SphI verdaut und das 4,3-KpnI-SphI-Fragment wurde Gel- gereinigt. Durch die Verdauung wurde die mittlere TGV-Domäne von dem synthetischen Gen TTV im Klonierungsplasmid pLEBam entfernt.

b) Ligierung und Isolierung von pLEBam/TVV

Die Oligonukleotide VGF101a und 102a wurden an das 4,3-kb-KpnI-SphI-Fragment von pLEBam/TTV unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Ampicillin selektiert und einem Screening mittels Nukleotidsequensierung unter Verwendung der Sanger-dideoxy-Methode unterzogen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pLEBam/TVV bezeichnet.

Beispiel IV Expression des gewünschten Polypeptid als Fusionsprotein mit dem N-Protein A. Modifiziertes synthetisches TGF 1. Herstellung von pBM11/TGF

Das modifizierte Human-TGF wurde in diesem System als Teil einer Fusion mit den 33-N-terminalen Aminosäuren des N-Gens exprimiert und es besitzt die Sequenz QEEK anstelle der Humansequenz QEDK.

a) Herstellung eines 780-bp-SphI-PvuI-Fragments von pBM11/TTV

Das Plasmid pBM11/TTV wurde mit SpHI und PvuI verdaut und das 780-bp-SphI-PvuI-Fragment wurde Gel- gereinigt. Dieses Fragment enthält einen Teil des pBM11-Plasmids am PvuI-Ende und am SphI-Ende, das N-Gen und die N-terminalen beiden Drittel des Human-TGF-Gens.

b) Herstellung des 5-kb-BamHI-PvuI-Fragments von pBM11/N/TTV

Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit BamHI und PvuI verdaut und das 5-kb-BamHI-PvuI-Fragment wurde Gel- gereinigt.

c) Ligierung und Isolierung von pBM11/N/TGF

Die Oligonukleotide TGF 205 und 206, das 780-bp- SphI-PvuI-Fragment und da 5-kb-BamHI-PvuI-Fragment pBM11/N/TTV wurden zusammen ligiert und dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin selektiert und einem Screening durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRI und Nukleotidsequenzierung entsprechend der Sanger-Dideoxymethode unterzogen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pBM11/N/TGF bezeichnet.

B. Modifiziertes synthetisches TGF-VGF-Hybrid 1. Herstellung von pBM11/N/TTV

In diesem Konstrukt wurde ein synthetisches modifiziertes chimäres TTV-Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins mit den ersten 33 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Dieser Hybridwachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in den beiden aminoterminalen Dritteln des Gens mit der Ausnahme, daß die Sequenz QEEK die natürliche Humansequenz QEDK ersetzt. Der Carboxyterminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR aufwärts der natürlichen Sequenz PNT beendet.

a) Herstellung des synthetischen NcoI(blunt)-BamHI TTV-Gens

Das Plasmid pLEBam/TTV wurde mit NcoI verdaut und die Enden abgestumpft, indem unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA- Polymerase die Überhänge eingefüllt wurden. Die DNA wurde anschließend mit BamHI verdaut und das 170-bp-NcoI(blunt)-BamHI TTV-Fragment wurde Gel-gereinigt.

b) Herstellung von mit BamHI verdautem pBM11

Das Plasmid pBM11 wurde mit BamHI verdaut.

c) Ligierung und Isolierung von pBM11/N/TTV

Mit BamHI verdautes pBM11, das NcoI(blunt)-BamHI TTV- Fragment, und BamHI-Linker (5′GATCCG3′) wurden unter Verwendung von DNA-Ligase zusammen ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin selektiert und einem Screening unter Verwendung einer Restriktionsanalyse und einer Nukleotidsequenzierung unter Anwendung der Sanger- Dideoxymethode unterzogen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pBM11/N/TTV bezeichnet.

Beispiel V Herstellung des gewünschten Polypeptids als Fusionsprotein mit dem N-Protein und einer Spaltungsstelle A. Modifiziertes synthetisches VGF 1. Herstellung von pBM11/NDP/VGFA

Die N-terminale Sequenz des synthetischen VGFA-Gens ist eine verkürzte Version der natürlichen VGF- Sequenz und beginnt mit der Sequenz DIPAIR. In diesem Plasmid ist das VGFA-Fragment abwärts der 32 Aminosäuren des λ-N-Proteins und des Dipeptids Asparaginsäure- prolin lokalisiert. Um die KpnI-Klonierungsstelle zu konservieren, wurde die synthetische Sequenz so geändert, daß sie für CLHCGTC anstelle der natürlichen VGF-Sequenz CLHGDC kodiert und mit der Sequenz YQR aufwärts von der natürlichen Sequenz PNT endet. Zusätzlich kodiert das VGFA-Gen für die Sequenz GYACVC, die die natürliche Sequenz GMYCRC ersetzt.

a) Herstellung eines KpnI-BamHI-80-bp C-terminalen Fragments des synthetischen VGF-Gens

Das Plasmid pLEBam/TVV wurde mit KpnI und BamHI verdaut und das 80-bp-KpnI-BamHI-Fragment wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment enthält die C-terminalen zwei Drittel des synthetischen VGF-Gens mit der KpnI-Stelle am 5′-Ende.

b) Herstellung von BamHI verdautem dephosphoryliertem pBM11

Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit BamHI verdaut und die 5′-Phosphate wurden durch Behandlung mit mit intestinaler alkalischer Kälberphosphatase entfernt. Das 5,6-kp-BamHI-Plasmidfragment wurde Gel- gereinigt.

c) Ligierung und Isolierung von pBM11/NDP/VGFA

Die Oligonukleotide VGF 103a, 104a, das 5,6-kb-BamHI- Fragment von pBM11 und das 80-bp-KpnI-BamHI-Fragment von pBLEBam/TVV wurden miteinander unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und anschließend dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin selektiert und einem Screening durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von ClaI und Nukleotidsequenzierung gemäß der Sander-Dideoxymethode unterzogen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pBM11/NDP/VGFA bezeichnet. Dieses Konstrukt besitzt die Sequenzen GTC und GYACVC anstelle der authentischen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC.

2. Herstellung von pBM11/NDP/VGFa

Die N-terminale Sequenz von VGFa ist eine verkürzte Version der natürlichen VGF-Sequenz und sie beginnt mit der Sequenz DIPAIR. Zusätzlich enthält die VGFa-Sequenz die Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC. In diesem Plasmid ist das VGFa-Gen abwärts der 32 Aminosäuren des λ-N-Proteins und des Dipeptid Asparaginsäure- Prolin lokalisiert. Behandlung des gereinigten Fusionsproteins mit Ameisensäure führt zur Spaltung an der säurelabilen Asparaginsäure-Prolin-Peptidbindung, so daß die Trennung des VGFa-Proteins von dem λ-N-Protein- Aminoterminus ermöglicht wird. Die Spaltung erfolgt derart, daß das VGFa-Protein den Prolinrest am Aminoterminus behält.

a) Herstellung von SphI verdautem, dephosphoryliertem pBM11/DP/VGFA

Das Plasmid pBM11/DP/VGFA (10 µg) wurde mit 30 Einheiten SphI verdaut und die 5′-Phosphate wurden durch Behandlung mit intestinaler alkalischer Kälberphosphatase entfernt. Das 5-kb-Plasmidfragment wurde nach Elektrophorese an einem Agarosegel gewonnen.

b) Herstellung eines EcoRI-SphI-70-bp-Fragments von pBM11/DP/VGFA

Das Plasmid pBM11/DP/VGFA (10 µg) wurde mit 30 Einheiten EcoRI und anschließend mit 30 Einheiten SphI verdaut. Das 70-bp-Fragment wurde nach Elektrophorese an einem Agarosegel gewonnen.

3. Ligierung und Isolierung von pBM11/NDP/VGFa

Das 24-bp-Fragment, das die Oligonukleotide VGF 1A und 2A enthält, das 5-kb-SphI-Fragment und das 70-bp-EcoRI- SphI-Fragment pBM11/DP/VGFA wurde ligiert und die Mischung wurde dazu verwendet, kompetente E. Coli HB101-Zellen zu transformieren. Die Transformanten wurden einem Screening durch Nukleotidsequenzierung unter Verwendung der Sanger-Dideoxynukleotidmethode unterzogen. Ein korrekter Klon wurde isoliert und als pBM11/NDP/VGFa bezeichnet.

B. Modifizierte synthetische TGF-VGF-Hybride 1. Herstellung von pBM11/NDP/TTV

In diesem Konstrukt wird das synthetische modifizierte, chimäre TTV-Gen als C-terminaler Teil des Fusionsproteins mit den ersten 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Ein säurelabiles Asparaginsäure-Prolin-Dipeptid trennt die beiden Fusionsteile. Der Hybridwachstumsfaktor enthält die Aminosäuresequenz von Human-TGF in den amino- terminalen zwei Dritteln des Gens mit der Ausnahme, daß die Sequenz QEEK anstelle der natürlichen Human- TMR-Sequenz QEDK vorliegt. Der Carboxyterminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR aufwärts der natürlichen Sequenz PNT beendet.

a) Herstellung des 5-kb-NcoI-pBM11-Plasmidfragments

Das Plasmid pBM11/NDP/VGFA wurde mit NcoI verdaut und das 5-kb-NcoI-Plasmidfragment wurde Gel- gereinigt. Dieses Fragment hat einen NcoI-Überhang an der Asparaginsäure-Prolin-Spaltungsstelle abwärts der für die ersten 32 Aminosäuren des N- Gens kodierenden Sequenzen. Die andere NcoI-Stelle befindet sich in dem Neomycin-Resistenz-Gen.

b) Herstellung von 0,6-kb-NcoI-BamHI pBM11-Fragment

Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit NcoI und BamHI verdaut und das 0,6-kb-NcoI-BamHI-Plasmidfragment wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment besitzt den NcoI-Überhang in dem Neomycin-Resistenz-Gen.

c) Herstellung des synthetischen 170-bp-TGF/TGF/VGF- Fragment

Das Plasmid pLEBam/TTV wurde mit NcoI und BamHI verdaut und das NcoI-BamHI 170-bp-Fragment, das das synthetische TGF/TGF/VGF-Gen enthält, wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment besitzt den NcoI-Überhang am 5′-Ende des Gens und den BamHI-Überhang am 3′-Ende des Gens.

d) Ligierung und Isolierung von pBM11/NDP/TTV

Die 5-kb-NcoI und 0,6-kb-NcoI-BamHI-Plasmidfragmente wurden mit dem 170-bp-NcoI-BamHI-TTV-Gen unter Verwendung der DNA-Ligase ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin derart selektiert, daß nur Kolonien mit korrekt konstruiertem Neomycin-Resistenz-Gen überlebten. Die Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse mit NcoI und Nukleotidsequenzierung unter Verwendung der Sanger-Dideoxymethode einem Screening unterzogen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pBM11/NDP/TTV bezeichnet.

2. Herstellung von pBM11/NDP/VTV

In diesem Konstrukt wurde das synthetische modifizierte chimäre VTV-Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins mit den ersten 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Ein säurelabiles Asparaginsäure- Prolin-Dipeptid trennt die beiden Fusionsteile. Der Hybridwachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz des Human-TGF in der mittleren Domäne, wobei die Aminosäuresequenz QEEK die natürliche Sequenz QEDK ersetzt. Die N-terminalen und C-terminalen Domänen wurden von der verkürzten VGF-Sequenz abgeleitet und beginnen mit der Sequenz DIPAIR und enden mit der Sequenz VQR, die sich aufwärts der natürlichen Sequenz PNT befindet.

a) Herstellung eines 5-kb-BamHI-NcoI-Fragments von pBM11

Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit BamHI und NcoI verdaut und das 5-kb-BamHI-NcoI-Fragment wurde Gel- gereinigt. Dieses Fragment enthält einen BamHI- Überhang am 3′-Ende der Sequenzen, die für die ersten 32 Aminosäuren des N-Gens kodieren sowie eine NcoI- Stelle in dem Neomycin-Resistenzgen.

b) Herstellung eines 700-bp-KpnI-NcoI-Fragments von pBM11/N/TTV

Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit KpnI und NcoI verdaut und das 700-bp-KpnI-NcoI-Fragment wurde Gel- gereinigt. Dieses Fragment ist aus einem Teil des Plasmids pBM11 gebildet, das einen Teil des Neomycin-Resistenzgenz am NcoI-Überhang und die C-terminale VGF-Domäne des synthetischen TTV-Gens am KpnI-Überhang enthält.

c) Ligierung und Isolierung von pBM11/NDP/VTV

Die Oligonukleotide VGF 103a und 104a, das 5-kb- BamHI-NcoI-Fragment von pBM11 und das 700-bp-KpnI- NcoI-Fragment von pBM11/N/TTV wurden zusammen unter Verwendung der DNA-Ligase ligiert und anschließend dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin selektiert und eine Screening durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von ClaI und Nukleotidsequenzierung gemäß der Sanger-Dideoxymethode unterzogen.

3. Herstellung von pBM16/NDP/TVV

In diesem Konstrukt wurde das synthetische modifizierte chimäre TVV-Gen als C-terminaler Teil eines Fusionsproteins mit den ersten 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert. Ein säurelabiles Asparaginsäure- Prolin-Dipeptid trennt die beiden Fusionsteile. Der Hybridwachstumsfaktor enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in der N-terminalen Domäne. Die mittlere und C-terminalen Domäne wurden von der verkürzten VGF-Sequenz abgeleitet und enden mit der Sequenz YQR. Zusätzlich ersetzt diese Sequenz GYACVC die Sequenz GMYCRC.

a) Herstellung des 4,3-kb-NcoI-BglII-Fragments von pBM11/NDP/VGFa

Das Plasmid pBM11/NDP/VGFa wurde mit NcoI und BglII verdaut und das 4,3-kb-Fragment wurde Gel-gereinigt. Der NcoI-Überhang ist an der Asparagin-Prolin- Spaltungsstelle unmittelbar abwärts der ersten 32 Aminosäuren des N-Gens angeordnet.

b) Herstellung des 1,2-kb-BamHI-BglII-Fragments von pBM11M5

Das Plasmid pBM11M5 wurde mit BamHI und BglII verdaut und das 1,2-kb-Fragment wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment unterscheidet sich von dem normalen pBm11-Fragment dadurch, daß die NcoI-Selle im Neomycin- Resistenzgen entfernt wurde. Alle nachfolgenden Vektoren, denen diese NcoI-Stelle fehlt, werden als pBM16 bezeichnet.

c) Herstellung des synthetischen 170-bp-NcoI-BamHI TVV-Gens

Das Plasmid pLEBam/TVV wurde mit NcoI und BamHI verdaut und das 170-bp-NcoI-BamHI-Fragment wurde Gel- gereinigt. Dieses synthetische Genfragment hat die NcoI-Stelle am 5′-Ende und die BamHI-Stelle am 3′-Ende.

d) Ligierung und Isolierung von pBM16/NDP/TVV

Das 4,3-kb-NcoI-BamHI-Fragment von pBM11/NDP/VGFa und 1,2-kb-BamHI-BglII-Fragment von pBM11M5 und das synthetische 170-bp-NcoI-BamHI-TVV-Genfragment wurden zusammen unter Verwendung der DNA-Lignase ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin selektiert und einem Screening durch Restriktionsanalyse und Nukleotidsequenzierung unter Verwendung der Sanger-Dideoxymethode unterzogen. Das Plasmid wird als pBM16 bezeichnet, um den Verlust der NcoI- Restriktionsstelle im Neomycin-Resistenzgen anzugeben.

C. Synthetisches EGF 1. Herstellung von pBM11/NDP/EGF

In diesem Kontrukt wird das Human-EGF-Gen als Teil einer Fusion mit den 32 N-terminalen Aminosäuren des N-Gens exprimiert, welches sich abwärts einer Asp-Pro- Spaltungsstelle befindet.

a) Herstellung eines 5-kb-NcoI-Fragments von pBM11

Das Plasmid pBM11/DP/VGFA wurde mit NcoI verdaut und die 5′-Phosphatasen wurden durch Behandlung mit intestinaler alkalischer Kälberphosphatase entfernt. Das 5-kb-Plasmidfragment wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment hat einen NcoI-Überhang an der Asp-Pro-Spaltungsstelle abwärts derjenigen Sequenzen, die für die ersten 32 Aminosäuren des N-Gens kodieren. Die andere NcoI- Stelle befindet sich im Neomycin-Resistenzgen.

b) Herstellung eines 0,6-kb-NcoI-BamHI-Fragments von pBM11

Das Plasmid pBM11/N/TTV wurde mit NcoI und BamHI verdaut und das 0,6-kb-NcoI-BamHI-Plasmidfragment wurde Gel-gereinigt. Dieses Fragment hat den NcoI-Überhang im Neomycin-Resistenzgen.

c) Ligierung und Isolierung von pBM11/DP/EGF

Die drei Sätze der annellierten EGF-Oligonukleotide mit eine NcoI-Überhang am 5′-Ende und einem BamHI- Überhang am 3′-Ende, das 5-kb-NcoI-Fragment von pBM11 und das 0,6-kb-NcoI-BamHI-Fragment von pBM11 wurden zusammen unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes E. Coli HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin derart selektiert, daß nur Kolonien mit einem korrekt konstruierten Neomycin-Resistenzgen überleben. Die Transformanten wurden einem Screenung durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von EcoRT und BamHI und durch DNA-Sequenzierung, wie oben beschrieben, unterzogen.

Beispiel VI Herstellung eines Polypeptids als Fusionsprotein mit einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz A. Herstellung von pBM11/PD/EGF

Die synthetischen Oligonukleotide wurden so konstruiert, daß sie die Insertion einer für ein modifiziertes alkalische Phosphatase-Signalpeptid kodierenden DNA und einer Linker-Region mit drei Klonierungsstellen (HindIII, SmaI und BamHI) in den pBM11-Expressionsvektor abwärts vom P_L-Promotor und der ribosomalen N-Gen-Bindungsstelle ermöglichen. Die Nukleotidsequenz wurde optimiert, so daß sie so ähnlich wie möglich der Nukleotidsequenz des Aminoterminus des λ-N-Gens war, da die λ-N-Gensequenz sich zusammen mit derjenigen ihrer ribosomalen Bindungsstelle als wirksam für die Ribosomeninitiierung und -translation erwiesen hat. Zusätzlich wurde die zweite Aminosäure der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz, nämlich die basische Aminosäure Lysin, durch die saure Aminosäure Asparaginsäure ersetzt.

1. Herstellung des 0,17-kb-EcoRI-BamHI-Fragments von EGF

Das Plasmid pBM11/NDP/EGF (30 µg) wurde mit 30 Einheiten EcoRI verdaut und anschließend mit 4 Einheiten des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase verdaut, um stumpfe Enden zu erzeugen. Die DNA wurde schließlich mit 30 Einheiten BamHI verdaut und das 0,7-kb- Fragment des EGF-Gens wurde nach Elektrophorese an einem Agraosegel gewonnen. Die auf diese Weise gereinigte DNA hat eine stumpfe EcoRI-Stelle am 5′-Ende und einen BamHI-Überhang am 3′-Ende.

2. Herstellung des 0,5-kb-PvuI-HindIII-Fragments von pBM11/PAD

Das Plasmid pBM11/PAD (18 µg) wurde mit 30 Einheiten HindIII verdaut und anschließend mit dem Klenow- Fragment behandelt, um stumpfe Enden zu erzeugen. Die DNA wurde anschließend mit PvuI verdaut und das 0,5-kb-PvuI-HindIII (blunt)-Fragment wurde nach Elektrophorese an einem Agarosegel gewonnen.

3. Herstellung des 5,2-kb-PvuI-BamHI-Fragments von pBM11/PAD

Das Plasmid pBM11/PAD (18 µg) wurde mit 30 Einheiten PvuI und anschließend mit 30 Einheiten BamHI verdaut.

Das 5,2-kb-Fragment wurden nach Elektrophorese an einem Agarosegel gewonnen.

4. Ligierung und Isolierung von pBM11/PAD/EGF

Das 0,17-kb-EcoRI(blunt)-Fragment, das 0,5-kb-PvuI- HindIII(blunt)-Fragment und das 5,2-kb-PvuI-BamHI- Fragment wurden miteinander ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes E. Coli HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden mittels DNA-Sequenzierung, wie oben beschrieben, einem Screening unterworfen. Die gewünschte Signalsequenz/EGF-Region hatte die folgende Sequenz:

Die Wirksamkeit der Produktion von Fremdprotein im pBM11/PAD-Expressionssystem und die Möglichkeit funktionell wirksame Fremdproteine vom Fusionsprodukt zu reinigen, wurde beispielhaft unter Verwendung von pBM11/PAD/EGF gezeigt. Nach Größenausschluß- Chromatographie (TSK-250), wurden 10,3 mg Äquivalente des aktiven EGF-Fusionspolypeptids aus 23 g (8 l) E. Coli gewonnen, das zur Expression des EGF-Gens dereprimiert war. 40% der EGF-Aktivität stammte aus EGF, von dem die Signalsequenz abgespalten war.

B. Herstellung von pBM11/PAD/nVGFa

Es wurden synthetische Oligonukleotide konstruiert, um das synthetische VGFa-Gen mit einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz zu verbinden, so daß eine optimale Signalsequenz-Spaltungsstelle durch Kodierung für die zusätzlichen N-terminalen Reste zur Verfügung gestellt wird, welche umittelbar abwärts der Signalsequenz-Spaltungsstelle in natürlichem VGF, welche oben als extremer N-Terminus bezeichnet wurde, auftreten. Die n-VGFa-Sequenz enthält die Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC und sie endet mit der Sequenz YQR aufwärts der natürlichen Sequenz PNT. In diesem Expressionssystem bleibt für die Hauptmenge der Moleküle die Signalsequenz an das nVGFa gebunden, wobei ein Fusionsprotein mit nVGFa am C-Terminus gebildet wird.

1. Herstellung des mit pBM11/PAD verdauten 0,5-kb- HindIII-PvuI

Das Plasmid pBM11/PAD wurde mit HindIII und PvuI verdaut und das 0,5-kb-Fragment wurde Gel-gereinigt. Die HindIII-Stelle ist am C-Terminus der modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz lokalisiert.

2. Herstellung des 5,2-kb-PvuI-BamHI pBM11-Plasmidfragments

Das Plasmid pBM11/NDP/VGFa wurde mit PvuI und BamHI verdaut und das 5,2-kb-Plasmidfragment wurde Gel- gereinigt.

3. Herstellung des synthetischen 170-bp-NcoI(blunt)- BamHI-VGFa-Gens

Das Plasmid pBM11/NDP/VGFa wurde mit NcoI verdaut und die 5′-Überhänge wurden durch Behandlung mit S1-Nuklease entfernt. Dies ergab ein stumpfes Ende am ersten Kodon des VGFa-verkürzten synthetischen Gens. Die DNA wurde anschließend mit BamHI verdaut und das 170-bp-NcoI(blunt)-BamHI-Fragment wurde Gel-gereinigt.

4. Ligierung und Isolierung von pBM11/PAD/nVGFa

Die Oligonukleotide VGF105 und 106, das 0,5-kb-HindIII- PvuI-Fragment von pBM11/PAD, das 5,2-kb-PvuI-BamHI- pBM11-Fragment und das 170-bp-NcoI(blunt)-BamHI- synthetische VGFa-Gen wurden miteinander unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die erhaltene Mischung wurde dazu verwendet, kompetentes HB101 zu transformieren. Die Transformanten wurden an Neomycin selektiert und einem Screening durch Restriktionsanalyse und Nukleotidsequenzierung unter Anwendung der Sanger-Dideoxymethode unterzogen. Es wurde ein korrektes Konstrukt isoliert, das die modifizierte alkalische Phosphatase- Signalfrequenz in Übereinstimmung mit dem nVFa-Gen enthielt.

Beispiel VII Expression eines Polypeptids als Fusionsprotein mit einer alkalischen Phosphate-Signalsequenz A. Herstellung von pBM11/PAK/nVGFa (Alkalische Phosphatase- Signalsequenz/nVGFa mit natürlichem VGF-N-Terminus und Sequenzen GTC und GYACRC

Das Plasmid pBM11/PAD/nVGF wurde in vitro (Morinaga et al., Biotechnology [1984]2 : 636-643) mutagenisiert, um die für die zweite Aminosäure in der Signalsequenz kodierenden Kodons zu ändern, nämlich um den Asp (D)- Kodon wieder in den Kodon für Lys (K), den in der natürlichen Sequenz gefundenen Rest, zu ändern. Diese Mutagenese ergab auch eine Einführung einer PvuI-Stelle in die Signalsequenz.

B. Herstellung von pBM11/PAK/EGF

In dieser Expressionskassette ist das EGF-Gen Teil einer Fusion mit der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz.

Das Plasmid pBM11/PAD/EGF wurde in vitro mutagenisiert, um die für die zweite Aminosäure in der Signalsequenz kodierenden Kodons zu verändern, d. h. um den Asp (D)- Kodon in den Kodon für Lys (K), den in der natürlichen Sequenz gefundenen Rest, zu überführen. Diese Mutagenese ergab auch eine Einführung einer PvuI-Stelle in die Signalsequenz.

C. Herstellung von TacPak/EGF (alkalische Phosphatase- Signalsequenz/Human EGF) 1. Herstellung der Plasmidfragmente

Das Plasmid pl35-1 wurde vom Plasmid pDR540 (Pharmacia) abgeleitet und enthielt das Cro-Gen SD und eine BglII-Stelle abwärts vom lac SD. pDR540 ist ein Expressionsvektor, der den trp-lac-Hybrid promotor enthält. pl35-1 wurde mit BglII und BamHI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt.

Das Plasmid pBM11/PAK/EGF wurde mit PvuII und BamHI verdaut und das ∼230-bp-Fragment, das für einen Teil der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz und Human-EGF kodiert, wurde isoliert.

2. Herstellung der TacPak1 und TacPak2-Oligonukleotide

Die synthetischen Oligonukleotide TacPak1 und TacPak2 wurden mit einem Überhang, der mit der BglII- Stelle von pl35-1 verträglich ist und einem PvuII-Überhang konstruiert, der mit der PvuII-Stelle in dem alkalischen Phosphatase/EGF PvuII/BamHI-Fragment verträglich ist. Die Oligonukleotide wurden an einem Oligonukleotid-Synthesizer von Applied Biosystems synthetisiert.

3. Ligierung und Isolierung des TacPak/EGF-Klons

Das mit pl35-1 verdaute BglII-BamHI, das 230-bp-Pak/EGF- Fragment und die Oligonukleotide TacPak1 und TacPak2 wurden miteinander unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert, in kompetentes HB101 transformiert, wobei ein korrektes Konstrukt durch DNA-Sequenzierung isoliert wurde.

Beispiel VIII Expression eines Polypeptids als Fusionsprotein mit der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz unter Verwendung einer Expressions-Kassette, die eine transkriptionale Terminationsregion enthält A. Herstellung von pTCPt/EGF ((trp-35)16bp(lac-10)(lacSD) 11bp(ATG)/alkalische Phosphatase-Signal/Human EGF/trans. term.-NEO)

Dieses Plasmid ist so konstruiert, daß es die tac- Promotorelemente enthält und cro SD zur Expression von Human-EGF hinter der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz verwendet. Es hat einen pBR322-Hintergrund mit dem Neomycin-Resistenzgen.

1. Herstellung des 420-bp-HindIII(blunt)-BamHI- Fragments von TacPak/EGF

TacPak/EGF wurde mit HindIII verdaut und anschließend mit dem Klenow-Fragment der DNA- Polymerase verdaut, um stumpfe Enden zu erzeugen. Die DNA wurde anschließend mit BamHI verdaut und das 420-bp-Fragment, das die tac-Promotorelemente und die für die alkalische Phosphatase-Signalsequenz und Human-EGF kodierende Region enthält, wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert.

2. Herstellung des 2,8-kb-EcoRI(blunt)-BamHI-Fragments von pBM16t/NDP/VGFa

pBM16t/NDP/VGFa wurde mit EcoRI verdaut und anschließend mit dem Klenow-Fragment behandelt, um stumpfe Ende zu erzeugen. Die DNA wurde anschließend mit BamHI verdaut und das 2,8-kb-Fragment wurde isoliert. Dieses DNA-Fragment enthält den pBR322-Ursprung, das Neomycin-Resistenzgen, dessen NcoI-Stelle entfernt wurde, und den Gen-32-ähnlichen Transkriptionsterminator abwärts der BamHI-Stelle.

3. Ligierung und Isolierung von pTCPt/EGF

Das 2,8-kb-EcoRI(blunt)-BamHI-Fragment von pBM16/NDP/VGFa wurde mit dem 420-bp-HindIII(blunt)-BamHI-Fragment von TacPak/EGF ligiert und die erhaltene DNA wurde dazu verwendet, kompetentes JM109(lacIq) zu transformieren. Ein korrektes Konstrukt wurde aufgrund seiner Resistenz gegenüber Neomycin und mittels DNA- Sequenzierung isoliert.

B. Herstellung von pTCPt/nVGFa ((trp-35)16bp(lac-10) (lacSD)(croSD)11bp(ATC)/alkalische Phosphatase-Signal/ N-terinales VGFa mit Sequenz GTC und GYACRC)/trans

Dieses Plasmid hat die tac-Promotorelemente und verwendet das cro SD zur Expression des modifizierten VGF-Gens mit der N-terminalen Extension abwärts der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz. Das Plasmid hat einen pBR322-Hintergrund mit dem Neomycin-Resistenzgen.

1. Herstellung des 350-bp-PvuI-BamHI-Fragments von pBM11/PAK/nVGFa

Das Plasmid pBM11/PAK/nVGFa wurde mit PvuI und BamHI verdaut und das 350-bp-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment enthält den Hauptteil der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz und das nVGFa-Gen.

2. Herstellung des 2,8 kb PvuI-BamHI-Fragments von pTCPt/EGF

Das Plasmid pTCPt/EGF wurde mit PvuI und BamHI verdaut und das 2,8-kb-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert.

Ligierung und Isolierung von pTCPt/nVGFa

Das 2,8-kb-Fragment und das 350-bp-Fragment wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die DNA wurde dazu verwendet, kompetentes JM109 (lacIq) zu transformieren. Ein korrektes Konstrukt wurde mittels Restriktionsanalyse isoliert.

3. Ligierung und Isolierung von pTCPt/nVGFa

Das 2,8-kb-Fragment und das 350-bp-Fragment wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die DNA wurde dazu verwendet, kompetentes JM109 (lacIq) zu transformieren. Ein korrektes Konstrukt wurde durch Restriktionsanalyse isoliert.

C. Herstellung von pTNPt/EGF ((trp-35)17bp(lac-10)(nSD) 8bp(ATG)/alkalisches Phosphatase-Signal/Human EGF/trans. term.-NEO)

Dieses Plasmid enthält die tac-Promotorelemente und verwendet das N-Gen SD zur Expression von Human EGF hinter der alkalischen Phosphatase-Signalsequenz. Es hat einen pBR322-Hintergrund mit dem Neomycin-Resistenz-Gen.

1. Herstellung von 2,8-kb-PvuI-BamHI pTNPt

Das Plasmid pTNPt wurde mit PvuI und BamHI verdaut und das 2,8-kb-Fragment wurde mittels Gelelektrophorese isoliert.

2. Herstellung des 300-bp-PvuI-BamHI-Fragments von pBM11/PAK/EGF

Das Plasmid pBM11/PAK/EGF wurde mit PvuI und BamHI verdaut und das 300-bp-Fragment wurde isoliert.

3. Ligierung und Isolierung von pTNPt/EGF

Das 2,8-kb-Fragment und das 300-kb-Fragment wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die DNA wurde in kompetentes JM109 (LacIq) transformiert. Ein korrektes Konstrukt wurde mittels Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung isoliert.

Beispiel IX Bildung der Wachstumsfaktorgene zur Expression in eukaryonitischen Zellen A. Herstellung des Plasmids pRSV/VGF

Transfektion dieses Plasmids in Chinese Hamster- Ovarialzellen ergab eine Produktion von natürlichem VGF.

a) Herstellung von HindIII(blunt)-BglII(blunt)-pRSV

Das Plasmid pRSV wurde mit HindIII und BglII verdaut, und das 4-kb-Fragment wurde Gel-gereinigt. Die vorstehenden Enden wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase abgestumpft und die 5′-Phosphatasen wurden anschließend mit intestinaler alkalischer Kälberphosphatase entfernt.

b) Herstellung eines das VGF-Gen enthaltenden DdeI-Fragments

Ein subkloniertes Genomfragment von Vaccinia-DNA wurde mit DdeI verdaut, die vorspringenden Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments abgestumpft und das 550-bp-DdeI-Fragment wurde Gel-gereinigt.

c) Ligierung und Isolierung von pRSV/VGF

Das 4-kb-HindIII(blunt)-BglII(blunt)-Fragment von pRSV und das 550-bp-DdeI(blunt)-Fragment von Vaccinia-DNA wurden miteinander unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die Transformanten wurden mit Ampicillin selektiert und einem Screening mittels Restriktionsanalyse unterworfen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pRSV/VGF bezeichnet.

d) Transfektion der CHO-Zellen durch pRSV/VGF

Das Plasmid pRSV/VGF wurde mit dem Plasmid pRSV durch Calciumphosphat-Fällung in Chinese Hamster-Ovarialzellen (CHO) kotransfektiert. Die Transfektanten wurden durch Southern dot blot-Hydridisierung einem Screening unterworfen und ein positiver als pRSV/VGF52 bezeichneter Klon wurde isoliert.

B. Herstellung des Plasmids pAc/VGF

Ein weiteres Expressionssystem zur Expression des rekombinanten VGF-Proteins ist ein Insektensystem, siehe Maeda et al. und Carbonell et al., siehe oben. In einem derartigen System verwendet man Autographa california nuclear polyherosis-Virus (AcNPV als Vektor zur Expression von Fremdgenen. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Das Hüllgen kann in die nicht-essentiellen Regionen (beispielsweise das Polyhedringen) des Virus kloniert werden und wird unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise der Polyhedrin-Promotor) gestellt. Eine erfolgreiche Insertion des VGF-Genkonstrukts führt zur Inaktivierung des Polyhedringens und Produktion eines nicht- okkludierten rekombinanten Virus (d. h. eines Virus, dem die Proteinhülle fehlt, für die das Polyhedringen kodiert). Diese rekombinanten Viren werden anschließend zur Infizierung von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet, in denen das insertierte Gen exprimiert wird.

Das VGF-Gen wird unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors für ein Insektenzellsystem gestellt. Das Plasmid pAc610 enthält das Polyhedringen in einem Plasmidvektor geklont, der einen Ampicillin-Resistenz-Marker besitzt. In dieses Gen sind Polylinker insertiert, die sich 50 Basen abwärts der transkriptionalen Startstelle des Polyhedringens und 7 Basen vor dem ersten ATB befinden. Das VGF-Gen ist in eine zweckmäßige Polylinkerstelle kloniert, so daß es unter der Kontrolle des Polyhedrinpromotors steht. Das ATG-Initiations-Methionin- Kodon und die translationalen Terminationskodons sind diejenigen des VGF-Gens; die transkriptionalen Startstellen und Polyadenylierungssignale sind diejenigen des Polyhedringens.

a) Herstellung von SmaI-BamHI pAc610

Das Plasmid pAc610 wurde mit SmaI und BamHI verdaut.

b) Herstellung des HindIII(blunt)-BglII-Fragments des VGF-Gens

Das Plasmid pRSV/VGF wurde mit HindIII verdaut und die vorstehenden Enden wurden unter Verwendung des Klenow- Fragments abgestumpft. Die DNA wurde anschließend in BglII verdaut und 560-bp-Fragment wurde Gel-gereinigt.

c) Ligierung und Isolierung von pAc/VGF

Das SmaI-BamHI-Fragment von pAc610 und das 560-bp-Fragment von pRSV/VGF, enthaltend das VGF-Gen, wurden unter Verwendung von DNA-Ligase ligiert und die Transformanten wurden mittels Restriktionsanalyse einem Screening unterworfen. Ein korrektes Konstrukt wurde isoliert und als pAc/VGF bezeichnet.

d) Transfektion von Sf9-Zellen mit pAc/VGF

Das Plasmit pAcVGF wurde mit AcNPV-Wildtyp-Baculovirus- DNA in Sf9-Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) kotransfektiert. Die Transfektanten wurden hinsichtlich eines Okklusions-negativen Phenotyps in Plaque-Assays einem Screening unterworfen. Eine Okklusions-negative Plaque wurde isoliert und nach fünf Runden erfolgreicher Plaque-Reinigung wurde ein hoher Titer an rekombinanten Virus (Stock) erhalten.

C. Herstellung von pAc/SFGF Baculovirus-Expression des natürlichen Shope-Fibroma- Virus-Wachstumsfaktors a) Herstellung von BamHI verdautem pAc710

Das Plasmid pAc710 wurde mit BamHI und SmaI verdaut. Die SmaI-Stelle in diesem Plasmid befindet sich abwärts des Baculovirus-Polyhedrin-Genpromotors.

b) Herstellung eines 430-bp-HincII-Sau3a-Fragments der Shope-Fibroma-Virusgenom-DNA

Das 3,7-kb-BglII-Fragment des 19-kb-BamHI-C-Fragments der Shope-Fibroma-Virusgenom-DNA wurde in einem BamHI verdautes SP64-Plasmid kloniert und als SP64/3,7 bezeichnet. Das Plasmid SP64/3,7 wurde mit HincII verdaut und das 1-kb-HincII-Fragment wurde Gel-gereinigt. Das 1-kb-Fragment wurde anschließend mit Sau3a verdaut und das 430-bp-HincII- Sau3a-Fragment wurde Gel-gereinigt.

c) Ligierung und Isolierung von pAc/SFGF

Das BamHI-SmaI verdaut pAc610 wurde mit dem 430-bp-HincII-Sau3a-Fragment, enthaltend das SFGF-Gen, ligiert und die erhaltene Mischung wurde in kompetentes E. Coli HB101 transformiert. Die Transformanten wurden mittels Restriktionsanalyse einem Screenung unterzogen, und es wurde ein korrektes Konstrukt isoliert und als pAc/SFGF bezeichnet.

Beispiel X Herstellung von Polypeptiden A. Festphasen-Synthese von VGF und TGF 1. Synthetisches VGF-Fragment

Die dem verkürzten VGF entsprechende Sequenz beginnend mit der Sequenz DIPAIR und endend mit der Sequenz LVDY, wurde an einem Peptid-Syntheziser von Applied Biosystems, Modell 430A, unter Verwendung einer Standardvorschrift hergestellt. Behandlung des endgültigen Peptidharzes mit flüssiger HF unter Standard-"low-high"-Bedingungen ergab das rohe entschützte Peptid. Das Peptid wurde einer Chromatofokusierung an PBE94 (Pharmacia) unterzogen. Das teilweise gereinigte Peptid wurde bei pH 6,5 eluiert. Eine kurze Behandlung mit 0,2 N Natriumhydroxid führte zur Entfernung der Cystein-Schutzgruppen (Ethylcarbamoyl). Das Peptid wurde in Gegenwart von oxidiertem und reduziertem Glutathion oxidiert. Reinigung mittels Gelfiltration und HPLC lieferte hochreines VGF mit folgender Sequenz:

DIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIRCQHVVLVDY

2. Synthetisches Human- und Ratten-TGF-α

Human- und Ratten-TGF-α wurden chemisch im wesentlichen wie oben für VGF beschrieben, synthetisiert und durch Penninsula Labs zur Verfügung gestellt.

B. Isolierung rekombinanter Polypeptie, hergestellt in prokaryontischen Zellen 1. Wachstumsfaktoren, hergestellt in Vektoren auf pBM- Basis unter Verwendung des P_L-Promotors und des ts CI-Repressors

E. Coli B (HB101), enthaltend die pBM11/NDP/Wachs tumsfaktorplasmide, wurden in Luria-Brühe bei 30°C kultiviert. Die Dichte der Kultur wurde bei 550 nm gemessen und sobald die Dichte eine Absorption von 0,7 bis 0,9 erreicht hatte, wurde die Synthese des Wachstumsfaktor-Fusionsproteins durch Erhöhung der Temperatur auf 42° induziert. Die Kultur wurde bei dieser Temperatur 5 bis 20 h inkubiert und die Bakterien wurde anschließend durch Zentrifugieren isoliert und bei -70°C bis zum Gebrauch eingefroren.

Zur Isolierung des rekombinanten Proteins, wurden die Zellen in einem Puffer aufgetaut, der 0,05 M NaH₂PO₄, pH 7,2, 0,5 M NaCl, 0,01 M EDTA enthielt. 150 ml Puffer wurden zur Herstellung von 50 g Bakterien verwendet. Die Zellen wurden durch 15minütige Ultraschall-Behandlung auf Eis unter Verwendung eines 6,35 mm-Behälters, 50% Pulsrate bei 60 W zerstört. Nach der Zerstörung der Zellen wurde das unlösliche Protein durch 90minütiges Zentrifugieren bei 12 000 Upm in einem GSA-Rotor isoliert. Das das unlösliche Protein enthaltende Pellet wurde anschließend erneut in 50 ml 6 M Guanidin-hydrochlorid suspendiert. Das unlösliche Material wurde durch 2stündiges Zentrifugieren bei 25 000 Upm in einer Beckman-Typ-30-Ultrazentrifuge isoliert. Der Überstand wurde gesammelt und bei -20°C bis zum weiteren Gebrauch aufbewahrt.

Die Reinigung des Fusionsproteins erfolgte entweder an einer Sephacryl S3000- oder Fractogel-HW-55-Säule, die mit 1 M Guanidin-hydrochlorid äquilibriert wurde. Die das Fusionsprotein enthaltenden Fraktionen waren diejenigen, die ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht enthielten, das übereinstimmte mit dem Molekulargewicht des Polypeptids (bestimmt an einen 15% Polyacrylamid-Harnstoffgel), für das das synthetische Gen kodiert.

Um eine aktive Form des rekombinanten Wachstumsfaktors zu erhalten, ließ man das Fusionsprotein sich wieder falten, indem man es in einem 50-mM-Tris-HCl-Puffer, pH 8,7, enthaltend 1 M Guanidin-Hydrochlorid, 1,25 mM reduziertes Glutathion und 0,25 mM oxidiertes Glutahion, 3 bis 10 Tage bei 4°C inkubierte. Die biologische Aktivität des Wachstumsfaktors wurde mittels eines kompetitiven Rezeptor- Bindungs-Assays wie oben beschrieben (siehe Beispiel I. C) verfolgt. Sobald ein maximaler Aktivitätsspiegel erhalten wurde, wurde das Protein gegen destilliertes Wasser dialysiert und bis zur Trockene lyophilisiert.

Falls die Entfernung der Leadersequenz gewünscht ist, wird das Protein entweder durch Resuspendieren in 70%iger Ameisensäure und 3tätigem Inkubieren bei 40°C oder durch Inkubieren über Nacht bei Raumtemperatur in einem 100fachen molaren Überschuß an Cyanogenbromid gespalten. Das gespaltene Produkt wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und zur Trockene lyophilisiert.

Um den rekombinanten Wachstumsfaktor weiter zu reinigen, wurde der Wachstumsfaktor erneut in 40%igem Acetonitril, 0,1% TFA suspendiert und mittels HPLC unter Verwendung einer BioRad-TSK-250-Säule gereinigt. Die den Wachstumsfaktor enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und weiter unter Anwendung der Umkehrphasen-HPLC, entweder an Waters µBondpak C-18 oder Rainin Dynamax C-8, gereinigt. Das Eluierungsmittel war ein linearer Gradient von 20 bis 40% Acetonitril, enthaltend 0,1% TFA. Die die Rezeptor- Bindungsaktivität enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, lyophilisiert und bis zum Gebrauch bei -20°C aufbewahrt.

a) TGF und modifizierter TGF

i) N/TGF
Rekombinanter modifizierter Human-TGF wurde aus dem Plasmid pBM11/N/TGF produziert. Er enthielt 33 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und die Sequenz QEEK anstellee der natürlichen Humansequenz QEDK.

b) Modifiziertes und verkürztes VGF

i) PAD/nVGFa
Rekombinantes modifiziertes VGF wurde aus dem Plasmid pBM11/PAD/nVGFa produziert, welches die extreme N-terminale Sequenz von VGF und die modifizierten Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenz GDC und GMYCRC enthielt. Das nVGFa-Fragment wurde als Fusionsprotein mit einer modifizierten alkalischen Phosphatase-Signalsequenz am N-Terminus exprimiert und war an der Sequenz YQR am C-Terminus verkürzt.
ii) NDP/VGFa
Rekombinantes modifiziertes VGF wurde aus dem Plasmid pBM11/Nd/VGFa, beginnend mit der DIPAIR- Sequenz und endend an der YKQR-Sequenz in VGF, produziert. Es hat die modifizierten Sequenzen GTC und GYACRC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GMYCRC. Das VGFa-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure- Prolin exprimiert.
iii) VGFa
Das VGF-Fragment wurde wie oben unter 2.b) beschrieben hergestellt und nach Abspaltung vom Fusionsprotein durch Säurebehandlung weiter mittels HPLC gereinigt.
iv) NDP/VGFA
Rekombinantes modifiziertes VGF wurde aus dem Plasmid pBM11/NDP/VGFA, das bei der DIPAIR-Sequenz beginnt und an der YKQR-Sequenz in VGF endet und die Sequenzen GTC und GYACVC anstelle der natürlichen VGF-Sequenzen GDC und GYMCRC besitzt, hergestellt. Das VGFA-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure- Prolin exprimiert.

c) Chimäre TGF/VGF-Hybride

i) N/TTV (TGF/TGF/VGF)
Rekombinantes modifiziertes TTV wurde aus pBM11/ N/TTV produziert und enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in den amino-terminalen zwei Dritteln des Gens mit Ausnahme der Sequenz QEEK anstelle der natürlichen Humansequenz QEDK. Der Carboxy-Terminus wurde von der Aminosäuresequenz von VGF abgeleitet und mit der Sequenz YQR aufwärts der natürlichen Sequenz PNT beendet. Das TTV-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 33 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus exprimiert.
ii) NDP/TTV
Rekombinantes TTV wurde aus dem Plasmid pBM11/N/TTV produziert und wie oben unter a) beschrieben, modifiziert, mit der Ausnahme, daß das TTV-Fragment als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure- Prolin exprimiert wurde.
iii) NDP/VTV
Rekombinantes modifiziertes VTV wurde aus dem Plasmid pBM11/NDP/VTV produziert und enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in der mittleren Domäne, wobei die natürliche Sequenz QEDK durch die Aminosäuresequenz QEEK ersetzt ist. Die N-terminalen und C-terminalen Domänen wurden von der verkürzten VGF-Sequenz abgeleitet und beginnen mit der Sequenz DIPAIR und enden mit der Sequenz YQR. Das VTV- Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert.
iv) NDP/TTV
Rekombinantes modifiziertes VTV wurde aus dem Plasmid pBM11/NDP/TVV erzeugt und enthielt die Aminosäuresequenz von Human-TGF in der N-terminalen Domäne des Gens. Die mittlere und C-terminale Domäne wurden von der verkürzten VGF-Sequenz abgeleitet und enden mit der Sequenz YQR. Zusätzlich weist das synthetische Gen die Modifikation GYACVC statt GMYCRC auf. Das TVV-Fragment wurde als Fusionsprotein mit 32 Aminosäuren des N-Gens am N-Terminus und dem säurelabilen Dipeptid Asparaginsäure-Prolin exprimiert.

2. Wachstumsfaktoren, hergestellt in Vektoren, die die tac- oder lac-Promotorn umfassen

Bakterielle Wirte mit Expressionskassetten, welche die tac oder lac-Promotoren umfassen, wurden bei 30 bis 37°C bis zu einer optischen Dichte von A600=0,2 bis 0,8 entweder in LB-Brühe oder einem chemisch definierten Medium, wie M9-Medium, supplementiert mit Thiamin und Glukose, kultiviert. Ein geeignetes Antibiotikum wurde in das Wachstumsmedium zur Selektion der die Expressionskassette enthaltenden Wirte gegeben. Die Bakterienkulturen wurden mit einer Konzentration von 100 bis 1000 mM IPTG induziert und 16 bis 24 h bei 30°C kultiviert. Bei Expressionskassetten, denen ein lacqI-Gen fehlte, hatten die bakteriellen Wirte einen F-Faktor mit dem lacqI-Gen, wie JM109, XK1, JM103 etc. Beispiele für bakterielle Wirte bei Expressionskassetten mit dem lacI-Gen sind HB101, DH1, DH5 etc. Wenn der bakterielle Wirt ein funktionelles lac-Operon (lac+) aufweist, kann die Expressionskassette mit 1% Lactose induziert werden. Nach der Induktionsperiode kann man die Wachstumsfaktoren entweder aus dem Medium oder dem Zellpellet isolieren.

a) PAK/EGF

Aus den Expressionskassetten TacPak/EGF und pTcCPt/ EGF erzeugtes Human-EGF wurde aus dem Medium in aktiver Form isoliert, wobei die alkalische Phosphatase-Signalsequenz entfernt war. Etwa 85% des aktiven EGF wurden im Medium gefunden, der Rest war mit dem Zell-Pellet assoziiert. Diese Expressionskassetten ergaben 4 mg/l aktives EGF. Die Zellen wurden aus dem Medium durch Zentrifugieren entfernt und das Medium wurde durch einen Amicon SY30, 30 000 M_r-Spiral-Trennfilter und anschließend durch eine Q-Sepharose-Säule gegeben. Das hochgereinigte Human-EGF wurde 20 mM NaPO₄, pH 7, mit einem 0 bis 0,5 M NaCl-Gradienten eluiert. Alternativ kann man die Wachstumsfaktoren aus dem Zell-Pellet durch osmotischen Schock oder Ultraschallbehandlung isolieren und in im wesentlichen gleicher Weise wie oben beschrieben, reinigen.

b) PAK/nVGFa

Rekobinantes nVGFa wurde aus der Expressionskassette pTCPt/nVGFa erzeugt. Das nVGFa wurde aus dem Zell-Pellet durch Ultraschallbehandlung isoliert und es wurde gezeigt, daß es etwa 40% des gesamten Bakterienproteins ausmachte.

C. Isolierung von VGF und SFGF, produziert durch eukaryontische Expression der natürlichen Gene 1. Herstellung von VGF in Affennierenzellen

Natürliche VGF wurde durch Infektion von Affenierenzellen mit Vaccinia-Viren produziert. Cercopithecus-Affennieren (BSC-1)-Zellmonoschichten wurden mit 15 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) pro Zelle an gereinigtem VV infiziert (Stamm WR, kultiviert in Hela-Zellen und gereinigt durch Sedimentation mit einem Sucrose-Dichtegradienten, (Moss B., [1981] in Gene Amplification and Analysis, Hrsg. Chirickjian, J. G. und Papis, T. S. [Elsevier/ North-Holland, NY], Bd. 2, S. 253-266). Die infizierten Zellen wurden bei 37°C mit etwa 1 ml Eagle's Grundmedium, das mit 2% fötalem Kälberserum pro 2 ×10⁶- Zellen ergänzt wurde, inkubiert. Mock-infizierte Zellen wurden in identischer Weise behandelt. Die Zellkulturüberstände wurden mittels Zentrifugieren bei geringen Umdrehungszahlen geklärt und lyophilisiert. Der Rückstand wurde anschließend erneut in 1 M Essigsäure suspendiert und intensiv gegen 0,2 M Essigsäure dialysiert. Unlösliches Material wurde abzentrifugiert und der Überstand wurde lyophilisiert und in 1/100 des ursprünglichen Volumens der 1 M Essigsäure resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt.

2. Herstellung von VGF in CHO-Zellen

Natürliches VGF wurde auch durch Transfektion des Plasmids pRSV/VGF produziert, das das VGF-Genfragment in Chinese- Hamster-Ovarialzellen enthielt. Die transfektierten Zellen wurden expandiert und das Medium und das Zell- Pellet wurden auf die Anwesenheit vo VGF mittels Immun präzipitation unter Verwendung eines Antriserums gegen ein N-terminales VGF-Peptid untersucht.

3. Herstellung von VGF in Seidenraupen unter Verwendung eines Baculovirus-Promotors a) Transformation

Die Wirtszelle für AcNPV ist Spodoptera frugiperda (sf9). Um einen rekombinanten Virusvorrat zu erzeugen, wurde das VGF enthaltende Plasmid mit AcNPV DNA vermischt und sf9-Zellen unter Verwendung der Calciumphosphat-Technik transfektiert. Die rekombinanten Viren wurden aus dem Medium isoliert und an sf9-Zellen-Plaque gereinigt. Die rekombinanten Plaquen wurden durch Hybridisierung unter Verwendung von Radio-markiertem VGF DNA als Sonde identifiziert.

b) Expression

Sobald die rekombinanten Viren identifiziert waren, wurden sie an sf9-Zellen expandiert. Die rekombinanten Viren wurden dann dazu verwendet, sf-Zellen zu infizieren. Die Zellen wurden lysiert und die Überstände einem Screening auf Produktion des VGF-Proteins unterzogen, welches wie oben für Vaccinia-Virus infizierte Säugetierzellen beschrieben, gereinigt wurde.

Die vorausgesagte Sequenz des in den Insektenzellen produzierten VGF ist:

DSGNAIETTSPEITNATTDIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIR
CQHVVLMYQRSENPNTTTSYIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVYRFTRRTKLPIQDMVVP

Eine potentielle Glykosilierungsstelle liegt am Asparagin in Position 15 vom N-terminalen Ende des Polypeptids vor.

Diese 121-Restsequenz beginnt mit der N-terminalen Sequenz, die direkt für VGF bestimmt wurde, das aus VV-infizierten Affenzellen isoliert wurde (d. h. beim Rest 20 des offenen VGF-Leserahmens) und setzt sich bis zum letzten Rest des offenen Leserahmens fort. Es fehlt demnach das Signalpeptid (Reste 1 bis 19 des offenen Leserahmens), die transmembrane Sequenz ist aber umfaßt

(YIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVY).

Das vorausgesagte Molekulargewicht des Peptids mit 121 Resten ist 13,304 ohne Kohlehydratanteil. Das scheinbare Molekulargewicht des Baculovirus- erzeugten VGF beträgt 17 000, was signifikant geringer ist als das Molekulargewicht des aus VV-infizierten Zellen erhaltenen Produkts. Dies bedeutet, daß die beiden Formen wahrscheinlich in unterschiedlicher Weise prozessiert worden sind. Dem Baculovirus-erzeugten VGF kann ein weiterer Teil der N-terminalen Sequenz und/oder ein Teil der C-terminalen Sequenz fehlen und/oder es kann sich in der Art und im Ausmaß der Glykosilierung unterscheiden.

4. Herstellung von SFGF in Seidenraupen unter Verwendung des Baculovirus-Promotors A) Transfektion von Sf9-Zellen mit pAc/SFGF

Das Plasmid pAc/SFGF wurde mit AcNPV-Wildtyp- Baculovirus-DNA in Sf9-Insektenzellen (Spodoptera frugiperda) kotransfektiert. Die Transfektanten wurden mittels Plaque-Assays auf einen Okklusions-negativen Phenotyp einem Screening unterworfen. Eine Okklusions-negative Plaque wurde isoliert und nach 5maliger intensiver Plaque-Reinigung wurde ein hoher Titer rekombinanter Viren erhalten. Mittels Southern Analysis konnte gezeigt werden, daß die rekombinanten Viren das SFGF-Gen enthielten.

D. Natürliches EGF

Natürliches EGF wurde aus Mäusespeicherdrüsen isoliert und von Collaborative Research bezogen.

Beispiel XI Aktivitäts-Assay A. Mitogen-Assay

Die Mitogenese-Assays wurden folgendermaßen durchgeführt: Diploide Humanfibrolasten, die aus Explantaten der Vorhaut von Neugeborenen erhalten worden sind, wurden in einer Dichte von 3 × 10⁴-Zellen/Vertiefungen (Platten mit 96 Vertiefungen, Nunclon, Roskilde, Dänemark) eingesät und die zur Konfluenz in Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium (GIBCO)/10%igem Serum von neugeborenen Kälbern kultiviert. Die Kulturen wurden dann in ein Medium gegeben, das 0,2% Serum von neugeborenen Kälbern enthielt. 2 Tage später wurde das zu testende EGF (10 ng/ml) oder der zu testende Wachstumsfaktor (10 ng Äquivalent EGF/ml) zugegeben. Nach 8 h wurden die Kulturen mit 5-(¹²⁵I-)-Jodo-2′-deoxyuridin (Amersham, 10 lCi/ml, 5 Ci/mg; 1 Ci=37GBq) markiert und die in das TCA-unlösliche Material inkorporierte Isotopenmenge wurde wie beschrieben bestimmt (Twardzik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [1985] 182 : 5300 : 5304).

B. Assay mit Stimulierung des Koloniewachstums auf Softagar (Soft Agar Colony Growth Stimulation Assay)

Eine 0,5 ml Basisschicht eines 0,5%igen Agars (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in Wachstumsmedium wurde zu Costar-Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen gegeben. Die Agarbasisschicht wurde mit 0,5 ml eines 0,3%igen Agars in Wachstumsmedium, enthaltend 1 bis 1,5 × 10⁴-Zellen/ml NRK-Zellen oder einer anderen Zellinie und unterschiedliche Konzentrationen des zu bestimmenden Faktors überschichtet. Die Platten wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂ in der Luft inkubiert und nach 7 Tagen durch Zugabe von 0,5 ml des 0,3%igen Agars in Wachstumsmedium, der die gleichen Konzentrationen des zu bestimmenden Faktors enthielt, gefüttert. Die Kolonien wurden unfixiert und ungefärbt ausgezählt. Die Zahl der Kolonien mit mehr als 6 Zellen wurden gewertet.

C. Assay mit Inhibierung der EGF-Rezeptorbindung (EGF Receptor Binding Inhibition Assay)

Die Radiorezeptor-Assays wurden folgendermaßen durchgeführt: Das von Cohen und Carpenter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1975) 72 : 1317-1321 beschriebene Verfahren wurde zur Bindung von ¹²⁵I-markiertem EGF (¹²⁵I-EGF) an seinen Rezeptor an Monoschichten von A431-Zellen modifiziert. Die Zellen (1 × 10³ pro Well) wurden an 24-Well-Platten (Linbro, Flow Laboratories) mit Formalin in phosphatgepufferter Saline vor dem Assay fixiert. Die Formalin- fixierten Zellen haften besser an den Platten als unfixierte Zellen, so daß die Werte verläßlich sind. Unter diesen Assay-Bedingungen sättigt ¹²⁵I-EGF (1 × 10¹⁰ cpm/nmol) die Bindung bei 3 nM; die Assays wurden mit 10% des Sättigungswertes durchgeführt. Die Wachstumsfaktorkonzentrationen sind ausgedrückt als ng-Äquivalente EGF/ml, d. h. die Menge, die erforderlich ist, um eine Inhibierung der ¹²⁵I-EGF-Bindung hervorzurufen, die derjenigen äquivalent ist, die durch eine bekannte Menge EGF hervorgerufen wird.

D. Radioimmunoassay

Jeweils 50 µl Reaktionsmedium enthielten die folgenden Bestandteile: 20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4, 200 mM NaCl, 40 mM Dithiotreitol, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% NaN₃, ¹²⁵sI-markiertes Peptid (2 × 10⁴ cpm), entsprechend den 17 Carboxyl-terminalen Resten von α-TGF (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [1985] 82 : 356-369), Antiserum in einer endgültigen Verdünnung von 1 : 5000 und weitere Additive. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Antiserum gestartet und 90 Min. bei 23° fortgeführt. Anschließend wurde ein gleiches Volumen von 10% Formalin-fixiertem S. Aureus (Pansorbin, Calbiochem) zugegeben. Die Inkubation wurde für weitere 30 Min. bei 23°C fortgesetzt. Das Immunoadsorbens wurde durch Sedimentation entfernt und die Menge an gebundenem ¹²⁵I- markiertem Peptid wurde gemessen. Die Menge an gebundenem Peptid ist um die in Abwesenheit von Antikörpern (weniger als 5% der Gesamtmenge) gemessene nicht-spezifische Bindung korrigiert und ausgedrückt als prozentuale maximale Bindung.

E. Wundheilung 1. Mittelhautverbrennungen

Thermische Verletzungen der Mittelhaut wurden am dorsalen Thorax anästethisierter weiblicher Yorkshireschweine (13,5 kg; 30 lbs) erzeugt, deren Rücken rasiert und mit einer handelsüblichen Enthaarungscreme enthaart worden ist. Ein Messingkörper (3 × 3 cm, 147 g) wurde in einem Wasserbad von 70°C äquilibriert und genau 10 Sek. mit der Haut in Kontakt gebracht. Die entstandenen Blasen wurden dann entfernt. Es wurden 5 Mittelhautverbrennungen auf jeder Seite des Rückgrats angebracht, die voneinander etwa 2,5 cm getrennt waren. Die Verbrennungen wurden 2 × täglich mit etwa 3 ml einer Trägercreme (Silvadene®) alleine oder mit der Trägercreme, die den Wachstumsfaktor enthielt, behandelt oder sie blieben unbehandelt. Nach 9 oder 10 Tagen Behandlung mit natürlichem VGF, wurden die Schweine anesthetisiert und der Schorf wurde von den Brandwunden entfernt. Biopsien wurden von jeder Wunde aus den re-epithelialisierten Flächen vorgenommen.

2. Verletzungen durch Donor-Transplantate der Mittelhaut

Ein 5 Monate altes Schwein mit 20,5 kg wurde mit 20 mg/kg Ketamin und 2 mg/kg Rompum anästhetisiert. Der dorsale Thorax wurde rasiert, mit Betadin behandelt und sorgfältig mit Saline gespült. Sechs 5 × 5 cm Donortransplantate wurden auf jeder Seite des dorsalen Thorax mit einem Padgett-Dermatom bei 60/1000 Inch in zwei Streifen bei 30/1000 Inch entnommen. Die topsiche Behandlung erfolgte mit 1 ml Saline in 20 g Silvadene, die gleichmäßig auf die sechs Wunden auf der linken Seite verteilt wurden. Die rechte Seite wurde mit 1 ml des zu testenden Wachstumsfaktors in 20 g Silvadene, über alle sechs Wunden gleichmäßig verteilt behandelt. Alle Wunden wurden großflächig mit Brandbinden bedeckt und in üblicher Weise versorgt. Die Tiere wurden an den Tagen 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 und 11 nach der Operation wie oben beschrieben anästhetisiert. Der Verband wurde entfernt und die Wunden wurden leicht mit Betadin abgewischt und sorgfältig mit Saline gespült. Das betreffende Mittel wurde aufgetragen und die Wunden wurden wie oben beschrieben versorgt.

Beispiel XII Biologische Aktivität rekombinanter Wachstumsfaktoren, die in prokaryontischen Zellen hergestellt wurden A. EGF-Rezeptorbindung

Dieser Assay dient zur Bestimmung der Fähigkeit der Moleküle an den EGF-Rezeptor zu binden, wobei die Fähigkeit die Bindung des EGF an seinen Rezeptor zu inhibieren, gemessen wird. Alle bis jetzt isolierten Wachstumsfaktoren und chimären Wachstumsfaktoren, modifiziert oder verkürzt, waren um EGF-Rezeptorbindungs-Inhibierungsassay wirksam. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist nachfolgend dargestellt:

Tabelle

EGF-Rezeptorbindung von rekombinanten Wachstumsfaktoren

Ein Vergleich der Bindungsinhibierungskurven für natürliches Mäuse-EGF mit dem bakteriell exprimierten rekombinanten chimären Wachstumsfaktor N/TTV (Fusionspolypeptid der 32 N-terminalen Aminosäuren des λ-N-Gens und des modifizierten und verkürzten TGF/VGF-Hybrids) zeigt, daß keine Unterschiede in der Bindungsaktivität bestehen.

B. Mitogenaktivität

Die Aktivität mehrerer gereinigter Wachstumsfaktoren wurde getestet. Die in allen Fällen gemessene Aktivität war vergleichbar mit der Aktivität von EGF. Die getesteten Verbindungen sind nachfolgend zusammengestellt:

Tabelle

Mitogenaktivität von Wachstumsfaktoren

C. Wundheilung 1. Mittelhautverletzungen

Die Wirkung von natürlichem oder synthetischem TGF, EGF und VGF sowie die Wirkung von rekombinanten Wachstumsfaktoren auf Mittelhautverletzungen wurde wie im Beispiel VI E.1 beschrieben, bestimmt. Der Prozentsatz der ursprünglich verbrannten Fläche, der abgeheilt war, wurde durch computergestützte Telemetrie gemessen, wobei die prozentuale Re- Epithelialisierung der Wunde bestimmt wurde. Unbehandelte Wunden waren zu etwa 15% re-epithelialisiert. Die Behandlung mit Silvadene alleine oder mit Silvadene mit EGF führte zu einer etwa 50%igen Reepithelialisierung. Die Behandlung mit synthetischem TGF oder natürlichem VGF ergab eine Reepithelialisierung von etwa 90%. Die optimale Konzentration zur Förderung der Reepithelialisierung war bei EGF 1 bis 10µg/ml; synthetisches TGF und natürliches VGF verursachten ein maximales Ansprechen bei 0,1 µg/ml.

Ähnliche Experimente wie die oben beschriebenen wurden vorgenommen, um den Effekt auf die Wundheilung von TGF, einer modifizierten, verkürzten Form von VGF (VGFa) oder einer modifizierten, verkürzten, chimären Fusion von TGF und VGF (TTV), die alle durch rekombinante Methoden in Bakterien erzeugt wurde, zu bestimmen. Die rekombinanten Wachstumsfaktoren und Hybridwachstumsfaktoren beschleunigten die Wundheilung im gleichen Ausmaß wie synthetisches TGF oder natürliches VGF, wobei die optimale Konzentration bei 0,1 µg/ml lag.

2. Verletzungen durch Donor-Transplantate der Mittelhaut

Die Fähigkeit von modifiziertem verkürztem VGFa die Wundheilung nach Entnahme von Donor-Transplantaten zu beschleunigen, wurde bestimmt. Der Behandlungsplan war wie oben beschrieben (siehe Beispiel XI) unter Verwendung von 1 ml VGFa, 5 µg/ml in 20 g Silvadene. Von den Wunden wurden täglich Fotographien angefertigt. Die Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt:

Tabelle

Effekt von rekombinantem VGFa auf die Wundheilung

Das modifizierte VGFa beschleunigte die Wundheilung im Vergleich zur Kontrolle. Fotografien aim Tag 8 nach der Operation zeigten wesentliche Unterschiede nach Behandlung mit Saline und VGFa.

Beispiel XIII Biologische Aktivität von VGF, das in eukaryontischen Zellen hergestellt worden ist A. VGF, hergestellt in Affennieren (BSC-1)-Zellen

1. Das aus BSC-1-Zellen 24 h nach der Infektion mit VV erhaltene Medium wurde auf die Anwesenheit von Material getestet, das mit ¹²⁵I-EGF um die Bindung an EGF-Rezeptor-reiche Human-Epidermoid-Karzinomzellen (A431) konkurrieren kann. Die VV-infizierten Zellen setzten eine Aktivität frei, die mit EGF konkurriert und als VGF bezeichnet wird. Das Kontrollmedium von mock-infizierten BSC-1-Kontrollkulturen enthielt eine minimale Aktivität, die mit EGF konkurriert.

Beim Verfolgen der VGF-Produktion wurden zum frühesten Untersuchungszeitpunkt (2 h nach Infektion) höhere VGF-Spiegel im Kulturmedium beobachtet. Nach 12 h wurde ein Maximum an Aktivität im Kulturüberstand gefunden. Eine nur leichte Erhöhung war nach 24 h zu beobachten.

Die VGF-Produktion hat sich als Funktion der Multiplizität der Virusinfektion erwiesen, wie in der nachfolgenden Tabelle gezeigt wird.

Tabelle

Effekt der Multiplizität der Infektion auf die VGF-Freisetzung

2. Teilweise Reinigung von VGF

Die mit EGF konkurrierende und in VV-infizierten BSC-1- Zellen gefundene Aktivität wurde teilweise aus Säure- extrahierten Kulturüberständen 24 h nach der Infektion wie oben beschrieben gereinigt. Säuresolubilisierte Polypeptide (10,5 mg) aus den Überständen wurden auf eine mit 1 M Essigsäure äquilibrierte Biogel-P10-Säule gegeben. Proben jeder Fraktion wurden auf Aktivität, die mit EGF konkurrierte, getestet. Die wirksamste Fraktion (Fraktion 42) eluierte kurz nach dem M_r 29 000-Carbon säureanhydrase-Marker mit einem scheinbaren M_r von 25 000.

Das Molekulargewicht wurde unter Verwendung von vernetzten Bio-Sil-TSK-250-HPLC-Sizingsäulen bestätigt, wobei die gesamte Aktivität als Hauptpeak in der Region des M_r 25 000-Proteinmarkers eluierte. 1 µg teilweise gereinigtes VGF war äquivalent zu 90 ng EGF im Radio- Rezeptor-Kompetitionsassay.

3. Weitere Reinigung von VGF

Vereinigte Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule (25-35) wurden durch Vakuumzentrifugen konzentriert, in 0,05% Trifluoressigsäure (TFA) resuspendiert, geklärt und in eine 3,9 mm × 30 cm µBondapak C₁₈-Säule (Waters, Milford, MA) injiziert. Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten aus 20 bis 60% Acetonitril in 0,05% TFA bei einer Fließrate von 1,0 ml/Min. bei 22°C eluiert. Aliquote Teile jeder Fraktion wurden in einem Radiorezeptor-Assay auf EGF-kompetitive Aktivität untersucht. Das der höchsten Aktivität entsprechende Peptid wurde isoliert, mit 0,05% TFA verdünnt, in eine µBondapak-Säule injiziert und unter Anwendung isokratischer Bedingungen eluiert. Die Acetonitril- Konzentration war etwa 22 bis 25%.

Ein Vergleich der VGF-Spiegel, die durch BSC-1-Zellen produziert wurden, welche mit 15 pfu VV pro Zelle infiziert waren, mit denjenigen von α-TGF, produziert durch Retrovirus-transformierte Zellen ist in der nachfolgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle

Vergleich der biologischen Aktivität von VGF mit α-TGF und EGF

B. VGF, hergestellt in CHO-Zellen

Die biologische Aktivität von in CHO-Zellen hergestelltem VGF wurde unter Verwendung des EGF-Rezeptor-Bindungsassays untersucht. Das Kulturwachstumsmedium wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Der Wachstumsfaktor bindet an den EGF-Rezeptor.

C. VGF, hergestellt in Seidenraupen

Die biologische Aktivität von teilweise gereinigtem (etwa 50%) VGF, hergestellt in Seidenraupen unter Anwendung des EGF-Rezeptor-Bindungsassays bestimmt. Es erfolgte eine Bindung an den EGF-Rezeptor.

Tabelle

Prozentuale Epithelialisierung von Wunden nach Behandlung mit Wachstumsfaktor

Schwein 1 (9 Tage nach der Verbrennung)

Schwein 2 (10 Tage nach der Verbrennung)

Schwein 3 (9 Tage nach der Behandlung)

D. Immunologischer Vergleich von VGF und TGF

In dem oben beschriebenen Radioimmunoassay wurde ein 50%iger Ersatz des Antigens aus Antikörpern gegen das Molekül mit 17 Carboxyl-terminalen Aminosäuren des Ratten- TGF-α bei einer Antigenkonzentration von etwa 0,2 bis 0,3 ng Äquivalenten-EGF (Konkurrenz von ¹²⁵I-markiertem α-TGF mit α-TGF) beobachtet. Wenn VGF bei äquivalenten Konzentrationen getestet wurde, war keine Kompetition zu beobachten. In einem kompetitiven Radioimmunoassay auf natives EGF, zeigten VGF-Präparationen selbst bei 50 ng EGF-Äquivalenten/ml einen minimalen Ersatz (<10%) von ¹²⁵I-EGF aus einem polyklonalen Antikörper gegen natives EGF.

Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß VGF ein potentes Epithelialisierungsmittel ist, das mit anderen Wachstumsfaktoren vergleichbar ist, die vorher getestet wurden und die Mitogenaktivität besitzen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide kann man in verschiedenen Wirten zur Induktion einer Immunogenantwort, zur Erhöhung der Zell- Proliferation, zur Wundheilung und dergleichen verwenden. Bei Wunden wird Epithelialisierung und Vaskularisierung sowie eine rasche Wiederherstellung der Wundfestigkeit, d. h. Beständigkeit gegenüber Ablösung und Einreißen, beobachtet. Die hier in Rede stehenden Wirte umfassen Säugetiere, wie Nagetiere, Haustiere, Primaten und Menschen.

Erfindungsgemäß werden neue Peptide und Zusammensetzungen zur Verfügung gestellt, die ein breites Anwendungsgebiet finden, beispielsweise in der Diagnose, in vitro und in vivo-Effekte auf Zellen ausüben, als Mitogene wirken, als Additive in Nährmedien brauchbar sind, als Agonisten und Antagonisten gegen EGF und TGF brauchbar sind, als Immunogene und Therapeutika wirken, die Wundheilung fördern und dergleichen. Weiter werden kleine Oligopeptide mit Bindungsaktivität zur Verfügung gestellt, die für sich genommen oder in Kombination mit anderen Polypeptiden verwendet werden können, mit anderen Polypeptiden zur Variation der Eigenschaft der anderen Polypeptide fusioniert werden können, was zu einer Bindung der Polypeptide an Zellen mit Wachstumsfaktor-Rezeptoren führt. Auf diese Weise kann man reversibel verschiedene Polypeptide an Zellen mit Wachstumsfaktor-Rezeptoren binden, wobei die Eigenschaften der Zellen in vorbestimmter Weise beeinflußt werden.

Auf die Offenbarung aller Publikationen und Patentanmeldungen, die in der vorliegenden Anmeldung erwähnt werden, wird hiermit Bezug genommen.

Claims

1. DNA-Sequenzen, die für Polypeptide kodieren, die

(1) in der Lage sind, an einen EGF-Rezeptor zu binden,
(2) im wesentlichen die gleiche Schleifenstruktur besitzen, wie in natürlich vorkommender Wachstumsfaktor, der in der Lage ist, an einen EGF-Rezeptor ("natürlicher Ligand") zu binden und
(3) zu wenigstens 30% homolog sind mit einem natürlichen Liganden, wobei das Polypeptid drei Domänen umfaßt, die jeweils eine Aminosäure darstellen, die wenigstens zu etwa 30% mit den Fragmenten der gleichen oder verschiedenen natürlichen Liganden homolog sind und die die gleiche relative Position wie die Fragmente der natürlichen Liganden einnehmen, wobei es sich bei den erwähnten Domänen um folgende handelt:
eine erste Domäne von wenigstens etwa 11 N-terminalen Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa^-6 bis aa¹ und endend bei etwa Aminosäure aa¹¹ bis aa¹⁵;
eine zweite Domäne mit wenigstens etwa 11 Zentralfragment- Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa¹¹ bis aa¹⁵ und endend etwa bei Aminsäure aa²⁵ bis aa²⁹;
eine dritte Domäne von wenigstens etwa 14 C-terminalen Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa²⁵ bis aa²⁹ und endend etwa bei Aminosäure aa⁴⁰ bis aa⁴³; und
wobei die DNA-Sequenz gegebenenfalls zusätzlich für eine vierte Domäne von wenigstens etwa 6 extremen N-terminalen Aminosäuren kodiert, beginnend etwa bei Aminosäure aa^-7 bis aa^-1 und endend etwa bei Aminosäure aa^-45 bis aa^-7, wobei gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz, die selektiv gespalten werden kann, am Carboxy-Terminus der vierten Domäne insertiert und mit dem Aminoterminus der ersten Domäne verbunden ist, unter der Voraussetzung, daß, wenn das Polypeptid eine mit dem natürlichen Liganden identische Aminosäuresequenz besitzt, die für die vierte Domäne kodierende DNA-Sequenz vorhanden ist und für andere Aminosäuren kodiert als für die extremen N-terminalen Aminosäuren des natürlichen Liganden.

2. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der natürliche Ligand VGF, TGF-α, MGF, EGF, SFGF oder Amphiregulin ist.

3. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz zusätzlich für eine Leadersequenz kodiert, wobei gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz, die selektiv gespalten werden kann, am Carboxy-Terminus der Leadersequenz insertiert und mit dem Aminoterminus der ersten Domäne, oder wenn die vierte Domäne vorhanden ist, mit dem Aminoterminus der vierten Domäne verbunden ist.

3. DNA-Sequenzen nach Anpruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Leadersequenz ein N-terminales Fragment eines λ-N-Proteins, λ-cro-Proteins oder des Amphiregulins ist.

5. DNA-Sequenzen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Leadersequenz eine Signalsequenz oder ein Mutant davon ist.

6. DNA-Sequenzen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalsequenz eine alkalische Phosphatase-Signalsequenz, eine Affen-TGF-β-Signalsequenz oder eine K. Lactis-Killertoxin-Signalsequenz ist.

7. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Domänen zu wenigstens etwa 30% homolog mit einem Fragment von VGF, TGF-α, EGF oder SFGF ist.

8. DNA-Sequenzen nach eineem der Ansprüche 1, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für VGF kodiert.

9. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für TGF kodiert.

10. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für EGF kodiert.

11. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für SFGF kodiert.

12. DNA-Sequenzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz wenigstens eine Änderung in der für einen natürlichen Liganden kodierenden Sequenz umfaßt, derart, daß die Aminosäuresequenzen HGD in HGT; GMYC in GYAC; RCS in VCS; CLHGDC in CLHGTC und GMYCRC in GYACVC geändert sind.

13. DNA-Sequenzen, kodierend für ein Polypeptid und eine Leadersequenz von etwa 8 bis 45 N-terminalen Aminosäuren von einem Bakteriophagen-λ-N-Protein oder cro-Protein, Amphiregulin, T4-Gen 32 oder einer bakteriellen alkalischen Phosphatase-Signalsequenz, einschließlich der Modifikationen davon, welche mit dem Amino-Terminus des Polypeptids, gegebenenfalls über eine selektiv spaltbare Aminosäuresequenz, verbunden ist, wobei das Polypeptid drei Domänen umfaßt und die Sequenz jeder Domäne wenigstens im wesentlichen der Sequenz eines Fragments eines natürlich vorkommenden Wachstumsfaktors, der in der Lage ist, an einen EGF-Rezeptor zu binden ("natürlicher Ligand"), entspricht und die gleiche relative Position wie die Fragmente des natürlichen Liganden aufweist, wobei es sich um folgende Domänen handelt:
eine erste Domäne mit wenigstens etwa 11 N-terminalen Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa^-6 bis aa¹ und endend etwa bei Aminsosäure aa¹¹ bis aa¹⁵;
eine zweite Domäne mit wenigstens etwa 11 Zentralfragment- Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa¹¹ bis aa¹⁵ und endend etwa bei etwa Aminosäure aa²⁵ bis aa²⁹;
eine dritte Domäne mit wenigstens etwa 14 Amino- C-terminalen Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa²⁵ bis aa²⁹ und endend etwa bei Aminosäure aa⁴⁰ bis aa⁴⁷.

14. DNA-Sequenzen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Leadersequenz etwa 32 oder 33 N-terminale Aminosäuren des N-Gens umfaßt.

15. DNA-Sequenzen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid TGF-α, VGF, VGFA, VGFa oder EGF ist.

16. DNA-Sequenzen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Leadersequenz eine alkalische Phosphatase-Signalsequenz oder eine modifizierte alkalische Phosphatase-Signalsequenz ist.

17. DNA-Sequenzen nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid VGFa, nVGFa oder EGF ist.

18. DNA-Sequenzen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid folgende Aminosäuresequenz besitzt:
MVVSHFNDCPDSHTQFCFHG
TCRFLVQEEKPACVCSHGYT
GIRCQHVVLVDYQR.

19. DNA-Sequenzen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid folgende Aminosäuresequenz besitzt:
MDIPAIRLCGPEGDGYCLHG
TCRFLVQEEKPACVCSHGYT
GIRCQHVVLVDYQR.

20. DNA-Sequenzen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
MVVSHFNDCFDSHTQFCFHGT
CIHARDIDGYACVCSHGYTGI
RCQHVVLVDYQR.

21. DNA-Sequenzen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Leadersequenz etwa 21 N-terminale Aminosäuren des Cro-Proteins umfaßt.

22. DNA-Sequenzen nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz besitzt:
MVVSHFNDCFDSHTQFCFHG
TCRFLVQEEKPACVCSHGYT
GIRCQHVVLVDYQR.

23. DNA-Sequenzen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Leadersequenz etwa 8 Amino-N- terminale Aminosäuren des T4-Gens 32 umfaßt.

24. DNA-Sequenzen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid folgende Aminosäuresequenz besitzt:
VVSHFNDCPDSHTQFCFHGT
CRFLVQEEKPACVCSHGYTG
IRCQHVVLVDYQR.

25. Expressionskassette, umfassend in Transkriptionsrichtung eine in einer Gastzelle funktionelle, Transkriptions- und Translations-Initiierungs-Regulatorregion; eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 24 und eine in der Gastzelle funktionelle, Transkriptions- und Translations-Terminations-Regulatorregion.

26. Gastzelle, enthaltend eine Expressionskassette nach Anspruch 25.

27. Plasmide, enthaltend die funktionellen Domänen von
pBM11/NDP/EGF, pBM11/PAD/EGF; pBM11/PAK/EGF;
pBM11/N/TGF; pBM11/NDP/VGFA; pBM11/NDP/VGFa;
pBM11/PAD/nVGFa; pBM11/PAK/nVGFa; pRSV/VGF; pAc/SFGF;
pAc/VGF; ptac/TTV; TacPak/EGF; pTCPt/EGF; pTCPt/nVGFa;
pBM11/N/TTV, pBM11/NDP/TTV; pBM11/NDP/VTV;
pBM16/NDP/TVV.

28. Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(1) in der Lage sind, an einen EGF-Rezeptor zu binden,
(2) im wesentlichen die gleiche Schleifenstruktur besitzen, wie ein natürlich vorkommender Wachstumsfaktor, der in der Lage ist, an einen EGF-Rezeptor ("natürlicher Ligand") zu binden und
(3) zu wenigstens 30% homolog sind mit einem natürlichen Liganden, wobei das Polypeptid drei Domänen umfaßt, die jeweils eine Aminosäure darstellen, die wenigstens zu etwa 30% mit den Fragmenten der gleichen oder verschiedenen natürlichen Liganden homolog sind und die die gleiche relative Position wie die Fragmente der natürlichen Liganden einnehmen, wobei es sich bei den erwähnten Domänen um folgende handelt:
eine erste Domäne von wenigstens etwa 11 N-terminalen Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa^-6 bis aa¹ und enden etwa bei Aminosäure aa¹¹ bis aa¹⁵;
eine zweite Domäne mit wenigstens etwa 11 Zentralfragment- Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa¹¹ bis aa¹⁵ und endend etwa bei Aminosäure aa²⁵ bis aa²⁹;
eine dritte Domäne von wenigstens etwa 14 C-terminalen Aminosäuren, beginnend etwa bei Aminosäure aa²⁵ bis aa²⁹ und endend etwa bei Aminosäure aa⁴⁰ bis aa⁴³; und
wobei die DNA-Sequenz gegebenenfalls zusätzlich für eine vierte Domäne von wenigstens etwa 6 extremen N-terminalen Aminosäuren kodiert, beginnend etwa bei Aminosäure aa^-7 bis aa^-1 und enden etwa bei Aminosäure aa^-45 bis aa^-7, wobei gegebenenfalls eine Aminosäuresequenz, die selektiv gespalten werden kann, am Carboxy-Terminus der vierten Domäne insertiert und mit dem Aminoterminus der ersten Domäne verbunden ist, unter der Voraussetzung, daß, wenn das Polypeptid eine mit dem natürlichen Liganden identische Aminosäuresequenz besitzt, die für die vierte Domäne kodierende DNA-Sequenz vorhanden ist und für andere Aminosäuren kodiert als für die extremen N-terminalen Aminosäuren des natürlichen Liganden.

29. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Gastzelle, die die Expressionskassette nach Anspruch 25 enthält, in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert, wobei das Polypeptid exprimiert wird, und das Polypeptid isoliert.

30. Polypeptide mit folgender Aminosäuresequenz oder Fragmente davon mit wenigstens 37 Aminosäuren, die wenigstens etwa die Aminosäuren 1 bis 37 umfassen: worin
X¹ eine Bindung oder eine Aminosäure bedeutet;
X² eine Bindung oder 1 bis 2 Aminosäuren bedeutet;
X³ eine Bindung oder 1 bis 4 Aminosäuren bedeutet;
wobei X¹, X² und X³ gleich oder verschieden sein können.

31. Polypeptide nach Anspruch 30, wobei wenigstens eine der nachstehenden Aminosäuren die angegebene Bedeutung besitzt:
aa¹⁴ steht für Threonin; aa²⁴ steht für Tyrosin; aa²⁵ steht für Analin und aa²⁷ steht für Valin.

32. Polypeptide nach Anspruch 30, wobei die Aminosäuresequenz aa^-6 bis aa⁴⁷ umfaßt.

33. Polypeptide nach Anspruch 32, wobei aa¹⁴ für Threonin, aa²⁴ für Tyrosin und aa²⁵ für Analin steht.

34. Polypeptide nach Anspruch 33, wobei die Aminosäuren aa^-6 bis aa¹³ der Aminosäuresequenz durch die folgende Aminosäuresequenz ersetzt sind:

35. Polypeptid nach Anspruch 33, wobei die Aminosäuren aa¹⁴ bis aa²⁷ der Aminosäuresequenz durch die folgende Aminosäuresequenz ersetzt sind:

36. Polypeptide nach Anspruch 35, wobei aa²² durch Glutaminsäure ersetzt ist.

37. DNA-Sequenzen, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 30 bis 36 kodieren.

38. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend wenigstens ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 28 oder 30 bis 36, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Trägern und/oder Zusatzstoffen.

39. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 28 oder 30 bis 36 in Nährmedien und bei Diagnoseassays.