DE68929387T2

DE68929387T2 - Interleukin-1-Inhibitoren

Info

Publication number: DE68929387T2
Application number: DE68929387T
Authority: DE
Inventors: William P. Arend; Stephan P. Eisenberg; Charles H. Hannum; Fenneke G. Joslin; Andreas Sommer; Robert C. Thompson
Original assignee: Amgen Inc; University of Colorado Foundation Inc
Current assignee: Amgen Inc; University of Colorado
Priority date: 1988-05-27
Filing date: 1989-05-26
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2009-05-27
Also published as: EP1133995A3; GR900300115T1; ATE88502T1; EP0541920B1; NZ229326A; CA1341322C; KR900700618A; DE68929387D1; ES2018750T3; DE343684T1; SG59969A1; IE891781L; IE950317L; NL300091I1; IE66712B1; EP1133995A2; KR0148009B1; HK1039901A1; LU90943I2; ES2176181T3

Description

Hintergrund der Erfindung

A. IL-1

Interleukine-1 sind eine von einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich von Monozyten und einigen Makrophagen, erzeugte Klasse von Proteinen. Diese Klasse umfasst mindestens zwei Proteine von 17 bis 18 Kilodalton, die als Interleukin-1 alpha und Interleukin-1 beta bekannt sind. Diese Proteine haben bedeutende physiologische Wirkungen auf eine Anzahl von unterschiedlichen Zielzellen, die in die Antwort auf Entzündungen und die Immunantwort involviert sind. Diese Proteine sind Co-Mitogene (mit Phytohämagglutinin) für T-Zellen, veranlassen sowohl Fibroblasten als auch Chondrozyten, latent Kollagenase auszuscheiden, und erhöhen die adhäsiven Oberflächenkräfte von Endothelzellen für Neutrophile. Zusätzlich wirken sie auf den Hypothalamus als Pyrogene, sie stimulieren den Katabolismus von Muskelprotein und sie veranlassen Hepatozyten, eine als "acute phase reactants" (Akutphasenreaktanten) bekannte Klasse von Proteinen zu synthetisieren. Die Interleukine-1 (IL-1) sind offensichtlich ein bedeutender Teil der Antwort eines Organismus auf Infektion und Verletzung.

B. Pathologische Rolle von IL-1

Es sind jedoch trotz ihrer normalerweise vorteilhaften Wirkungen Umstände ans Licht gekommen, unter denen die Wirkungen von IL-1 schädlich sind. Beispielsweise kann IL-1 den Kollagenasespiegel in einem arthritischen Gelenk erhöhen und es wurde vorgeschlagen, dass es als Mediator an sowohl den akuten als auch den chronischen immunpathologischen Stadien der rheumatoiden Arthritis beteiligt ist. IL-1 kann für die Veränderung der Endothelzellfunktion verantwortlich sein, indem es die Chemotaxis und die Migration von Leukozyten und Lymphozyten in das Synovialgewebe steuert, die kapilläre Proliferation induziert und die Makrophagenakkumulation in der Synovialauskleidung während der akuten Phase der Erkrankung stimuliert. Es wurde vorgeschlagen, dass IL-1 in der Phase der Gewebezerstörung als Mediator bei der Induktion der Gewebeschädigung durch Stimulation der Freisetzung von Enzymen aus Fibroblasten und Chondrozyten beteiligt ist.
Zusätzlich ist eine überschüssige IL-1-Produktion in der Haut von Patienten mit Psoriasis gezeigt worden, und hohe Spiegel von IL-1 können in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit psoriatischer Arthritis gefunden werden. Das von Zellen in dem entzündeten Synovium bei psoriatischer Arthritis freigesetzte IL-1 kann die Gewebezerstörung durch Stimulierung der Enzymfreisetzung aus anderen Zellen vermitteln. Die Pathologie des Gelenkes bei Reiters Syndrom ist ähnlich der, die bei psoriatischer Arthritis und rheumatoider Arthritis beobachtet wird. Es wurde vorgeschlagen, dass IL-1 als Mediator der Gewebezerstörung in diese drei verschiedenen Formen der entzündlichen Arthritis beteiligt ist. Darüber hinaus kann IL-1 in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthritis gefunden werden. Es wurde vorgeschlagen, dass die Freisetzung von IL-1 durch Chondrozyten mit der Zerstörung von Gelenkknorpel bei dieser Erkrankung in Verbindung steht.
IL-1 kann außerdem die Schwere von Autoimmunerkrankungen erhöhen. Beispielsweise ist eine verringerte IL-1-Produktion für periphere Blutzellen von Personen, die an systemischen Lupus Erythematosus leiden, beschrieben worden. Außerdem können einige der Veränderungen der B-Lymphozytenfunktion mit Abnormalitäten der IL-1- Produktion oder IL-1-Verfügbarkeit in Zusammenhang stehen.
In den peripheren Monozyten von Patienten mit Sklerodermie ist eine übermäßige IL-1- Produktion gezeigt worden, und es wurde vorgeschlagen, dass IL-1 als mögliches Fibrose-verursachendes Agens durch Stimulation der Kollagenproduktion von Fibroblasten beteiligt ist. Der Mechanismus der Gewebeschädigung bei Dermatomyositis könnte auch eine Zell-vermittelte Immunität einbeziehen, und IL-1 kann daher als Mediator an diesem pathophysiologischen Prozess beteiligt sein.
Akute und chronische interstitielle Lungenerkrankungen sind durch eine übermäßige Kollagenproduktion der Lungenfibroblasten gekennzeichnet, die durch IL-1 stimuliert sein kann. Neuere Untersuchungen der pulmonalen Hypertonie in einem Tiermodell weisen darauf hin, dass IL-1 für die Induktion von Veränderungen der Endothelzellen verantwortlich sein kann, die zu einer Verengung der Pulmonalarterien führen. Es ist diese Verengung, die zu pulmonaler Hypertonie und weiteren sekundären Schäden führt. IL-1-Inhibitoren könnten daher für die Behandlung dieser Lungenerkrankungen nützlich sein.
Jüngere Untersuchungen haben beschrieben, dass IL-1 die Betazellen in den Langerhans'schen Inseln, die für die Produktion von Insulin verantwortlich sind, direkt schädigen können. Es ist nun die Hypothese aufgestellt worden, dass die Schädigung dieser Zellen durch IL-1 das primäre Ereignis in der akuten Phase von juvenilem Diabetes mellitus sein kann.
Die Infiltration von Monozyten und Makrophagen in die Nieren herrscht bei vielen Formen akuter und chronischer Glomerulonephritis vor. Die IL-1-Freisetzung durch diese Zellen kann zu einer lokalen Anhäufung von anderen entzündlichen Zellen führen, was schließlich zu einem entzündlichen Schaden und fibrotischen Reaktionen in den Nieren führt.
Es ist gezeigt worden, dass die Kristalle, die in den Geweben oder Flüssigkeiten bei Gicht oder Pseudogicht gefunden wurden, die Makrophagen direkt stimulieren können, IL-1 freizusetzen. IL-1 kann daher ein wichtiger Mediator in dem entzündlichen Zyklus bei diesen Erkrankungen sein.
IL-1 kann den Verlust von Calcium aus Knochen induzieren und kann für die bei entzündlichen Gelenkserkrankungen beobachtete Osteoporose verantwortlich sein.
Die Keratinozyten aus Patienten mit Psoriasis setzen große Mengen von IL-1 frei. Dieser Mediator kann für die sekundäre Zellproliferation und -akkumulation verantwortlich sein, die in der Haut von Patienten mit dieser Erkrankung auftritt.
IL-1 ist eines der bedeutenden endogenen Pyrogene und kann für die Induktion von hohem Fieber bei einigen Infektionserkrankungen, beispielsweise akuten, auf Bakterien oder Viren zurückzuführenden fiebrigen Erkrankungen, verantwortlich sein.
Die Sarcoidose ist durch granulomatöse Läsionen in vielen verschiedenen Organen im Körper charakterisiert. Von IL-1 ist gezeigt worden, dass es die Granulombildung in vitro induzieren kann und bei Patienten mit Sarcoidose an diesem Prozess beteiligt sein kann.
Eine übermäßige IL-1-Produktion ist in peripheren Monozyten sowohl bei Morbus Crohn als auch ulcerativer Colitis gezeigt worden. Die lokale IL-1-Freisetzung im Darm kann ein bedeutender Mediator zur Stimulation des entzündlichen Zyklus bei diesen Erkrankungen sein.
Bestimmte Lymphome sind durch Fieber, Osteoporose und sogar sekundäre Arthritis gekennzeichnet. In vitro ist eine übermäßige IL-1-Freisetzung durch einige Lymphomzellen gezeigt worden, und diese kann für einige der klinischen Manifestationen dieser malignen Erkrankungen verantwortlich sein. Weiter kann die IL-1-Produktion einiger maligner Lymphozyten für das bei Leukämien beobachtete Fieber, die Akutphasenantwort und die Kachexie verantwortlich sein.
Es wird angenommen, dass die IL-1-Freisetzung durch Astrozyten im Gehirn für die Induktion der Fibrose verantwortlich ist, die einer Schädigung des Gehirns durch Gefäßverschlüsse folgen kann.

C. Verwendungen für einen IL-1-Inhibitor

Unter diesen und auch unter anderen Umständen, unter denen IL-1 eine schädliche Wirkung hat, gibt es offensichtlich eine klinische Verwendung für einen Inhibitor der IL-1-Wirkung. Da IL-1 ein Co-Mitogen für T-Zellen ist, ist es von zentraler Bedeutung für die Entwicklung von Autoimmun- und anderen Immunerkrankungen. IL-1-Inhibitoren könnten daher bei systemischer Verabreichung nützliche immunsuppressive Mittel sein. Lokal appliziert, könnten IL-1-Inhibitoren dazu dienen, der Gewebezerstörung in einem entzündeten Gelenk oder in anderen Entzündungsherden vorzubeugen. Tatsächlich könnten einige IL-1-Inhibitoren sogar wirksamer bei der Vorbeugung gegen Gewebezerstörung sein, wenn sie in Verbindung mit Kollagenaseinhibitoren verabreicht werden.
Eine therapeutische Intervention gegen die Wirkung von IL-1 könnte auf der Ebene der Synthese, der Ausscheidung oder der Bindung an die Zielzelle oder bei deren Antwort auf das Protein möglich sein. IL-1 wird durch Monozyten/Makrophagen und andere Zellen als Antwort auf Lipopolysaccharide, Komplementfragmente und Viren synthetisiert. Jedes Molekül, das die Bindung dieser induzierenden Mittel an Erzeugerzellen blockiert, oder deren Wirkungen die Physiologie dieser Zellen beeinträchtigen, würde als Regulator der IL-1-Wirkung dienen. IL-1 wird nicht von einem traditionellen Ausscheidungssystem ausgeschieden, da mRNAs isoliert worden sind, die für mindestens zwei 30 kD-Vorläufer des Proteins kodieren, die aber keine hydrophobe Signalsequenz enthalten. Die Freisetzung des aktiven Proteins aus dem inaktiven Vorläufer erfordert wahrscheinlich die Proteolyse des Vorläufers. Ein Inhibitor der Freisetzung von lL-1 oder mehreren IL-1 aus ihren Vorläufern könnte theoretisch die IL-1-Wirkung regulieren. IL-1 wirkt wahrscheinlich über einen klassischen Rezeptor-vermittelten Weg auf die Zielzellen, obwohl dieser Rezeptor bis jetzt nicht isoliert worden ist. Es könnte daher sein, dass ein Molekül, das die IL-1-Bindung an seine Rezeptoren stört, oder diese Rezeptoren herunterreguliert, ebenfalls die IL-1-Wirkung regulieren könnte. Obwohl die intrazellulären Ereignisse, die der Rezeptorbindung von IL-1 folgen, bis jetzt nicht vollständig geklärt sind, ist es auch möglich, dass Mittel existieren, die die zellulären Antworten auf andere Rezeptor-vermittelten Ereignisse stören und daher die IL-1-Wirkung blockieren. Aus den oben genannten Gründen wurden Proteine und kleine Moleküle gesucht, die in der Lage sind, IL-1 auf eine oder mehrere dieser Weisen zu inhibieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise mindestens zwei IL-1-Inhibitorproteine mit IL-1-inhibierenden Eigenschaften gefunden. Diese in gereinigter Form erhaltenen Moleküle werden dem Fachmann ermöglichen, ihre Aminosäuresequenz zu bestimmen. Weiterhin wurden eine Präparation von Zellen, die diese Proteine erzeugen, und eine mRNA, die zu ihrer Synthese führt, charakterisiert. Schließlich ist ein Antiserum entwickelt worden, das das Durchmustern von cDNA-Expressionsbanken auf Gene, die für diese Inhibitoren kodieren, erleichtern wird. Zusammen werden diese Reagenzien es gestatten, die für die IL-1-Inhibitoren kodierenden cDNAs zu klonieren. Diese Gene werden es wiederum möglich machen, IL-1-Inhibitoren in großem Maßstab zu produzieren, die für die Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen, die bei der Behandlung von IL-1-vermittelten pathophysiologischen Zuständen verwendet werden, geeignet sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf IL-1-Inhibitoren ("IL-1i") im allgemeinen und insbesondere auf einen von Monozyten abgeleiteten IL-1-Inhibitor. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf biologisch aktive Analoga dieser Inhibitoren.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, gereinigte Formen von IL-1-Inhibitoren zur Verfügung zu stellen, die gegen 1L-1α oder IL-1β oder eine Kombination davon aktiv sind. Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diese Inhibitoren in gereinigten Formen zur Verfügung zu stellen, um die Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz zu ermöglichen. Eine weitere Aufgabe ist es, die Aminosäuresequenzen von bestimmten IL-1-Inhibitoren zur Verfügung zu stellen. Weiterhin ist die Identifizierung biologisch aktiver Analoga solcher IL-1-Inhibitoren mit verbesserten oder äquivalenten Eigenschaften ebenfalls eine Aufgabe der Erfindung.
Diese Aufgabe wird durch ein rekombinantes Polypeptid mit Interleukin-1-Inhibitor(IL-1i)- Aktivität gemäß Anspruch 1 gelöst, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:
(A) einer Aminosäuresequenz, die von einem Fragment der kodierenden Region einer DNA-Sequenz (A) kodiert wird, die einen IL-1i oder einen IL-1i mit einer N-terminalen Ausscheidungsleitsequenz (Signalsequenz) wie im Folgenden angegeben kodiert:
wobei S in der DNA-Sequenz C oder G ist, und wobei (X) R oder P ist;
(B) einem Fragment der nachstehenden Aminosäuresequenz:
(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N
N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A
L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V
N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F
E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E
G V M V T K F Y F Q E D E
in der (U) nicht vorhanden oder M ist, oder eine N-terminale Ausscheidungsleitsequenz (Signalsequenz) umfasst, die in der Lage ist, das Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität in prozessierter Form aus der Zelle auszuschleusen, und in der (X) R oder P ist; oder
(C) einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 70% homolog zu der Aminosäuresequenz des nativen IL-1-Inhibitors mit der nachstehenden Aminosäuresequenz ist:
(X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N
N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A
L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V
N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F
E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E
G V M V T K F Y F Q E D E
in der (X) R oder P ist;
mit der Maßgabe, dass die Aminosäuresequenz von (A), (B) oder (C) die Aminosäuresequenz von Position 26 bis zum Ende oder von Position 1 bis zum Ende der nachstehenden Sequenz nicht umfasst:
wobei (X) entweder P = Prolin oder R = Arginin ist.
Ferner ist es eine Aufgabe dieser Erfingung, ein System von rekombinanter DNA zur Herstellung der hier beschriebenen IL-1-Inhibitoren zur Verfügung zu stellen. Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung ausgeführt, und sind teilweise aus der Beschreibung ersichtlich oder können bei der Durchführung der Erfindung erlernt werden. Die Aufgaben und Vorteile können mittels der in den angefügten Ansprüchen dargelegten Nützlichkeiten und Kombinationen erkannt und erreicht werden.
Zur Lösung der Aufgaben und im Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung werden IL-1-Inhibitoren offenbart, die eine inhibierende Aktivität gegenüber IL-1 aufweisen. Die bevorzugten Inhibitoren sind in gereinigter Form aus Monozyten-konditioniertem Medium mit auf einer IgG-beschichteten Platte gewachsenen Monozyten isoliert werden.
Weiterhin wird zur Lösung der Aufgaben und im Einklang mit dem Zweck der vorliegenden Erfindung ein System rekombinanter DNA für die Erzeugung dieser IL-1-Inhibitoren und deren Analoga offenbart. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Systemes umfasst mindestens einen cDNA-Klon oder sein synthetisches Äquivalent, der bzw. das mindestens einen IL-1-Inhibitor kodiert, in Verbindung mit Vektoren und Zellen, die ein Expressionssystem darstellen, das zur Expression des hier offenbarten IL-1-Inhibitors fähig ist. Expressionssysteme für die Erzeugung dieser IL-1-Inhibitoren unter Verwendung dieser cDNA-Klone, deren Analoga oder anderer DNA-Sequenzen, die diese Inhibitoren kodieren, werden ebenfalls bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1a und 1b zeigen das Proteinprofil der Mono Q-Chromatographie von zwei metabolisch markierten Monozytenüberständen. Diese Zellen wurden auf Platten kultiviert, die mit IgG (1a) oder fötalem Kälberserum (1b) beschichtet worden waren.
Fig. 2a zeigt silbergefärbte Gele von Fraktionen der in den Fig. 1a und 1b gezeigten Bereiche.
Fig. 2b ist ein Autoradiogramm der in Fig. 2a gezeigten Gele.
Die Fig. 3a, b und c zeigen Daten für den gereinigten IL-1i aus Beispiel 1. Fig. 3a zeigt die Chromatographiedaten, wobei das Radioaktivitätsmuster überlagert ist. Fig. 3b zeigt silbergefärbte Gele, auf denen Proben der in Fig. 3a gezeigten Fraktionen laufengelassen worden sind. Fig. 3c zeigt die Autoradiogramme der in Fig. 3b gezeigten Gele.
Die Fig. 4a und b zeigen die Ergebnisse der Gelfiltrationschromatogramme von Mono Q-gereinigtem IL-1i.
Die Fig. 5a und b zeigen die Western-Analyse mit Mausantiseren.
Die Fig. 6 zeigt die Konstruktion des Plasmides pSVXVPL2IL-1i.
Fig. 7 zeigt die Konstruktion des Plasmides pMK-SGE:IL-1i.
Die Fig. 8a-d zeigen Daten für IL-1i-α. Die Fig. 8a und 8b zeigen Chromatographiedaten. Die Fig. 8c zeigt ein silbergefärbtes Gel, auf dem die in Fig. 8b gezeigten Fraktionen laufengelassen worden sind. Fig. 8d zeigt ein Autoradiogramm.
Fig. 9a und 9b zeigen Daten für IL-1i-β. Fig. 9a zeigt Chromatographiedaten. Fig. 9b zeigt SDS-PAGE-Daten.
Fig. 10 zeigt Daten der IL-1i-α-Peptidtrennung.
Fig. 11 zeigt Daten der IL-1i-β-Peptidtrennung.
Fig. 12a ist eine Photographie eines Geles mit GT10-IL-1i-2A, verdaut mit EcoRI, nach Elektrophorese gemäß Beispiel 6.
Fig. 12b zeigt die Daten eines Autoradiogramms eines Southern-Blots des in Fig. 12a gezeigten Geles.
Fig. 14 zeigt die Nukleotidsequenz von GT10-IL-1i-2A.
Fig. 15 zeigt ein Peptid, das unter anderem eine IL-1i-Sequenz und eine Aussscheidungsleitsequenz (Signalsequenz) umfasst.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Im Folgenden werden die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung im Detail beschrieben, die zusammen mit den nachstehenden Beispielen dazu dienen, die Erfindung zu erläutern.

A. Inhibitor aus humanen Monozyten

Wie oben festgestellt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf 1L-1-Inhibitoren, die in einer gereinigten Form isoliert worden sind. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen IL-1-Inhibitoren aus mit humanen Monozyten konditioniertem Medium abgeleitet, wo die Monozyten in IgG-beschichteten Gefäßen wachsengelassen werden. Die Erfindung umfasst weiterhin im Wesentlichen gereinigte IL-1-Inhibitoren jeden Ursprungs, die dem Inhibitor, der aus einem humane Monozyten enthaltenden Medium abgeleitet ist, biologisch gleichwertig sind.
Mit "biologisch gleichwertig", wie es in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, sind erfindungsgemäße Zusammensetzungen gemeint, die die IL-1-Wirkung auf ähnliche Weise aber nicht notwendigerweise im gleichen Maß wie der aus Monozyten isolierte native IL-1-Inhibitor verhindern können. Mit "im Wesentlichen homolog", wie es in der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, ist ein Ausmaß von Homologie zu dem aus konditioniertem Monozytenmedium isolierten nativen IL-1- Inhibitor gemeint, das das von jedem zuvor beschriebenen IL-1-Inhibitor übertrifft. Der Grad der Homologie beträgt bevorzugt über 70%, besonders bevorzugt über 80% und am stärksten bevorzugt über 90%. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Inhibitoren haben mehr als 95% Homologie zu dem nativen Inhibitor. Der beschriebene Prozentsatz der Homologie wird als der Prozentsatz von Aminosäureresten in der kleineren der beiden Sequenzen berechnet, die mit identischen Aminosäureresten in der zu vergleichenden Sequenz übereinstimmen, wenn zur besseren Übereinstimmung bei einer Länge von 100 Aminosäuren vier Lücken eingeführt werden können, wie von Dayhoff, M. D. in Atlas of Protein Sequence and Structure, Band 5, S. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C., beschrieben; diese Beschreibung wird durch Bezugnahme hier einbezogen.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen IL-1-Inhibitoren sind von konditioniertem Monozytenmedium abgeleitet und sind zum ersten Mal in gereinigter Form isoliert worden. Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung bezeichnen die Ausdrücke "reine Form" oder "gereinigte Form", wenn sie in Bezug auf die hier offenbarten IL-1-Inhibitoren verwendet werden, eine Präparation, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, die keine IL-1-Inhibitorproteine sind, ist. Die erfindungsgemäßen IL-1-Inhibitoren sind bevorzugt mindestens 90% rein, bevorzugt 95% rein.
Mindestens drei gereinigte IL-1-Inhibitoren sind mit den Verfahren aus dem Beispiel isoliert worden. Diese umfassen den Inhibitor 1, Inhibitor 2 und Inhibitor 3. Inhibitor 1 verhält sich als ein Molekül von 22-23 kD auf SDS-PAGE mit einem ungefähren isoelektrischen Punkt von 4,8; er wird von einer Mono Q-FPLC-Säule bei ungefähr 52 mM NaCl in Tris-Puffer, pH 7,6 eluiert. Inhibitor 2 ist ebenfalls ein Protein von 22-23 kD, pI = 4,8, wird jedoch von einer Mono Q-Säule bei 60 mM NaCl eluiert. Inhibitor 3 ist ein Protein von 20 kD und wird von einer Mono Q-Säule bei 48 mM NaCl eluiert. Die Inhibitoren 1, 2 und 3 sind immunologisch und funktionell verwandt. Diese Inhibitoren in gereinigter Form erhalten zu haben, hat die Erfinder der vorliegenden Erfindung in die Lage versetzt, ihre Aminosäuresequenzen zu erhalten. Bei Verwendung der gereinigten Inhibitoren, die zum ersten Mal hier offenbart werden, und der Verfahren wie jener, die hier beschrieben werden und in dem mit dem ABI-Proteinsequenzgerät bereitgestellten Technischen Handbuch zum ABI-Protein-Sequencer beschrieben werden, kann ein wesentlicher Teil der Aminosäuresequenzen dieser Inhibitoren deduziert werden.
Beispiel 3 zeigt die Aminosäuredaten, die von drei Arten von IL-1-Inhibitoren, nämlich IL-1i-X, IL-1i-α und IL-1iβ, erhalten wurden.
Die Erfinder haben auch mindestens einen Antikörper, der gegen einen IL-1-Inhibitor gerichtet ist, entdeckt. Weitere polyklonale und monoklonale Antikörper gegen diesen und andere IL-1-Inhibitoren können mit Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Ein besonderer polyklonaler Antikörper ist in Beispiel 4 beschrieben.

B. Rekombinanter Inhibitor

1. Allgemeines

Es wird nun ein rekombinantes DNA-Verfahren zur Herstellung eines IL-1-Inhibitors offenbart. In einer Ausführungsform der Erfindung funktioniert die aktive Stelle auf eine Weise, die der des nativen, aus Menschen isolierten IL-1-Inhibitors biologisch äquivalent ist. Es kann eine natürlich oder synthetische DNA-Sequenz verwendet werden, um die Erzeugung von IL-1-Inhibitoren zu steuern. Dieses Verfahren umfasst:
(a) Bereitstellen einer DNA-Sequenz, die eine Wirtszelle zur Erzeugung eines Proteins mit IL-1-Inhibitor-Aktivität steuern kann;
(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine Wirtszelle überführt und dort repliziert werden kann, wobei der Vektor funktionelle Elemente enthält, die zur Expression der DNA-Sequenz erforderlich sind;
(c) Überführen des Vektors mit der synthetischen DNA-Sequenz und den funktionellen Elementen in eine Wirtszelle, die die IL-1-Inhibitor kodierende DNA exprimieren kann;
(d) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Amplifizierung des Vektors und zur Expression des Inhibitors geeignet sind;
(e) Ernten des Inhibitors, und
(f) Zulassen, dass der Inhibitor eine aktive tertiäre Struktur annimmt, wodurch der Inhibitor IL-1-inhibitorische Aktivität besitzt.

2. DNA-Sequenzen

Die für die Verwendung in diesem Verfahren in Betracht gezogenen DNA-Sequenzen werden zum Teil in Beispiel 5 und zum Teil in Beispiel 6 diskutiert. Es ist beabsichtigt, dass diese Sequenzen synthetische und natürliche DNA-Sequenzen umfassen. Die natürlichen Sequenzen umfassen weiter cDNA oder genomische DNA-Segmente.
Beispiel 6 stellt einen molekularen Klon einer DNA zur Verfügung, die für ein Protein kodiert, das mit dem in den Beispielen 1-3 isolierten identisch ist. In Beispiel 6 wurde ein Plaque, GT10-IL1i-2A, aus einer GT10-Bank isoliert. Der Phage aus diesem Plaque wurde propagiert und die DNA isoliert und mit EcoRI verdaut. Ein EcoRI-Fragment von 1850 Basenpaaren trägt die für den IL-1-Inhibitor kodierende Sequenz. Fig. 14 zeigt die DNA-Teilsequenz des EcoRI-Fragmentes.
Im Licht der hier enthaltenen Lehren und der bekannten Verfahren werden dem Fachmann andere synthetische Polynukleotidsequenzen zur Verfügung stehen. Als ein Beispiel für den gegenwärtigen Stand der Technik im Zusammenhang mit Polynukleotidsynthese wird auf Matteucci, M. D. und Caruthers, M. H., in J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981) und Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H., in Tetrahedron Lett. 22: 1859 (1981) sowie auf die mit der ABI-Oligonukleotidsynthesemaschine bereitgestellten Instruktionen verwiesen, die alle ausdrücklich durch Bezugnahme hier einbezogen werden sollen.
Diese synthetischen Sequenzen können mit den nachstehend im Detail beschriebenen natürlichen Sequenzen identisch sein oder sie können unterschiedliche Nukleotide enthalten. Enthalten die synthetischen Sequenzen in einer Ausführungsform Nukleotide, die von denen verschieden sind, die in den erfindungsgemäßen natürlichen DNA-Sequenzen gefunden werden, so ist es beabsichtigt, dass diese unterschiedlichen Sequenzen immer noch ein Polypeptid mit der gleichen Primärstruktur wie der des aus Monozyten isolierten IL-1i kodieren. In einer anderen Ausführungsform kann die synthetische Sequenz, die unterschiedliche Nukleotide enthält, ein Polypeptid kodieren, das die gleiche biologische Aktivität hat, wie das hier beschriebene IL-1i.
Die DNA-Sequenz kann außerdem ein Fragment einer natürlichen Sequenz sein, d. h., ein Fragment eines Polynukleotids, das in der Natur vorkommt und das von den Erfindern zum ersten Mal isoliert und gereinigt worden ist. In einer Ausführungsform ist die DNA-Sequenz ein Restriktionsfragment, das aus einer cDNA-Bank isoliert worden ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist die DNA-Sequenz aus einer Humangenombank isoliert. Ein Beispiel für eine solche Bank, die für diese Ausführungsform nützlich ist, wird von Lawn et al. in Cell 15: 1157-1174 (1978) beschrieben.
In einer bevorzugten Version dieser Ausführungsform ist beabsichtigt, die natürliche DNA-Sequenz durch ein Verfahren zu erhalten, das umfasst:
a) Das Herstellen einer humanen cDNA-Bank aus Zellen, bevorzugt Monozyten, die einen IL-1-Inhibitor in einem Vektor und einer Zelle erzeugen können, die die gesamte cDNA oder einen Teil davon amplifizieren bzw. exprimieren können;
b) das Durchsuchen der humanen DNA-Bank mit mindestens einer Sonde, die an das IL-1-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt binden kann;
c) das Identifzieren mindestens eines Klones, der das für den Inhibitor kodierende Gen enthält, mittels der Fähigkeit des Klones, an mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden;
d) das Isolieren des Genes oder eines Teil des Genes, das den Inhibitor kodiert, aus dem ausgewählten Klon oder den ausgewählten Klonen;
e) das Verbinden der Gene oder geeigneter Fragmente davon mit funktionellen Elementen, die dazu notwendig sind, das Gen in einer Wirtszelle zu halten und zu exprimieren.
Die für das vorstehend genannte Verfahren verwendbaren DNA-Sequenzen können außerdem durch ein Verfahren identifiziert und isoliert werden, das umfasst:
a) das Herstellen einer Humangenom-DNA-Bank, bevorzugt propagiert in einem reck recBC-E. coli-Wirt;
b) das Durchsuchen der Humangenom-DNA-Bank mit mindestens einer Sonde, die an ein IL-1-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt binden kann;
c) das Identifizieren mindestens eines Klones, der das für den Inhibitor kodierende Gen enthält, mittels der Fähigkeit des Klones, an mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden;
d) das Isolieren des für den Inhibitor kodierenden Genes aus dem identifizierten Klon oder den identifizierten Klonen; und
e) das Verbinden der Gene oder geeigneter Fragmente davon mit funktionellen Elementen, die dazu notwendig sind, das Gen in einer Wirtszelle zu halten und zu exprimieren.
Bei der Isolierung einer natürlichen DNA-Sequenz, die für die Verwendung in dem oben genannten Verfahren geeignet ist, ist es bevorzugt, die beiden Restriktionsschnittstellen, die innerhalb der entsprechenden Gene oder Genabschnitte und den Endteilen am nächsten liegen, zu identifizieren. Das das entsprechende Gen enthaltende DNA-Segment wird dann unter Verwendung entsprechender Restriktionsendonukleasen aus dem übrigen genomischen Material entfernt. Nach dem Ausschneiden werden die 3'- und 5'-Enden der DNA-Sequenz und jede Exonverbindung rekonstruiert, um entsprechende DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für die N- und C-Termini des IL-1-Inhibitorproteins kodieren können und die Fusion der DNA-Sequenz mit ihren funktionellen Elementen.

3. Vektoren

(a) Mikroorganismen, insbesondere E. coli

Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Vektoren umfassen jeden Vektor, in den eine DNA-Sequenz, wie sie oben diskutiert ist, in Verbindung mit jedem bevorzugten oder erforderlichen funktionellen Element eingebaut werden kann, wobei der Vektor anschließend in eine Wirtszelle übertragen werden und in einer solchen Zelle replizieren kann. Bevorzugte Vektoren sind solche, deren Restriktionsschnittstellen gut dokumentiert sind und die die funktionellen Elemente enthalten, die zur Transkription der DNA-Sequenz bevorzugt oder erforderlich sind. Es sind jedoch auch bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung denkbar, die derzeit noch unbekannte Vektoren verwenden, die eine oder mehrere der hier beschriebenen cDNA-Sequenzen enthalten würden. Es ist insbesondere bevorzugt, dass alle dieser Vektoren einige oder alle der folgenden Merkmale aufweisen: (1) sie besitzen ein Minimum an Sequenzen aus dem Wirtsorganismus; (2) sie werden in den gewünschten Wirt stabil gehalten und propagiert; (3) sie können in dem gewünschten Wirt in einer hohen Kopienzahl vorhanden sein; (4) sie besitzen einen regulierbaren Promotor, der so angeordnet ist, dass er die Transkription des gewünschten Genes steuern kann; (5) sie haben mindestens eine Marker-DNA-Sequenz, die einen selektiven Marker kodiert, der auf einem Teil des Plasmides vorhanden ist, der getrennt ist von dem Teil, in den die DNA-Sequenz eingebaut werden wird; und (6) sie haben eine DNA-Sequenz, die die Transkription terminieren kann.
In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Klonierungsvektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthalten und diese exprimieren können, verschiedene funktionelle Elemente. Diese "funktionellen Elemente", wie sie hier diskutiert werden, umfassen mindestens einen Promotor, mindestens eine Shine-Dalgamo- Sequenz und ein Initiationskodon und mindestens ein Terminationskodon. Vorzugsweise umfassen diese "funktionellen Elemente" mindestens einen Operator, mindestens eine Leitsequenz (Signalsequenz) für den Export von Proteinen aus dem intrazellulären Raum; mindestens ein Gen für ein Regulatorprotein und jedwede andere DNA-Sequenzen, die für eine entsprechende Transkription und anschließende Translation der Vektor-DNA notwendig oder bevorzugt sind.
Einige dieser funktionellen Elemente können in jedem der bevorzugten erfindungsgemäßen Vektoren vorhanden sein. Es wird angenommen, dass jedes zusätzliche funktionelle Element, das erforderlich sein könnte, um diesen Vektoren unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren und insbesondere im Licht der hier dargelegten Lehre zugefügt werden kann.
In der Praxis ist es möglich, jeden diesen Vektoren auf eine Art zu konstruieren, die es gestattet, ihn leicht zu isolieren, zusammenzusetzen und auszutauschen. Dies erleichtert das Zusammensetzen von zahlreichen funktionellen Genen aus Kombinationen dieser Elemente und dem kodierenden Bereich der DNA-Sequenzen. Außerdem können viele dieser Elemente in mehr als einem Wirt verwendbar sein. Zusätzlich wird angenommen, dass diese Vektoren in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen DNA-Sequenzen, die als Regulatoren ("Operatoren") wirken können, sowie andere DNA-Sequenzen, die für Regulatorproteine kodieren können, enthalten.

(i) Regulatoren

Diese Regulatoren dienen in einer Ausführungsform dazu, die Expression der DNA-Sequenz unter bestimmten Bedingungen in der Umgebung zu verhindern, und unter anderen Bedingungen in der Umgebung Transkription und anschließend Expression des von der DNA-Sequenz kodierten Proteins zu erlauben. Es ist insbesondere bevorzugt, dass die regulatorischen Abschnitte in den Vektor so eingebaut werden, dass die Expression der DNA-Sequenz nicht oder in einem stark verringertem Ausmaß in Abwesenheit von z. B. Isopropylthio-β-D-galactosid geschieht. In dieser Situation können die die DNA-Sequenz enthaltenden transformierten Mikroorganismen bis zu einer gewünschten Dichte wachsengelassen werden, bevor die Expression von IL-1i initiiert wird. In dieser Ausführungsform wird die Expression des gewünschten Proteines durch Zugabe einer Substanz in die mikrobielle Umgebung induziert, die nach Erreichen der gewünschten Dichte die Expression der DNA-Sequenz herbeiführen kann.

(ii) Promotoren

Die Expressionsvektoren müssen Promotoren enthalten, die von dem Wirtsorganismus für die Expression seiner eigenen Proteine verwendet werden können. Während das Lactosepromotorsystem allgemein verwendet wird, sind andere mikrobielle Promotoren isoliert und charakterisiert worden, die den Fachmann in die Lage versetzen, sie für die Expression von rekombinanten IL-1i zu verwenden.

(iii) Transkriptionsterminator

Die hier in Betracht gezogenen Transkriptionsterminatoren dienen zur Stabilisierung des Vektors. Insbesondere werden die von Rosenberg, M. und Court, D., in Ann. Rev.
Genet. 13: 319-353 (1979) beschriebenen Sequenzen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.

(iv) Nicht-translatierte Sequenzen

Es wird angemerkt, dass es in der bevorzugten Ausführungsform auch wünschenswert sein kann, die 3'- oder 5'-Enden des kodierenden Bereiches zu rekonstruieren, um den Einbau von 3'- oder 5'-nicht-translatierten Sequenzen in das Gentranskript zu ermöglichen. Zu diesen nicht-translatierten Sequenzen gehören solche, die die mRNA stabilisieren, wie sie von Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg, M. und Court, D., J. Mol. Biol. 176: 39-53 (1984), identifiziert worden sind.

(v) Ribosomen-Bindungsstellen

Die mikrobielle Expression fremder Proteine erfordert bestimmte funktionelle Elemente, die Ribosomen-Bindungsstellen einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Eine Ribosomen-Bindungsstelle ist eine Sequenz, die das Ribosom bei der Initiation der Proteinsynthese erkennt und an die es bindet, wie von Gold, L., et al., Ann Rev. Microbio. 35: 557-580, oder Marquis, D. M., et al., Gene 42: 175-183 (1986) beschrieben. Eine bevorzugte Ribosomen-Bindungsstelle ist GAGGCGCAAAAA(ATG).

(vi) Signalsequenz und Translationskoppler

Zusätzlich ist es bevorzugt, dass eine für eine entsprechende Ausscheidungsleit(Signal)-Sequenz kodierende DNA am 5'-Ende der DNA-Sequenz vorhanden ist, wie von Watson, M. E., in Nucleic Acids Res. 12: 5145-5163 beschrieben ist, wenn das Protein aus dem Zytoplasma ausgeschieden werden soll. Die DNA für die Signalsequenz muß in einer Position sein, die die Produktion eines Fusionsproteines gestattet, bei der die Signalsequenz dem Inhibitor unmittelbar benachbart ist und mit ihm kovalent verbunden ist, d. h., zwischen den beiden kodierenden DNA-Sequenzen dürfen keine Transkriptions- oder Translationsterminationssignale auftreten. Die Gegenwart einer Signalsequenz wird zum Teil aus einem oder mehreren der folgenden Gründe gewünscht. Zunächst kann die Gegenwart einer Signalsequenz die Prozessierung von IL-1i durch den Wirt erleichtern. Die Signalsequenz kann insbesondere die Spaltung des ursprünglichen Translationsproduktes durch eine Signalpeptidase steuern, um die Signalsequenz zu entfernen und ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz zurückzulassen, das eine potentielle Proteinaktivität hat. Zweitens kann die Gegenwart der Signalsequenz die Reinigung von IL-1i erleichtern, indem das Protein aus dem Zellzytoplasma herausgesteuert wird. In einigen Arten von Wirtsmikroorganismen erlaubt die Gegenwart einer entsprechenden Signalsequenz den Transport des fertigen Proteins in den periplasmatischen Raum, wie es in einigen E. coli-Stämmen der Fall ist. Im Fall von bestimmten E. coli-, Saccharomyces-, Bacillus und Pseudomonas-Stämmen wird eine geeignete Signalsequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran und in das extrazelluläre Medium erlauben. In dieser Situation kann das Protein von extrazellulärem Protein gereinigt werden. Drittens kann bei einigen der erfindungsgemäß hergestellten Proteine die Gegenwart einer Signalsequenz dazu notwendig sein, das fertige Protein in eine Umgebung zu bringen, in der es sich falten kann, um seine aktive Struktur, die die entsprechende Proteinaktivität besitzt, anzunehmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine zusätzliche DNA-Sequenz unmittelbar vor der DNA-Sequenz angeordnet, die den IL-1-Inhibitor kodiert. Die zusätzliche DNA-Sequenz kann als Translationskoppler wirken, d. h., es handelt sich um eine DNA-Sequenz, die eine RNA kodiert, die dazu dient, Ribosomen unmittelbar benachbart zu der Ribosomen-Bindungsstelle der Inhibitor-RNA anzuordnen, mit der sie fortlaufend ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Translationskoppler unter Verwendung der folgenden DNA-Sequenz abgeleitet werden:
TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCTTGGAGGATGATTAAATG
und unter Anwendung von Methoden, die derzeit dem Fachmann in Verbindung mit Translationskopplern bekannt sind.

(vii) Translationsterminator

Die hier in Betracht gezogenen Translationsterminatoren dienen dazu, die Translation der mRNA zu beenden. Sie können entweder natürlich sein, wie von Kohli, J., Mol. Gen. Genet. 182: 430439, beschrieben, oder synthetisiert, wie von Pettersson, R. F., Gene 24: 15-27 (1983), beschrieben.

(viii)Selektierbare Marker

Zusätzlich ist es bevorzugt, dass der Klonierungsvektor einen selektierbaren Marker enthält, beispielsweise einen (Drogen-)Resistenzmarker oder einen anderen Marker, der die Expression eines selektierbaren Merkmals durch den Wirtsmikroorganismus hervorruft. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Gen für Ampicillinresistenz in den Vektor einbezogen, während in anderen Plasmiden das Gen für Tetracyclinresistenz oder das Gen für Chloramphenicolresistenz einbezogen wird.
Ein solcher (Drogen-)Resistenz- oder anderer selektierbarer Marker soll zum Teil die Selektion von Transformanten erleichtern. Zusätzlich kann die Gegenwart eines solchen selektierbaren Markers in dem Klonierungsvektor von Nutzen sein, um kontaminierende Mikroorganismen davon abzuhalten, sich in dem Kulturmedium zu vermehren. In dieser Ausführungsform würde man eine reine Kultur des transformierten Wirtsmikroorganismus erhalten, indem man die Mikroorganismen unter Bedingungen kultiviert, bei denen ein induzierter Phänotyp zum Überleben benötigt wird.
Die hier diskutierten funktionellen Elemente werden vom Fachmann routinemäßig im Licht der früheren Literatur und der darin enthaltenen Lehren ausgewählt. Allgemeine Beispiele für solche funktionellen Elemente sind in B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983), ausgeführt. Verschiedene Beispiele für geeignete funktionelle Elemente können in den oben diskutierten Vektoren gefunden werden und könnten erklärt werden, indem die Publikationen, die die grundlegenden Merkmale der zuvor genannten Vektoren diskutieren, durchgesehen werden.
Nach Synthese und Isolierung aller notwendigen und gewünschten Bestandteile des oben diskutierten Vektors wird der Vektor durch dem Fachmann allgemein bekannte Verfahren zusammengesetzt. Das Zusammensetzen eines solchen Vektors wird als innerhalb der Aufgaben und Pflichten des Durchschnittsfachmanns liegend angesehen und kann als solches ohne unzumutbare experimentelle Arbeit des Fachmanns durchgeführt werden. Beispielsweise sind ähnliche DNA-Sequenzen in entsprechende Klonierungsvektoren ligiert worden, wie von Maniatis et al., in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984), beschrieben.
Bei der Konstruktion der erfindungsgemäßen Klonierungsvektoren sollte zusätzlich angemerkt werden, dass vielfache Kopien der DNA-Sequenz und der sie begleitenden funktionellen Elemente in jeden Vektor eingebaut werden können. In einer solchen Ausführungsform würde der Wirtsorganismus größere Mengen des gewünschten IL-1-Inhibitors pro Vektor erzeugen. Die Anzahl multipler Kopien der DNA-Sequenz, die in den Vektor eingebaut werden kann, wird nur durch die Fähigkeit des resultierenden Vektors beschränkt, aufgrund seiner Größe in eine geeignete Wirtszelle übertragen, repliziert und transkribiert zu werden.

(b) Andere Mikroorganismen

Für diese Erfindung werden außerdem Vektoren in Betracht gezogen, die zur Verwendung in von E. coli verschiedenen Mikroorganismen geeignet sind. Solche Vektoren sind in Tabelle 1 beschrieben. Zusätzlich werden bestimmte bevorzugte Vektoren unten diskutiert. Tabelle 1
* nicht reguliert
1. Backman, K., Ptashne, M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4174-4178 (1976).
2. de Boer, H. A., Comstock, L. J. und Wasser, M.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983).
3. Shimatake, H. und Rosenberg, M., Nature 292, 128-132 (1981).
4. Derom, C., Gheysen, D. und Fiers, W., Gene 17, 45-54 (1982).
5. Hallewell, R. A. und Emtage, S., Gene 9, 27-47 (1980).
6. Brosius, J., Dull, T. J., Sleeter, D. D. und Noller, H. F., J. Mol. Biol. 148, 107-127 (1981).
7. Normanly, J., Ogden, R. C., Horvath, S. J. und Abelson, J., Nature 321, 213-219 (1986).
8. Belasco, J. G., Nilsson, G., von Gabain, A. und Cohen, S. N., Cell 46, 245-251 (1986).
9. Schmeissner, U., McKenney, K., Rosenberg M. und Court, D., J. Mol. Biol. 176, 39-53 (1984).
10. Mott, J. E., Galloway, J. L. und Platt, T., EMBO J. 4, 1887-1891 (1985).
11. Koshland, D. und Botstein, D., Cell 20, 749-760 (1980).
12. Movva, N. R., Kakamura, K. und Inouye, M., J. Mol. Biol. 143, 317-328 (1980).
13. Surin, B. P., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Shaw, D. C., Cox, G. B. und Rosenberg, H., J. Bacteriol. 157, 772-778 (1984).
14. Sutcliffe, J. G, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3737-3741 (1978).
15. Peden, K. W. C., Gene 22, 277-280 (1983).
16. Alton, N. K., und Vapnek, D., Nature 282, 864-869 (1979).
17. Yang, M., Galizzi, A. und Henner, D., Nuc. Acids Res. 11 (2), 237-248 (1983).
18. Wong, S. -L., Prlce, C. W., Goldfarb, D. S., und Doi, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1984).
19. Wang, P.-Z., und Doi, R. H., J. Biol. Chem. 251, 8619-8625 (1984).
20. Lin, C.-K., Quinn, L. A. Rodriguez, R. L., J. Cell Biochem. Suppl.(9B), S. 198 (1985).
21. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C., Nagle, J. und Filpula, D., J. Bact. 159(3), 811-819 (1984).
22. Palva, L, Sarvas, M., Lehtovaara, P., Sibazkov, M., und Kaariainen, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5582-5586 (1982).
23. Wong. S.-L., Pricee, C. W., Goldfarb, D. S. und Doi, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1184-1188 (1994).
24. Sullivan, M. A., Yasbin, R. E. und Young, F. E., Gene 29, 21-46 (1984).
25. Vasantha, N., Thompson, L. D., Rhodes, C., Banner, C. Nagle, J. und Filula, D. J. Bact. 159(3), 811-819 (1984).
26. Yansura, D. G. und Henner, D. J., PNAS 81, 439-443 (1984).
27. Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H. und Heyneker, H. L., Biotechnology, 161-165 (1984).
28. Lory, S. und Tai, P. C., Gene 22, 95-101 (1983).
29. Liu, P. V., J. Infect. Dis. 130 (suppl), 594-599 (1974).
30. Wood, D. G., Hollinger, M. F. und Tindol, M. B., J. Bact. 145, 1448-1451 (1981).
31. St. John, T. P. und Davis, R. W., J. Mol. Biol. 152, 285-315 (1981).
32. Hopper, J. E. und Rowe, L. B., J. Biol. Chem. 253, 7566-7569 (1978).
33. Denis, C. L., Ferguson, J. und Young, E. T., J. Biol. Chem. 258, 1165-1171 (1983).
34. Lutsdorf, L. und Megnet, R., Archs. Biochem. Biophys. 126, 933-944 (1968).
35. Meyhack, B., Bajwa, N., Rudolph, H. und Hinnen, A., EMBO. J. 6, 675-680 (1982).
36. Watson, M. E., Nucleic Acid Research 12, 5145-5164 (1984).
37. Gerband, C. und Guerineau, M., Curr. Genet. 1, 219-228 (1980).
38. Hinnen, A., Hicks, J. B. und Fink, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933 (1978).
39. Jabbar, M. A., Sivasubramanian, N. und Nayak, D. P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2019-2023 (1985).

(i) Pseudomonas-Vektoren

Einige Vektorplasmide, die in einem weiten Bereich verschiedener Gram-negativen Bakterien autonom replizieren, sind für die Verwendung als Klonierungsvehikel in Wirten der Gattung Pseudomonas bevorzugt. Einige dieser Vektorplasmide sind von Tait, R. C., Close, T. J., Lundquist, R. C., Hagiya, M., Rodriguez, R. L. und Kado, C. I. in Biotechnology, Mai, 1983, S. 269-275; Panopoulos, N. J. in Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, New York, S. 163-185 (1981); und Sakagucki, K. in Current Topic in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982) beschrieben worden.
Ein besonders bevorzugtes Konstrukt würde das Plasmid RSF1010 und dessen Derivate, wie beschrieben von Bagdasarian, M., Bagdasarian, M. M., Coleman, S. und Timmis, K. N. in Plasmids of Medical. Environmental and Commercial Importance, Timmis, K. N. und Pühler, A. Hrsg., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), verwenden. Die Vorteile von RSF1010 sind, dass es ein relativ kleines Plasmid mit hoher Kopienzahl ist, das leicht sowohl in E. coli- als auch Pseudomonas-Arten transformiert und stabil gehalten werden kann. In diesem System wäre es bevorzugt, das Tac-Expressionssystem, wie für Escherichia beschrieben zu verwenden, da es so scheint, als ob der trp-Promotor von E. coli von der Pseudomonas-RNA-Polymerase leicht erkannt wird, wie von Sakagucki, K. in Current Topics in Microbiology and Immunology 96: 31-45 (1982) und Gray, G. L., McKeown, K. A., Jones, A. J. S., Seeburg, P. H., und Heyneker, H. L. in Biotechnology, Feb. 1984, S. 161-165, beschrieben. Die Transkriptionsaktivität kann weiter erhöht werden, indem der Promotor durch beispielsweise einen trp-Promotor von E. coli oder P. aeruginosa ausgetauscht wird. Zusätzlich könnte das lacl-Gen von E. coli in das Plasmid einbezogen werden, um die Regulation zu bewirken.
Die Translation kann an die Translationsinitiation für jedes der Pseudomonas-Proteine gekoppelt werden, sowie an Initiationsstellen für jedes der hoch exprimierten Proteine des zum Herbeiführen der intrazellulären Expression des Inhibitors ausgewählten Typs.
In den Fällen, in denen Stämme ohne Restriktion (restriction minus strains) eines Wirtes der Art Pseudomonas nicht verfügbar sind, ist die Transformationseffizienz mit Plasmidkonstrukten, die aus E. coli. isoliert sind, schlecht. Daher ist es wünschenswert, vor der Transformation des gewünschten Wirtes eine Passage des Pseudomonas-Klonierungsvektors durch einen r&supmin;m&spplus;-Stamm einer anderen Art durchzuführen, wie von Bagdasarian, M., et al., Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, S. 411-422, Timmis und Pühler Hrsg., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979), beschrieben.

(ii) Bacillus-Vektoren

Ein weiteres bevorzugtes Expressionssystem in Wirten der Gattung Bacillus beinhaltet die Verwendung des Plasmides pUB110 als Klonierungsvehikel. Wie in anderen Wirts- Vektorsystemen ist es in Bacillus möglich, den erfindungsgemäßen IL-1i entweder als intrazelluläres oder als ausgeschiedenes Protein zu exprimieren. Die vorliegenden Ausführungsformen umfassen beide Systeme. Wie von Dubnau, D., Gryczan, T., Contente, S., und Shivakumar, A. G. in Genetic Engineering, Band 2, Setlow und Hollander Hrsg., Plenum Press, New York, New York, Seiten 115-131 (1980) beschrieben, sind Schaukelvektoren für die Konstruktion und das Ausprobieren verschiedener Gene verfügbar, die sowohl in Bacillus als auch E. coli repliziert werden. Für die Expression und Ausscheidung von IL-1i aus B. subtilis wird bevorzugt die Signalsequenz der α-Amylase an den das Protein kodierenden Bereich gekoppelt. Für die Synthese von intrazellulärem Inhibitor wird die tragbare DNA-Sequenz translationell an die Ribosomen-Bindungsstelle der α-Amylase-Signalsequenz gekoppelt.
Vorzugsweise wird die Transkription jeder dieser Konstrukte vom α-Amylase-Promotor oder einem seiner Derivate gesteuert. Dieses Derivat enthält die RNA-Polymerase-Erkennungssequenz des nativen α-Amylase-Promotors, aber enthält außerdem den lac-Operatorbereich. Von ähnlichen Hybridpromotoren, die aus dem Promotor des Penicillinasegenes und dem lac-Operator konstruiert worden sind, ist gezeigt worden, dass sie in Bacillus-Wirten auf regulierbare Art funktionieren, wie von Yansura, D. G. und Henner in Genetics and Biotechnology of Bacilli, Ganesan, A. T, und Hoch, J. A., Hrsg., Academic Press, S. 249-263 (1984) gezeigt worden ist. Das lacl-Gen von E. coli würde weiter in das Plasmid einbezogen werden, um die Regulation zu bewirken.

(iii) Clostridium-Vektoren

Ein bevorzugtes Konstrukt für die Expression in Clostridium ist das von Squires, C. H. et al., in J. Bacteriol. 159: 465471 (1984) beschriebene Plasmid pJU12, das nach dem Verfahren von Heefner, D. L. et al., wie in J. Bacteriol. 159: 460464 (1984) beschrieben, in C. perfringens transformiert wird. Die Transkription wird durch den Promotor des Tetracyclinresistenzgens gesteuert. Die Translation ist an die Shine-Dalgamo-Sequenz des gleichen tet'-Genes auf eine Weise gekoppelt, die dem oben ausgeführten Verfahren für Vektoren, die für die Verwendung in anderen Wirten geeignet sind, streng analog ist.

(iv) Hefe-Vektoren

Die Stabilität von in Hefe eingeführter fremder DNA kann auf verschiedene Arten bewirkt werden, wie von Botstein, D. und Davis, R. W., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathem, Jones und Broach, Hrsg., S. 607-636 (1982) beschrieben. Ein bevorzugtes Expressionssystem zur Verwendung mit Wirtsorganismen der Gattung Saccharomyces beherbergt das IL-1i-Gen auf dem 2-Mikron-Plasmid. Die Vorteile dieses 2-Mikron-Kreises sind unter anderem eine relativ hohe Kopienzahl und Stabilität, wenn der in cirº-Stämme eingeführt wird. Vorzugsweise enthalten diese Vektoren den Replikationsursprung und mindestens einen Antibiotikaresistenzmarker aus pBR322, um Replikation und Selektion in E. coli zu erlauben. Vorzugsweise wird das Plasmid zusätzlich die 2-Mikron-Sequenz und das LEU2-Gen aus Hefe enthalten, um den gleichen Zwecken in LEU2-defekten Hefemutanten zu dienen.
Wenn es in Betracht gezogen wird, die rekombinanten IL-1-Inhibitoren letztendlich in Hefe zu exprimieren, ist es bevorzugt, dass der Klonierungsvektor zunächst in Escherichia coli übertragen wird, wo der Vektor repliziert werden könnte und woraus der Vektor nach Amplifikation erhalten und gereinigt werden würde. Der Vektor würde dann für die letztendliche Expression des IL-1-Inhibitors in Hefe übertragen werden.

(c) Säugetierzellen

Die cDNA für den IL-1-Inhibitor wird als das Gen für die Expression des Inhibitors in Säugetierzellen dienen. Sie sollte eine Sequenz haben, die effizient an Ribosomen bindet, beispielsweise eine solche, wie sie von Kozak, in Nucleic Acids Research 15: 8125-8132 (1987) beschrieben worden ist, und sollte eine Kodierungskapazität für eine Signalsequenz (siehe Abschnitt 3(a)(vi)) haben, um das reife Protein in prozessierter Form aus der Zelle auszuschleusen. Das DNA-Restriktionsfragment, das die vollständige cDNA-Sequenz trägt, kann in einen Expressionsvektor eingebaut werden, der einen Transkriptionspromotor und einen Transkriptionsenhancer (-steigerer) enthält, wie von Guarente, L. in Cell 52: 303-305 (1988) und Kadonage, J. T. et al., in Cell 51: 1079-1090 (1987) beschrieben. Der Promotor kann regulierbar sein, wie im Plasmid pMSG (Pharmacia Katalog Nr 27450601), wenn die konstitutive Expression des Inhibitors sich auf das Zellwachstum schädlich auswirkt. Der Vektor sollte ein vollständiges Polyadenylierungssignal haben, wie von Ausubel, F. M. et al. in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987) beschrieben, so dass die von diesem Vektor transkribierte mRNA korrekt prozessiert wird. Schließlich wird der Vektor den Replikationsursprung und mindestens einen Antibiotikaresistenzmarker von pBR322 haben, um eine Replikation und Selektion in E. coli zu erlauben.
Zur Selektion einer stabilen Zelllinie, die den IL-1 Inhibitor erzeugt, kann der Expressionsvektor das Gen für einen selektierbaren Marker tragen, beispielsweise einen (Drogen-)Resistenzmarker, oder ein komplementierendes Gen für eine defiziente Zelllinie tragen, beispielsweise das Dihydrofolatreductase(dhfr)-Gen für die Transformation einer dhfr&supmin;-Zelllinie, wie von Ausubel et al., siehe oben, beschrieben. Alternativ kann ein getrenntes Plasmid, das den selektierbaren Marker trägt, mit dem Expressionsvektor cotransformiert werden.

4. Wirtszellen/Transformation

Der so erhaltene Vektor wird in eine entsprechende Wirtszelle überführt. Diese Wirtszellen können Mikroorganismen oder Säugetierzellen sein.

(a) Mikroorganismen

Es wird angenommen, dass jeder Mikroorganismus mit der Fähigkeit, exogene DNA aufzunehmen und deren Gene und dazugehörige funktionelle Elemente zu exprimieren, ausgewählt werden kann. Nachdem ein Wirtsorganismus ausgewählt worden ist, wird der Vektor unter Anwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren in den Wirtsorganismus überführt. Beispiele solcher Verfahren können in Advanced Bacterial Genetics von R. W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980) gefunden werden. In einer Ausführungsform ist es bevorzugt, dass die Transformation bei niedrigen Temperaturen stattfindet, da die Temperaturregulation durch die Verwendung funktioneller Elemente als ein Mittel zur Regulation der Genexpression angesehen wird, wie oben ausgeführt ist. In einer anderen Ausführungsform, wenn osmolare Regulatoren in den Vektor eingebaut worden sind, wäre die Regulation der Salzkonzentrationen während der Transformation erforderlich, um eine angemessene Kontrolle der fremden Gene sicherzustellen.
Es ist bevorzugt, dass der Wirtsorganismus fakultativ anaerob oder aerob ist. Besondere Wirte, die für die Verwendung in diesem Verfahren bevorzugt sein können, sind unter anderem Hefen und Bakterien. Spezielle Hefen sind unter anderem jene der Gattung Saccharomyces, und insbesondere Saccharomyces cerevisiae. Besondere Bakterien sind unter anderem solche der Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas, insbesondere Bacillus subtilis und Escherichia coli. Zusätzliche Wirtszellen sind in Tabelle I, oben, aufgeführt.

(b) Säugetierzellen

Der Vektor kann mit verschiedenen Verfahren in Säugetierzellen in Kultur eingeführt werden, beispielsweise durch Calciumphosphat-DNA-Präzipitation, Elektroporation oder Protoplastenfusion. Die bevorzugte Ausführungsform ist die Copräzipitation mit Calciumphosphat, wie von Ausubel et al., a.a.O., beschrieben worden ist.
Es gibt viele stabile Zelltypen, die transformierbar sind und die cDNA-Sequenz transkribieren und translatieren, das Vorläufer IL-1i prozessieren und das reife Protein ausscheiden können. Die Zelltypen können jedoch variabel hinsichtlich einer eventuellen Glycosylierung ausgeschiedener Proteine oder einer eventuellen post-translationalen Modifikation von Aminosäureresten sein. Ideale Zelltypen sind daher solche, die einen rekombinanten IL-1-Inhibitor erzeugen, der mit den natürlichen Molekül identisch ist.

5. Kultivieren manipulierter Zellen

Die Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression des IL-1- Inhibitors geeignet sind. Diese Bedingungen sind im allgemeinen spezifisch für die Wirtszelle und können vom Fachmann im Licht der publizierten Literatur, die die Wachstumsbedingungen für solche Zellen betrifft, und der darin enthaltenen Lehren leicht bestimmt werden. Beispielsweise enthält Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, Informationen über die Bedingungen für die Kultivierung von Bakterien. Ähnliche Informationen über die Kultivierung von Hefe- und Saugetierzellen können von Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring Harbor Laboratories (1975), erhalten werden.
Alle Bedingungen, die für die Regulation der Expression der DNA-Sequenz notwendig sind, abhängig davon, ob funktionelle Elemente in den Vektor insertiert sind oder vorhanden sind, wären in den Transformations- und Kultivierungsstadien wirksam. In einer Ausführungsform werden die Zellen in Gegenwart entsprechender regulierender Bedingungen, die die Expression der DNA-Sequenz inhibieren, zu einer hohen Zelldichte wachsengelassen. Wenn die optimale Zelldichte erreicht ist, werden die Umgebungsbedingungen in solche verändert, die für eine Expression der DNA-Sequenz geeignet sind. Es ist also beabsichtigt, dass die Produktion des IL-1-Inhibitors in einer Zeitspanne auftritt, die im Anschluß an das Wachstum der Wirtszellen bis zur nahezu optimalen Dichte liegt, und dass der resultierende IL-1-Inhibitor einige Zeit nach Induzieren der für seine Expression notwendigen regulatorischen Bedingungen geerntet wird.

6. Reinigung

(a) Von Mikroorganismen erzeugter IL-1i

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekombinante IL-1-Inhibitor nach seiner Ernte und bevor er seine aktive Struktur annimmt, gereinigt. Diese Ausführungsform ist bevorzugt, da die Erfinder glauben, dass die Gewinnung des gefalteten Proteins mit hoher Ausbeute erleichtert wird, wenn das Protein zuerst gereinigt wird. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann sich der IL-1- Inhibitor jedoch vor der Reinigung falten, um seine aktive Struktur anzunehmen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der IL-1-Inhibitor nach der Gewinnung aus dem Kultivierungsmedium in seinem gefalteten, aktiven Zustand vorhanden.
Unter bestimmten Umständen wird der IL-1-Inhibitor seine korrekte aktive Struktur nach Expression in dem Wirtsmikroorganismus und Transport des Proteins durch die Zellwand oder -membran oder in den periplasmatischen Raum annehmen. Dies wird im allgemeinen dann auftreten, wenn eine für eine entsprechende Signalsequenz kodierende DNA mit der das rekombinante Protein kodierenden DNA verbunden worden ist. Wenn der IL-1-Inhibitor seine korrekte, aktive Struktur nicht annimmt, werden alle Disulfidbindungen, die sich gebildet haben, und/oder jede auftretende nicht kovalente Wechselwirkung zunächst mit denaturierenden oder reduzierenden Mitteln, beispielsweise Guadiniumchlorid und β-Mercaptoethanol, aufgebrochen, bevor dem IL-1-Inhibitor gestattet wird, nach Verdünnung und Oxidation dieser Mittel unter kontrollierten Bedingungen seine aktive Struktur anzunehmen.
Für eine Reinigung vor und nach der Faltung werden bevorzugt einige Kombinationen der folgenden Schritte verwendet: Anionenaustauscherchromatographie (Mono Q oder DEAE-Sepharose), Gelfiltrationschromatographie (Superose), Chromatofokussierung (Mono P) und hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (Octyl- oder Phenylsepharose). Von besonderem Wert wird die Antikörperaffinitätschromatographie unter Verwendung IL-1i-spezifischer monoklonaler Antikörper sein (beschrieben in Beispiel 3).

(b) In Säuciertierzellen erzeuates IL-1i

In Säugetierzellen erzeugtes IL-1i wird aus dem konditionierten Medium durch Schritte gereinigt werden, die eine Ionenaustauscherchromatographie und eine Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die in Beispiel 3 beschrieben sind, umfassen werden. Dem Fachmann ist offensichtlich, dass verschiedene Modifikationen und Variationen bei den erfindungsgemäßen Verfahren und Produkten vorgenommen werden können. Es ist daher beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung Modifikationen und Variationen dieser Erfindung umfaßt, vorausgesetzt, sie liegen innerhalb des Bereiches der angefügten Ansprüche und deren Äquivalente.
Es ist zu verstehen, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezielles Problem oder eine Umgebung im Licht der hier enthaltenen Lehren im Bereich der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns liegen. Beispiele für die erfindungsgemäßen Produkte und repräsentative Verfahren zu deren Isolierung und Herstellung werden im Folgenden angegeben.
Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene derzeit bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Proteinpräparation

A. Materialien

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS - Hanks ausgewogene Salzlösung) und RPMI wurden von Mediatech, Washington, D. C., erworben. Lymphoprep wurde von der Accurate Chemical und Scientific Corp., Westbury, N. Y., erhalten. Humanes IgG, MTT, Anti-Prostaglandin E&sub2;-Antiserum aus Kaninchen, Ammoniumbicarbonat, Dithiothreitol, vollständiges und unvollständiges Freund'sches Adjuvanz, Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, erworben. C3H/HeJ-Mäuse wurden von den Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, gekauft. BALB/c-Mäuse und P3-Myelomzellen wurden von Drs. John Kappier und Philippa Marrack von National Jewish Center for Immunology and Respiratory Medicin (NJC/IRM), Denver, Colorado, erhalten.
Rekombinantes humanes IL-1 wurde von Cistron Biotechnology, Pine Brook, N. J., erhalten. Gereinigtes Phytohämagglutinin wurde von Wellcome Diagnostics, Research Triangle Park, N. C., gekauft. Humane Vorhautfibroblasten aus Primärkulturen wurden von Dr. Richard Clark am NJC/IRM, Denver, Colorado, erhalten. Monoklonale Maus- Antikörper gegen Kaninchen-IgG wurden von AIA Reagents, Aurora, Colorado, erworben. RPMI mit erniedrigtem Methioningehalt wurde unter Verwendung eines Select- Aminkits von GIBCO Laboratories, Grand Island, N. Y., hergestellt. [³&sup5;S]-Methionin, Diphenyloxazol und [¹&sup4;C]-Jodessigsaure wurden von DuPont-NEN, Chicago, Illinois, erhalten. Fötales Kälberserum wurde von HyClone Laboratories, Logan, Utah, gekauft. Mono Q- und Superose 12-Säulen wurden von Pharmacia, Inc., Piscataway, N. J., erworben. C4-Reversed Phase(Umkehrphasen)-Säulen wurden von Synchrom, Inc., Lafayette, Indiana, erhalten. C8-Reversed Phase-Säulen wurden von Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, erhalten. Acetonitril und Polyethylenglycol 8000 wurden von J. T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, N. J., gekauft. Trifluoressigsäure und Guanidinhydrochlorid wurden von Pierce Chemicals, Rockford, Illinois, erhalten. Endoproteinase Lys C wurde von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, erhalten. Die Mikrotiterplatten, die für PGE&sub2;-ELISA verwendet wurden, waren Nung- Immuno-Platten I, erhalten von Intermountain Scientific Corporation, Bountiful, Utah. Die für die Hybridomherstellung verwendeten Platten waren von Costar, Cambridge, Massachusetts.

B. Erzeugen von Monozyten-IL-1-Inhibitor

Humane Leukozyten aus normalen Spendern wurden durch Leukophorese erhalten, in Hank's balanced salt solution (HBSS) im Verhältnis von einem Teil gepackter Zellen zu einem Teil HBSS resuspendiert, mit Lymphoprep unterschichtet und 30 min lang bei 400 · g und Raumtemperatur zentrifugiert. Die mononukleare Fraktion wurde entnommen (typischerweise wurden 4-5 · 10&sup9; Zellen pro Donor erhalten), in HBSS ohne Ca&spplus;&spplus; oder Mg&spplus;&spplus; gewaschen, in serumfreiem RPMI suspendiert und auf Petrischalen plattiert, die mit normalem humanem IgG beschichtet waren, das durch Chromatographie über Sephadex G200 (6 · 10&sup7; Zellen in 10 ml pro 100 mm Schale)von LPS befreit worden war. Alle Reagenzien enthielten weniger als 10 pg/ml LPS. Die Zellen wurden 24 bis 48 Stunden kultiviert; das resultierende konditionierte Medium stellte den rohen IL-1- Inhibitor (IL-1i)-Überstand dar. Typischerweise ergaben die Zellen eines Spenders 700-900 ml rohen IL-1i-Überstand.

C. Tests für den IL-1-Inhibitor

Zum Nachweis von IL-1i wurden routinemäßig zwei IL-1-Tests verwendet. Thymozyten (1 · 10&sup6; Zellen aus 4 bis 6 Wochen alten C3H/HeJ-Mäusen) reagieren auf 1,0 Einheiten/ml rekombinantes humanes IL-1 plus 1 ug/ml Phytohämagglutinin durch halbmaximale Proliferation, gemessen über ³H-Thymidin-Einbau oder Aufnahme des Tetrazoliumsalzes MTT (Mosmann, T., J. Immunol. Method, 65: 55-61 (1983)) nach 3 Tagen Stimulation. Roher IL-1i-Überstand inhibiert diese proliferative Antwort bei einer 1/10-Verdünnung vollständig. Humane Hautfibroblasten (1 · 10&sup5; Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen) reagieren typischerweise auf 0,5 Einheiten/ml rekombinantes humanes IL-1 durch Ausscheiden von ungefähr 50.000 pg/ml PGE&sub2; nach 6 Stunden Stimulation, das mittels ELISA gemessen werden kann. Dieser Test ist so empfindlich für IL-1i, wie der Thymozytentest.

D. Metabolische Markierung des IL-1-Inhibitors

Der IL-1i wurde metabolisch markiert, indem mononukleare Leukozyten 48 Stunden lang auf IgG-beschichteten Platten (wie in B beschrieben) in serumfreiem RPMI, enthaltend nur 0,75 ug/ml kaltes Methionin (15 ug/ml ist üblich), dem 0,5 mCi ³&sup5;S-Methionin (1151 Ci/mmol) pro 10&sup7; Zellen zugesetzt worden waren, kultiviert wurden. Kontrollmarkierungen wurden identisch durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Platten mit fötalem Kälberserum anstelle von IgG beschichtet worden waren. Die Tests mit solchen Kontrollüberständen zeigten, dass sehr wenig IL-1i ausgeschieden wurde, wenn die Zelten auf mit fötalem Kälberserum beschichteten Platten kultiviert wurden.

E. Reinigung IL-1-Inhibitorproteins

Rohe IL-1i-Überstände wurden 1,0 M an Natriumchlorid gemacht, eine Stunde lang auf Eis inkubiert und 15 min lang bei 10-000 UpM zentrifugiert. Zur Gradientenfraktionierung der Proteine auf einer Mono Q-Anionenaustauschersäule wurden die Überstände, die die gesamte Inhibitoraktivität, aber nur 20% des ursprünglichen Proteins enthielten, bei 4ºC ausgiebig gegen 0,025 M Tris, pH 7,6, enthaltend 0,1% Saccharose (A-Puffer) dialysiert,. Nach der Dialyse wurden die Inhibitor enthaltenden Lösungen erneut 15 min lang bei 10.000 UpM zentrifugiert und dann durch einen 0,22 u-Nylonfilter gegeben. Die Überstände wurden typischerweise mit 10 ml eines ähnlich hergestellten Überstandes von einer metabolischen Markierung vereint und auf Mono Q-Superose (Pharmacia FPLC)-Säulen mit Bett-Volumina von entweder 1,0 oder 8,0 ml geladen, mit A-Puffer gewaschen, bis die OD&sub2;&sub8;&sub0; der ausfließenden Lösung zur Grundlinie zurückkehrte, und unter Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten (0,02 M bis 0,10 M) in Puffer A sorgfältig chromatographiert. Die Säulenfraktionen wurden gesammelt und auf Radioaktivität und Bioaktivität analysiert. Proben jeder Fraktion wurden außerdem auf reduzierter 12,5% SDS-PAGE laufengelassen, silbergefärbt, mit Diphenyloxazol durchsetzt, getrocknet und auf einen Film gelegt, um autoradiographische Daten zu erhalten. Fig. 1a zeigt das Proteinprofil der Mono Q-Chromatographie von 40 ml rohem IL-1i- Überstand, gemischt mit 3 ml metabolisch markiertem IL-1i-Überstand. Überlagert sind die Mengen an Radioaktivität, die in 50 ul jeder Fraktion gefunden worden sind, sowie die IL-1i-Bioaktivität, wie sie in dem PGE&sub2;-Produktionstest gemessen wurde. Zwei größere und eine kleinere radioaktive Spezies werden gezeigt, die perfekt mit den drei Bioaktivitätsgipfeln korrelieren. Fig. 1b zeigt die ähnliche Chromatographie von 15 ml rohem IL-1i-Überstand, gemischt mit 3 ml Überstand aus Monozyten, die auf mit fötalem Kälberserum (FCS) anstelle von IgG beschichteten Platten metabolisch markiert worden waren. Die Spiegel der drei radioaktiven Spezies, die oben diskutiert worden sind, sind beachtlich verringert. Fig. 2a zeigt die silbergefärbten Gele, die mit den Fraktionen aus den interessanten Bereichen aus den in den Fig. 1a und 1b gezeigten Chromatographien laufengelassen worden sind. Beachte, dass sowohl die Fraktionen des Radioaktivitätsgipfels als auch die des Bioaktivitätsgipfels in Fig. 1a (Fraktionen 52 und 59) eine Hauptbande bei 22 kD (gekennzeichnet mit Pfeilen) auf SDS-PAGE zeigen. Die dritte Spezies (Fraktion 48 in Fig. 1a) zeigt eine Bande bei 20 kD auf SDS-PAGE. Gelfiltrationsexperimente mit rohem IL-1i haben gezeigt, dass die aktiven Moleküle ein Molekulargewicht von 18 bis 25 kD haben. Fig. 2b ist ein Autoradiogramm der in Fig. 2a gezeigten Gele. Es kann leicht festgestellt werden, dass die Proteinbanden bei 20 und 22 kD die radioaktive Hauptspezies in diesen Fraktionen sind.
Aus der Zusammenfassung dieser Ergebnisse folgt, dass wir gezeigt haben, dass die metabolische Markierung von auf IgG-beschichteten Petrischalen plattierten Monozyten zu einer radioaktiven Spezies führt, die nur wenig erzeugt wird, wenn die Zellen auf mit FCS-beschichteten Schalen plattiert werden. Diese induzierte radioaktive Spezies co-chromatographiert genau mit verschiedenen Spezies der IL-1i-Bioaktivität auf Mono Q, und die Gele und resultierenden Autoradiogramme zeigen, dass die drei induzierten Hauptmoleküle Proteine des für IL-1i vorhergesagten Molekulargewichtes sind.
Die IL-1i-Moleküle wurden für die Sequenzierung auf zwei Arten weiter gereinigt. Zunächst wurden die Mono Q-Fraktionen mit den Bioaktivitäts- und Radioaktivitätsgipfeln auf eine C4-Reversed Phase-Säule geladen und mit einem H&sub2;O/0,1% TFA : Acetonitril/0,1% TFA-Gradienten eluiert. Da Spuren des IL-1i-Moleküles markiert waren, wurden Proben jeder Fraktion direkt gezählt, um Radioaktivität festzustellen, und außerdem durch SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Autoradiographie. Fig. 3a zeigt eine solche Chromatographie mit überlagertem Radioaktivitätsmuster. Die silbergefärbten Gele, die mit Proben von jeder Fraktion (Fig. 3b) durchgeführt wurden, und die anschließenden Autoradiogramme der Gele (Fig. 3c) zeigen, dass das IL-1i-Molekül in den Fraktionen 32-36 gefunden wird. Diese Fraktionen wurden getrocknet und sequenziert. Alternativ wurden die Mono Q-Peak-Fraktionen mit der Speed Vac getrocknet, in 0,4 ml 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3; resuspendiert und direkt zweimal auf einer 10 · 300 mm Superose 12-Gelfiltrationssäule (Pharmacia FPLC) chromatographiert, die im gleichen Puffer equilibriert war, wie in den Fig. 4a und 4b gezeigt. Die Fraktionen wurden gesammelt und Proben jeder Fraktion wurden auf Radioaktivität und Bioaktivität getestet und durch silbergefärbte und autoradiographierte SDS-PAGE analysiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden dann in einer Speed Vac getrocknet und sequenziert.

Beispiel 2

Vorschlag für die Sequenzierung des IL-1-Inhibitors

Vor der Sequenzierung wurden die Proben in 6 M Guanidin-HOI, pH 8,6 gelöst, 4 Stunden lang bei 37ºC unter N&sub2; mit einem 100-fachen molaren Überschuß Dithiothreitol über Protein reduziert und 1 Stunde lang mit einem 400-fachen Überschuss ¹&sup4;C-Jodessigsäure alkyliert. In diesem Fall würden die Reaktionsansätze auf einer C8-Reversed Phase-Säule entsalzt, eluiert und partiell getrocknet werden. Die N-terminalen Sequenzen werden unter Verwendung eines Applied Biosystems Protein Sequencers bestimmt. Um interne Sequenzen zu erhalten, würden Proben, die reduziert und alkyliert sein können, mit Bromcyan oder proteolytischen Enzymen verdaut, wobei dem Fachmann bekannte Verfahren angewandt werden. Die Reaktionsansätze werden getrocknet, in 0,1% TFA/H&sub2;O gelöst und die Peptide werden unter Verwendung einer C8-Reversed Phase-Säule getrennt.

Beispiel 3

Reinigung und Sequenzierung der IL-1-Inhibitoren-Spezies

A. IL-1i-X-, IL-1i-a- und IL-1i-b-Spezies

Die Mono Q-Reinigung von IL-1i löst die biologische Aktivität in drei größere Spezies auf, wie in Fig. 1a gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist, wo die Gipfelfraktionen für diese Aktivität 48, 52 und 59 sind. Die SDS-PAGE von Proben dieser Fraktionen, gezeigt in Fig. 2a, zeigt relevante Spezies bei 20 kD, 22 kD bzw. 22 kD. Eine Western- Analyse solcher Gele unter Verwendung des in Beispiel 4, unten, diskutierten Maus- Antiserums färbt alle drei dieser Spezies. Wenn IL-1i aus Zellen hergestellt wird, die metabolisch mit ³&sup5;S-Methionin markiert sind, ist jede dieser Banden während des Wachstums auf IgG-beschichteten Platten radioaktiv (wie gezeigt in Fig. 2b, dem Autoradiogramm des oben erwähnten Geles). Auf der Basis der in Beispiel 1 diskutierten Überlegungen, nämlich, dass parallele Zellen, die unter nicht-induzierenden Bedingungen inkubiert werden, keine IL-1i-Bioaktivität erzeugen und diese radioaktiven Banden nicht produzieren, können wir schließen, dass diese drei Spezies für die biologische Aktivität verantwortlich sind. Wir haben diese Spezies vorläufig IL-1i-X, IL-1i-a bzw. IL-1i-b genannt.

B. Reinigung und Sequenzierung von IL-1i-X

Mono Q-Fraktionen, die IL-1i-X und/oder IL-1i-a enthielten, wurden weiter durch Reversed Phase-HPLC-Chromatographie auf einer Synchropak RP-4(C4)-Säule gereinigt und die radioaktiven Spezies wurden einer weiteren Sequenzanalyse unterworfen. Zahlreiche Versuche, RP-HPLC-gereinigtes IL-1i-a und IL-1i-b direkt zu sequenzieren, sind fehlgeschlagen, was darauf hinweist, dass sie an ihren N-Termini chemisch blockiert sind. Eine Präparation von IL-1i-a (IL-1i-aB2p42) ergab jedoch die folgende Sequenz:
und anschließende Präparationen von IL-1i-X, ähnlich durch C4 RP-HPLC gereinigt, · haben die gleiche Sequenz erzeugt:
Dies ist offensichtlich ein Teil der in dem ursprünglichen Versuch zur Sequenzierung von IL-1i-a gefundenen Sequenz. Es ist die Schlußfolgerung der Erfinder, dass die gezeigten Sequenzdaten den N-Terminus der 20 kD Spezies, die IL-1i-X genannt wird, darstellen.
In diesen und allen anschließenden Sequenzen weist eine unterstrichene Position entweder darauf hin, dass ein Rest nicht identifiziert werden konnte, oder darauf, dass hinsichtlich des identifizierten Restes Zweifel bestehen. Wenn zwei oder mehr Reste an einer Position angegeben worden sind, weist dies darauf hin, dass mehr als eine Aminosäure in diesem Sequenzierungsschritt nachgewiesen wurde, und der wahrscheinlich richtige Rest ist oben wiedergegeben.

C. Erzeugung. Reinigung und Sequenzierung von Peptiden von IL-1i-a und IL-1i-b

Da IL-1i-a und IL-1i-b scheinbar an ihren N-Termini chemisch blockiert sind, wurden Peptide davon durch Endoproteinaseverdau erzeugt. Im einzelnen wurden Mono Q- Fraktionen, die entweder IL-1i-a oder IL-1i-b enthielten, über eine 4,6 · 250 mm C3-RPHPLC-Säule (Zorbax Protein Plus) gegeben, einer akzeptablen Alternative zu den in allen vorherigen Experimenten verwendeten C4-Säulen. Sehr gradielle Gradienten (0,2% Acetonitril pro Minute bei 0,5 ml/min) trennten das IL-1i-a (Fig. 8a, b) bzw. IL-1i-b (Fig. 9a) besser von der hauptsächlichen kontaminierenden radioaktiven Spezies, humanem Lysozym. Die Identitäten der gereinigten Spezies wurden durch die Gegenwart eines einzelnen, radioaktiven 22 kD-Proteins auf SDS-PAGE und anschließenden Autoradiogrammen (Fig. 8c, d und 9b) bestätigt. Die Proteine wurden mit der Hand in siliconisierte Glasröhrchen gesammelt, denen jeweils 25 ml einer 0,2%igen Tween-20-Lösung zugesetzt wurden. Das Volumen der IL-1i-enthaltenden Fraktionen wurde dann in einer Speed-Vac auf 50 ml reduziert, durch Zugabe von 1% NH&sub4;HCO&sub3; auf 300 ml gebracht, gefolgt von dem Zusatz von 1 mg Endoproteinase. Im Fall von IL-1i-a war das verwendete Enzym Endoproteinase Lys C (Boehringer Mannheim), während IL-1i-b mit Endoproteinase Asp N (Boehringer Mannheim) gespalten wurde. Die Spaltung wurde 16 Stunden lang bei 37ºC durchgeführt und dann wurde das Volumen des Reaktionsgemisches mit einer Speed-Vac auf 50 ml reduziert.
Im Fall von IL-1i-a wurde die Probe direkt chromatographiert, während die IL-1i-b-Probe zunächst durch Zugabe von 5 ml 50 mM Dithiothreitol in 2 M Tris, pH 8,0, reduziert, 30 min bei 37ºC umgesetzt und dann durch Zugabe von 1,1 umol ³H-Jodessigsäure in 10 ml Ethanol carboxymethyliert wurde (Umsetzung 30 min lang bei 37ºC im Dunkeln). Die Trennung der Peptide wurde auf einer 2,1 · 250 mm Brownlee Aquapore RP-300(C8)-Säule mit enger Bohrung bei einer Flußrate von 100 ml/min unter Verwendung einer Beckmann HPLC durchgeführt, die mit Mikrobohrungs-Hardware und Mikrobohrungskompatiblen Pumpen ausgerüstet war. Es wurde ein linearer Gradient von 0 bis 100% in 200 min verwendet (H&sub2;O/0,1% TFA zu Acetonitril/0,1% TFA). Die Peptidtrennungen sind in den Fig. 10 und 11 gezeigt. Die folgende Sequenzinformation wurde erhalten:
Zwei der Peptidsequenzen standen offensichtlich in Zusammenhang mit denen, die früher von IL-1i-X erhalten worden waren. Eine von diesen, RaLysC-41, ist eine IL-1i-a-Sequenz und die andere, RbAspN-51, ist eine IL-1i-b-Sequenz, was darauf hinweist, dass die drei IL-1i-Spezies mindestens nah verwandte Proteine, wenn nicht chemisch und/oder physikalisch modifizierte Form eines einzelnen ursprünglichen IL-1i-Moleküles sind. Wenn die aufgeführten Sequenzen miteinander kombiniert werden, ergeben sich die folgenden zusammengesetzten Sequenzen:
Diese zusammengesetzten Sequenzen scheinen in keinem anderen bekannten Polypeptid vorhanden zu sein, das in der kürzlich auf den neuesten Stand gebrachten Protein Identification Resource Database (PIR 16.0) aufgeführt ist. Die Erfinder glauben, dass diese Sequenzen oder kleinere Varianten davon, eine Klasse von Molekülen repräsentieren, die als IL-1-Inhibitoren wirken können.

Beispiel 4

Herstellung von für den IL-1-Inhibitor spezifischen Antikörpern

10 Wochen alten BALB/c-Mäusen wurde subkutan IL-1i injiziert, das aus rohen Überständen durch Mono Q-Chromatographie partiell (400-fach) gereinigt, gegen PBS dialysiert und mit vollständigem Freund'schen Adjuvanz emulgiert worden war. Jede Maus erhielt der aus 5 ml des rohen Überstandes gereinigte IL-1i. Die Mäuse wurden alle 2 Wochen mit einer entsprechenden Menge von mit unvollständigem Freund'schen Adjuvanz emulgiertem IL-1i, einer Auffrischungsimpfung unterworfen und 7 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung wurden Serumproben aus den Schwänzen entnommen. Die Antiseren wurden auf Anti-IL-1i-Aktivität durch Western-Analyse der Transblotts des Immunogens, das auf SDS-PAGE laufengelassen worden war, wie gezeigt in Fig. 5a, untersucht. Fig. 5b zeigt, dass alle Mäuse nach drei Injektionen von IL-1i Anti-IL-1i- Antikörper erzeugen.
Da monoklonale Antikörper von großem Wert für die Klonierung des IL-1i-Genes aus einer Expressionsbank, die Reinigung des rekombinanten IL-1i-Proteins und die Untersuchung der Biologie des Moleküles sein werden, haben wir mit dem Prozess des Herstellens einer Reihe von monoklonalen Antikörpern, die für IL-1i spezifisch sind, begonnen. Zur Erzeugung von Hybridomen mit B-Zellen wurden den oben genannten Mäusen 24 Stunden vor der Entfernung der Milz die gleiche Menge von IL-1i in Kochsalz intravenös injiziert. Die Splenozyten wurden aus den Milzen in kalte ausgewogene Salzlösung (BSS) gezupft, zweimal in BSS gewaschen, mit P3-Myelomzellen in einem Verhältnis von 2 · 10&sup7; P3 pro 10&sup8; Milz-B-Zellen gemischt und herunterzentrifugiert. Die Zellen wurden dann durch tropfenweise Zugabe von 1 ml warmem, begastem (5% CO&sub2;) PEG 6000 (40% Polyethylenglycol 6000: 60% essentielles Minimalmedium) zu dem trockenen Pellet fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden mit BSS gewaschen und in 10 ml reichen Mediums (10% FBS), das 2 · 10&sup5; peritoneale Zellen pro ml enthielt, resuspendiert und das Pellet wurde sanft unter Verwendung einer 10 ml Pipette aufgebrochen. Das Volumen wurde auf 20 ml eingestellt, wobei mehr peritoneale Zellen dem Medium zugefügt wurden, und die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen mit 0,1 ml/Vertiefung ausplattiert. Die Platten wurden in einen Gasinkubator gestellt und anschließend auf die folgende Weise behandelt:
Tag 1 - Zufügen von 3 · HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin) in reichem Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 ·
Tag 5 - Mediumwechsel, Ersetzen durch 200 ul 1 · HAT in reichem Medium
Tag 10 - Beginn der Untersuchung auf Wachstum von Hybriden. Wechsel des Mediums, Ersetzen durch 200 ul 1 · HAT in reichem Medium, enthaltend 1,5 · 10&sup6; peritoneale Zellen pro ml.
Wenn die Hybridzellen in einer Vertiefung beinahe konfluent waren, wurden die Überstände zum Testen übertragen und die Zellen wurden sanft mit einer Pipettenspitze abgekratzt und in 1 ml Kulturvertiefungen, enthaltend 1 · HAT in reichem Medium plus 3 · 10&sup6; peritoneale Zellen pro ml, überführt.
Die Überstände aus den konfluenten Vertiefungen werden auf Anti-IL-1i-Aktivität unter Verwendung eines ELISA getestet, in dem partiell gereinigtes IL-1i (Mono Q-gereinigtes Material identisch jenem, das den Mäusen injiziert wurde) an die Vertiefung der Mikrotiterplatten gebunden wird. Normales Mausserum und Hyperimmunantiseren werden als negative bzw. als positive Kontrollen verwendet. Positive Überstände werden erneut mit ELISA auf Platten getestet, die mit homogen gereinigtem IL-1i und durch Immunpräzipitation von gereinigtem metabolisch markiertem IL-1i beschichtet sind. Positive Zellen werden dann durch limitierte Verdünnung kloniert und Pristan-behandelten Mäusen zur Erzeugung von Aszites injiziert. Große Mengen IL-1i-spezifischer Antikörper können durch Gewebekultur produziert werden oder durch massive Erzeugung und Sammlung von Ascitesflüssigkeit in Mäusen. Die Reinigung dieser Antikörper und deren Anheftung an unlösliche Kugeln wird zu Affinitätsadsorbenzien für die Reinigung des rekombinanten IL-1i-Proteines führen.

Beispiel 5

Klonieren der IL-1i-cDNA

Es konnte gezeigt werden, dass auf IgG-beschichteten Petrischalen plattierte und 24 Stunden lang in Gegenwart von [³&sup5;S]-Methionin kultivierte Monozyten [³&sup5;S]- IL-1i erzeugten, der aufgrund seiner chromatographischen Eigenschaften auf Mono Q identifiziert werden konnte.
Um zu bestimmen, wann (während des 24 Stunden-Zeitraums) IL-1i mit maximaler Rate erzeugt wurde, wurden die plattierten Monozyten für einen kurzen, 2-stündigen Zeitraum [³&sup5;S]-Methionin ausgesetzt (gepulst), nach welcher Zeit ein großer Überschuss unmarkierten Methionins zugefügt wurde und weitere 2 Stunden inkubiert wurde. Das Medium wurde dann gesammelt und auf radioaktiv markierten IL-1i untersucht. Dieses Verfahren wurde auf Monozyten zu verschiedenen Zeiten nach dem Plattieren der IgG-beschichteten Platten angewendet und es wurde festgestellt, dass, wenn die Monozyten 15 Stunden nach dem Plattieren [³&sup5;S]-Methionin ausgesetzt wurden, die maximale Menge an [³&sup5;S]-IL-1i erzeugt wurde, was darauf hinweist, dass die IL-1i-mRNA in den Monozyten 15 Stunden nach dem Plattieren auf IgG auf ihrem Höchstspiegel war.
Es wurden dann frische Monozyten auf LPS-freiem IgG plattiert, das wie in Beispiel 1B erhalten wurde. Nach 15-stündiger Inkubation in RPMI-Medium bei 37ºC wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, dann mit 4 M Guadiniumthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7, 0,5% Sarcosyl, 0,1 M 2-Mercaptoethanol lysiert. Aus diesem Lysat wurde die Gesamt-RNA mittels des AGPC-Verfahrens nach P. Chomczynski und N. Sacchi, beschrieben in Analytical Biochemistry, Bd. 162, S. 156-159 (1987), isoliert..
Poly A&spplus;-RNA wurde mit Oligo dT-Zellulose-Chromatographie nach dem Verfahren von Aviv, H. und Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69: 1408-1412 isoliert, mit Ethanol präzipitiert und in einer Konzentration von 0,36 ug/gl gelöst. Ein Mikrogramm Poly A&spplus;-RNA wurde verwendet, um nach Gubler, U. und Hoffman, B. J. (1983) Gene 25: 263-169, cDNA herzustellen.
Die cDNA wurde in eine λ-g11-Expressionsbank unter Verwendung von EcoRI-Linkem von Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 988448, oder New England Bio Lab, Nr. 1070, im Einklang mit den von diesen Herstellern gegebenen Instruktionen eingebaut.
Die resultierende Bank, die 10&sup6; unabhängige Klone enthält, wurde auf E. coli Y1090 rk&supmin; (Promega Biotec) mit einem geeigneten polyklonalen Antikörper gegen IL-1i durchmustert, wie zuvor beschrieben, wobei die von R. A. Young und R. W. Davis [(1983) PNAS 80: 1194-1198] beschriebenen Bedingungen verwendet wurden. Bei Verwendung eines biotinylierten zweiten Antikörpers (beispielsweise eines Ziegen-Antikörpers gegen Maus-IgG, Bethesda Research Labs), gefolgt von einem Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase (Bethesda Research Labs), wie beschrieben von Bayer, E. A. und Wilchek, M. (1979) in Methods in Biochemical Analysis, und Guesdon, J. L. Ternynch, T. und Avrameas, S. (1979) J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1138 im Einklang mit den Anweisungen des Herstellers wurden positive Signale nachgewiesen.

Beispiel 6

Herstellung und Sequenzierung des für IL-1i kodierenden Genes

Die wie im Beispiel 5 beschrieben hergestellte cDNA wurde in den Klonierungsvektor λ-GT10 eingebaut. Diese cDNA wurde zuerst unter Verwendung von EcoRI-Methylase mit S-Adenosylmethionin als Substrat methyliert, in einer Ligationsreaktion wurden EcoRI-Linker angeheftet und überschüssige Linker wurden durch Verdauen mit EcoRI-Endonuklease und Chromatographie auf einer CL6B Spin-Säule entfernt. Mit 0,124 ug der mit Linkem versehenen, größenselektierten cDNA und 1 ug EcoRI-geschnittenem und Phosphatase-behandeltem λ-GT10 wurde eine Ligationsreaktion durchgeführt, und die Produkte dieser Ligationsreaktion wurden unter Verwendung eines GIGAPACK-GOLD-Verpackungsextraktes (Stratagene) verpackt. Dies führte zu einer Bank von 1 · 10&sup7; Klonen.
Zum Durchmustern dieser GT10-Bank wurden Oligonukleotid (antisense)-Sonden auf der Grundlage der in Beispiel 3 dargestellten Protein- und Peptidsequenzen synthetisiert. Die Sequenzen der Sonden und deren entsprechende Peptidsequenzen sind die folgenden:
Beachte: N = A, G, C, und T
Sonde #IL1i1-3 wurde an ihrem 5'-Ende mit ³²P phosphoryliert und zum Durchmustern von 3 · 10&sup5; Plaques der Bank verwendet. Die Sonde hybridisierte reproduzierbar mit 3 Plaques, und von diesen konnte für einen Plaque gezeigt werden, dass er außerdem mit Sonde #IL1i1-4 hybridisierte. Dieser Plaque, GT10-IL1i-2A, wurde kultiviert und die DNA wurde unter Verwendung von Lambdasorb (Promega) im Einklang mit den Anweisungen des Herstellers isoliert. GT10-IL1i-2A wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland, unter der HinteMegungs-Nr. 40488 hinterlegt. Die DNA wurde mit EcoRI verdaut, in fünf gleiche Aliquots aufgeteilt und auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisiert.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt. Eine Fotografie dieses Geles ist in Fig. 12a gezeigt. Die Spuren 6, 8, 10, 12 und 14 enthalten 5 Aliquots aus dem EcoRI-Verdau. Spur 5 enthält eine Mischung aus Wildtyp-λ-DNA, geschnitten mit HindIII und φX174 RF-DNA, geschnitten mit Haelll (New England Biolabs) als Molekulargewichtsmarker. Fig. 12a zeigt, dass GT10-IL1i-2A ein EcoRI-Fragment mit einer Länge von 1850 Basenpaaren enthält.
Um schlüssiger zeigen zu können, dass das 1850 bp-Fragment die für den IL-1-Inhibitor kodierende Sequenz trägt, wurde ein Southern-Blot wie folgt durchgeführt. Die DNA- Fragmente des in Fig. 12a gezeigten Geles wurden auf Nitrozellulose unter Anwendung von Standardverfahren geblottet (übertragen). Die Nitrozellulose wurde dann längs in 5 Streifen geschnitten, so dass je ein Streifen die DNA aus Spur 6, 8, 10, 12 bzw. 14 enthielt. Die Streifen wurden dann einzeln mit jeder der 5 Oligonukleotidsonden (oben) hybridisiert, die an ihren 5¹-Ende mit ³²P-Phosphat markiert worden waren. Die Oligonukleotidkonzentration betrug 1 umol/ml und die Hybridisierungstemperaturen wurden wie folgt gewählt:
Nach dem Waschen wurden die Streifen nebeneinander angeordnet und zusammengeklebt, um wieder das ursprüngliche Nitrozelluloseblatt zu bilden. Dies wurde 24 Stunden lang bei -70ºC in Gegenwart eines Verstärkungsschirmes autoradiographiert. Fig. 12b ist eine Fotografie dieser Autoradiographie. Sie beweist, dass alle Sonden spezifisch mit dem 1850 bp-Fragment hybridisieren, was zeigt, dass dieses Fragment die wesentlichen kodierenden Sequenzen für den IL-1-Inhibitor trägt.
Um ihre DNA-Sequenz zu bestimmen, wurde die GT10-IL-1i-2A-DNA mit EcoRI verdaut, auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisiert und das 1850 bp-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit EcoRI-verdautem M13 mp19 ligiert und in E. coli- Stamm JM109 transformiert. Die Transformanten wurden durchmustert, indem solche ohne β-Galactosidaseaktivität gesucht wurden. Fünf solcher Transformanten wurden isoliert, es wurde einzelsträngige DNA hergestellt und eine Sequenzierung nach Sanger et al. durchgeführt. Die DNA-Sequenz von drei der Transformanten entsprach dem 3'-Ende der mRNA, während zwei Transformanten Protein-kodierende Sequenzen lieferten.

Beispiel 7

Sequenzierung von GT10-IL-1i-2A und IL-1i

Ein Teil von GT10-IL-1i-2A ist sequenziert worden und wird in Fig. 14 gezeigt. Die DNA kodiert ein Protein, das Aminosäuresequenzen enthält, die für IL-1i charakteristisch sind (Nukleotide 99-557). Es wird jedoch angenommen, dass an diesem Protein einige Modifikationen vorgenommen werden, bevor es in das extrazelluläre Milieu ausgeschieden wird. Diese Modifikationen können oder können auch nicht wesentlich für die Aktivität des Proteins als ein IL-1i.
GT10-IL1i-2A kodiert mindestens 32 Aminosäuren N-terminal von dem Aminoterminus der als X bekannten Form von IL-1i (Nukleotide 3-98). Es wird angenommen, dass diese 32 Aminosäuren eine Signalsequenz enthalten, die bei dem von den Nukleotiden 24-26 kodierten M beginnt, das wachsende IL-1i in das extrazelluläre. Milieu leitet und dann von einer Signalpeptidase und möglicherweise anderen Peptidasen entfernt wird. Das Ausmaß, zu dem diese Sequenz in den α- und β-Formen von IL-1i entfernt wird, ist derzeit unbekannt, aber es wird angenommen, dass der N-Terminus dieser Formen nahe dem der Form X liegt. Die Entfernung der Sekretionsleitsequenz ist wahrscheinlich erforderlich, damit das Protein wirksame IL-1i-Aktivität hat.
Die Nukleotide 349 bis 351 von GT10-IL-1i-2A kodieren einen N-Rest, der Teil einer Konsensus-N-Glycosylierungsstelle ist. Auf der Grundlage ihrer Empfindlichkeit für einen Verdau mit N-Glycanase wird angenommen, dass die α- und β-Formen von IL-1i glycosyliert sind. Da weiter angenommen wird, dass die Form X gegenüber einem Verdau mit diesem Enzym nicht empfindlich ist, wird angenommen, dass sie nicht glycosyliert ist, obwohl dies eine Möglichkeit bleibt, die von einem Fachmann auf dem Gebiet der Proteinsequenzierung unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen leicht gezeigt werden könnte. Es wird angenommen, dass die Glycosylierung dieses N-Restes für eine wirksame IL-1i-Aktivität nicht erforderlich ist.
Die Nukleotide 99-101 von GT10-IL-1i-2A kodieren ein P (siehe Fig. 15), aber an dieser Position (dem N-Terminus) der Form X von IL-1i ist kein P nachgewiesen worden. Es ist möglich, dass dieser Rest im reifen Protein modifiziert ist. Es wird angenommen, dass die Modifikation dieses Restes für eine wirksame IL-1i-Aktivität nicht wesentlich ist.
Die derzeit unbekannten N-terminalen Reste der α- und β-Formen sind durch Edman- Abbau nicht vollständig nachweisbar und werden wahrscheinlich nach Entfernung einiger der N-terminalen Reste des von GT10-IL-1i-2A kodierten Proteines modifiziert. Es wird angenommen, dass diese Modifikation für eine wirksame IL-1i-Aktivität nicht wesentlich ist.

Beispiel 8

Expression von IL-1i-kodierenden Genen in tierischen Zellen

Die Expression von IL-1i in tierischen Zellen erfordert die folgenden Schritte:
a. Konstruktion eines Expressionsvektors
b. Auswahl einer Wirtszelllinie
C. Einführen des Expressionsvektors in die Wirtszellen
d. Manipulation der rekombinanten Wirtszellen, um die Expressionsspiegel von IL-1i zu erhöhen.
1. Für die Verwendung in tierischen Zellen vorgesehene IL-1i-Expressionsvektoren können verschiedenen Typen angehören, einschließlich starker konstitutiver Expressionskonstrukte, induzierbarer Genkonstrukte sowie solcher, die für die Expression in besonderen Zelltypen entworfen worden sind. In allen Fällen werden Promotoren und weitere Gen-regulatorische Bereiche, z. B. Enhancer (induzierbar oder nicht) und Polyadenylierungssignale in entsprechender Anordnung im Verhältnis zur cDNA-Sequenz in Vektoren auf Plasmidgrundlage angeordnet. Zwei Beispiele solcher Konstrukte folgen: (1) ein Konstrukt, das einen starken konstitutiven Promotorbereich verwendet, sollte unter Verwendung der Affenvirus 40 (SV40)-Genkontrollsignale in einer Anordnung hergestellt werden, wie sie in dem von Gorman et al. in Mol. Cel. Biol. 2: 1044-1051, 1982, beschriebenen Plasmid pSV2CAT gefunden wird. Die Literaturstelle wird durch Bezugnahme hier einbezogen. Dieses Plasmid könnte auf eine solche Weise manipuliert werden, dass die IL-1i-cDNA die für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierenden Sequenzen ersetzt, wie gezeigt in Fig. 6, wobei molekularbiologische Standardverfahren (Maniatis et al., a.a.O.) verwendet werden. (2) Ein induzierbares Genkonstrukt könnte unter Verwendung des Plasmides PMK hergestellt werden, das den Promotorbereich des Metallothionins (MT-1) von Maus enthält (Brinster et al., Cell 27: 228-231, 1981). Dieses Plasmid kann als Ausgangsmaterial verwendet werden und sollte wie in Fig. 7 gezeigt manipuliert werden, um zu einem metallinduzierbaren Genkonstrukt zu führen.
2. Eine Anzahl von tierischen Zelllinien sollte verwendet werden, um IL-1i unter Verwendung der oben beschriebenen Vektoren zu exprimieren, um aktives Protein zu produzieren. Zwei mögliche Zelllinien, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Fremdgenexpression zu unterstützen, gut charakterisiert sind, sind die LtK&supmin;Zellen von Maus und die Chinese hamster ovary (CHO)-dhfr&supmin;Zellen; die Expression von IL-1i ist jedoch nicht auf diese Zelllinien beschränkt.
3. Die Vektor-DNA sollte in diese Zelllinien unter Verwendung irgendeiner der großen Zahl von Gentransferverfahren eingeführt werden. Das hier verwendete Verfahren involviert das von S. L. Graham & A. S. von der Eb (Virology 52: 456467, 1973) beschriebene Calciumphosphat-DNA-Präzipitationsverfahren, bei dem der Expressionsvektor für IL-1i mit einem zweiten Expressionsvektor, der für einen selektierbaren Marker kodiert, co-präzipitiert wird. Im Fall der Transfektion von Ltk&supmin;-Zellen ist der selektierbare Marker ein Thymidinkinasegen und die Selektion wird wie von Wigler, et al. (Cell 16: 777-785, 1979) beschrieben durchgeführt, und im Fall von CHO-dhfr&supmin;-Zellen ist der selektierbare Marker die Dihydrofolatreductase (DHFR), deren Selektion wie von Ringold et al. in J. Mol. Appl. Genet. 1: 165-175, 1981 beschrieben durchgeführt wird.
4. Die die IL-1i-Genkonstrukte exprimierenden Zellen sollten dann unter Bedingungen wachsengelassen werden, unter denen das Ausmaß der IL-1i-Produktion gesteigert wird. Zellen, die Konstrukte mit dem Metallothionin-Promotor tragen, können nun in Gegenwart von Schwermetallen, beispielsweise Cadmium, wachsengelassen werden, was zu einer 5-fach gesteigerten Verwendung des MT-1-Promotors führt (Mayo et al., Cell 29: 99-108), was anschließend zu einer vergleichbaren Erhöhung der IL-1i-Proteinspiegel führt. Auf Zellen, die IL-1i-Expressionsvektoren (entweder auf SV40- oder MT-1-Grundlage) zusammen mit einem DHFR-Expressionsvektor enthalten, kann das von Ringold et al., (J. Mol. Appl. Genet. 1: 165-175, 1981) beschriebene Genamplifikationsprotokoll unter Verwendung von Methotrexat, einem kompetitiven Antagonisten von DHFR, angewendet werden. Dies führt dazu, dass mehr Kopien des DHFR-Genes und gleichzeitig eine erhöhte Kopienzahl des IL-1i-Genes in den Zellen vorhanden sind, was zur Produktion von mehr IL-1i-Protein durch die Zellen führen kann.

Beispiel 9

Reinigung von IL-1i aus rekombinanten tierischen Zellen

Da von dem IL-1i erwartet wird, dass er aus den Zellen wie natürliches Material ausgeschieden wird, wird erwartet, dass die vorstehend zur Reinigung des natürlichen Proteins beschriebenen Verfahren eine ähnliche Reinigung und Charakterisierung des rekombinanten Proteines erlauben werden. Beispiel 11 Ein Protein mit der Sequenz:
in der X Cystein, Serin oder Alanin und Z Arginin oder Prolin ist, wird von der Erfindung ebenfalls umfasst.

Beispiel 10

Seauenz von IL-1i

Der aminoterminale Rest von IL-1i ist mehrfach durch direkte Proteinsequenzierung als Arginin (R) identifiziert worden. Das Ergebnis einer solchen Sequenzierung ist im Beispiel 3 gezeigt. Im Gegensatz dazu ist der aminoterminale Rest von IL-1i, wie er anhand der cDNA-Sequenz vorhergesagt wird, ein Prolin (P). Dieser aminoterminale Rest ist in den Fig. 14 und 15 eingekreist. Diese offensichtliche Diskrepanz zwischen der cDNA-Sequenz und der direkten Proteinsequenz kann unter der Annahme erklärt werden, dass während der durch reverse Transkriptase katalysierten Synthese der cDNA aus der rnRNA ein Fehler in die cDNA-Sequenz eingebaut worden ist. Das heißt, dass ein CGA (Arginin)-Kodon, angeordnet auf der mRNA, wo es für diesen aminoterminalen Rest kodieren würde, während der reversen Transkriptasereaktion in ein CCA (Prolin)-Kodon in der cDNA hätte verändert werden können. Dieser Typ von Problem mit reverser Transkriptase ist in der Literatur bereits zuvor erwähnt worden, z. B. von B. D. Clark et al. in Nucleic Acids Research 14: 7897 (1986).
Die Erfinder glauben, dass die korrekte Aminosäuresequenz des Proteins die von der cDNA vorhergesagte ist, mit der Ausnahme, dass die aminoterminale Aminosäure ein Arginin anstelle des in den Fig. 14-15 gezeigten Prolinrestes ist. Die Erfinder gehen davon aus, dass beide DNA-Sequenzen und ihre entsprechenden Peptidsequenzen in den Schutzbereich der Erfindung fallen, obwohl die Sequenz mit einem aminoterminalen Arginin bevorzugt ist.

Claims

1. Rekombinantes Polypeptid mit Interleukin-1-Inhibitor(IL-1i)-Aktivität, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:

(A) einer Aminosäuresequenz, die von einem Fragment der kodierenden Region einer DNA-Sequenz (A) kodiert wird, die einen IL-1i oder einen IL-1i mit einer N-terminalen Ausscheidungsleitsequenz (Signalsequenz) wie im Folgenden angegeben kodiert:

wobei S in der DNA-Sequenz C oder G ist, und wobei (X) R oder P ist;

(B) einem Fragment der nachstehenden Aminosäuresequenz:

(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (U) nicht vorhanden oder M ist, oder eine N-terminale Ausscheidungsleitsequenz (Signalsequenz) umfasst, die in der Lage ist, das Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität in prozessierter Form aus einer Zelle auszuschleusen, und in der (X) R oder P ist; oder

(C) einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 70% homolog zu der Aminosäuresequenz des nativen IL-1-Inhibitors mit der nachstehenden Aminosäuresequenz ist:

(X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (X) R oder P ist;

mit der Maßgabe, dass die Aminosäuresequenz von (A), (B) oder (C) die Aminosäuresequenz von Position 26 bis zum Ende oder von Position 1 bis zum Ende der nachstenden Sequenz nicht umfasst:

in der (X) entweder P = Prolin oder R = Arginin ist.

2. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass (X) R = Arginin ist.

3. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es das Fragment der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 1 (B) umfasst, wobei (U) M ist.

4. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens zu 80% homolog zu der Aminosäuresequenz des nativen IL-1-Inhibitors mit der nachstehenden Aminosäuresequenz ist:

(X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der X entweder R oder P ist.

5. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz mindestens zu 90% homolog ist.

6. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz mindestens zu 95% homolog ist.

7. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es das Fragment gemäß Anspruch 1 (B) umfasst, wobei (U) nicht vorhanden ist.

8. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es von einer rekombinanten Wirtszelle gebildet wird.

9. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.

10. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle Escherichia coli ist.

11. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.

12. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.

13. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ein durch Expression in Hefe oder Säugerzellen erhältliches Glycosylierungsmuster aufweist oder nichtglycosyliert ist.

14. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es zu 90% rein ist.

15. Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es zu 95% rein ist.

16. Isoliertes DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz umfasst, die ein Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert,

mit der Maßgabe, dass das DNA-Molekül die nachstehende Nukleotidsequenz von Position 99 bis Position 554 oder von Position 1 bis 554 nicht umfasst:

in der das S entweder C oder G ist, wobei das Codon Prolin oder Arginin kodiert.

17. Isoliertes DNA-Molekül gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA-Sequenz umfasst, die aus einem Fragment der kodierenden Region der nachstehenden Sequenz (A) ausgewählt ist.

(A)

18. Rekombinanter DNA-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 16-17 umfasst.

19. Vektor gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Expressionsvektor ist und weiterhin mindestens ein zur Expression des DNA-Moleküls in einem Wirt benötigtes funktionelles Element umfasst.

20. Vektor gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül in Bakterien oder in Säugerzellen exprimiert werden kann.

21. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül umfasst, das die nachstehende Aminosäuresequenz kodiert:

(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (U) nicht vorhanden oder M ist, oder eine N-terminale Ausscheidungsleitsequenz (Signalsequenz) umfasst, die in der Lage ist, das Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität in prozessierter Form aus einer Zelle auszuschleusen, und in der (X) R oder P ist.

22. Vektor gemäß Anspruch 21, wobei (X) R = Arginin ist.

23. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 16 oder 17 umfasst, wobei das DNA-Molekül ein Polypeptid mit IL-1- Inhibitor-Aktivität kodiert.

24. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22 enthält.

25. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Bakterienzelle ist.

26. Wirtszelle gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie Escherichia coli ist.

27. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Säugerzelle ist.

28. Wirtszelle gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine CHO-Zelle ist.

29. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-15, in dem das Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität in einer Wirtszelle hergestellt wird, die ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 16 bis 17 umfasst.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, das darüber hinaus die Gewinnung des gebildeten Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität umfasst.

31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Molekül Promotor-DNA umfasst, die mit der DNA-Sequenz funktionell verbunden ist.

32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 29 oder 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die zur Expression des Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität geeignet sind.

33. Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es den weiteren Schritt des Herstellens einer das Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst.

34. Verwendung eines Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung von Interleukin-1.

35. Verwendung eines Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines durch IL-1 vermittelten pathophysiologischen Zustands.

36. Verwendung eines Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis, rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis, Osteoporose, juvenilem Diabetes, Psoriasis, Lupus Erythematosus, Fibrose, Glomerulonephritis, Gicht, akuten fiebrigen Erkrankungen, Sarcoidose oder Lymphomen, zur Behandlung eines Patienten nach einer Schädigung des Gehirns durch Gefäßverschluss oder zur Behandlung von akuten oder chronischen interstitiellen Lungenerkrankungen.

37. Verwendung eines Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität, das die nachstehende Aminosäuresequenz umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis, rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis, Osteoporose, juvenilem Diabetes, Psoriasis, Lupus Erythematosus, Fibrose, Glomerulonephritis, Gicht, akuten fiebrigen Erkrankungen, Sarcoidose oder Lymphomen, zur Behandlung eines Patienten nach einer Schädigung des Gehirns durch Gefäßverschluss oder zur Behandlung von akuten oder chronischen interstitiellen Lungenerkrankungen:

(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (U) nicht vorhanden oder M ist, und (X) R oder P ist.

38. Verwendung gemäß Anspruch 37, wobei (X) R = Arginin ist.

39. Verwendung eines Polypeptids mit IL-1-Inhibitor-Aktivität, das die nachstehende Aminosäuresequenz umfasst, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung eines durch IL-1 vermittelten pathophysiologischen Zustands:

(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (U) nicht vorhanden oder M ist, und (X) R oder P ist.

40. Verwendung gemäß Anspruch 39, wobei (X) R = Arginin ist.

41. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung von Interleukin-1, umfassend ein Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-7.

42. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines durch IL-1 vermittelten pathophysiologischen Zustands, die ein Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-7 umfasst.

43. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis, rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis, Osteoporose, juvenilem Diabetes, Psoriasis, Lupus Erythematosus, Fibrose, Glomerulonephritis, Gicht, akuten fiebrigen Erkrankungen, Sarcoidose oder Lymphomen, zur Behandlung eines Patienten nach einer Schädigung des Gehirns durch Gefäßverschluss oder zur Behandlung von akuten oder chronischen interstitiellen Lungenerkrankungen, umfassend ein Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität gemäß einem der Ansprüche 1-7.

44. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Arthritis, rheumatoider Arthritis, Morbus Crohn, ulcerativer Colitis, Osteoporose, juvenilem Diabetes, Psoriasis, Lupus Erythematosus, Fibrose, Glomerulonephritis, Gicht, akuten fiebrigen Erkrankungen, Sarcoidose oder Lymphomen, zur Behandlung eines Patienten nach einer Schädigung des Gehirns durch Gefäßverschluss oder zur Behandlung von akuten oder chronischen interstitiellen Lungenerkrankungen, umfassend ein Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität, das die nachstehende Aminosäuresequenz umfasst:

(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F f R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (U) nicht vorhanden oder M ist, und (X) R oder P ist.

45. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 44, wobei (X) R = Arginin ist.

46. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines durch IL-1 vermittelten pathophysiologischen Zustands, umfassend ein Polypeptid mit IL-1-Inhibitor-Aktivität, das die nachstehende Aminosäuresequenz umfasst:

(U) (X) P S G R K S S K M Q A F R I W D V N Q K T F Y L R N

N Q L V A G Y L Q G P N V N L E E K I D V V P I E P H A

L F L G I H G G K M C L S C V K S G D E T R L Q L E A V

N I T D L S E N R K Q D K R F A F I R S D S G P T T S F

E S A A C P G W F L C T A M E A D Q P V S L T N M P D E

G V M V T K F Y F Q E D E,

in der (U) nicht vorhanden oder M ist, und (X) R oder P ist.

47. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 45, wobei (X) R = Arginin ist.