DE3888779T2

DE3888779T2 - Immuntestsatz und -verfahren für ganze Zellen.

Info

Publication number: DE3888779T2
Application number: DE3888779T
Authority: DE
Inventors: Dominique Carriere
Original assignee: Elf Sanofi SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1987-09-30
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2008-10-01
Also published as: PT88615B; NO177444B; KR0126236B1; KR890005518A; FI95752B; EP0311492B1; NO884327D0; JPH01121755A; NO884327L; EP0311492A2; DE3888779D1; AU2294888A; PT88615A; EP0311492A3; IL87882A; AU621310B2; DK550288D0; FI884472A; ES2053785T3; DK550288A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit und ein Verfahren zur immunometrischen Bestimmung unter Anwendung dieses Kits zur Bestimmung von Oberflächenantigenen, die für Populationen oder Unterpopulationen von Zellen charakteristisch sind. Das immunometrische Bestimmungsverfahren und der dazugehörige Kit sind auch zur Bestimmung der Zellen selbst über die Bestimmung ihrer Oberflächenantigene gedacht. Diese Bestimmungen können diagnostisch angewendet werden.
Die Kenntnis der Antigene oder Marker der Zelloberfläche erfuhr einen enormen Fortschritt mit der Anwendung der lymphozytären Hybridisierung und der Entdeckung der monoklonalen Antikörper durch Koehler und Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497). Insbesondere die monoklonalen Antikörper gestatteten den Nachweis und die Analyse von Oberflächenmarkern oder Membranantigenen von Zellen verschiedensten Ursprungs. Diese Marker (oder Antigene) können unterschiedlicher Art sein: Proteine, Glycoproteine oder Glycolipide. Die gesuchten Charakterisierungen sind dabei in erster Linie auf Gewebe- oder Organmarker, auf Marker im Differenzierungs- oder Aktivierungszustand von normalen Zellen und auf die Identifikation oder Typisierung von normalen oder kanzerösen Zellen gerichtet. Ein besonders wichtiges Anwendungsgebiet ist die Untersuchung der Zellinien der Hämatopoese (von Erythrozyten, Megakaryozyten, Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten).
So ermöglichten beispielsweise die monoklonalen Antikörper die genaue Bestimmung der entsprechenden Oberflächencharakteristika von T- und B-Lymphozyten. Die entsprechenden Marker identifizieren alleine oder in Kombination Differenzierungs- und funktionelle Spezialisierungsstadien der Lymphozyten. Durch ein internationales Übereinkommen wurden die Oberflächenmarker der menschlichen Leukozyten in Differenzierungsgruppen oder -klassen (CD) eingeteilt, die im Unterausschuß der WHO-IUIS, 1984 definiert und im Bulletin der Weltgesundheitsorganisation, 1984, 62 (5), 813-815, beschrieben sind.
Durch die Identifikation dieser Marker, die dank der monoklonalen Antikörper möglich gemacht wurde, erlangte man Zutritt zu deren Struktur und deren biologischen Funktionen. Beispielsweise nehmen die Moleküle der Marker CD4 und CD8 an leukozytären Adhäsionsfunktionen teil und befinden sich an Oberfläche der T-Lymphozyten mit einer Hilfs- und Induktionsfunktion (Marker CD4) bzw. mit einer zytotoxischen und suppressiven Funktion (Marker CD8).
Die Etablierung dieser Kenntnisse gestattete die Verwendung dieser Marker dank der sie erkennenden Antikörper bei der Diagnose und Überwachung von verschiedenen Krankheitszuständen, insbesondere malignen Hämopathien (Leukämie, Lymphomen, etc.) und von Dysfunktionen des Immunsystems (Autoimmunkrankheiten, ererbte oder erworbene immunschwächen, wie AIDS, etc.) (Breton-Gorius und Vainchenker, Le Biologiste, 1987, XXI, Nr. 167 63-70, Shaw, immunology Today, 1987, 8 (1), 1-3).
Monoklonale Antikörper sind heutzutage unersetzliche Werkzeuge der bei Zellanalysen angewendeten klinischen Biologie.
Es gibt Verfahren zum Zählen von Zellen unter Markierung von deren Oberflächenantigenen, diese Methoden sind aber häufig langwierig, mühsam, schwierig in der Durchführung, und die Ergebnisse sind manchmal zufallsbedingt.
Die bekannten und zur Messung der normalen oder modifizierten Expression von Oberflächenantigenen einer Zelle verwendeten Verfahren können in zwei Gruppen geteilt werden. In der ersten Gruppe werden die Antigene mit Hilfe von komplizierten und speziellen Laborausrüstungen, beruhend auf der Durchfluß-Zytometrie (siehe insbesondere Poncelet et al., J. Immunol. Methods, 1985, 85, 65-74) oder den Methoden der quantitativen Mikroskopie (Poulter et al. J. Immunol. Methods, 1987, 98, 227-234) gemessen. Die Durchführung dieser Verfahren zur Bewertung der Zellantigene basiert auf der Messung von Signalen, die von Antizellantikörpern abgegeben werden, die direkt oder indirekt an ein mit fluoreszierenden (oder fluorochromen) Substanzen, wie Fluoreszein- oder Rhodaminisothiocyanat, oder Enzymen, wie Peroxidase oder Alkaliphosphatase, markiertes Reagens gekoppelt sind. Der Einsatz dieser fluoreszierenden oder enzymatischen Reagenzien in Verbindung mit entsprechenden Waschschritten führt dann zu Fluoreszenz- oder Farberscheinungen, die streng auf die Zellmembranen beschränkt sind und nicht in das umliegende Milieu diffundieren. Die laufende Verwendung dieser Laborverfahren ist nach wie vor durch die Notwendigkeit einer speziellen und kostspieligen Apparatur (Fluoreszenzmikroskop gegebenenfalls in Verbidung mit einem Bildanalysator, Kryostat, Durchfluß-Zytometer) limitiert. Außerdem erfordern die Analyse und die Interpretation der Immunmarkierungen der Zellen durch diese Verfahren die Zuständigkeit eines Zytologiespezialisten.
Eine zweite Gruppen von Verfahren zur Messung von Antigenen basiert auf der quantitativen Bestimmung der Marker der globalen Zellpopulation. Diese Verfahren gestatten die Messung der Antigene durch direkte oder indirekte Markierung, die am häufigsten in zwei, drei oder vier Stufen ausgeführt wird. In sämtlichen Fällen trägt das bei der letzten Stufe der Markierung eingesetzte Reagens eine Sonde, die entweder isotoper Natur, z. B. Iod 125, für eine Bestimmung immunoradiometrischer Art (Brow et al., J. Immunol. Methods, 1979, 31, 201 - Stocker und Heusser, J. Immunol Methods, 1979, 26, 87-95) oder ein Enzym für eine Bestimmung immunenzymometrischer Art ist, u.zw. am häufigsten Peroxidase, alkalische Phosphatase oder β-Galactosidase (Van Leuven et al., J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109-116 - Morris Transplantation, 1983, 36 (6), 719 - Baumgarten J. Immunol. Methods, 1986, 94, 91-98).
Die Verfahren dieser zweiten Gruppe sind in der Anwendung ziemlich unbequem, mühsam und dem Zufall überlassen, u.zw. aufgrund der Notwendigkeit zahlreicher Waschungen und Zentrifugationen des Zellmaterials; es ist manchmal notwendig, das aus der enzymatischen Reaktion stammende gefärbte Milieu zur spektrofotometrischen Endmessung zu entnehmen; schließlich ist die chemische Fixierung der Zellen, die am häufigsten angewendet wird, die Ursache für die irreversible Zerstörung bestimmter Antigene, die gegenüber üblichen chemischen Fixiermitteln, wie Glutaraldehyd oder Methanol, besonders empfindlich sind (Drover et al., J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).
In der Literatur ist es bekannt, daß man ein Antigen, das mehrere Antigendeterminanten, d. h. mehrere Epitope, trägt, bestimmen kann, indem man dieses Antigen dank eines auf einem festen Träger immobilisierten Antikörpers mit einem seiner Epitope fixiert und an ein anderes Epitop des Antigens einen anderen Antikörper, der Träger eines die Bestimmung ermöglichenden enzymatischen oder radioisotopen Markers ist, bindet.
Eine solche Technik, die häufig Sandwich-Technik genannt wird, ist insbesondere in den Patenten bzw. Patentanmeldungen FR-2 487 983, FR-2 500 166 und EP-119 736 beschrieben. Keines dieser Dokumente beschreibt die Anwendung dieser Technik bei ganzen Zellen, auch wenn das Wort "Zelle" manchmal in der Liste der Antigene enthalten ist, bei denen das Verfahren angewendet wird.
In den obigen Patenten sind die verschiedenen Antigene, die Gegenstand der beschriebenen Beispiele sind, alle und einzig und allein Proteinmoleküle, die in Wasser und physiologischen Flüssigkeiten löslich sind, wie Hormone, Enzyme oder zirkulierende Tumormarker. Demgegenüber ist klar, daß eine Zelle kein Molekül ist und sich zumindest durch eine wesentlich größere Dimension und durch die Tatsache unterscheidet, daß sie in physiologischen Medien nicht löslich ist. Daher wurde die Sandwich-Technik bis heute noch nie bei ganzen Zellen angewendet.
Daneben ist der Immuneinfang von Zellen auf einem festen Träger in der Patentanmeldung WO 86/02091 beschrieben, in welcher es das Ziel ist, unerwünschte Zellen aus Proben von für Transplantationen bestimmtem Knochenmark zu entfernen.
In dieser Patentanmeldung erfolgt der Einfang der Zellen über flotierende Mikrokugeln und erfordert, daß der verwendete Antikörper an den festen Träger über eine komplexe makromolekulare Struktur, genannt Relaispyramide, gebunden ist, die eine gegenüber der des entsprechenden Zellantigens bevorzugte Ausrichtung des Antikörpers gewährleisten kann. In dieser Anmeldung gibt es keinen Hinweis auf eine Anwendung der Technik bei der quantitativen Bestimmung eines Antigens.
Der Immuneinfang von Zellen ist auch in der Patentanmeldung WO 84/03151 für eine analytische Anwendung beschrieben. In dieser Anmeldung besteht das Ziel in der Identifizierung der Gewebsgruppen, zu denen die untersuchten Zellen gehören (ein im allgemeinen HLA-Typisierung genannter Vorgang). Der Einfang der Zellen erfolgt mit Hilfe von Antikörpern, die in einer speziellen Geometrie auf ganz speziellen Trägern (Mikroskoplamellen) angeordnet sind. Die Ergebnisse werden durch einfache visuelle Beobachtung des Trägers erhalten und führen zu "Alles-oder-Nichts" -Reaktionen. So führten die bisher beschriebenen Systeme zum Immuneinfang von Zellen zu keinen analytischen Anwendungen, die die quantitative Bestimmung eines an der Membran bestimmter Zellen exprimierten Antigens gestatten. Daneben kann es allen diesen Systemen an Spezifität mangeln, da sie auf dem Erkennen der Zellen durch einen einzigen Antikörper beruhen.
Das Bestimmungsverfahren, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, besitzt beträchtliche Vorteile gegenüber sämtlichen früher bekannten und verwendeten Techniken, denn es gestattet die quantitative Messung mehrerer Antigene, die jeweils für eine zelluläre Unterpopulation, die eine Population bilden, charakteristisch sind, zu einem einzigen Analysezeitpunkt. Diese Bestimmung erfolgt an Zellen, an denen kein chemischer oder physikalischer Eingriff vorgenommen wurde und die sich in ihrem physiologischen Integritätszustand befinden. Weiters besitzt das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren die Merkmale einer sehr hohen Spezifität, die den Systemen mit doppelter immunologischer Erkennung eigen ist, bei denen zwei verschiedene spezifische Antikörper von zwei verschiedenen Antigenen, die von ein- und derselben Zelle getragen sind, zum Einsatz gelangen. Dieses Verfahren ist einfach, rasch und reproduzierbar. Es ist durchaus geeignet zur Analyse einer großen Anzahl von Proben, wodurch sein Einsatz für diagnostische Zwecke in Labors der klinischen Biologie in großem Umfang möglich ist.
So bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit zur immunometrischen Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene, die jeweils für eine zelluläre Unterpopulation charakteristisch sind, welche Unterpopulationen eine Population ausmachen, welcher Kit folgende Bestandteile aufweist:
a) einen festen Träger, auf dem durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption ein oder mehrere monoklonale Antikörper fixiert sind, die gegen der gesamten Zellpopulation gemeinsame Oberflächenantigene und nicht gegen die für die Unterpopulationen charakteristischen Antigene gerichtet sind;
b) mehrere Lösungen, die jeweils einen monoklonalen Antikörper enthalten, von denen jeder spezifisch für das zu bestimmende und für eine zelluläre Unterpopulation charakteristische Antigen ist, welcher Antikörper mit einer radioaktiven Sonde oder einer enzymatischen Sonde markiert ist;
c) im Fall von mit einer enzymatischen Sonde markierten Antikörpern eine oder mehrere die zur Anzeige der Aktivität des Enzyms notwendigen Reagenzien einführende Lösung(en);
d) gegebenenfalls einen zusätzlichen Bestandteil, bestehend aus einer Waschpufferlösung und/oder Proben, die die Kalibrierung und die Qualitätskontrolle der Bestimmung gestatten.
Der Ausdruck Zelle, wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den anschließenden Patentansprüchen verwendet ist, inkludiert menschliche Zellen, tierische Zellen, Zellen von Protozoen und Zellen von Mikroorganismen (Bakterien oder Pilzen). Betreffend Blutzellen inkludiert die vorliegende Erfindung kernhaltige korpuskuläre Bestandteile, wie Leukozyten, und kernlose korpuskuläre Bestandteile, wie rote Blutkörperchen oder Plättchen.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren ist bei ganzen Zellen, d. h. nicht lysierten Zellen, anwendbar.
An diesen Zellen wurde keinerlei physikalischer oder chemischer Eingriff vorgenommen, und sie kommen in einem Zustand der kompletten physiologischen Integrität zum Einsatz. Diese Situation stellt die beste Garantie für die Integrität der Membranmarker dar, die als Bestimmungsziele ausgewählt wurden.
Als festen Träger kann man jede Vorrichtung verwenden, die zur Manipulation von Zellsuspensionen geeignet ist, vorzugsweise Reagenzgläser, spezielle Magnetträger oder starre oder nachgiebige Mikrotiterplatten aus Polyethylen, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Nitrocellulose, mit Mikrovertiefungen. Die zur Immobilisierung der Zellen bestimmten monoklonalen Antikörper können an den festen Trägern entweder durch kovalente chemische Bindung oder durch physikalische Adsorption gemäß den dem Fachmann gut bekannten klassischen Methoden, wie den von Stocker und Heusser, J. Immunol. Methods, 1979, Bd. 26, S. 87-95 beschriebenen, fixiert werden. Vorteilhafterweise kann der Träger zuvor mit einem Protein gesättigt werden.
Erfindungsgemäß müssen der oder die monoklonale(n) Antikörper, die am festen Träger fixiert sind, den Immuneinfang der Zellpopulation gestatten, unter denen sich die Zellpopulation(en) befindet(en), die Träger der zu bestimmenden Antigene ist(sind). Wenn diese Population aus menschlichen Zellen besteht, sind die für den Immuneinfang bevorzugten monoklonalen Antikörper anti-HLA-Antikörper der Klasse I, die spezifisch für den gemeinsamen Teil der HLA-Antigene A, B und C sind, die bei den Leukozyten und zahlreichen anderen Zellinien des Organismus vorhanden sind. Von diesen Antikörpern wird jener mit der Bezeichnung S-Klasse I, der von BIOSYS vertrieben wird, besonders bevorzugt.
In anderen Fällen, wo die untersuchten Zellen menschliche Zellen sind, und in sämtlichen Fällen, wo die ,Zellen keine menschlichen Zellen sind, können auch monoklonale Antikörper für den erfindungsgemäßen Immuneinfang verwendet werden, die für den Typ der untersuchten Zellen geeignet sind.
Der Ausdruck "ein mit einer radioisotopen Sonde markierter monoklonaler Antikörper" bedeutet, daß der monoklonale Antikörper entweder an einem eigenen Element seiner Struktur, z. B. den konstitutiven Tyrosinresten, oder an einem an ihm fixierten geeigneten Radikal ein radioaktives Isotop trägt, das die Bestimmung durch Zählung der ihm zugehörigen Radioaktivität gestattet.
Der Ausdruck "mit einer enzymatischen Sonde markierter monoklonaler Antikörper" bedeutet, daß der monoklonale Antikörper an ein Enzym gekoppelt ist, das, in Kombination mit dem Einsatz geeigneter Reagenzien, eine quantitative Messung dieses monoklonalen Antikörpers gestattet.
Das Substrat und die Reagenzien werden derart gewählt, daß das Endprodukt der durch das Enzym induzierten Reaktion bzw. Reaktionsfolge, bei der diese Substanzen zum Einsatz gelangen,
- entweder eine färbige oder fluoreszierende Substanz ist, die in das flüssige Milieu diffundiert, das die Zellen umgibt und Gegenstand der spektrofotometrischen bzw. fluorimetrischen Endmessung ist,
- oder eine unlösliche färbige Substanz ist, die sich an den Zellen und den Zellwänden, an denen sie fixiert sind, ablagert und Gegenstand entweder einer fotometrischen Messung durch Reflexion oder einer Bewertung mit dem Auge, gegebenenfalls unter Bezugnahme auf eine Skala von Standard-Farbtönen, sein kann.
Der Bestimmungskit kann als zusätzlichen Bestandteil eine Pufferlösung zum Waschen des festen Trägers nach der Immobilisierung und Markierung der Zellen mit dem bzw. den die gewählte Sonde tragenden Antikörper(n) enthalten.
Der Bestimmungskit kann auch als zusätzliche Bestandteile die zur Kalibrierung der Bestimmung sowie zur Qualitätskontrolle der Bestimmung notwendigen Proben enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur immunometrischen Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene, die jeweils für eine zelluläre Unterpopulation charakteristisch sind, welche Unterpopulationen eine Population ausmachen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es umfaßt:
- eine einzige Stufe zur spezifischen Fixierung bzw. zum Immuneinfang einer Zellpopulation auf einem festen Träger unter Verwendung eines oder mehrerer monoklonaler Antikörper(s), die zuvor durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption auf dem Träger fixiert wurden und in der Lage sind, ein an der Oberfläche der Zellen vorhandenes Antigen, das nicht das zu bestimmende Antigen ist, zu erkennen, und zur gleichzeitigen direkten Markierung des zu bestimmenden Oberflächenantigens, das zur fixierten Zellpopulation oder zu einer seiner Unterpopulationen gehört, mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper dieses zu bestimmenden Antigens, wobei der monoklonale Antikörper mit einer radioisotopen oder alternativ mit einer enzymatischen Sonde versehen ist;
- einen Zeitraum der Inkubation zur Ermöglichung des Immuneinfangs und der gleichzeitigen Markierung;
- eine Waschung des festen Trägers zur Entfernung der nicht immobilisierten unerwünschten Zellen und des Überschusses an die radioisotope oder enzymatische Sonde tragenden monoklonalen Antikörpern;
- die eigentliche Bestimmung jedes aus den markierten Zell- Unterpopulationen zu bestimmenden Antigens durch Zählung der fixierten Radioaktivität oder alternativ, nach Behandlung des Milieus mit dem Substrat des Enzyms und gegebenenfalls einem oder mehreren geeigneten Hilfsstoffen, durch fotometrische Transmissions- oder Reflexionsmessung oder durch Messung der Fluoresezenzemission.
Der Bestimmungskit und das erfindungsgemäße immunometrische Verfahren werden vorzugsweise bei der Bestimmung der Oberflächenantigene der korpuskulären Bestandteile des menschlichen Bluts, insbesondere der Leukozyten, genauergesagt der Lymphozyten, der T-Lymphozyten, der T4-Lymphozyten, der T8-Lymphozyten, der B-Lymphozyten, sowie der Granulozyten, der Monozyten und der Blutplättchen, angewendet.
Eine weitere bevorzugte Anwendung ist die Bestimmung der Oberflächenantigene von pathogenen Mikroorganismen, z. B. Candida albicans.
Weiters sind der Bestimmungskit und das immunometrische Verfahren gemäß der Erfindung besonders nützlich bei der Bestimmung der Oberflächenantigene von Tumorzellen, insbesondere von Krebszellen des Harntraktes und solchen maligner Hämopathien Der Bestimmungskit und das immunometrische Verfahren gemäß der Erfindung ermöglichen die Messung von Signalen (Radioaktivität oder Absorptions- oder Emissionslicht), die gleichzeitig von der Anzahl an in der untersuchten Zellpopulation vorhandenen Zellen und von der Dichte des an der Oberfläche dieser Zellen gemessenen Antigens abhängen. Die Messung dieser Signale gestattet eine quantitative Auswertung der Gesamtzahl an Molekülen dieses Antigens, die von der untersuchten Zellpopulation oder -unterpopulation getragen sind, unabhängig davon, ob dieses Antigen eine strukturelle oder funktionelle Funktion hat.
Beispielsweise weiß man im Fall von in der Hämatologie besonders wichtigen leukozytären Markern, daß bei gesunden Personen der Mittelwert der Antigendichte in der Mehrzahl der Fälle bei ein- und derselben Zellpopulation nicht wesentlich von einer Probe zur anderen variiert. Es besteht dann eine gute Korrelation zwischen der zytologischen Zählung der das betreffende Antigen tragenden Zellen und dem erfindungsgemäß gemessenen Signal, das proportional zur Gesamtzahl der in der untersuchten Probe vorhandenen Antigenmoleküle ist. Im Gegensatz dazu kann bei bestimmen pathologischen Zuständen die Dichte der Oberflächenantigene bei ein- und derselben Zellpopulation variieren, ohne daß die Anzahl oder das Verhältnis der positiven Zellen merklich variiert. Solche pathologischen Zustände werden wirkungsvoller nachgewiesen durch Anwendung des erfindungsgemäßen iommunometrischen Verfahrens oder unter Anwendung des erfindungsgemäßen Kits als durch einen herkömmlichen zytologischen Zählvorgang.
Eine weitere Anwendung der Erfindung ergibt sich bei der Wahl einer Mikrotiterplatte als festen Träger. Der Bestimmungskit und das immunometrische Verfahren gemäß der Erfindung können dann vorteilhaft zur Bestimmung einer Reihe von Oberflächenantigenen, die für verschiedene, die untersuchte Zellpopulation bildende Unterpopulationen charakteristisch sind, auf einer einzigen Platte verwendet werden. Bei dieser Anwendung kann man einerseits gebrauchsfertige Mikrotiterplatten verwenden, auf denen zuvor ein oder mehrere monoklonale Antikörper fixiert worden sind, die alle Zellen der untersuchten Population festhalten können, und andererseits über eine Reihe von monoklonalen Antikörpern verfügen, die an einen geeigneten und spezifischen Marker jeweils eines Antigens gekoppelt sind, das für eine der zu bewertenden Unterpopulationen charakteristisch ist. So kann man mit einer einzigen Manipulation und auf ein- und demselben Träger die quantitative Bestimmung sämtlicher Antigene erreichen, die für die Charakterisierung der gewählten Unterpopulationen notwendig sind.
Diese Anwendung der vorliegenden Erfindung wird durch die Charakterisierung der Antigenausstattung von Zellen veranschaulicht, die in der klinischen Biologie von Bedeutung sind. Einen ersten Fall stellt die Bestimmung der Gewebsgruppen dar, die eine bestimmte Person charakterisieren, welche unter der üblichen Bezeichnung HLA-Typisierung bekannt ist.
Einen zweiten Fall repräsentiert die Typisierung von Tumorzellen, insbesondere bei Kranken mit malignen Hämopathien, wie Leukämie oder Lymphomen. Diese diagnostische Untersuchung, die systematisch praktiziert wird, besteht darin, den Typ und den Ursprung der Tumorzellen des Patienten durch die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Reihe von zweckmäßig ausgesuchten Oberflächenantigenen an den Zellen zu charakterisieren.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kits mit einer Mikrotiterplatte, auf der zuvor ein oder mehrere monoklonale Antikörper fixiert wurden, die sämtliche Zellen der untersuchten Population und Lösungen unterschiedlicher monoklonaler Antikörper, die mit einer enzymatischen oder radioisotopen Sonde markiert und jeweils für ein an den Tumorzellen vorhandenes Antigen spezifisch sind, fixieren können, kann man die Antigene, die für die Population der Tumorzellen des Patienten charakteristisch sind, identifizieren und quantitativ auswerten und sie so einer der großen Gruppen von Krebs, insbesondere von malignen Hämopathien, die klinisch gekennzeichnet sind, zuordnen. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht so die rasche Durchführung der qualitativen und quantitativen Untersuchung der Antigenausrüstung der Tumorzellen auf einem einzigen Träger.
Zur Veranschaulichung einer anderen Anwendung der Erfindung kann man den Fall menschlicher T-Lymphozyten nennen, bei denen es insbesondere zwei Zellunterpopulationen gibt: die Lymphozyten, die durch die Anwesenheit des Markers CD4 gekennzeichnet sind und positive T4-Lymphozyten oder einfach T4-Lymphozyten genannt werden, und die Lymphozyten, die durch die Anwesenheit des Markers CD8 gekennzeichnet sind und positive T8-Lymphozyten (oder T8-Lymphozyten) genannt werden.
Die Messung des numerischen Verhältnisses T4/T8 ist von großer diagnostischer Bedeutung in der klinischen Biologie. Es ist nämlich bekannt, daß Veränderungen des Verhältnisses T4/T8 in verschiedenen Erkrankungen des Immunsystems auftreten, wie Immunfunktionsstörungen, chronischen Infektionskrankheiten, Virusinfektionen und insbesondere HIV-Erkrankungen (AIDS- Virus).
Der Bestimmungskit und das immunometrische Verfahren der Erfindung können zur Bestimmung von Antigenen verwendet werden, die global charakteristisch für die Population von T- Lymphozyten und/oder von Antigenen sind, welche für Unterpopulationen von T4- und T8-Lymphozyten charakteristisch sind. In diesem Fall erfolgt die spezifische Immobilisierung der T- Lymphozyten der untersuchten Probe auf einem festen Träger, und gleichzeitig führt man die direkte Markierung der Oberflächenantigene der T4-Lymphozyten mit einem eine radioisotope oder enzymatische Sonde tragenden monoklonalen anti-CD4-Antikörper durch; auf die gleiche Weise erfolgt die direkte Markierung der Oberflächenantigene der T8-Lymphozyten mit einem monoklonalen anti-CD8-Antikörper, der eine entsprechende Sonde aufweist.
Zur Bestimmung der gesamten T-Lymphozyten verwendet man vorzugsweise einen monoklonalen anti-CD7-Antikörper (auch anti- T2 genannt), der eine entsprechende Sonde aufweist.
Um die spezifische Immobilisierung der T-Lymphozyten der Probe zu erreichen, verwendet man vorzugsweise einen oder mehrere monoklonale Antikörper, die allein oder in Kombination in der Lage sind, die Gesamtheit-der T-Zellen der Probe zu erkennen, was für die gemeinsamen Anti-Leukozyten-Antikörper (oder anti-CD45-Antikörper) oder Antikörper, die die Gruppe der T-Population erkennen (genannt "pan-T"), wie anti-CD2- (oder anti-T11)-Antikörper, anti-CDS- (oder anti-T1)-Antikörper, anti-CD7- (oder anti-T2)-Antikörper oder andere pan-T- Antikörper, die noch nicht einer Differenzierungsklasse gemäß den WHO-Kriterien zugeordnet sind, zutrifft.
Man kann erfindungsgemäße immunometrische Verfahren vorteilhafterweise zur Bestimmung von Antigenen, die für die Population der T-Lymphozyten und der T4- und T8-Lymphozyten charakteristisch sind, auf mehreren Teilen ein- und desselben festen Trägers verwenden. Die Messung der Signale durch Zählung der Radioaktivität, fotometrische Transmissions- oder Reflexionsmessung oder Fluoreszenzmessung ermöglicht die einfache und direkte Berechnung des numerischen Verhältnisses CD4/CD8.
Auf die gleiche Weise kann man auf ein- und demselben festen Träger die Unterpopulationen der T-Lymphozyten und B- Lymphozyten bestimmen, die die Gesamtheit der lymphozytären Zellinie bilden.
Man kann beispielsweise durch Adsorption einen monoklonalen Antikörper oder eine Mischung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die Gesamtheit der Oberflächenantigene der T-Zellen sind, an den Wänden der Mikrovertiefungen fixieren. Diese monoklonalen Antikörper gestatten dann die Immobilisierung der gesamten Population der T-Zellen der untersuchten Probe in den Mikrovertiefungen. Die so präparierten Platten können lyophilisiert und vorzugsweise bei 4ºC aufbewahrt werden. Diese Stufe kann industriell ausgeführt werden, und man hat so verwendungsfertige Platten für Bestimmungskits zur Verfügung, die entweder bei sämtlichen T- Lymphozyten oder bei jeder Unterpopulation der T-Lymphozyten angewendet werden können.
Die Proben, die die zu bestimmenden und von Blut oder jeder geeigneten normalen oder pathologischen biologischen Flüssigkeit stammenden Zellen enthalten, können als solche oder nach einer Vorbehandlung, wie Dichtegradient-Zentrifugieren nach bereits bekannten Methoden und insbesondere in einem Medium mit hoher Dichte, wie z. B. Ficoll-Paque®, das von Pharmacia vertrieben wird, verwendet werden. Zur Bestimmung der Blutlymphozyten kann man die zu bestimmende Blutprobe auch mit einer sogenannten Lyse-Pufferlösung behandeln, die die roten Blutkörperchen zerstört.
Aliquote Teile der entsprechenden Zellsuspension werden in Kontakt mit dem festen Träger, z. B. in die Mikrovertiefungen einer vorpräparierten Mikrotiterplatte, gebracht, u.zw. gleichzeitig mit der einen Teil des Bestimmungskits bildenden Lösung, die den für die Zielzellpopulation spezifischen und eine entsprechende Sonde, d. h. einen radioisotopen oder enzymatischen Tracer, aufweisenden monoklonalen Antikörper enthält. So kann eine radioisotope Sonde beispielsweise durch Markieren des monoklonalen Antikörpers mit Iod 125 oder Iod 131, z. B. in Gegenwart von Chloramin T nach einem bekannten Verfahren (F. C. Greenwood, W. M. Hunter et al., Biochem. J., 1963, 89, 114) hergestellt werden; oder aber es kann eine enzymatische Sonde durch Konjugation des monoklonalen Antikörpers an ein Enzym, wie Alkaliphosphatase, Peroxidase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase, nach bekannten Verfahren (siehe z. B. M. O'Sullivan Methods in Enzymology 1981, 73, 147) oder nach einer davon abgeleiteten Methode hergestellt werden. In bestimmten Fällen werden die Enzyme, um gewisse Nachteile in Verbindung mit der Manipulation von radioaktiven Substanzen und der beschränkten Wirkungsdauer der Reagenzien auszuschalten, vorzugsweise in radioisotopen Sonden verwendet.
Die Inkubationsperiode, d. h. die zur Immobilisierung und gleichzeitigen Markierung der Zellen erforderliche Zeit, liegt vorzugsweise unter oder bei 1 Stunde. Während dieses Zeitraums kann der feste Träger zur besseren Immobilisierung der Zellen gegebenenfalls zentrifugiert werden. Der feste Träger, z. B. die Mikrotiterplatte, wird danach gewaschen, um gleichzeitig die nicht fixierten Zellen und den Überschuß an eine enzymatische oder radioisotope Sonde aufweisendem monoklonalem Antikörper zu entfernen.
Verwendet man eine radioisotope Sonde, wie z. B. Iod 125, wird die den Zellen zugehörige Radioaktivität in einem Gammazähler je nach der geeigneten Modalität und beispielsweise nach Lösen der Zellen in einer alkalischen Lösung (z. B. Sodalösung) und Rückgewinnung der die Radioaktivität enthaltenden Lösung mit Hilfe eines Absorptionspuffers gezählt.
Verwendet man eine enzymatische Sonde am monoklonalen Antikörper, wird das Erscheinen eines färbigen oder fluoreszierenden Produkts dadurch erzielt, daß zum festen Träger, an dem die das zu bestimmende Antigen tragende Zellpopulation fixiert ist, eine Lösung zugegeben wird, die das Substrat des Enzyms und ein oder mehrere Hilfsreagenzien enthält, die schließlich die Gewinnung entweder eines im Milieu löslichen färbigen Produkts oder eines unlöslichen färbigen Produkts oder eines löslichen fluoreszierenden Produkts als Reaktionsprodukt, wie zuvor ausgeführt, gestattet. Danach mißt man das von den so behandelten Proben stammende Lichtsignal mit Hilfe des für so einen Fall konzipierten Geräts, nämlich eines Übertragungs- oder Reflexionsfotometers bzw. eines Fluorometers. Ist der feste Träger eine Mikrotiterplatte, kann die Ablesung des Lichtsignals nacheinander in sämtlichen Vertiefungen einer Platte durch den Einsatz von automatischen Lesegeräten, die üblicherweise in Biologielaboratorien verwendet werden, wie z. B. dem Plattenleser Titertek® oder dem Plattenleser Fluoroscan® für spektrofotometrische bzw. fluorometrische Ablesungen, erfolgen.
Bei Verwendung von alkalischer Phosphatase als enzymatische Sonde erfolgt die Kopplung dieses Enzyms mit dem monoklonalen Antikörper nach der von Boehringer Mannheim - Biochemica vorgeschlagenen Methode. Die bevorzugten Substrate dieses Enzyms sind Paranitrophenylphosphat für eine spektrofotometrische Endablesung oder 4-Methylumbelliferylphosphat für eine fluorometrische Ablesung oder 5-Brom-4-chlorindol-3-ylphosphat zur Erzielung eines unlöslichen färbigen Reaktionsprodukts. Man kann als enzymatische Sonde auch β- Galactosidase verwenden, deren bevorzugte Substrate dann Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactopyranosid sind.
Vorzugsweise kann man die monoklonalen Antikörper an Peroxidase koppeln. In diesem Fall ist das Kopplungsverfahren von jenem abgeleitet, das von M. B. Wilson und P. K. Nakane in Immunofluorescence and Related Staining Techniques beschrieben ist. W. Knapp, K. Kolubar, G. Wicks et., Elsevier/Nordholland. Amsterdam, 1978, S. 215-224. Die-gegenüber dem ursprünglichen Protokoll zur Herstellung des Enzymkonjugats vorgenommenen Modifikationen sind wie folgt:
- Molverhältnis Peroxidase/Antikörper: 3 gegenüber 2 im Protokoll
- weniger starke Oxidation der Kohlehydrateinheiten der Peroxidase durch 33%ige Verringerung der vorgeschlagenen Konzentration an Natriumperiodat.
Die zum Nachweis der an die monoklonalen Antikörper konjugierten Peroxidase verwendeten Reagenzien enthalten mit Sauerstoff angereichertes Wasser, Enzymsubstrat und ein geeignetes Chromogen, z. B. Orthophenylendiamin oder 2,2'-Azinobis-(3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfon)säure oder ABTS, um ein gefärbtes und im Milieu lösliches Reaktionsendprodukt zu erhalten, oder aber 3,3'-Diaminobenzidin oder 3-Amino-9- ethylcarbazol oder 4-Chlor-α-naphthol, um ein unlösliches Reaktionsendprodukt zu erhalten, oder aber Parahydroxyphenylpropionsäure, um ein fluoreszierendes und im Milieu lösliches Reaktionsprodukt zu erhalten.
Gemäß einer bevorzugten Form umfaßt der erfindungsgemäße Kit zur Bestimmung von für die T-Lymphozyten T4 und T8 charakteristischen Antigenen folgendes auf:
a) eine Mikrotiterplatte, in deren Vertiefungen ein oder mehrere monoklonale anti-T-Lymphozyten-Antikörper fixiert sind;
b1) eine Lösung, enthaltend mindestens einen monoklonalen anti-Lymphozyten T-Antikörper, der mit Peroxidase markiert ist;
b2) eine Lösung, enthaltend mindestens einen monoklonalen anti-Antigen CD4-Antikörper, der mit Peroxidase markiert ist;
b3) eine Lösung, enthaltend mindestens einen monoklonalen anti-Antigen CD8-Antikörper, der mit Peroxidase markiert ist;
c1) eine Lösung, enthaltend mit Sauerstoff angereichertes Wasser, Enzymsubtrat, in einem geeigneten Puffer;
c2) eine Lösung, enthaltend das zum Nachweis der Expression der Aktivität des Enzyms verwendete Chromogen.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liegt in der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die an Acetylcholinesterase gekoppelt sind.
Acetylcholinesterase wird an den Antikörper gekoppelt, vorzugsweise unter Verwendung eine Verfahrens, das von dem im französischen Patent Nr. 2 550 799 beschriebenen hergeleitet ist, oder eines Verfahrens, das schematisch die Herstellung von Fragmenten des. Antikörpers durch eine bekannte Technik, die Modifikation des Enzyms durch Umsetzung mit einem geeigneten heterobifunktionellen Mittel und schließlich die Kopplung der so erhaltenen Produkte umfaßt. In diesem Fall können auch andere bekannte Verfahren zur Konstruktion von immunenzymatischen Konjugaten verwendet werden.
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität, die speziell mit dem vom Konjugat mit Acetylcholinesterase erkannten Zellantigen verbunden ist, erfolgt vorzugsweise nach der gut bekannten Technik, bei der Acetylthiocholin als Substrat des Enzyms und das Ellman-Reagens oder 5,5'-Dithio-2-nitrobenzoesäure als Chromogen eingesetzt werden, u.zw. gemäß jeder, an den untersuchten Fall angepaßten Variante, beispielsweise der von Pradelles et al. Anal. Chem. 57 (1985) 1170-1173 beschriebenen.
Die genannten Chromogene werden als solche oder in Form von wasserlöslichen Salzen verwendet.
Die Resultate der erfindungsgemäßen Antigenbestimmung können gemäß jeder für die durchgeführte Untersuchung geeigneten Modalität ausgedrückt werden. Insbesondere kann man diese Resultate entweder als Gesamtzahl an in einem bestimmten Volumen der untersuchten Probe (z. B. pro Mikroliter Blut) vorhandenen Molekülen eines speziellen Antigens (z. B. des Antigens CD4) oder durch das Verhältnis der Anzahl der Moleküle eines Antigens zur Anzahl der Moleküle eines anderen Antigens in der untersuchten Probe (z. B. das Verhältnis der Antigene CD4 zu den Antigenen CD8 - oder das Verhältnis CD4/CD8 in der untersuchten Blutprobe) ausdrücken.
Zur Bestimmung der Anzahl der Moleküle eines speziellen Antigens in der untersuchten Probe verwendet man vorzugsweise eine Kalibrierskala, die durch geeignete Zellen oder Zellpräparationen gebildet ist, welche das zu bestimmende Antigen tragen und die zuvor mittels einer bekannten Referenzmethode kalibriert wurden. Diese Standards sind vorzugsweise entweder aus Zellen gebildet, die in ihrer Abstammung identisch mit den Zellen sind, die Gegenstand der Bestimmung sind, oder durch Zellen aus festgelegten Zellstämmen, die das gesuchte Antigen tragen, oder aus Präparationen, z. B. Membranen, die von diesen Zellen stammen.
Diese Standards werden dann genauso wie die zu untersuchenden. Proben behandelt. Die davon herrührenden Signale dienen zur Konstruktion einer Kalibrierskala, mit der die mit den zu untersuchenden Proben gemessenen Signale in Bezug gebracht werden. Die anschließenden Berechnungen sind klassisch.
Zur Bestimmung des Verhältnisses der Anzahl der Moleküle von zwei Antigenen in der zu untersuchenden Probe kann man das oben beschriebene Kalibriersystem verwenden und schließlich das gesuchte Verhältnis ausrechnen. Einfacher kann man in zahlreichen Fällen direkt das Verhältnis der mit jedem der gesuchten Antigene erhaltenen spezifischen Signale berechnen, es gegebenenfalls durch bekannte Faktoren, wie das Verhältnis der Dimensionen der zum Einsatz gelangenden Probenahmen, korrigieren, und man erhält direkt das gesuchte Verhältnis.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur immunometrischen Bestimmung ist einfach, rasch und reproduzierbar. Seine Anwendung ist ganz und gar auf die Analyse einer großen Anzahl von Proben abgestellt. Um die Vorteile desselben gegenüber den anderen beschriebenen Methoden zu verstehen, ist es zweckmäßig, die verschiedenen Stufen desselben zu untersuchen.
Die Immobilisierung der Zellen am festen Träger ist die Phase der Bestimmung, die üblicherweise die größten Schwierigkeiten bereitet oder die bei der Durchführung die heikelste ist. Das häufig eingesetzte Mittel ist die chemische Fixierung der Zellen mittels Glutaraldehyd oder Methanol in gegebenenfalls mit Poly-L-Lysin behandelten Bechern (Van Leuven F. et al., J. Immunol. Methods, 1978, 23, 109). Die so vorgenommenen Fixierungen können jedoch die gewünschte spezifische Detektion schwächen oder sogar ausschalten oder, im Gegenteil, falsch positive Markierungen von Zellen herbeiführen, was ein schwerwiegender Nachteil ist (Drover und Marshall J. Immunol. Methods, 1986, 90, 275-281).
Weiters erfordert die Durchführung des Verfahrens mittels chemischer Fixierung mehrere Schritte: die Zentrifugation der Zellen, die Herstellung der Fixiermischung, die Fixierung und die Waschungen der fixierten Zellen.
Es wurde auch die Entwässerung der Zellen bei 37ºC, gegebenenfalls mit einer anschließenden Fixierung mit Methanol in den Mikrovertiefungen vorgeschlagen (Baumgarten, J. Immunol, Methods, 1986, 94, 91-98). Die Dehydratisierung der Zellen bei 37ºC macht, abgesehen davon, daß sie gewisse fragile Antigene verändern kann, die periplasmatische Membran durchlässig, was die Immunomarkierung von intrazytoplasmatischen Antigenen zusätzlich zur Markierung der Oberflächen antigene erleichtert, wodurch es zu störendem Grundrauschen oder zu falsch positiven Resultaten kommt, wenn man eine auf Oberflächenantigene beschränkte Messung will.
Weiters ist die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens ungewiß; die Dekantierung der Zellen in die Mikrovertiefungen für die Bestimmung und die Entwässerung der Zellen können nämlich von einem Versuch zum anderen variieren. Schließlich dauert diese Bestimmung lang, denn die Entwässerungsstufe der Zellen erfordert alleine schon über 2 Stunden.
Die Immobilisierung von lymphozytären Populationen wurde auch mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern erzielt, die in Mikrovertiefungen adsorbiert wurden (Stocker und Heusser J. Immunol. Methods, 1979, 26, 87-95). Abgesehen davon, daß die Immobilisierung von Fremdzellen an der einzigen Population, die man analysieren möchte, möglich ist, haben die polyklonalen Antikörper auch den Nachteil, daß sie mit den zur Messung durch den markierten Antikörper bestimmten Antigenen reagieren, wodurch das endgültig gemessene Signal umso mehr reduziert wird.
Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern mit einer hohen Spezifität und Affinität, die am festen Träger und insbesondere in Vertiefungen zur Bestimmung adsorbiert oder fixiert werden, gestattet die exklusive Erfassung der gesuchten Zellen, wobei die nicht zurückgehaltenen, anderen Zellpopulationen während der am Ende der Markierung der zu bestimmenden Antigene durchgeführten Waschungen entfernt werden. Weiters verändert kein chemisches oder physikalisches Mittel die Charakteristika der Antigene in dieser Stufe, denn es fallen die verschiedenen Schritte zur chemischen oder physikalischen Fixierung der Zellen am Träger weg.
So wurde gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden, daß die Immobilisierung der Zellen mittels monoklonaler Antikörper ein Verfahren ist, das die Vereinfachung der Stufe der Immobilisierung der das zu bestimmende Antigen tragenden Zellen gestattet, dabei aber zuverlässigere Resultate liefert.
Die an Zellpopulationen angewendeten immunometrischen Bestimmungen werden im allgemeinen durch Markierung der Zellen gemäß einem indirekten Verfahren in zwei oder drei aufeinanderfolgenden Stufen ausgeführt, wobei die das spezifische Signal liefernde Sonde im Verlauf der letzten Stufe des Markierungsverfahrens an den Zellen fixiert wird. Bei der Markierung der Zellen in zwei Stufen verwenden die eingesetzten Hauptreagenzien anti-Immunglobulin-Antikörper (anti-Ig), die an β-Galactosidase (Cobold et al., J. Immunol. Methods, 1971, 44, 125-133) oder an Alkaliphosphatase (Hessian, J. Immunol. Methods, 1986, 91, 29-34) gekoppelt oder mit Iod 125 markiert sind (Savion, J. Immunol. Methods, 1987, 97, 49-56). Die Markierungstechnik mit anti-Peroxidase-Peroxidasereagens ihrerseits wird in drei Stufen ausgeführt (Van Leuven 1978).
Bei einem anderen, ebenfalls dreistufigen Verfahren kommen ein für den zu analysierenden Antigenmarker spezifischer monoklonaler Antikörper, dann anti-Ig-Antikörper der Maus als Biotinträger und schließlich ein Streptavidin-Peroxidase- Konjugat (Baumgarten, 1986) oder ein Streptavidin- Alkaliphosphatase-Konjugat (Igietseme et al., J. Immunol. Methods, 1987, 97, 123-131) zum Einsatz.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das die gleichzeitige Anwendung eines Immuneinfangverfahrens der ganzen Zellen ohne physikalischen oder chemischen Eingriff an den Zellen und die gleichzeitige Markierung der gesamten oder eines Teils der Zellen mit einem oder mehreren, direkt eine radioisotope oder enzymatische Sonde tragenden monoklonalen Antikörper umfaßt, gestattet zum ersten Mal die quantitative Bestimmung ausgewählter Membranantigene an den Zellen selbst.
Erfindungsgemäß gestattet die direkte Markierung der immunologisch immobilisierten Zellen:
- die Vereinfachung des Bestimmungsverfahrens durch Wegfall der wiederholten Zwischenmanipulationen zwischen den aufeinanderfolgenden Markierungsstufen im Fall der indirekten Markierung, nämlich Zentrifugation der Zellen, Entfernung der Markierungsreagenzien, neuerliches Suspendieren;
- eine Einsparung an Reagenzien;
- eine verbesserte Zuverlässigkeit durch Verringerung der Anzahl an Schritten und Manipulationen;
- einen Zeitgewinn;
- die Möglichkeit der gleichzeitigen Behandlung einer großen Anzahl von Proben ausschließlich unter Verwendung üblicher Materialien und Apparaturen.
Die Zeit der Inkubation für die Immobilisierung der Zellpopulation und die gleichzeitige direkte Markierung der zu bestimmenden Antigene der zellulären Unterpopulation ist kurz. Sie liegt im Fall der Bestimmung von T-Lymphozyten und der Unterpopulationen von T4- und T8-Lymphozyten bei 1 Stunde oder darunter.
Nach dem Waschen des festen Trägers erfolgt die eigentliche Bestimmung durch Beobachtung eines mit üblichen Apparaturen zu messenden präzisen und einfachen Signals: Radioaktivität, Lichtabsorption oder -emission.
So bietet das gesamte erfindungsgemäße Verfahren zahlreiche Vorteile: es ist rasch, zuverlässig, wirtschaftlich und einfach.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene, die jeweils für eine zelluläre Unterpopulation charakteristisch sind, in einem weiten Zellkonzentrationsbereich.
Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber der Anzahl an Zellen hängt von der Antigendichte der bestimmten Zellpopulation ab. Gewünschtenfalls kann man für jedes Antigen die minimale Molkonzentration an Antigen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden kann, definieren.
So wurde beispielsweise, wenn der gewählte feste Träger eine Mikrotiterplatte ist und die untersuchten Zellen menschliche Lymphozyten sind, beobachtet, daß man signifikante Meßwerte erhält, wenn die Anzahl an analysierten Zellen zwischen einigen Hundert und etwa 200 000 pro 200 ul Mikrovertiefung liegt, wobei die Untergrenze durch die Dichte des gemessenen Antigens an den untersuchten Zellen und die Empfindlichkeit der gewählten Detektionstechnik gegeben ist, während die Obergrenze im wesentlichen von der Dimension und der Geometrie des festen Trägers abhängt. Dasselbe trifft zu, wenn der feste Träger aus Reagenzgläsern besteht.
Es wurde überprüft, ob die aufgezeichneten Signale (Zählung der Radioaktivität oder fotometrische Messungen) die Darstellung von regelmäßigen und zufriedenstellenden Kalibrierkurven als Funktion der Anzahl an eingesetzten Zellen unter den üblichen Manipulationsbedingungen zulassen.
Außerdem kann man die Empfindlichkeit des Verfahrens nötigenfalls verbessern, indem man gleichzeitig auf ein- und demselben Oberflächenantigen mehrere verschiedene monoklonale Antikörper, die spezifisch für mehrere verschiedene Epitope ein- und desselben Antigens sind, fixiert. Dies wurde durch eine Bestimmung der CD4-Antigene auf Zellen des Stamms Ichikawa (menschlicher T-Stamm) überprüft, bei der gleichzeitig OKT4- und ST4-Antikörper verwendet wurden, die mit Iod 125 markiert waren. Das gemessene Signal stieg um etwa 50%, bezogen auf die Signale, die mit jedem der anti-CD4-Antikörper, alleine verwendet, erhalten wurden.
In den folgenden Beispielen sind die folgenden Ausdrücke bzw. ihre Abkürzungen ohne Unterschied verwendet:
BSA: Rinderserumalbumin oder Rinder albuminserum
PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4
POD: Peroxidase
IgG: Immunglobulin G
IgM: Immunglobulin M
anti-T-IgG od. anti-T: Antilymphozyten T-Antikörper
anti-CD4-IgG od. anti-CD4: anti-CD4-Antigen-Antikörper
anti-CD8-IgG od. anti-CD8: anti-CD8-Antigen-Antikörper
cpm: Counts pro Minute
dpm: Zerfälle pro Minute

Beispiel 1

Immunenzymometrische Bestimmung der Molkonzentration der CD4- und CD8-Antigene aus Proben von menschlichem Blut mit einer Markierung der Antikörper mit Peroxidase.

A) Vorbereitung des Bestimmungskits

a) Präparation der Platte

Man verwendet eine Mikrotiterplatte aus Plastik, erhältlich bei NUNC (Referenz 64 394), die 96 Mikrovertiefungen aufweist. Pro Mikrovertiefung bringt man 200 ul einer Lösung ein, enthaltend den gereinigten monoklonalen anti-CD2- Antikörper (genannt St 11), der zur Immobilisierung sämtlicher T-Lymphozyten, d. h. zur Bewirkung des Immuneinfangs derselben, verwendet wurde. Dieser bei BIOSYS, Compiegne, Frankreich, unter der Referenz ST 11 erhältliche Antikörper wird in einer Konzentration von 10 ug/ml in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) mit pH 7,4 verwendet.
Die Adsorption des monoklonalen Antikörpers erfolgt bei 4ºC 12 Stunden lang. Man entfernt den überschüssigen Antikörper durch Umdrehen der Platte.
Man bereitet eine Lösung, die 0,1% Gelatine und 0,5% BSA in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung enthält. Man bringt 250 ul dieser Lösung pro Mikrovertiefung ein, um die Oberfläche der Vertiefungen mit Protein zu sättigen, was nach 1 Stunde bei 37ºC erreicht ist; man wäscht die Platten dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die so präparierten Platten werden lyophilisiert und bei 4ºC in einem versiegelten Plastiksack gelagert.

b) Herstellung der Lösung des Konjugats aus monoklonalem Antikörper und Peroxidase

Man verwendet Peroxidase (POD), die bei Boehringer Mannheim Biochemica (Referenz 814 393) erhältlich ist.
Das Kopplungsverfahren zwischen dem Antikörper und der Peroxidase ist das von M. B. Wilson und P. K. Nakane in Immunofluorescence and Related Techniques (W. Knapp, K.
Kolubar, G. Wicks ed., 1978, Elsevier/Nordholland, Amsterdam - S. 215 4) beschriebene, mit der Ausnahme, daß man zur Oxidation der Peroxidase 1,5 mg POD in 0,36 ml destilliertem Wasser verwendet und 50 ul einer 0,2 M Natriumperiodatlösung zugibt. Das so erhaltene Produkt wird mit 2 mg anti-CD4-IgG gekoppelt, die in 500 ul Carbonatpuffer enthalten sind. Nach der Behandlung mit Natriumborhydrid und Dialyse gegen PBS wird das IgG-POD-Konjugat durch eine Filtration über eine 0,22 um Membran sterilisiert und unter sterilen Bedingungen in einer Konzentration von 0,5 mg IgG pro ml bei 4ºC in Reagenzgläsern aufbewahrt. Das Reagens ist mindestens 1 Jahr haltbar.
Auf die gleiche Weise bereitet man das anti-CD8-IgG-POD- Konjugat. Auf die gleiche Weise kann man IgM-POD-Konjugate herstellen.

c) Herstellung des Nachweisreagens

Das Nachweisreagens wird folgendermaßen erhalten: man bereitet einen 0,1 M Citratpuffer, indem man Zitronensäuremonohydrat mit 2,1% in Wasser löst und durch Zugabe von 7 N Soda auf pH 5 einstellt. Man gibt danach 30 mg Orthophenylendiamin-hydrochlorid zu 20 ml des erhaltenen Citratpuffers, dann gibt man im letzten Augenblick 40 ul mit Sauerstoff angereichertes Wasser (Enzymsubstrat) mit 30% pro 20 ml Citratpuffer, enthaltend Orthophenylendiamin, zu.

B) Immunometrisches Verfahren

a) Trennung der Zellen

Man entnimmt 2 ml der zu bestimmenden Blutprobe. Man mischt sie mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung und gibt diese Mischung auf 3 ml Ficoll-Paque® (erhältlich bei Pharmacia). Durch Zentrifugieren mit 400 · g während 30 min bei Umgebungstemperatur bildet sich ein Suspensionsring, der die einkernigen Zellen enthält. Man sammelt die Gesamtheit dieser Suspension unter einem Volumen von 1 ml und verteilt 6 · 100 ul der so erhaltenen Suspension in 6 Mikrovertiefungen der zuvor präparierten Platte.

b) Inkubation der Zellen

Man verdünnt das zuvor erhaltene POD-Antikörper-Konjugat mit PBS, enthaltend 1% Proteinsubstanz, wie BSA oder entrahmte Milch in Pulverform, auf ein Hundertstel und bringt 100 ul dieser Lösung pro Mikrovertiefung ein, u.zw.:
- 2 Mikrovertiefungen werden mit jeweils 100 ul der Lösung des POD-anti-CD4-Konjugats gefüllt.
- 2 Mikrovertiefungen werden mit jeweils 100 ul der Lösung des POD-anti-CD8-Konjugats gefüllt.
- 2 Kontroll-Mikrovertiefungen werden mit jeweils 100 ul Lösung mit 1% Proteinsubstanz (Reaktionsleerwert) gefüllt.
Zur Verbesserung der Fixierung der Zellen auf dem Träger zentrifugiert man die Platte 3 min lang mit 150 · g nach 1 h Wartezeit bei Umgebungstemperatur.

c) Nachweis des fixierten Enzyms und Messung

Man leert die Mikrovertiefungen, indem man die Platte umdreht. Man wäscht die Mikrovertiefungen viermal mit 200 ul PBS. Man gibt in jede Vertiefung 200 ul ad hoc bereitetes Nachweisreagens. Man läßt 20 min lang bei Umgebungstemperatur in abgeschwächtem Licht inkubieren. Man mißt die optische Dichte mit dem Spektrofotometer bei 492 nm (Apparat Titertek Multiskan® Typ 310 C - Flow Laboratories).

d) Kalibrierung und Darstellung der Resultate

Zur Durchführung der Kalibrierung dieser Versuche wurde eine Präparation von ganzen menschlichen Lymphozyten verwendet, die zuvor mittels der zytofluorometrischen Methode von Poncelet et al (J. Immunol. Methods 1985, 85, 65-74) auf CD4- und CD8- Antigene kalibriert wurde. Bekannte aliquote Entnahmen dieser Referenzpräparation dienten zur Bildung der zwei Standardskalen für das CD4-Antigen bzw. das CD8-Antigen, wobei unter Bezugnahme auf dieselben die Antigenanzahlen entsprechend jeder Probe errechnet werden.
Zur Veranschaulichung zeigt die nachstehende Tabelle 1 für 20 menschliche Blutproben von gesunden Spendern die erhaltenen Werte für die optische Dichte, die Anzahl an Molekülen der entsprechenden Antigene CD4 und CD8 und die Verhältnisse der davon abgeleiteten Antigenanzahlen (Verhältnis CD4/CD8). TABELLE 1 Antigen Nummer des Spenders Optische Dichte Anzahl an Antigenmolekülen (in Millionen) pro ul Blut Molverhältnis

Beispiel 2

Immunenzymometrische Bestimmung der Molkonzentration der CD4- und CD8-Antigene aus menschlichen Blutproben mit einer Antikörpermarkierung mittels alkalischer Phosphatase.
Diese Bestimmung erfolgt wie in Beispiel 1. Die Herstellung des Konjugats aus monoklonalem Antikörper - alkalischer Phosphatase erfolgt nach der von Boehringer Mannheim - Biochemica (Ref. 567 744) aufgezeigten Methode. Nach 1 Stunde Inkubation der zu bestimmenden Zellen mit diesem Konjugat weist man das fixierte Enzym durch Zugabe einer Paranitrophenylphosphatlösung mit 1 mg/ml in einem 1,2%igen Diethanolaminpuffer in destilliertem Wasser, der mit einer verdünnten Salzsäurelösung auf pH 9,8 eingestellt wurde, nach. Nach 2 Stunden bei 37ºC mißt man die optische Dichte mit dem Spektrofotometer bei 405 nm.
Es werden die Resultate berechnet und wie in Beispiel 1 ausgedrückt.

Beispiel 3

Immunradiometrische Bestimmung der Molkonzentration der CD4- und CD8-Antigene aus menschlichen Blutproben mit einer Antikörpermarkierung mittels Iod 125.
Die Herstellung des mit Iod 125 markierten Antikörpers erfolgt nach der von F. C. Greenwood, V. M. Hunter et al., Biochem. J., 1963, 89, 114 beschriebenen Technik.
Man mischt 50 ug monoklonalen anti-CD4- oder anti-CD8- Antikörper, der in 50 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit pH 7,2 enthalten ist, mit 37 MBq Iod 125 in Form von Natriumiodid und 30 ul einer Chloramin T-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,33 mg Chloramin T pro ml. Nach 1 min Rühren stoppt man die Markierungsreaktion des monoklonalen Antikörpers, indem man 100 ul einer Natriummetabisulfitlösung' in einer Menge von 2,5 mg/ml zugibt. Die so hergestellte Lösung wird über eine PD 10-Säule (Pharmacia - Sephadex® G25M) geleitet, und man gewinnt im Eluat die den radiomarkierten Antikörper enthaltende Fraktion. Die Bestimmung erfolgt, indem in 4 Mikrovertiefungen ein Volumen von 100 ul Zellsuspension, enthaltend die einkernigen Zellen des wie in Beispiel 1 präparierten menschlichen Bluts eingebracht wird. Man gibt danach 100 ul verdünnte Lösung des radioaktiven Antikörpers in einen 5% BSA enthaltenden PBS-Puffer, so daß 150 000 cpm pro Vertiefung eingebracht werden; 2 Mikrovertiefungen werden mit jeweils 100 ul der Lösung des anti-CD4-125-I-Konjugats gefüllt, 2 Mikrovertiefungen werden mit jeweils 100 ul der Lösung des anti-CD8-125-I-Konjugats gefüllt. Die Fixierung der Zellen wird durch eine Zentrifugation der Platte während 3 min mit 150 · g nach 1 Stunde Inkubation bei Umgebungstemperatur verbessert. Die Mikrovertiefungen werden durch Umdrehen der Platte entleert. Man wäscht die Mikrovertiefungen 4-mal mit 200 ul PBS pro Vertiefung. Man bringt danach 75 ul 1 M Natriumhydroxidlösung in jede Vertiefung ein. Nach 10 min wird der Inhalt jeder Vertiefung mit einem Absorptionspuffer gesammelt, bevor die Radioaktivität mit dem γ-Zähler (Zähler LKB mit vielen Vertiefungen) gezählt wird.
Es werden die Resultate errechnet und wie in Beispiel 1 ausgedrückt, wobei anstelle der optischen Dichtewerte die Zählresultate in dpm angegeben sind.

Beispiel 4

Überprüfung der Qualität des Verfahrens

An 20 menschlichen Blutproben wurden die Antigene CD4 und CD8 der menschlichen T-Zellen unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen immunometrischen Verfahrens mit Peroxidase gemessen. An denselben Blutproben wurde weiters unter Anwendung der konventionellen Technik (W.W. Erber et al., Lancet, 1984, (8385), 1042-1045) der Zellzählung das Verhältnis der Anzahl an positiven T4-Zellen zur Anzahl an positiven T8-Zellen bestimmt.
Der Korrelationskoeffizient zwischen dem durch immunenzymometrische Bestimmung erhaltenen CD4/CD8-Verhältnis und dem durch Zellzählung erhaltenen T4/T8-Verhältnis ist r = 0,72.
Desgleichen wurde an sieben weiteren menschlichen Blutproben das CD4/CD8-Verhältnis, das durch die immunradiometrische Methode unter Anwendung der Markierung mit Iod 125 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurde, mit dem Verhältnis der T4/T8-Zellen verglichen, das durch Zählung der Zellen bestimmt wurde. Der Korrelationskoeffizient ist r = 0,87.
In beiden Fällen zeigen die erhaltenen Korrelationskoeffizienten, daß trotz einer zufriedenstellenden Gesamtübereinstimmung zwischen den Resultaten der beiden Methoden die durch die zwei Verhältnisse erbrachte Information nicht äquivalent ist, was insofern klar ist, da die erfindungsgemäße Bestimmung der Antigene nicht nur die Anzahl an positiven Zellen berücksichtigt, wie dies der Fall bei der zytologischen Methode ist, sondern auch die Dichte des betreffenden Antigens an den positiven Zellen jeder Probe. Die durch die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Technik gelieferte Information ist somit vollständiger als die durch die konventionelle Referenztechnik (W. W. Erber et al., Lancet, 1984, (8385), 1042-1045) erbrachte.

Beispiel 5

Immunenzymometrische Bestimmung der Molkonzentration der Antigene CD4 und CDB der T-Lymphozyten aus menschlichen Blutproben mit einer Markierung der Antikörper mittels Peroxidase.
Dieses Beispiel soll zeigen, daß man die zur Bestimmung notwendige Zeit gegenüber den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen verringern kann, indem man einerseits das Verfahren zur Trennung der Zellen und andererseits die Inkubationszeit verändert, die für den Schritt des Immuneinfangs und der Markierung der Zellen notwendig ist.

A) Einfluß des Verfahrens zur Trennung der Zellen vom Gesamtblut

a) Technik der Kurzzentrifugation

Man nimmt 0,5 ml der zu bestimmenden Blutprobe, die man mit 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung mischt. In ein Hämolyseröhrchen von 5 ml gibt man 1,5 ml Ficoll-Paque®, erhältlich bei Pharmacia, und man bringt die in PBS verdünnt Blutprobe auf die Oberfläche der Ficoll®-Schicht auf. Nach 5 min Zentrifugieren mit 900 · g bei Umgebungstemperatur entnimmt man den Suspensionsring, der einkernige Zellen in einem Volumen von 0,5 ml enthält. Diese Probe wird mit 1,5 ml PBS versetzt.

b) Technik mittels Erythrozytenlyse

Ein anderes Schnellverfahren zur Abtrennung von Zellen aus dem Blut beruht auf der Verwendung eines Puffers, der die roten Blutkörperchen zerstört. Der Lysepuffer, der als Beispiel und nicht einschränkend verwendet wurde, hat folgende Zusammensetzung:
Ammoniumchlorid: 8,29 g
saures Kaliumcarbonat: 1 g
Ethylendiamintetraessigsäure-dinatriumsalz 0, 0307 g pro 1 l destilliertem Wasser, wobei der pH auf 7,3 eingestellt wird.
Man mischt 5 ml Lysepuffer und 0,250 ml Blut. Nach 10 min unter Rühren zentrifugiert man mit 600 · g 10 min lang. Der gebildete Zellrückstand wird in 1 ml PBS-Puffer aufgenommen. Indem man danach die Bestimmung der Antigene CD4 und CD8 unter den Bedingungen des Beispiels 1 vornimmt sowie durch einen Vergleich mit dem in Beispiel 1 für die Isolierung der einkernigen Zellen vom Blut beschriebenen Referenzprotokoll wurde überprüft, ob die eine oder die andere der beiden Varianten des Verfahrens zur Abtrennung der einkernigen Zellen vom Vollblut auch wirklich die Gewinnung sämtlicher Lymphozyten aus den untersuchten Blutproben zuließ.

B) Einfluß der Inkubationszeit für den Immuneinfang und die Markierung der Zellen

Um zu überprüfen, ob der in Beispiel 1 angewendete Zeitraum von 1 Stunde nicht reduziert werden kann, um den Ablauf der Bestimmung zu beschleunigen, wurden die Ergebnisse verglichen, die für identische Proben, enthaltend jeweils 20 000 einkernige Zellen pro Vertiefung, erhalten wurden, wenn man den für den Einfang und die Markierung der Zellen zugestandenen Zeitraum von 10 min bis zu 1 Stunde variieren läßt. Die Arbeitsbedingungen waren ansonsten jene des Beispiels 1, die erzielten Resultate sind in Tabelle 2 aufgezeigt. TABELLE 2 Inkubationszeit (Minuten) Optische Dichte Antigen Versuch Leerwert
*Diese Werte der optischen Dichte entsprechen dem Reagenzien- Leerwert, der in Abwesenheit der Zellen erhalten wurde. Die in Gegenwart der Zellen und unter Weglassung entweder des Konjugats oder des Substrats erzielten Kontrollwerte sind nicht höher als die aufgezeigten Werte.
Diese Resultate zeigen, daß:
- das nicht spezifische Signal (Reagenzien-Leewert) immer auf geringen Werten bleibt, u.zw. umso geringeren, je kürzer die Zeit des Anwesenheit des Konjugats ist;
- das spezifische Signal nach 10 min Kontakt einen Wert erreicht, der analytisch mit Präzision und Reproduzierbarkeit genützt werden kann. Dies bedeutet, daß es möglich ist, die Durchführungsdauer der Bestimmung ohne bedeutenden Verlust bei der Genauigkeit der Resultate signifikant zu verringern.
In der Praxis ist es, rechnet man den Zeitgewinn, den man bei der Herstellung der Blutprobe und beim Immuneinfang erzielen kann, zusammen, mit dem erfindungsgemäßen Kit und Verfahren möglich, die Antigene CD4 und CD8 (als nicht einschränkende Beispiele) von Proben von Vollblut in einer Menge von 10 oder 20 Proben pro Platte mit 96 Vertiefungen in einer Gesamtzeit (ab dem Empfang der Proben im Labor) zu bestimmen, die 1 Stunde nicht übersteigt. Dieser Grad der Produktivität liegt über jenem sämtlicher bisher bekannter alternativer Methoden.

Beispiel 6

Bestimmung von verschiedenen an aktivierten menschlichen T-Lymphozyten exprimierten Antigenen

Die Aktivierung der T-Lymphozyten ist ein physiologischer Prozeß, der frühzeitig eintritt jedes Mal, wenn das Immunsystem belastet wird, wie z. B. bei Infektionskrankheiten, bei Organtransplantationen und bei gewissen Immunstörungen. Dieser natürliche Prozeß wird auch häufig im Labor in vitro herbeigeführt, u.zw. in Versuchen, wie insbesondere über gemischte Lymphozytenreaktionen, oder Versuchen über die Lymphoblastentransformation. Im letzteren Fall wird die polyklonale Aktivierung durch den Einsatz von Mitteln, wie Phytohämagglutinin (PHA), Concanavalin A oder anderen Lectinen, erreicht. Die Aktivierung der T-Lymphozyten geht Hand in Hand mit einem beträchtlichen Anstieg der Expression mehrerer Membranmarker, insbesondere des Antigens CD25 (Interleukin 2- Rezeptors) oder des Antigens CD2. Diese Antigene stellen somit hervorragende Marker des Aktivierungszustandes dar, und ihre Bestimmung ist von großem Interesse sowohl in der klinischen Biologie als auch für Arbeiten im Labor, wie oben ausgeführt, wobei in allen Fällen der Einsatz von radioaktiven Reagenzien vermieden wird.
Diese Antigene werden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens mit den in Tabelle 3 präzisierten Spezifikationen gemessen. TABELLE 3 Messung der Oberflächenantigene der aktivierten T-Lymphozyten Gemessenes Antigen Für den Immuneinfang verwendeter Antikörper erhältlich bei Mit Peroxidase markierter Antikörper erhältlich bei
Die Werte der optischen Dichte, gemessen bei 450 nm für 25·10³ zum Einsatz gelangende einkernige Zellen sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefaßt und geben einen Vergleich der gleichen Zellen ohne Stimulation durch PHA und nach dreitägiger Stimulation. TABELLE 4 Optische Dichte Antigen Nicht aktivierte Zellen 3 Tage aktivierte Zellen Reagenzien-Leerwert
Diese Resultate zeigen den beträchtlichen Anstieg der spezifischen Signale der beiden untersuchten Antigene bei einer Aktivierung.

Beispiel 7

Bestimmung der an den B-Lymphozyten vorhandenen Antigene CD 22 und HLA-Dr (oder HLA der Klasse II)

Das vorliegende Beispiel beschreibt die Bestimmung dieser Antigene an Zellen des Stamms RAJI, der eine menschliche Lymphoid B-Linie und von Pulvertaft in J. Clin. Pathol, 1965, 18, 261-274 beschrieben ist.
Für den Immuneinfang der Zellen wurde in den Vertiefungen für die Bestimmung, wie in Beispiel 1 ausgeführt, entweder der Antikörper S-Klasse II (Biosys) zur Bestimmung der Antigene CD22 oder der Antikörper SB4 (Biosys) zur Bestimmung der Antigene HLA der Klasse II (oder HLA-Dr) adsorbiert.

a) Bestimmung des Antigens CD22

Der Antikörper SB22 (Biosys) wurde mit Iod 125 nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren markiert. Die Bestimmung der Antigene CD22 erfolgt auf die in Beispiel 3 für die Antigene CD4 und CD8 beschriebene Weise, indem in die Mikrovertiefungen nacheinander 5·10&sup4; Zellen der Linie RAJI und dann 10- cpm markierter Antikörper SB22 eingebracht wurden. Nach einem Zeitraum von einer Stunde bei 4ºC werden die Mikrovertiefungen durch Umdrehen der Platte entleert und viermal mit 200 ul PBS pro Vertiefung bei jeder der Waschungen gewaschen. Die an den Zellen fixierte Radioaktivität wird gesammelt und wie in Beispiel 3 gezählt. Man erhält so eine Zählung von 760 dpm für die Vertiefungen, die 5 · 10&sup4; Zellen RAJI enthalten, bei einem Reagenzien-Leerwert (ohne Zellen) von 50 dpm.

b) Bestimmung des Antigens HLA-Dr

Man bringt nacheinander in die Vertiefungen 10&sup5; Zellen und das gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit Peroxidase markierte Antikörper S-Klasse II-Konjugat ein. Die Bestimmung erfolgt nach demselben Protokoll wie in Beispiel 1. Man erhält so eine optische Dichte von 1,840 und einen Reagenzien-Leerwert ohne Zellen von 0,105.

Beispiel 8

Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Messung von an T-Lymphozyten und B-Lymphozyten des menschlichen Bluts vorhandenen Antigenen.

A) Präparation der Platten

Man verwendet Mikrotiterplatten, die wie in Beispiel 1 präpariert wurden, mit der Ausnahme, daß in jeder Vertiefung der Mikroplatte gleichzeitig monoklonale Antikörper, die mindestens die Gesamtheit der T-Lymphozyten (S-Klasse I von Biosys) und B-Lymphozyten (S-Klasse II von Biosys) fixieren können, adsorbiert werden, wobei jeweils eine Konzentration von 5 ug/ml verwendet wurde.

B) Immunometrische Bestimmung

Die einkernigen Zellen werden mit Hilfe von Ficoll® unter den Bedingungen des Beispiels 1 oder des Beispiels 5 vom Vollblut abgetrennt, dann bringt man 80 000 einkernige Zellen pro Vertiefung in 75 ul PBS-Puffer ein. In gewissen Vertiefungen werden die T-Lymphozyten mit dem Antikörper ST 11 (anti-CD 2) von Biosys gemessen; in anderen Vertiefungen werden die B-Lymphozyten mit dem Antikörper SB 3 (anti-CD 37) von Biosys, der alle peripheren B-Lymphozyten erkennt, gemessen. Diese Antikörper werden zuvor nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll mit Peroxidase gekoppelt. Die eigentliche Bestimmung wird wie in Beispiel 1 ausgeführt.

C) Resultate

Es wird die absolute Anzahl der in der Probe enthaltenen T-Lymphozyten und B-Lymphozyten unter Bezugnahme auf erstellte Kalibrierkurven bestimmt, indem einkernige Zellen, in denen die T- und B-Lymphozyten durch eine Referenzmethode gezählt wurden, identisch behandelt wurden.
Alternativ kann man die Resultate in Molkonzentrationen der CD2- und CD37-Antigene in der untersuchten Probe auch mittels geeigneter Standards ausdrücken.

Beispiel 9

Bestimmung der Antigene GpIIb-IIIa und CD9 der menschlichen Blutplättchen.
Diese Bestimmung erfolgt nach Beispiel 3 unter Verwendung von mit Iod 125 radiomarkierten monoklonalen Antikörpern.
Die Plättchen werden vom menschlichen Blut durch Zentrifugation in Gegenwart von Perfusionsflüssigkeit Plasmion® (Labor R. Bellon) isoliert. In einem Reagenzglas mischt man 5 ml Blut plus 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 10 ml Plasmion®. Das Reagenzglas wird dann 10 min lang mit 1500 U/min zentrifugiert. Die im Überstand angesammelten Plättchen werden durch Ansaugung mittels Pipette entfernt. Sie werden einmal in PBS gewaschen, indem 1 Volumenteil Plättchensuspension mit 10 ml PBS gemischt wird, und dann 10 min lang mit 1000 · g zentrifugiert. Schließlich sammelt man das Plättchenpellet und bringt es neuerlich in PBS (2 ml) in Suspension. Die Plättchen werden gezählt und ihre Konzentration auf 2,5 Millionen/ml PBS eingestellt.
Zur Bestimmung des Antigens GpIIb-IIIa bewirkt man den Immuneinfang der Plättchen durch den monoklonalen Antikörper IOB2 (Immunotech) und die Markierung des Antigens GpIIb-IIIa mit dem monoklonalen Antikörper P2 (Immunotech).
Zur Bestimmung des Antigens CD9 bewirkt man den Immuneinfang mit dem monoklonalen Antikörper P2 und die Markierung mit dem monoklonalen Antikörper IOB2. Man mißt die Anzahl an dpm für eine Probe mit 200 000 Plättchen.
Die Resultate sind in Tabelle 5 angeführt. TABELLE 5 Gemessenes Antigen Gemessene Probe Kontrolle ohne Zellen

Beispiel 10

Auswertung des Phenotyps einer Leukämie mit dem immunenzymometrischen Verfahren.
Die Phenotypisierung der Tumorzellen eines Leukämiepatienten ist eine systematische diagnostische Untersuchung, die zur Charakterisierung des Typs und Ursprungs der Leukämiezellen des Patienten (T, B, Granulozyten, Myeloblasten, etc.) durchgeführt wird. Diese Untersuchung wird klassischerweise mittels der Immunfluoreszenzmethode unter Verwendung einer Batterie von monoklonalen Antikörpern und unter Beobachtung und Zählung der positiven Zellen im Mikroskop ausgeführt. Man verwendet auch die Fließzytometrie zur Analyse der Markierung der Zellen.
Der Einsatz von monoklonalen Antikörpern beim erfindungsgemäßen Verfahren gestattet die Identifizierung der großen, klinisch bedeutenden Gruppen von akuten oder chronischen Leukämien, wobei außerdem eine quantitative Information über die relative Dichte der verschiedenen untersuchten Antigene eingebracht wird.
In diesem Beispiel wurden sechs mit Peroxidase gekoppelte monoklonale Antikörper hergestellt, die spezifisch für an den Leukämiezellen vorhandene Antigene sind:
- ST 1 und ST 11 (Biosys): anti-CDE 5 und anti-CD 2
- SB 3 (Biosys): anti-CD 37
- S-CALLA (Sanofi): anti-CALLA (oder anti-CDIO)
- S-Klasse II (Biosys): anti-HLA-Dr (oder anti-HLA der Klasse II)
- SMY 15 (Biosys): anti-CD 15
Die Mikrotiterplatte wird präpariert durch Voradsorption einer Mischung von monoklonalen anti-CD 45-Antikörpern (S-LCA, Biosys) und anti-HLA-Antikörpern der Klasse I (S-Klasse I, Biosys).
Unter Verwendung der sechs oben ausgesuchten monoklonalen Antikörper wird der Phänotyp einer chronischen lymphoiden Leukämie B (LLC-B) ermittelt, der außerdem durch die konventionelle Methode charakterisiert wurde.
Für 80 000 ganze einzellige Zellen, die pro Vertiefung eingebracht wurden, bzw. für die Kontrollvertiefungen ohne Zellen sind die bei 492 nm gemessenen optischen Dichten in der nachstehenden Tabelle 6 aufgezeigt. Bei den Kontrollvertiefungen, die die Zellen, aber keinen mit Peroxidase markierten Antikörper enthalten, ist die optische Dichte 0,110. TABELLE 6 Monoklonaler Antikörper und entsprechendes Antigen Optische Dichte Probe mit Zellen Kontrolle ohne Zellen S-Klasse II
So weisen die untersuchten Leukämiezellen die Antigene CDS, CD37 und HLA der Klasse II reichlich auf, sie haben aber keine oder nur sehr wenige Antigene CDIS, CALLA und CD2, was charakteristisch für LLC-B ist.

Claims

1. Kit zur immunometrischen Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene, die jeweils für eine zelluläre Unterpopulation charakteristisch sind, welche Unterpopulationen eine Population ausmachen, welcher Kit folgende Bestandteile aufweist:

a) einen festen Träger, auf dem durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption ein oder mehrere monoklonale Antikörper fixiert sind, die gegen der gesamten Zellpopulation gemeinsame Oberflächenantigene und nicht gegen die für die Unterpopulationen charakteristischen Antigene gerichtet sind;

b) mehrere Lösungen, die jeweils einen monoklonalen Antikörper enthalten, von denen jeder spezifisch für das zu bestimmende und für eine zelluläre Unterpopulation charakteristische Antigen ist, welcher Antikörper mit einer radioaktiven Sonde oder einer enzymatischen Sonde markiert ist;

c) im Fall von mit einer enzymatischen Sonde markierten Antikörpern eine oder mehrere die zur Anzeige der Aktivität des Enzyms notwendigen Reagenzien einführende Lösung(en);

d) gegebenenfalls einen zusätzlichen Bestandteil, bestehend aus einer Waschpufferlösung und/oder Proben, die die Kalibrierung und die Qualitätskontrolle der Bestimmung gestatten.

2. Kit nach Anspruch 1, worin der Bestandteil a) ein fester Träger ist, welcher durch eine Mikrotiterplatte gebildet ist, in deren Vertiefungen der oder die zur Immobilisierung der Zellen der Population bestimmte(n) Antikörper fixiert ist/sind.

3. Kit nach Anspruch 1, worin der Bestandteil a) ein partikelförmiger Magnetträger ist.

4. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Bestandteil a) durch einen festen Träger gebildet ist, auf dem ein oder mehrere monoklonale HLA-Antikörper der Klasse I fixiert sind.

5. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die monoklonalen Antikörper des Bestandteils b) mit einer radioisotopen Jod 125- oder Jod 131-Sonde markiert sind.

6. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die monoklonalen Antikörper des Bestandteils b) mit einer enzymatischen Sonde markiert sind.

7. Kit nach Anspruch 6, worin die monoklonalen Antikörper des Bestandteils b) mit Peroxidase markiert sind und der Bestandteil c) im wesentlichen Wasserstoffperoxid und ein Chromogen, ausgewählt aus Orthophenylendiamin, 2,2' -Azino-bis- (3-ethyl-6-benzothiazolinsulfon)-säure, 3,3'-Diaminobenzidin, 3-Amino-9-ethylcarbazol oder einem wasserlöslichen Salz davon, umfaßt.

8. Kit nach Anspruch 6, worin die monoklonalen Antikörper des Bestandteils b) mit alkalischer Phosphatase markiert sind und der Bestandteil c) durch Paranitrophenylphosphat, 4-Methylumbelliferylphosphat oder 5-Brom-4-chlor-indol-3-yl-phosphat gebildet ist.

9. Kit nach Anspruch 6, worin die monoklonalen Antikörper des Bestandteils b) mit β-Galactosidase markiert sind und der Bestandteil c) durch orthonitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder 4-Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid gebildet ist.

10. Kit nach Anspruch 6, worin die monoklonalen Antikörper des Bestandteils b) mit Acetylcholinesterase markiert sind und der Bestandteil c) im wesentlichen Acetylthiocholin und 5,5'- Dithio-2-nitro-benzoesäure oder eines der wasserlöslichen Salze davon umfaßt.

11. Kit nach Anspruch 1 zur Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene der im menschlichen Blut vorhandenen Elemente, wie Leukozyten, Lymphozyten, T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten und Plättchen.

12. Kit nach Anspruch 11 zur Bestimmung der CD4- und CD8- Antigene der menschlichen T-Lymphozyten als Träger des einen oder anderen dieser Antigene, genannt T4-Lymphozyten und T8- Lymphozyten.

13. Kit nach Anspruch 1 zur Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene eines pathogenen Mikroorganismus.

14. Kit nach Anspruch 13, worin der pathogene Mikroorganismus Candida albicans ist.

15. Kit nach Anspruch 1 zur Bestimmung mehrerer Antigene von Tumorzellen.

16. Kit nach Anspruch 15, worin die Tumorzellen Krebszellen des Harnapparats oder solche maligner Hämopathien sind.

17. Kit nach Anspruch 1 zur Bestimmung von spezifischen Antigenen der Lymphozyten-Unterpopulationen T, T4, T8 und B.

18. Kit nach Anspruch 1 zur Charakterisierung und Bestimmung verschiedener Antigene, die die Antigenausrüstung der Oberfläche von Tumorzellen maligner Hämopathien bilden.

19. Verfahren zur immunometrischen Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene, die jeweils für eine zelluläre Unterpopulation charakteristisch sind, welche Unterpopulationen eine Population ausmachen, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht:

a) die Zellpopulation auf einem festen Träger mittels eines oder mehrere monoklonaler Antikörper(s), die zuvor durch kovalente Bindung oder durch physikalische Adsorption auf dem Träger fixiert wurden und spezifisch für andere Oberflächenantigene dieser Population als für die für die Unterpopulationen charakteristischen Antigene sind, zu immobilisieren und in derselben Stufe die fixierte Population bildende zelluläre Unterpopulationen direkt mit mehreren Lösungen zu markieren, welche jeweils einen monoklonalen Antikörper enthalten, von denen jeder spezifisch für ein zu bestimmendes Oberflächenantigen einer der zellulären Unterpopulationen ist, wobei die Antikörper mit einer radioisotopen oder enzymatischen Sonde versehen sind;

b) einen Inkubationszeitraum einzuhalten;

c) den Träger zur Entfernung der nicht immobilisierten Zellen und des Antikörperüberschusses zu waschen;

d) für den Fall, daß der Antikörper eine enzymatische Sonde aufweist, das oder die zur Anzeige der Aktivität des Enzyms notwendige(n) Reagens/zien (Substrat und Chromogen) zuzugeben, und

e) die Resultate entweder durch Zählung der Radioaktivität oder durch Messung der Lichtsignale (Färbung oder Fluoreszenz), gegebenenfalls unter Bezugnahme auf eine Kalibrierskala, abzulesen.

20. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 19, worin der feste Träger wie in einem der Ansprüche 2 oder 3 definiert ist.

21. Bestimmungsverfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, worin die zur Markierung bestimmten monoklonalen Antikörper mit einer enzymatischen Sonde versehen sind.

22. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 21, worin die enzymatische Sonde Peroxidase ist und die Aktivität des Enzyms durch Wasserstoffperoxid und ein Chromogen, ausgewählt aus Orthophenylendiamin, 2,2'-Azino-bis-(3-ethyl-6- benzothiazolinsulfon)-säure, 3,3'-Diaminobenzidin, 3-Amino-9- ethylcarbazol oder einem wasserlöslichen Salz davon, angezeigt wird.

23. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 21, worin die enzymatische Sonde alkalische Phosphatase ist und die Aktivität des Enzyms durch Paranitrophenylphosphat, 4-Methylumbelliferylphosphat oder 5-Brom-4-chlor-indol-3-yl-phosphat angezeigt wird.

24. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 21, worin die enzymatische Sonde β-Galactosidase ist und die Aktivität des Enzyms durch Orthonitrophenyl-β-D-galactopyranosid oder 4- Methyl-umbelliferyl-β-D-galactopyranosid angezeigt wird.

25. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 21, worin die enzymatische Sonde Acetylcholinesterase ist und die Aktivität des Enzyms durch Acetylthiocholin und, als Chromogen, 5,5'- Dithio-2-nitro-benzoesäure oder eines der wasserlöslichen Salze davon angezeigt wird.

26. Bestimmungsverfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die zur Markierung bestimmten monoklonalen Antikörper mit einer radioisotopen Jod 125- oder Jod 131-Sonde versehen sind.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, worin die Gesamtdauer der Durchführung der Bestimmung unter oder gleich 1 Stunde beträgt.

28. Verfahren nach Anspruch 19, worin der oder die auf dem festen Träger fixierte(n) monoklonale(n) Antikörper HLA- Antikörper der Klasse I sind.

29. Verfahren nach Anspruch 19 zur Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene der im menschlichen Blut vorhandenen Elemente.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin die im menschlichen Blut vorhandenen Elemente Leukozyten, Lymphozyten, T- Lymphozyten, T-Lymphozyten als Träger des Markers CD4, genannt T4-Lymphozyten, T-Lymphozyten als Träger des Markers CD8, genannt T8-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Granulozyten und Plättchen sind.

31. Verfahren nach Anspruch 19 zur Bestimmung mehrerer Oberflächenantigene eines pathogenen Mikroorganismus.

32. Verfahren nach Anspruch 31, worin der pathogene Mikroorganismus Candida albicans ist.

33. Verfahren nach Anspruch 19 zur Bestimmung mehrerer Membranantigene von Tumorzellen.

34. Verfahren nach Anspruch 33, worin die Tumorzellen Krebszellen des Harnapparats oder solche maligner Hämopathien sind.

35. Verfahren nach Anspruch 19 zur Bestimmung von spezifischen Antigenen der Lymphozyten-Unterpopulationen T, T4, T8 und B.

36. Verfahren nach Anspruch 19 zur Charakterisierung und Bestimmung verschiedener Antigene, die die Antigenausrüstung der Oberfläche von Tumorzellen maligner Hämopathien bilden.