DE3882058T2

DE3882058T2 - Immunoreaktives Reagens, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Bestimmung einer immunoreaktiven Spezies.

Info

Publication number: DE3882058T2
Application number: DE19883882058
Authority: DE
Inventors: Robert Troconis C O East Belly; Brian Anthony C O Eastm Snyder; Harold Chester Warren
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-02-26
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2008-02-27
Also published as: JPS63229367A; EP0281327A2; DE3882058D1; JPH0664061B2; EP0281327A3; EP0281327B1

Description

Diese Erfindung betrifft ein immunoreaktives Reagens sowie ein Verfahren zur Herstellung desselben. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verwendung des Reagens im Rahmen einer Bestimmung einer immunoreaktiven Species, wie beispielsweise Streptococcus-A-Antigen.
Die Antigen-Antikörper-Reaktion ist die Basis aller immunologischer Testverfahren. Bestimmte Proteine, bekannt als Antikörper, werden von Säugetieren als Reaktion auf die Anwesenheit eines Antigens erzeugt, bei dem es sich um eine Fremdsubstanz handelt, die aus einem anderen Protein bestehen kann oder einem Carbohydrat. Diese normale Körperreaktion auf eine Fremdsubstanz hat zur Entwicklung einer Anzahl von Methoden geführt, die dazu verwendet werden, um verschiedene Krankheiten, Störungen und physiologische Bedingungen zu diagnostizieren. Ganz allgemein wird die Komponente einer immunochemischen Reaktion, die bestimmt werden soll, hier definiert als die immunoreaktive Species, wohingegen die entsprechende Komponenten, die mit der Species reaktiv ist, als Rezeptor betrachtet wird.
Beispielsweise werden in vitro-Tests zur Bestimmung des Vorhandenseins eines vermuteten Proteins, Antigens oder Antikörpers in einer biologischen Probe durchgeführt durch Zugabe eines immunologischen Gegenspielers zur biologischen Probe. Ist die vermutete Substanz vorhanden, so läßt sich die ablaufende immunochemische Reaktion demonstrieren durch Ausfällung des Reaktionskomplexes (z.B. eines Antikörper- Antigen-Komplexes). Dieser Reaktionskomplex ist im allgemeinen visuell schwierig zu ermitteln. Aus diesem Grund werden entweder Antikörper oder Antigene oftmals an unlösliche Teilchen gebunden, beispielsweise Polymerlatexteilchen, so daß, wenn der Komplex gebildet wird, dieser leicht durch die ablaufende Agglutination ermittelt werden kann, durch Feststellung von entweder einer Verklumpung oder eines bestimmbaren Tracers, der mit den Teilchen assoziiert ist. Die Agglutination ist dann gekennzeichnet durch die Verklumpung von Teilchen aus einer Suspension von Teilchen. Weitere Details bekannter Agglutinationsverfahren ergeben sich aus den U.S.-Patentschriften 4 419 453 und 4 459 361.
Von den verschiedenen Streptococcus-Gruppen ist die Gruppe Streptococcus A (S. pyogenes) primär verantwortlich für die Verursachung von pathalogischen Zuständen beim Menschen, beispielsweise der B-hemolytischen Pneumonia, Scharlachfieber, rheumatischem Fieber, Kardial-Sequelae, Glomerulonephritis, septischer Pharyngitis und Kindbettsepsis. Aufgrund der schwerwiegenden Natur von Infektionen, die durch Streptococcus-A verursacht werden, ist es wichtig, das Vorhandensein dieses Streptococcus in einem frühen Zeitpunkt einer Infektion festzustellen, so daß eine geeignete Behandlungsmethode festgelegt werden kann. Frühere Testverfahren zur Bestimmung er forderten die Kultur einer biologischen Probe über längere Zeiträume hinweg, gewöhnlich mindestens 18 und bis zu 48 Stunden. In den meisten Fällen wird die Behandlung durch derartige langwierige Testverfahren in unerwünschter Weise verzögert.
In jüngerer Zeit sind Agglutinations-Testverfahren für Streptococcus-A beschrieben worden, die angeblich schneller durchzuführen sind als die Kulturmethoden (vgl. beispielsweise die U.S.-Patentschrift 4 618 576 und die europäischen Publikationen 150 567 und 174 195).
Nicht-spezifische Reaktionen zwischen Latexteilchen, die zur Agglutination führen, werden normalerweise gesteuert durch eine elektrostatische Abstoßung. Mit anderen Worten, auf den Teilchen liegen genügend ähnliche Ladungen vor, um andere Teilchen abzustoßen. Im Falle von Agglutinations-Bestimmungsverfahren, wie sie z.B. in der U.S.-Patentschrift 4 459 361 beschrieben werden, haben sich jedoch andere Probleme ergeben. Werden bestimmte Proteine (z.B. Rezeptoren für eine immunoreaktive Species, die bestimmt werden soll) an die Teilchen gebunden, so besteht die dabei anfallende Netto-Ladung aus einer Mischung von positiven und negativen Ladungen. Dies führt zu beträchtlichen nicht-spezifischen Reaktion unter den Teilchen, wie auch zu verstärkten nicht- spezifischen Reaktionen zwischen den Teilchen und anderen aufgeladenen Oberflächen in der Umgebung, z.B. bei mikroporösen Membranen. Es wäre daher wünschenswert, wenn sämtliche dieser nicht-spezifischen Reaktionen beträchtlich vermindert oder eliminiert werden können, um die Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode zu verbessern.
Erfindungsgemäß wurden die oben beschriebenen Probleme überwunden mit einem immunoreaktiven Reagens, das für die Bestimmung einer immunoreaktiven Species geeignet ist, und das umfaßt wasserunlösliche Partikel oder Teilchen mit Tracer-Molekülen, die den wasserunlöslichen Partikeln oder Teilchen zugeordnet sind, und Rezeptor-Molekülen, die mit der Species, die an die äußeren Oberflächen der Partikel oder Teilchen gebunden sind, reaktiv sind, wobei das Reagens dadurch gekennzeichnet ist, daß an die äußeren Oberflächen der Partikel oder Teilchen ferner Moleküle eines Proteins mit einem pI von weniger als 6 gebunden sind, wobei das Protein nicht reaktiv ist, weder mit der Species noch den Rezeptor-Molekülen, und wobei das Gew.-Verhältnis von Rezeptor-Molekülen zu den Protein-Molekülen bei 100:1 bis 1:10 liegt.
Durch die Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung des immunoreaktiven Reagens wie oben beschrieben bereitgestellt, das umfaßt:
Die Bereitstellung einer Suspension von wasserunlöslichen Partikeln mit diesen zugeordneten Tracer-Molekülen und
praktisch gleichzeitige Kontaktierung der Partikel oder Teilchen mit
(i) Rezeptor-Molekülen, die mit der Species reaktiv sind und
(ii) Molekülen eines Proteins mit einem pI von weniger als 6, wobei das Protein nicht reaktiv ist mit entweder der Species oder den Rezeptor-Molekülen, um die Rezeptor-Moleküle und die Protein-Moleküle an die äußeren Oberflächen der Partikel oder Teilchen zu binden, wobei das Protein in einer Menge vorliegt, derart, daß praktisch sämtliches Protein an die Partikel oder Teilchen gebunden wird, und daß das erhältene Gew.-Verhältnis von Rezeptor- Molekülen zu den Protein-Molekülen bei 100:1 bis 1:10 liegt.
Ein Verfahren zur Bestimmung einer immunoreaktiven Species in einer wäßrigen Flüssigkeit umfaßt:
(a) Kontaktieren der Flüssigkeit mit dem oben beschriebenen immunoreaktiven Reagens unter Bildung eines Reaktionsproduktes aus der Species und den Rezeptor-Molekülen,
(b) Trennung des Reaktionsproduktes von nicht-umgesetztem immunoreaktivem Reagens und
(c) Bestimmung der Menge an Tracer entweder im Reaktionsprodukt oder dem nicht-umgesetzten Reagens.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens ermöglicht ein Bestimmungsverfahren von wesentlich erhöhter Empfindlichkeit, da nicht nicht-spezifische Reaktionen unter Teilchen und zwischen Teilchen und anderen aufgeladenen Materialien in deren Nähe stark vermindert werden. Erreicht werden diese Ergebnisse durch Immobilisierung von einem oder mehreren Proteinen mit einem relativ niedrigen pI auf den Teilchen gemeinsam mit immobilisierten Rezeptor-Molekülen. Diese Proteine sind reaktiv weder mit den Rezeptor-Molekülen noch der immunoreaktiven Species, die durch das Bestimmungsverfahren ermittelt werden soll.
Wichtig ist, daß das Gew.-Verhältnis von Rezeptor-Molekülen und Protein-Molekülen mit niedrigem pI bei 100:1 bis 1:10 liegt, um die Bestimmungsempfindlichkeit zu maximieren und um nicht-spezifische Reaktionen zu vermindern. Wird zuviel Protein immobilisiert, so liegt zu wenig Rezeptor auf der Teilchenoberfläche vor, um geringe Mengen der Species bestimmen zu können. Wird zu wenig Protein immobilisiert, so sind die nicht-spezifischen Reaktionen in nicht akzeptierbarer Weise zu hoch. Zu erwähnen ist, daß in der U.S.- Patentschrift 4 459 361, die oben erwähnt wurde, ein Agglunations-Bestimmungsverfahren für Penicillin G in Beispiel 1 beschrieben wird, bei dem Penicillin G, konjugiert mit Rinderserumalbumin von Latexteilchen adsorbiert ist. Das anfallende Agglutinations-Reagens umfaßt Konjugat (5,5: 1-Konjugat an Rinderserumalbumin) zusätzlich zu einer Lösung von unkonjugiertem Rinderserumalbumin (9,6 mg/ml). Rinderserumalbumin lag im Immobilisierungsmedium im Überschuß vor, um eine unerwünschte Protein-Adsorption zu blockieren und um als Stabilisator im Medium zu wirken, um die Kügelchen oder Teilchen vor einer frühzeitigen Agglutinierung zu bewahren. Das Vorhandensein einer großen Menge an Rinderserumalbumin stellt eine beträchtliche Verschleuderung von Material dar und verursacht zusätzliche Störungen bei der Bestimmung der Species, die in einer Testprobe in niedriger Konzentration vorliegt.
Weitere Verbesserungen bei der Verminderung nicht-spezifischer Reaktionen zwischen Teilchen im Rahmen dieser Erfindung lassen sich erreichen durch Zugabe einer negativen Ladung zu den Rezeptor-Molekülen mit einem Modifizierungsmittel. Beispielsweise kann dies geschehen durch entweder Acylierung, Alkylierung oder Sulfonylierung der Rezeptor-Moleküle, wie es im folgenden im Detail beschrieben werden wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung eignet sich das Reagens für ein Agglutinations-Bestimmungsverfahren, bei dem durch Umsetzung der immobilisierten Rezeptor-Moleküle mit der immunoreaktiven Species ein bestimmbares Agglutinat erzeugt wird.
Bei der Figur handelt es sich um eine graphische Darstellung von Log (relative Hintergrund-Fluoreszenz) in Abhängigkeit von der Menge an Bernsteinsäureanhydrid, das verwendet wurde zum Acylieren von Antikörpern, die an polymere Teilchen gebunden waren, wie es in dem später folgenden Beispiel 2 beschrieben wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ein diagnostisches Testverfahren für eine immunoreaktive Species bereit, das in einer sehr kurzen Zeitspanne durchgeführt werden kann, ohne Verwendung einer komplizierten Ausrüstung. Dies ermöglicht es, das Testverfahren in einer Arztpraxis durchzuführen oder zu Hause und ermöglicht es dem Arzt oder dem Verbraucher, das Vorhandensein eines Analyten zu bestimmen, und zwar aufgrund der Ergebnisse des Testes am gleichen Tag. Bei dem Testverfahren wird das Vorhandensein der Species in einer biologischen Probe festgestellt, beispielsweise einem Rachen-Abstrich, einer Urinprobe oder einer Probe einer anderen wäßrigen Flüssigkeit. Derartige biologische Proben lassen sich testen mit oder ohne Vorbehandlung (z.B. Filtration) zur Entfernung von unerwünschtem nekrotischem Gewebe oder störenden Komponenten.
Das Verfahren dieser Erfindung läßt sich verwenden zur Bestimmung und Quantifizierung einer jeden einer großen Anzahl von immunoreaktiven Species. Bei diesen Species handelt es sich im allgemeinen um Protein, Hormone, Carbohydrate oder Lipopolysaccharide, mit einem oder mehreren Zentren zur Komplexbildung mit einem entsprechenden Rezeptor, z.B. entsprechenden Antikörpern für Antigene. Alternativ kann es sich bei den zu bestimmenden Species um Antikörper handeln mit einem oder mehreren Komplex bildenden Zentren, die mit dem entsprechenden Antigen oder einem Anti-Antikörper zu reagieren vermögen. Zu den immunoreaktiven Species, die gemäß der Erfindung bestimmt werden können, gehören, ohne die Species auf die folgenden genannten zu beschränken, Streptococcus-A-Antigen, Antigene von chlamydialen und gonoccocalen Organismen, retrovirale Antigene oder Antikörper (HIV oder HTLV), menschliches Choriongonadotropin (hCG), leutinisierendes Hormon (LH), Herpes-Viren, Arzneimittel, Antibiotika und andere hormonale, bakterielle oder virale Antigene und Antikörper. In manchen Fällen muß die Species aus dem Organismus oder Virus, der in der biologischen Probe aufgefunden wird, extrahiert werden. In anderen Fällen liegt die Species bereits in reaktiver Form vor, so daß keine Extraktionsverfahren vor dem Bestimmungsverfahren erforderlich sind. Extraktionsverfahren für eine bestimmte Species sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise anwendbare Extraktionsverfahren für Streptococcus-A-Antigen werden weiter unten beschrieben.
Vorzugsweise wird die Erfindung dazu verwendet, um eine multivalente immunoreaktive Species zu bestimmen, wie beispielsweise Streptococcus-A-Antigen, wie es in der folgenden Ausführungsform beschrieben wird und in dem unten folgenden Beispiel 1. Eine biologische Probe, von der vermutet wird, daß sie das Antigen enthält, wird einem Patienten in geeigneter Weise entnommen. Im allgemeinen jedoch wird eine Applikator-Vorrichtung dazu verwendet, um eine biologische Probe aufzunehmen durch Kontaktieren des Bereiches von vermuteter Infektion mit dem Applikator-Bausch, wodurch Zellen von Streptocöccus-A-Organismen, sofern vorhanden, aufgenommen werden. Daraufhin werden die Antigene aus dem Organismus in geeigneter Weise extrahiert. Zu einem bevorzugten Extraktionsverfahren gehört das Eintauchen des Bausches in eine geeignete Extraktions-Zusammensetzung mit einem oder mehreren Reagenzien, die einzeln oder in Kombination miteinander bewirken, daß das Streptococcus-A-Antigen aus dem Organismus, den Probezellen oder anderem nekrotischem Gewebe in der Probe freigesetzt wird.
Zu geeigneten Extraktions-Zusammensetzungen, die bekannt sind, gehört eine Mischung aus einem Nitritsalz und Eisessig, wie es beispielsweise in der europäischen Publikation 150 567 beschrieben wird, und weiterhin gehören dazu Enzyme, die sich von Bacterium Streptomyces albus ableiten, wie es in der obenerwähnten U.S.-Patentschrift 4 618 576 beschrieben wird. Ein bevorzugtes Extraktionsmittel ist eine Mischung aus einem Nitritsalz (z.B. Natriumnitrit oder Kaliumnitrit) mit einer organischen Säure (z.B. Bernstein- oder Zitronensäure).
Die Extraktion kann mit einer kurzzeitigen Inkubation verbunden werden, sofern dies erwünscht ist. Auch kann eine Zentrifugierung angewandt werden, um Fremdmaterial zu entfernen. Nach der Extraktion kann das Medium mit dem extrahierten Antigen, falls erforderlich, neutralisiert werden, um den pH-Wert des Mediums auf den pH-Wert zu bringen, der für die Antigen-Antikörper-Reaktion geeignet ist. Verwiesen wird beispielsweise auf die Arbeit von Slifkin und Mitarbeitern, veröffentlicht in J. Clin. Microbiol. 15(1), Seiten 187-189, 1982.
Das Vorhandensein einer immunoreaktiven Species, beispielsweise Streptococcus-A-Antigen, wird durch das immunoreaktive Reagens dieser Erfindung bestimmt, das umfaßt in Wasser unlösliche Partikel mit assoziierten Tracer-Molekülen sowie Rezeptor-Molekülen (z.B. Antikörpern für Streptococcus-A- Antigen), die reaktiv sind mit der Species, die in geeigneter Weise an die Oberfläche der Teilchen gebunden ist. Eine Reaktion (oder eine immunochemische Bindung) zwischen der immunoreaktiven Species und dem Rezeptor führt dann zu einem reaktiven Produkt, das in geeigneter Weise ermittelt werden kann. Beispielsweise kann das Reaktionsprodukt weiter umgesetzt werden mit einem anderen Rezeptor, der zu einer Komplexbildung mit der immunoreaktiven Species befähigt ist. Dieser zweite Rezeptor kann der gleiche sein oder sich unterscheiden von dem, der auf den Teilchen immobilisiert ist. Er kann markiert oder nicht markiert sein. Vorzugsweise bildet der Komplex große Agglutinate, die ermittelt werden können. Alternativ lassen sich die nichtumgesetzten Materialien in geeigneter Weise bestimmen.
Geeignete Teilchen oder Partikel, die als Teil des immunoreaktiven Reagens geeignet sind, können natürliche oder synthetische Teilchen bzw. Partikel sein, die wasserunlöslich sind und dazu befähigt sind, eine geeignete Anzahl von Tracer-Moleküle in geeigneter Weise zu assoziieren. Zu Beispielen von geeigneten Partikeln oder Teilchen gehören Ferritinkristalle, Agaroseteilchen, Glaskügelchen, Polymerteilchen, wie beispielsweise Latexteilchen und andere bekannte Teilchen. Repräsentative geeignete Teilchen bzw. Partikel werden in den folgenden U.S.-Patentschriften beschrieben 3 700 609, 3 853 987, 4 108 972, 4 401 765, 4 419 453, 4 459 361, 4 478 946 und 4 591 571. Die Teilchen oder Partikel, die für die Erfindung geeignet sind, sind im allgemeinen kleine Teilchen bzw. Partikel, d.h. sie haben einen Durchmesser von weniger als 2 Mikrometer. Vorzugsweise haben sie einen mittleren Durchmesser von 0,1 bis 1 Mikrometer.
Besonders geeignete Teilchen sind polymere Latexteilchen, wobei die bevorzugteren solche sind, die bekannt sind als polymere Kern-Hüllen-Latexteilchen. Eine Vielzahl von Monomeren kann dazu verwendet werden, um derartige Teilchen herzustellen, solange nur die Teilchen wasserunlöslich sind. Ein auf dem Gebiet der Polymerchemie tätiger Fachmann kann geeignete Latexteilchen konzipieren und herstellen. Bevorzugte polymere Latexteilchen vom Kern-Hüllentyp für die Durchführung der Erfindung werden im folgenden in den Beispielen 3 und 5 beschrieben. Diese Teilchen haben einen Kern aus einem Homo- oder Copolymeren des Styrols und eine Hülle, aufgebaut aus Homo- oder Copolymeren von Chloromethylstyrol oder (2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol.
Die Teilchen oder Partikel, die für die Durchführung dieser Erfindung geeignet sind, weisen genügend assoziierte Tracer- Moleküle auf, um eine quantitative Bestimmung der Species aus der Menge an Tracer zu ermöglichen, die entweder im Reaktionsprodukt vorhanden ist oder in den nichtumgesetzten verbleibenden Materialien. Die Tracer-Moleküle sind vorzugsweise innerhalb der Teilchen verteilt. Jedes Tracer-Material, das eine Bestimmung ermöglicht, läßt sich verwenden. Werden Ferritinkristalle als die Teilchen verwendet, so sind die Tracer-Moleküle Moleküle, bei denen Eisen in den Kristallen vorliegt. Andere natürliche oder synthetische Partikel oder Teilchen können als Tracer oder Markierungsmittel enthalten: Radioisotope, colorimetrische Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen und andere bekannte Materialien, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise ist der Tracer ein Radioisotop, ein colorimetrischer Farbstoff oder eine fluoreszierende Verbindung (z.B. ein Farbstoff oder ein Seltenes Erd-Chelat). Der Fachmann weiß, wie er ein geeignetes Markierungsmittel mit den speziell verwendeten Teilchen kombinieren kann.
Gemäß einer Ausführungsform besteht der Tracer aus einem fluoreszierenden Chelat einer Seltenen Erde, z.B. einem Europiumchelat, wie es beispielsweise in der U.S.-Patentschrift 4 259 313 beschrieben wird. Im Falle einer anderen und bevorzugten Ausführungsform besteht der Tracer aus einer colorimetrischen Verbindung, die leicht in dem Agglutinat bestimmt werden kann. Geeignete Farbstoffe sind dem Fachmann bekannt. Einige Farbstoffe können in die Teilchen oder Partikel eingearbeitet werden, wenn diese hergestellt werden. In alternativer Weise können die Farbstoffe auf die vorgebildeten Teilchen derart aufgebracht werden, daß sie nicht ausgelaugt werden.
Der Tracer oder das Markierungsmittel kann innerhalb der Teilchen in jeder geeigneten Weise verteilt werden. Beispielsweise kann der Tracer gleichmäßig in den Teilchen verteilt werden, wie es beispielsweise in der U.S.-Patentschrift 3 853 987 (wie oben angegeben) beschrieben wird. Vorzugsweise werden die Tracer-Moleküle in einem begrenzten Bereich der Teilchen untergebracht, z.B. nahe der Oberfläche oder überwiegend im Inneren der Teilchen. Im Falle der bevorzugt verwendeten Teilchen vom Kern-Hüllentyp kann der Tracer entweder in dem Kern oder der Hülle untergebracht werden, wird jedoch vorzugsweise im wesentlichen im Kern der Teilchen angeordnet. Mit anderen Worten: eine sehr geringe Menge (beispielsweise weniger als 5 Gew.-%) des Farbstoffes liegt in dem Hüllenteil der Teilchen vor.
Rezeptor-Moleküle (z.B. Antikörper), die mit der immunoreaktiven Species zu reagieren vermögen, die ermittelt werden soll, wie z.B. Streptococcus-A-Antigen, sind an die äußeren Oberflächen der Teilchen in geeigneter Weise gebunden, beispielsweise durch Adsorption oder covalente Bindung. Die Bindung oder die Haftung kann mittels bekannter Techniken erreicht werden, wie sie beispielsweise in den oben zitierten Dokumenten beschrieben werden. Eine covalente Bindung ist bevorzugt, da die Rezeptor-Moleküle von den Teilchen nach der Anbringung weniger leicht zu entfernen sind.
Erfolgt eine covalente Bindung, so können die Rezeptor-Moleküle direkt an die Teilchen gebunden werden oder über geeignete verbindende Gruppen. Bestehen die Rezeptor-Moleküle aus Antikörpern, so können entweder monoclonale oder polyclonale Antikörper verwendet werden, wobei jedoch monoclonale Antikörper (ganze Antikörper oder Fragmente hiervon) im allgemeinen bevorzugt verwendet werden. Antikörper lassen sich im Handel erhalten oder nach bekannten Methoden herstellen.
Die Rezeptor-Moleküle sind vorzugsweise chemisch modifiziert mit einem geeigneten Modifizierungsmittel, das dazu befähigt ist, die Moleküle mit einer negativen Ladung zu versehen. Zu Beispielen von solchen Modifizierungsmitteln gehören Acylierungsmittel, Alkylierungsmittel, Sulfonylierungsmittel, oxidierende und reduzierende Mittel, elektrophile Mittel, wie sie beispielsweise beschrieben werden in Enzyme-Immunoessay, Maggio (Herausgeber), CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1980, Seiten 72-77. Die Rezeptor-Moleküle werden nach Bindung an die wasserunlöslichen Teile modifiziert.
Repräsentative geeignete Acylierungsmittel werden in der U.S.-Patenschrift 5 591 571 beschrieben, wobei Anhydride, wie beispielsweise Bernsteinsäure-Anhydrid am meisten bevorzugt ist. Alkylierungsmittel, wie beispielsweise Chloressigsäure, Chlorpropionsäure, Fluoronitrobenzol, Bromessigsäure, Brommalonsäure und Brompropionsäure sind ebenfalls geeignet, wobei Bromessigsäure besonders bevorzugt ist. Zu geeigneten Sulfonylierungsmitteln gehören m-(Chlorosulfonyl)benzoesäure sowie p-(Chlorosulfonyl)benzoesäure.
Ebenfalls an die äußeren Oberflächen der Teilchen sind Moleküle von einem oder mehreren Proteinen gebunden, von denen ein jedes einen pI von weniger als 6 hat. Keines dieser Proteine ist reaktiv mit entweder der Species, die bestimmt werden soll oder den Rezeptor-Molekülen, die ebenfalls an die Teilchen gebunden sind. Die Bezeichnung pI (d.h. der isoelektrische Punkt), ist bekannt als der pH-Wert, bei dem die Anzahl von positiven und negativen Ladungen gleich ist. Der pI-Wert eines Proteins kann bestimmt werden unter Anwendung üblicher Vorrichtungen und Verfahren. Beispielsweise läßt sich dieser Wert bestimmen durch isoelektrische Fokussierung unter Verwendung einer geeigneten isoelektrischen Fokussierplatte, z.B. einer LKB Ampholine PAG-Platte (erhältlich von der Firma LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden), bei einem pH-Bereich von 3,5-9,5 und unter Verwendung von Standard-Kalibratoren.
Teilchen, die teilweise mit den Protein-Molekülen mit dem niedrigen pI-Wert bedeckt sind, weisen eine beträchtliche geringere Anziehungskraft zueinander auf. Zu geeigneten Proteinen, die in den Schutzbereich dieser Erfindung fallen, gehören Casein, succinyliertes Collagen, succinyliertes Casein und succinyliertes Rinderserumalbumin. Zu den bevorzugten Proteinen gehören Casein sowie succinyliertes Casein. Die Proteine sind an die Teilchen in jeder geeigneten Weise gebunden, einschließlich Absorption, covalente Bindung und andere Techniken, die dem Fachmann bekannt sind.
- Das Gew.-Verhältnis von den Rezeptor-Molekülen zu den Protein-Molekülen des niedrigen pI, die an die Teilchen gebunden sind, liegt bei 100:1 bis 1:10 und vorzugsweise liegt das Verhältnis bei 20:1 bis 1:1.
Das immunoreaktive Reagens dieser Erfindung wird hergestellt durch Kontaktieren geeigneter wasserunlöslicher Teilchen mit den Rezeptor-Molekülen und dem Protein von niedrigem pI zum praktisch gleichen Zeitpunkt unter Bedingungen, bei denen eine Bindung beider Materialien an die Teilchen erfolgt. Dies kann das Vorhandensein von Reagenzien bedeuten, die die covalente oder adsorptive Bindung erleichtern, die Auswahl eines geeigneten pH-Wertes einer Temperatur, von Misch- und Bewegungs- und anderen Bedingungen. Die Menge an Protein in der Reaktionssuspension läßt sich steuern, derart, daß praktisch sämtliches Protein an die Teilchen gebunden wird und nur eine sehr geringe Menge in der Suspension nach der Bindung hinterbleibt. Diese Menge kann variiert werden, je nach dem Oberflächenbereich der Teilchen, der beschichtet werden soll (d.h. den Prozenten Feststoffen der Teilchensuspension und der Teilchengrößenverteilung). Die Details eines Verfahrens zur Herstellung des Reagens sind in dein unten folgenden Beispiel 1 angegeben. Im allgemeinen liegt das Protein von niedrigem pI in der Reaktions-Suspension in einer Menge von 0,1 mg/ml oder weniger vor.
Wenn ein Reaktionsprodukt erzeugt worden ist, beispielsweise ein Agglutinat, so wird das Reaktionsprodukt, beispielsweise agglutinierte Materialien, von nicht umgesetzten Materialien abgetrennt, beispielsweise nicht-agglutinierten Materialien, und zwar in jeder geeigneten bekannten Weise. Nach der Trennung wird die Menge an Tracer oder Markierungsmittel bestimmt entweder in den umgesetzten oder nicht umgesetzten Materialien unter Einsatz bekannter Verfahren. Weitere Details bezüglich dieser Stufen werden weiter unten angegeben.
Gleichzeitig oder nach dem Kontakt der immunoreaktiven Species mit Rezeptor-Molekülen unter Bildung des Reaktionsproduktes kann das Reaktionsprodukt auch mit einer mikroporösen, wasserunlöslichen Membran in Kontakt gebracht werden, um eine Trennung im Falle einer Agglutionationsreaktion zu bewirken. Im Falle einer Ausführungsform kann das Agglutinat in einem besonderen Behälter erzeugt werden und dann in Kontakt mit der Membran gebracht werden. Alternativ und vorzugsweise wird das Agglutinat in Gegenwart der Membran erzeugt. Diese Membran (die weiter unten im Detail beschrieben wird) kann in einfacher Weise aus einem Filtermittel bestehen, das in der Hand gehalten wird, durch welches nichtagglutinierte Materialien filtriert werden. Vorzugsweise jedoch ist sie in einer Testvorrichtung angeordnet, in der das Bestimmungsverfahren durchgeführt wird. Ein solches Testverfahren wird ebenfalls weiter unten beschrieben.
Jede mikroporöse wasserunlösliche Membran kann verwendet werden, solange sie inert gegenüber den bei dem Bestimmungsverfahren verwendeten Materialien ist und solange sie die gewünschte Porosität aufweist, die es ermöglicht, Flüssigkeiten und nicht umgesetzten Materialien durch die Membran zu gelangen und die das Reaktionsprodukt zurückhält. Mit anderen Worten: die Membranporen müssen groß genug sein, um einen Durchtritt der nicht-agglutinierten Teilchen zu ermöglichen, müssen jedoch nicht groß genug sein, um agglutinierten Teilchen den Durchtritt zu ermöglichen. Ganz speziell soll die mittlere Porengröße der Membran mindestens fünfmal dem mittleren Durchmesser der wasserunlöslichen Teilchen, wie sie oben beschrieben wurden, entsprechen. Vorzugsweise liegt die durchschnittliche Porengröße bei dem 6- bis 15- fachen der mittleren oder durchschnittlichen Teilchendurchmesser. Zu geeigneten Membranen gehören polymere Materialien, die im Handel von verschiedenen Anbietern angeboten werden. Eine geeignete Membran ist eine mikroporöse Nylon- 66-Membran, die von der Firma Pall Corp. als BIODYNE A oder ULTIPOR N-66 hergestellt und vertrieben wird.
Im Falle eines Agglutinations-Bestimmungsverfahren kann eine geeignete Inkubationsperiode angewandt werden, um, falls erwünscht, die Agglutination zu optimieren, und zwar vor oder während des Kontaktes mit der Membran. Nach dieser Zeitspanne werden nicht-agglutinierte restliche Materialien durch die Membran ausgewaschen, wohingegen das Agglutinat zurückbleibt. Jede geeignete Waschflüssigkeit kann in dieser Verfahrensstufe verwendet werden, vorzugsweise jedoch weist die Waschlösung einen pH-Wert von 5-10 auf und enthält eine ionische Verbindung, z.B. ein Salz.
Nachdem die nicht-agglutinierten restlichen Materialien durch die Membran ausgewaschen wurden, läßt sich die Menge an immunoreaktiver Species in entweder dem Agglutinat oder den restlichen Materialien bestimmen, und zwar mit dem unbewaffneten Auge, falls der Tracer oder das Markierungsmittel ein leicht sichtbarer colorimetrischer Farbstoff ist. Andererseits läßt sich eine standardisierte colorimetrische Bestimmungsvorrichtung einsetzen. Ardere Typen von Tracern, beispielsweise Radioisotope, fluoreszierende Farbstoffe oder phosphoreszierende Farbstoffe erfordern eine geeignete Bestimmungsvorrichtung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung von Streptococcus-A die folgenden Stufen:
(i) Bereitstellung eines Applikators, einschließlich eines Applikatorstiftes und eines fasrigen Bausches sowie Aufnahme einer biologischen Probe mit dem Bausch,
(ii) Bereitstellung einer Extraktions-Zusammensetzung mit Natriumnitrit sowie Zitronensäure zur Bewirkung der Freisetzung von Streptococcus-A-Antigen aus dem Bausch, Eintauchen des Bausches in die Extraktions-Zusammensetzung und Inkubieren des Bausches in der Extraktions-Zusammensetzung eine Zeitspanne lang, die ausreicht, um das Antigen aus dem Bausch freizusetzen,
(iii) Neutralisierung der Lösung des extrahierten Antigens,
(iv) Kontaktieren der neutralisierten Lösung des extrahierten Antigens mit dem Agglutinations-Reagens dieser Erfindung zur Erzeugung eines Agglutinates des Reaktionsproduktes des Antigens und der Antikörper, wobei das Kontaktieren in Gegenwart einer mikroporösen wasserunlöslichen Membran erfolgt, die in einer Wegwerf-Vorrichtung angeordnet ist, wobei die Membran eine mittlere Porengröße aufweist, die mindestens fünfmal dem mittleren Durchmesser der wasserunlöslichen oben beschriebenen Teilchen entspricht,
(v) Auswaschen der nicht-agglutinierten restlichen Materialien durch die Membran unter Zurückbehalten des Agglutinates und
(vi) Bestimmung der Menge des Tracers oder Markierungsmittels in dem Agglutinat, das auf der Membran zurückgeblieben ist.
Obgleich die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt ist, läßt sich das Bestimmungsverfahren für eine multivalente immunoreaktive Species unter Verwendung einer geeigneten Testvorrichtung durchführen, die die mikroporöse Membran umfaßt, die hier beschrieben wird. Eine solche Vorrichtung kann eine oder mehrere Behälter oder Kanäle aufweisen, in welche extrahiertes Antigen zum Zwecke der Umsetzung mit dem Agglutinations-Indikator-Reagens abgeschieden wird. Dieses Reagens kann der Vorrichtung während des Bestimmungsverfahrens zugeführt werden oder zum Zeitpunkt der Herstellung eingearbeitet werden. Nachdem das Agglutinat erzeugt worden ist, können die nicht-agglutinierten restlichen Materialien durch die Membran mit der Waschlösung in ein besonderes Abteil unterhalb der Membran ausgewaschen werden.

Beispiel 1: Agglutinations-Reagens

Dies Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Agglutinations-Reagens gemäß dieser Erfindung und die Bedeutung des Proteins mit niedrigem pI zur Verminderung nicht-spezifischer Reaktionen zwischen Polymerteilchen.
Zur Herstellung des Agglutinations-Reagens wurden Latexteilchen aus Poly(styrol-co-m,p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat (76,2:22,7:1,1 Gew.-Verhältnis) mit einem mittleren Durchmesser von 0,45 Mikrometer in Form einer Suspenion mit 8% Feststoffen in Wasser verwendet. In die Teilchen wurde eine fluoreszierendes Europium(III)(thenoyltrifluoroaceton)&sub3;chelat auf saugen gelassen, gemeinsam mit Trioctylphosphinoxid im Verhältnis von 1 Teil Chelat zu 2 Teilen Oxid nach dem Verfahren, das in der belgischen Patentschrift 843 647 beschrieben wird. Lösungen von Casein und Rinderserumalbumin wurden in deionisiertem, destilliertem Wasser in Konzentrationen von 10 mg/ml hergestellt. Ein Boratpuffer (pH-Wert 8,5, 50 millimolar) wurde bei dem Immobilisierungsverfahren verwendet.
Verschiedene Verhältnisse von Antikörpern zu Protein (Casein oder Rinderserumalbumin) bei einem Gesamtgewicht von 0,1 mg wurden zu 0,6 ml des Boratpuffers zugegeben. Nach ausgiebigem Vermischen wurde die Teilchensuspension (25 ul, 2 mg Feststoffe) zu der abgepufferten Lösung zugegeben und die erhaltene Suspension wurde 24 h lang bei 37ºC rotiert, 5 min lang bei 7000 u/min zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit verworfen wurde. Die Feststoffe wurden in einem 0,1 molaren Glycinpuffer (pH 8,5) (0,3% Feststoffe) resuspendiert.
Ein Isolat von Streptococcus pyrogenes (Gruppe A) wurde aus einem lokalen Krankenhaus beschafft. Das Antigen wurde aus dem Organismus unter Verwendung der Reagenzien und unter Anwendung der Verfahren des DAI (Warenzeichen) Strep A- Testes extrahiert. Mikroporöse Nylon-Membranen (mit einer mittleren Porengröße von 5 um) wurden vorbehandelt durch Inkubieren derselben in 0,5%iger nicht-fetter, trockener Instant-Milch (enthaltend Casein), Tris-Puffer (50 millimolar, pH-Wert = 8), Natriumchlorid (100 millimolar) oder 7M Carboxymethylcellulose (2%). Eine Probe (10 ul) einer jeden Suspension der Partikel wurde zu einer Probe (10 ul) von extrahiertem Antigen zugegeben, das hergestellt wurde aus einer Lösung, enthaltend etwa 10&sup7; einer Kolonie bildenden Einheiten des Organismus. Die erhaltenen kombinierten Proben wurden 2 min lang inkubiert und 10 ul einer jeden Probe wurden auf ein vorbehandeltes mikroporöses Filter gebracht. Das Agglutinat auf dem Filter wurde im Vakuum mit einer Lösung von Tris-Puffer (100 ul, pH-Wert = 8) und Natriumchlorid (100 millimolar) gewaschen. Signal-Hintergrund-Oberflächen-Fluroeszenz-Werte, die auf den Filtern verblieben, wurden gemessen unter Verwendung eines standardisierten Spektrofluorometers, ausgerüstet mit einem Oberflächen- Fluoreszenz-Meßgerät (Anregung bei 342 nm, Emission bei 612 nm).
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, daß die Bindung von Rinderserumalbumin fehlschlug bei dem Bemühen, die Hintergrunddichten zu vermindern. Die Bindung von Casein an die Teilchen reduzierte die Hintergrunddichten jedoch wesentlich. Ein Verhältnis von Antikörper zu Casein von 4:1 erwies sich als besonders vorteilhaft, da nicht nur die Hintergrunddichten wesentlich vermindert wurden, sondern die hohen Signale aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion beibehalten wurden.
Höhere Konzentrationen an Casein, d.h. von bis zu 1:10 Antikörper zu Casein verminderten ebenfalls die Hintergrunddichte, jedoch wurde eine gewisse Signalverminderung festgestellt. Geringere Konzentrationen an Casein, d.h. von runter bis 100:1 Antikörper zu Casein verminderten ebenfalls die Hintergrunddichte, jedoch in einem geringeren Ausmaß, unter voller Signal-Beibehaltung.

Beispiel 2: Agglutinations-Reagens, das weiter acyliert wurde

Dies Beispiel entspricht Beispiel 1, veranschaulicht jedoch die weitere Verbesserung, die dann erhalten wird, wenn die Antikörper-Moleküle vor der Verwendung im Rahmen eines Bestimmungsverfahrens einer Acylierung unterworfen werden.
Die verwendeten Materialien waren die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben. Hergestellt wurde ferner eine Lösung von Bernsteinsäureanhydrid in Dimethylsulfoxid (10 mg/ml).
Zu dem Borat-Puffer (0,9 ml) wurde eine Probe von Streptococcus-A-Antikörper (0,12 mg) und Casein (0,3 mg) zugegeben. Nach extensivem Vermischen wurde eine Probe (41 ul, 3 mg Feststoffe) der Suspension von Polymerteilchen zur Pufferlösung zugegeben und die erhaltene Mischung wurde insgesamt 24 h lang bei 37ºC rotiert. Die Mischung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und eine bestimmte Menge (bis zu 300 Gew.-% des Antikörpers) von Bernsteinsäureanhydrid wurden zugegeben, worauf sich eine insgesamt 4 h währende Rotation bei Raumtemperatur anschloß. Die Suspension wurde dann bei 7000 U/min 5 min lang zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit verworfen wurde. Schließlich wurden die Feststoffe in einem 0,1 molaren Glycin-Puffer (pH-Wert = 8,5) in einer Konzentration von 0,3% Feststoffen re-suspendiert.
Das in der beschriebenen Weise hergestellte Agglutinations Reagens wurde wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Die Figur zeigt den dramatischen Abfall der Hintergrunddichte durch die Succinylierung der Antikörper-Moleküle auf den Teilchen. Die Abnahmen im Falle des absoluten Signals waren vernachlässigbar und es wurde keinerlei Verlust an der Antigen-Bestimmungs-Sensitivität festgestellt. Weiterhin wurde die Reproduzierbarkeit der Reagens-Herstellung verbessert.
Es ist offensichtlich, daß die Immobilisierung eines Proteins mit niedrigem pI-Wert, wie in Beispiel 1 beschrieben, unerwünschte, nicht-spezifische Reaktionen beträchtlich vermindert. Beispiel 2 veranschaulicht demgegenüber, daß eine weitere Verbesserung möglich ist, wenn die immobilisierten Rezeptor-Moleküle acyliert werden.

Beispiel 3: Bestimmung von Streptococcus-A

Dies Beispiel veranschaulicht die Verwendung des Agglutinations-Reagens dieser Erfindung zur Bestimmung von Streptococcus-A-Antigen.
Es wurden polymere Latexteilchen vom Kern-Hüllentyp mit einem roten Farbstoff (Oil Red EGN) im Kern hergestellt durch Aufsaugenlassen des Farbstoffes von den Teilchen nach der Methode, die in der belgischen Patentschrift 843 647 beschrieben wird. Die Teilchen wurden hergestellt unter Anwendung der Kern/Hüllen-Polymerisationstechnik. Der Kern der Teilchen bestand aus Poly(styrol-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (Gew.-Verhältnis 70:30), wohingegen die Hülle aus Poly(m,p-chloromethylstyrol) bestand. Der mittlere Durchmesser der Teilchen lag bei etwa 0,45 Mikrometer. Monoklonale Antikörper des Streptococcus-A-Antigens wurden gemeinsam mit Casein an diesen Teilchen wie folgt immobilisiert: zu 0,6 ml eines 50 mmolaren Borat-Puffers (pH-Wert = 8,5) wurden zugegeben 0,1 mg des Gesamt-Proteins, bestehend aus einer 10:1-Mischung von Anti-Strep-A-Antikörper (2,9 mg/ml Lösung in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, bekannt als PBS), und Casein (10 mg/ml Wasser). Nach dem Vermischen wurden 41,5 ul einer 5%igen Suspension der polymeren Latexteilchen zugegeben (unter Erzeugung eines Feststoffgehaltes von 0,3%) und die erhaltene Lösung wurde 24 h lang bei 37ºC rotiert (end-over-end), um eine covalente Bindung des Antikörpers und des Caseins an die Teilchen unter Erzeugung eines Agglutinations-Reagens zu bewirken.
Eine Lösung von Bersteinsäureanhydrid (10 mg/ml Dimethylsulfoxid) wurde zu einer Suspension des Agglutinations- Reagens wie oben beschrieben in einem Gew.-Verhältnis von 1 Teil-Anhydrid zu 1 Teil Gesamt-Protein zugegeben.
Die erhaltene Suspension wurde 4 h lang bei 25ºC miteinander vermischt, 5 min lang bei 7000 U/min zentrifugiert, worauf das erhaltene Pellet in einem 0,1 molaren Glycin-Puffer (pH- Wert = 8,5) re-suspendiert wurde, unter Erzeugung einer Konzentration von 0,3% Feststoffen.
Streptococcus-A-Antigen wurde aus einem Isolat extrahiert, das aus einem lokalen Krankenhaus beschafft wurde, und zwar 1 min lang bei 25ºC unter Verwendung einer Lösung von gleichen Volumina Natriumnitrit (8 molar) und Zitronensäure (0,2 molar). Die Lösung wurde dann mit einem gleichen Volumen an einem 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (2 molar, pH-Wert = 7,5) mit einem Gehalt an Ethylendiamintetraessigsäure (75 mmolar) neutralisiert.
Eine mikroporöse Nylon-66-Membran (mittlere Porengröße 5 um) wurde in einen Testbehälter einer wegwerfbaren Testvorrichtung gegeben und vorbehandelt durch Waschen mit 100 ul einer 2%igen succinylierten Caseinlösung.
- Eine Mischung von Natriumchlorid (80 ul, 1 molar) der oben beschriebenen Agglutinations-Reagens-Suspension (40 ul) und extrahiertem Antigen (80 ul) mit etwa 4,2 x 10&sup5; Kolonie bildenden Einheiten wurde in das Testgerät der Testvorrichtung gegeben, die die Membran enthielt, und hierin 2 min lang bei 25ºC inkubiert. Die Flüssigkeit wurde dann in ein Abteil unterhalb der Membran abtropfen gelassen und das Agglutinat auf der Membran wurde mit 150 ul einer Waschflüssigkeit (0,25 molar bezüglich Natriumchlorid) mit einer Ionenstärke von 0,25 gewaschen.
Nach der Waschstufe wurde die Menge an Farbstoff in dem Agglutinat auf der Membran bei 540 um unter Verwendung einer Reflexions-Meßvorrichtung gemessen. Die Williams-Clapper- Gleichung (J. Optical Soc.. Am. 43, Seite 595, 1953) wurde dazu angewandt, um die Transmissionsdichtewerte zu berechnen. Das Agglutinat auf der Membran war leicht feststellbar und hatte einen beträchtlich größeren Dichtewert als die Dichte eines Hintergrundvergleichs (der Unterschied betrug 0,148). Diese Daten zeigen an, daß das Agglutinations-Reagens der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von Streptococcus-A-Antigen in einer biologischen Probe geeignet ist.

Beispiel 4: Bestimmung von Gonorrhoe

Dies Beispiel veranschaulicht die Verwendung des Agglutinations-Reagens der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von Gonorrhoe. Das Agglutinations-Reagens, das im Falle dieses Beispieles verwendet wurde, bestand aus Latexteilchen aus Poly(styrol-co-m,p-chloromethylstyrol-co-2-hydroxyethylacrylat) (Gew.-Verhältnis 76:23:1) mit 5 Gew.-% aufgesaugtem Europium(III)(thenoyltrifluoroaceton)&sub3; gemeinsam mit Trioctylphosphinoxid im Verhältnis von 1 Teil Chelat zu 2 Teilen Oxid nach dem Verfahren, das in der belgischen Patentschrift 843 647 beschrieben wird. Die Teilchen hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 0,45 Mikrometer.
Monoclonale Antikörper des PI-Antigens der Serogruppe B von Neisseria gonorrhea (auch bekannt als PIB-Antigen) wurden auf den beschriebenen Teilchen wie folgt immobilisiert: zu 1,3 ml eines 50 mmolaren Borat-Puffers (pH-Wert = 8,5) wurden 0,15 ml einer 1,08 mg/ml Antikörperlösung in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (PBS) zugegeben. Weiterhin wurden 0,32 ml einer 1 mg/ml wäßrigen Lösung von Casein zugegeben, um ebenfalls Casein auf den Teilchen zu immobilisieren. Nach dem Vermischen wurden 41,5 ul einer 5 %igen Suspension der oben beschriebenen Latexteilchen zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde bei 37ºC 24 h lang gemischt. Dann wurde Bernstäureanhydrid (0,174 ml einer 10 mg/ml Dimethylsulfoxidlösung) zugegeben, und die erhaltene Lösung wurde 4 h lang bei 22ºC vermischt. Diese Lösung wurde dann 10 min lang zentrifugiert und das erhaltene Pellet wurde in 0,1 molarem Glycin (pH-Wert = 8,5) re-suspendiert, wodurch eine Mischung mit 0,3% Feststoffen von Agglutinationsreagens erhalten wurde.
Das PIB-Antigen wurde aus einer Probe von Neisseria gonorrhea extrahiert, unter Verwendung einer Mischung von 1% Ethanolamin und 10 mmolarer Ethylendiamintetraessigsäure mit anschließender Schallbehandlung und Filtration.
Eine mikroporöse Nylon-66-Membran mit einer mittleren Porengröße von 5 Mikrometern wurde durch Eintauchen in eine 2%ige Caseinlösung vorbehandelt. Eine Mischung aus Natriumchlorid (50 ul, 6 molar), Antigen-Lösung (50 ul) mit einer spezifischen Menge von Antigen (Nanogram) und der oben beschriebenen Agglutinations-Indikatorlösung wurde in ein Teströhrchen gegeben und hierin 30 min lang bei 22ºC inkubiert, worauf durch die behandelte mikroporöse Membran filtriert wurde. Das erhaltene Agglutinat auf der Membran wurde mit 0,15 ul eines 1 molaren Tricin-Puffers (pH-Wert = 8,6) gewaschen. Die Menge an Agglutinat wurde ermittelt durch Messung der Fluoreszenzmenge in dem Agglutinat unter Verwendung einer standardisierten Oberflächen-Fluoreszenz-Meßvorrichtung (Anregung 342 nm und Emission 610 nm). Eine Vergleichslösung, enthaltend spezielle Mengen an einem Extrakt aus einem unterschiedlichen Antigen (d.h. de PI-Antigen der Serogruppe A von Neisseria gonorrhea, auch bekannt als PIA-Antigen), wurde in der gleichen Weise behandelt, um die nicht-spezifischen Reaktionen mit den Antikörpern für das PIB-Antigen zu messen. Die unten folgende Tabelle I zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Es ist offensichtlich, daß das Bestimmungsverfahren dieser Erfindung zur Bestimmung eines gewünschten Antigens einer spezifischen Serogruppe von Gonorrhea eingesetzt werden kann. Tabelle I Relative Fluoreszenz PIB-Antigen-Konzentration (ng) Test Vergleich

Beispiel 5: Bestimmung von menschlichem Choriongonadotrophin

Dies Beispiel veranschaulicht die Praxis der vorliegenden Erfindung bei der Bestimmung von menschlichem Choriongonadotropin (HCG).
Von polyineren Teilchen vom Kern/Hüllen-Typ wurde nach üblichen Verfahren der Farbstoff Oil Red EGN aufsaugen gelassen. Die Teilchenkerne bestanden aus Poly(styrol-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (Gew.-Verhältnis 85:15) und die Teilchenhüllen bestanden aus Poly(m,p-chlorometnylstyrol-co- methacrylsäure) (Gew.-Verhältnis 99,8:0,2). Die Teilchen hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 0,32 Mikrometer.
Monoclonale Antikörper für zwei verschiedene epitope Zentren von hCG wurden auf diesen Teilchen wie folgt immobilisiert: zu 0,6 ml eines 50 mmolaren Borat-Puffers (pH-Wert = 8,5) wurden zugegeben 0,1 mg einer Mischung von hCG-Antikörpern im Verhältnis von 10:1 (2,9 mg/ml einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung) und Casein (10 mg/ml Wasser). Das Protein Casein von niedrigem pI (10 mg/ml Wasser) wurde ebenfalls zugegeben, um Casein auf den Teilchen zu immobilisieren. Nach der Vermischung wurden 41,5 ul einer 5%igen Suspension der Latexteilchen wie oben beschrieben zugegeben, und die erhaltene Suspension wurde rotiert (end-over-end) 24 h lang bei 27ºC, um eine covalente Bindung der Antikörper und Casein an die Teilchen unter Erzeugung eines Agglutinations-Reagenses zu bewirken.
Eine Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (10 mg/ml Dimethylsulfoxid) wurde zu der Mischung des Agglutinations-Reagens in einem Gew.-Verhältnis von 1 Teil Anhydrid zu 1 Teil Gesamtprotein zugegeben, worauf die erhaltene Mischung 4 h lang bei 25ºC vermischt und 5 min lang bei 7000 U/min zentrifugiert wurde. Der erhaltene Pellet wurde in 0,1 molarem Glycin (pH-Wert = 8,5) re-suspendiert unter Erzeugung einer 0,3%igen Feststoff-Konzentration.
Verschiedene Mengen von hCG (Milli-I.E./ml) wurden zu mit Phosphat abgepufferten Salzlösungen zugegeben (0,1 molar bezüglich Natriumphosphat und 0,15 molar bezüglich Natriumchlorid) mit einem Gehalt von 0,5% Rinderserumalbumin. Eine mikroporöse Nylon-66-Membran mit einer mittleren Porengröße von etwa 5 Mikrometern wurde in einen Testbehälter einer Wegwerf-Testvorrichtung, ähnlich wie in Beispiel 3 oben beschrieben, gegeben. Diese Membran wurde mit 2 Tropfen einer 1%igen wäßrigen Lösung von succinyliertem Casein gewaschen. Die hCG-Konzentration in Milli-I.E. ist definiert als 5000 Milli-I.E. als Äquivalent gegenüber einem Mikrogramm von gereinigtem hCG.
Eine Mischung von 60 ul von 4 molarem Natriumchlorid, 1 molarem Tricin-Puffer (pH-Wert = 8,6), 60 ul einer Suspension des Agglutinations-Reagens, wie oben beschrieben, und 240 ul der hCG-Lösungen, wie oben beschrieben, wurden in Teströhrchen gegeben, vorsichtig vermischt und 10 min lang bei 25ºC inkubiert. Ein Teil einer jeden Lösung (300 ul) wurde zu dem Testbehälter mit der Membran zugegeben und durch die Membran fließengelassen. Agglutinat, das sich auf der Membran bildete, floß jedoch nicht durch. Es wurde mit 300 ul einer 1 molaren Natriumchloridlösung gewaschen und die Menge an Farbstoff in dem Agglutinat wurde bei 540 nm, wie in Beispiel 3 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse dieser Messungen sind in Tabelle II unten zusammengestellt, in Form von Transmissionsdichten (DT). Es ist erkennbar, daß die Bestimmungsmethode dieser Erfindung zur Bestimmung von hCG angewandt werden kann. Tabelle II hCG-Antigen (Milli-E.E./ml

Claims

1. Immunoreaktives Reagens, das für die Bestimmung einer immunoreaktiven Species geeignet ist, mit wasserunlöslichen Partikeln, denen Tracer-Moleküle zugeordnet sind, und Receptor-Moleküle , die mit der Species, die an die äußere Oberfläche der Partikel gebunden sind, reaktiv sind,

dadurch gekennzeichnet, daß an die äußeren Oberflächen der Partikel ferner Moleküle eines Proteins mit einem pI von weniger als 6 gebunden sind, wobei das Protein nicht reaktiv ist, mit entweder der Species oder den Receptor- Molekülen, und wobei das Gewichtsverhältnis von Receptor- Molekülen zu den Proteinmolekülen bei 100 : 1 bis 1 : 10 liegt.

2. Reagens nach Anspruch 1, bei dem das Protein Casein, succinyliertes Collagen, succinyliertes Rinderserumalbumin oder succinyliertes Casein ist.

3. Reagens nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem das Gewichtsverhältnis von Receptor-Molekülen zu den Protein- Molekülen bei 20 : 1 bis 1 : 1 liegt.

4. Verfahren zur Herstellung eines immunoreaktiven Reagens für die Bestimmung einer immunoreaktiven Species, bei dem man:

eine Suspension von wasserunlöslichen Partikeln mit diesen zugeordneten Tracer-Molekülen bereitstellt und

die Partikel praktisch gleichzeitig kontaktiert mit

(i) Receptor-Molekülen, die mit der Species reaktiv sind und

(ii) Molekülen eines Proteins mit einem pI von weniger als 6, wobei das Protein nicht reaktiv ist mit entweder der Species oder den Receptor-Molekülen

um die Receptor-Moleküle und Protein-Moleküle an die äußeren Oberflächen der Partikel zu binden, wobei das Protein in einer Menge vorliegt, derart, daß praktisch sämtliches Protein an die Partikel gebunden wird, und daß das erhaltene Gewichtsverhältnis von Receptor- Molekülen zu den Protein-Molekülen bei 100 : 1 bis 1 : 10 liegt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Protein Casein, succinyliertes Collagen, succinyliertes Rinderserumalbumin oder succinyliertes Casein ist.

6. Verfahren zur Bestimmung einer immunoreaktiven Species in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei dem man:

(a) die Flüssigkeit mit einem immunoreaktiven Reagens kontaktiert, das wasserunlösliche Partikel enthält, denen Tracer-Moleküle zugeordnet sind, wobei an die äußere Oberfläche der Partikel gebunden sind:

(i) Receptor-Moleküle, die mit der Species reaktiv sind und

(ii) Moleküle eines Proteins mit einem pI von weniger als 6, wobei das Protein nicht reaktiv ist mit entweder der Species oder den Receptor-Molekülen,

wobei das Gewichtsverhältnis von den Receptor- Molekülen zu den Protein-Molekülen bei 100 : 1 bis 1 : 10 liegt, um ein Reaktionsprodukt aus der Species und den Receptor-Molekülen zu bilden,

(b) das Reaktionsprodukt von den nicht-umgesetzten Materialien trennt und

(c) die Menge des Tracers entweder in dem Reaktionsprodukt oder den nicht-umgesetzten Materialien bestimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Species ein Antigen ist und die Receptor-Moleküle Antikörper sind, die reaktiv gegenüber dem Antigen sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, für die Bestimmung von Streptococcus-A-Antigen in einer biologischen Probe.

9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Species ein Antikörper ist und die Receptor-Moleküle Antigen-Moleküle sind, die bezüglich des Antikörpers reaktiv sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, das eine Agglutinationsbestimmung ist.