DE2716335A1

DE2716335A1 - Neue cholinoxydase und verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number: DE2716335A1
Application number: DE19772716335
Authority: DE
Inventors: Spaeter Genannt Werden Wird
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1976-04-26
Filing date: 1977-04-13
Publication date: 1977-11-10
Also published as: FR2349599B1; US4135980A; NL189920C; CA1093993A; JPS604716B2; DE2716335C2; JPS52130984A; NL7704546A; GB1575249A; NL189920B; FR2349599A1; DE2760200C2

Description

Die Erfindung betrifft neue Enzymcholinoxydase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ein analytisches Verfahren unter Verwendung der Cholinoxydase.

Cholindehydrogenase [EC.1.1.99.1, Cholin:(Akzeptor) Oxidoreduktase] und Betainaldehyddehydrogenase [EC.1.2.1.8. Betainaldehyd:NAD Oxidoreduktase] sind bekannte Enzyme, die auf Cholin oder Cholinaldehyd als Substrat einwirken. Es ist weiterhin bekannt, daß diese Enzyme für ihre enzymatischen Wirkungen Coenzyme erfordern [Methods in Enzymology V, 562-570, (1962); ibid I, 674-678 (1955), Academic Press.], und daher werden sie als Dehydrogenase klassifiziert. Die Betainaldehyddehydrogenase wurde aus einem Stamm von Pseudomonas aeruginosa A-16 isoliert und gereinigt. Sie besitzt ein Molekulargewicht von etwa 145 000 (durch Gelfiltration bestimmt); einen isoelektrischen Punkt von 5,1; einen optimalen pH-Wert von 8,0 bis 9,0; und einen stabilen pH-Wert von etwa 7,5·

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Es wurde gefunden, daß ein Enzym, das die Oxydationsreaktion von Cholin zu Betain katalysiert, von dem Bakterienstamm B-0577, der zum Genus Arthrobacter gehört und aus Boden, der in Kagoshima, Japan, gesammelt wurde, gebildet wird. Dieses Enzym wurde gereinigt und es wurde festgestellt, daß es ein einziges Enzym ist.

Dieses Enzym besitzt die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften: einen isoelektrischen Punkt von 4,6 (Elektrophorese mit einem Träger-Ampholyten); Molekulargewicht etwa 84000 + 2100 (Gelfiltration an Sephadex G-150). Das Enzym besitzt eine Substratspezifizltät für Cholin und Betainaldehyd, es erfordert kein Coenzym und die Substrate reagieren direkt mit Sauerstoff bei der enzymatischen Reaktion.

Dieses neue Enzym, Cholinoxydase, katalysiert die Umsetzung, bei der 1 Mol Cholin zu Betain über den Betainaldehyd unter Bildung von 2 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert wird oder bei der 1 Mol Betainaldehyd zu Betain unter Bildung von 1 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert wird.

Der Stamm B-0577 besitzt die folgenden taxonomischen Eigenschaften.

A. Makroskopische Beobachtung auf verschiedenen Medien, kultiviert bei 26⁰C während 18 bis 42 Stunden

(1) Bouillonagarplatte:

Wachstum: gut, kreisförmig, glatt an der Peripherie, Änderungen zu glänzend konvex

Farbe der Kolonie: gräulich-weiß (Farbton % ca) bis

schwachgelb (Farbton 1^ ga), kein diffundierbares Pigment;

(2) Bouillonagarschrägkultur:

Wachstum: gut, fibröses Wachstum, glänzend

7 0 9 8 U R / 0 7 B 7

J- 3T-

Farbe der Kolonie: gräulich-weiß (Farbton 1·* ca) bis schwachgelb (Farbton 1^ ga), kein diffundierbares Pigment;

(3) Bouillonbrühe:

keine oder sehr dünne Häutchenbildung auf dem Oberflächenwachsum; kultivierte Brühe trübe und Niederschlagsbildung, nicht transparent;

(4) Bouillongelatinestichkultur:

Wachstum: gut, Wachstum auf der Oberfläche, keine Gelatineverflüssigung ;

(5) Lackmusmilch:

Wachstum: schwach, Peptonisierung bei etwa 2 Wochen, manchmal weiche Koagulatbildung oder Alkalischwerden; keine Lackmusreduktion.

Die Farbbestimmung erfolgte entsprechend "Color Harmony Manual" (Container Corporation of America, 1958).

B. Mikroskopische Beobachtungen

(1) Form und Größe der Zellen auf Bouillonagarplatten (6 Stunden Kultivierung: Stäbchen 0,5 bis 0,8 χ 1,5 bis 2,0/u; 18 Stunden Kultivierung: Kügelchen, 0,5 bis 0,8/u;

(2) Polymorphismus: in Bouillonbrühenkultur, manchmal T-för-

mige oder Y-förmige Zellen;

(3) Motilität: keine (auf weichem Agar);

(4) Sporen: keine;

(5) Gram-Anfärbung: junge Zellen: positiv; alte Zellen:

negativ;

(6) Säure-Schnellanfärbung: negativ;

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C. Physiologische Eigenschaften Nitratreduktion: negativ Denitrifikationsreaktion: negativ MR-Test: negativ VP-Test: negativ Indolbildung:negativ Schwefelwasserstoffbildung bzw.Hydrogensulfatbildung:

schwach positiv

Stärkehydrolyse: schwach positiv Citratverwendung: Koser-Medium: negativ

Christensen-Medium: positiv Nitratverwendung: negativ Ammoniumverwendung: negativ Pigmentbildung: negativ Urease: positiv Oxydase: schwach positiv Catalase: positiv Wachstums-pH: 4,0 bis 11,0 Wachsturnstemperatur: 5 bis 37°C Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob Cellulosehydrolyse: negativ Caseinhydrolyse: negativ O-F-Test⁺: 0 (oxydative Zersetzung) Säurebildung aus Zucker (keine Gasbildung)⁺⁺: innerhalb 1 Woche: Glucose, Inosit Innerhalb 2 WochenCellobiose, Erythrit, Fructose, Maltose, Mannit, Mannose, Sorbit, Saccharose,

Trehalose, Stärke keine Säurebildung: L-Arabinose, Dulcit, Aesculin, Galactose, Glycerin, Lactose, Melezitose, MeIi-

biose, Salicin, Sorbose, Xylose.

+ O-F-Testmedium: modifiziertes Medium: g NH₄H₂PO₄, 1 g Hefeextraktpulver, 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO₄.7H₂O, 10 g Glucose, 2 g Agarpulver, 1 1 destilliertes Wasser, pH 7,2; _709845/0757

++ Grundmedium: 1 g NH^HgPO^, 1 g Hefeextraktpulver, 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO^.7H₂O, 2 g Agarpulver, 1 1 destilliertes Wasser, pH 7,2.

Ein Vergleich mit Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ed. 1974, zeigt, daß der Stamm B-0577, der die oben erwähnten taxonomischen Eigenschaften besitzt, insbesondere gram-positiv ist, nicht säurebeständig ist und kein beweglicher Bazillus oder Coccus ist und verzweigt und nichtfaserartig ist und Zucker oxydativ zersetzt, eine positive Catalasereaktion zeigt, eine schwach positive Oxydasereaktion zeigt und Cellobiose nicht zersetzt, zu dem Genus Arthrobacter in der Coryneform-Bakteriengruppe gehört.

Ein Vergleich des Stamms B-0577 mit den Kulturen von sieben Species, die zum Genus Arthrobacter gehören und die in dem oben erwähnten Bergey's Manual, 1974, beschrieben werden, zeigt die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse.

In der Tabelle bedeuten:
+ positive Reaktion oder Säurebildung aus Zucker innerhalb

einer Woche
(+) schwach positive Reaktion oder Säurebildung innerhalb

von 1 bis 2 Wochen

negative Reaktion.

AB Arthrobacter

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Tabelle

Mikroorganismus

Test

co

C+

tu
ο

VJl

O co

ro S
O¹O ONH VO (D

H>

Oq

-* H IV5O

-^ σ¹

VJJH-

Kulturtemperatur:

►»3» O O

-A H-

IVJc+

vjkd co

IV)(D VO CQ 0>O O (D

O^ (D

(D 3 co

26⁰C

1—I S»-

IVJO

VOP.

VJl (D

VOO

P·

H-

CO

H P>

(D CO O (D 3 co

(D

►J

(D

Gram-Einfärbung "° säurebeständige Verfärbung co Form ^ Sporen ί" Oxydase ο Catalase m Urease "** Urease

Gelatine-Verflüssigung

Stärkehydrolyse

Caseinhydrolyse Cellulosehydrolyse Indol H₂S

S-R

S-R S-R

SSR-Mediun

Christensen-Mediuni

+ 2 Tage Kultur ,Eazier-Verfahren

+ 2 Tage Kultur, Jodometrie

Bleiacet-

tat-Papier-

verfahren

Tabelle (Fortsetzung)

Acetoin - - - -

MR-Test - - -

Nitratreduktion - -- ++++ +

Lackmusmilch Peptonisierung schwache Pep- Koagu- keine

tonisierung lation Änderung

Citratverwendung - - - Simmons-Medium

Citratverwendung + + + + + Christensen-

Medium

0 NT
gelb gräulich- gelb

O (D	OF- F-Test	O	O O	-	-
OO on	Farbe der Kolonie Säurebildung aus Zucker '	schwach gelb	gräulich-weiß	-
*rrm*	Arabinose	-	+	(+) +
w ■	Cellobiose	(+)	(+)	(+)
	Dulcit	-	+	+ +
	Erythrit	(+)	+ +
	Aesculin	-	(+)
	Fructose	(+)
	Galactose	-
	Glucose	+
	Glycerin	mm
	Inosit	+
	Lactose	-
	Maltose	( + )

cn co co

Tabelle (Fortsetzung)

Mannit (+) + -

Mannose (+) - - (+)

Melezitose __+---

Melibiose - - + (+)

Raffinose - - + (+)

Salicin _-++__

Sorbose __-.__-

^ Stärke (+) - + - -

oo Saccharose (+) (+) + (+) (+)

uiTrehalose (+) (+) + (+) (+) Q Xylose ·_- + ++_- ^i

^J S-R: beobachtete stäbchenförmige, kugelförmige, T- oder Y-förmige Zellen ι

NT: nicht geprüft

Arthrobacter duodecadis IFO 12959 und Arth. flavesceus wurden nur nach der Beschreibung in Bergey's Manual, 1974, mitverglichen; der erstere Stamm wächst nicht auf Nähragarmedium.

Man stellt fest, daß die taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0577 identisch sind mit denen des Stammes Arthrobacter globiformis IFO 12137, mit Ausnahme der Farbe der Kolonie, der Stärkezersetzung (etwas unterschiedlich) und der Säurebildung aus einigen Zuckern. Hinsichtlich der Farbe der Kolonie bildet Arthrobacter globiformis kein charakteristisches Pigment auf Nähragar, jedoch wird gelegentlich bzw. von einigen Stämmen ein mit Wasser unmischbares, zitronengelbes Pigment gebildet. Beide Stämme bilden aus Stärke Säure (Stärkezersetzung); weiterhin bildet Arthrobacter globiformis IF012137 aus allen Zuckern Säure, wohingegen der Stamm B-0577 Säure bildet, ausgenommen aus Erythrit. Der Stamm B-0577 wird daher als Arthrobacter globiformis eingeteilt und als Arthrobacter globiformis B-0577 bezeichnet. Dieser Stamm wurde bei der permanenten Sammlung im Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Nummer FERM-P Nr. 3518 hinterlegt. Der Stamm wurde ebenfalls bei ARS, USA, mit der Nummer NRRL hinterlegt.

Da das neue Enzym, Cholinoxydase, ein Enzym ist, für das Cholin und Betainaldehyd Substrate sind, kann Cholin oder Betainaldehyd in einer flüssigen Probe durch Behandlung der Probe mit Cholinoxydase quantitativ bestimmt werden, indem man das freigesetzte Wasserstoffperoxid, Betain oder den verbrauchten Sauerstoff mißt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues Enzym,Cholinoxydase,zu schaffen, das mindestens die folgenden Eigenschaften aufweist:

Substratspezifizität:für eine Verbindung der Formel

CH,

CH,- N⁺ - CH₉ - R.

CH, ^x

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in der R₁ -CH₂OH oder -CHO bedeutet;

optimaler pH-Wert: 8 (T-ris-HCl-Puffer);

isoelektrischer Punkt: 4,6 (Elektrophorese auf einem Ampholyten der Träger-Art

Molekulargewicht: 84 000 + 2 100 [Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-150 (Warenzeichen)]

Enzymwirkung: katalysiert Reaktion (I) und/oder (II)

CH₃ ^ CH₃

CH₃ N⁺-CH₂CH₂OH + 0_£ ^ CH₃ N⁺-CH₂CHO + H₂O₂ (I)

CH₃ ^ CH₃

CH₃ CH₃

CH₃—" N⁺-CH₂CHO + H₂O + O₂ > CH₃- N⁺-CH₂COOH + H₂O₂ (II)

CH₃ ' CH₃

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der neuen Enzym-Cholinoxydase geschaffen werden, bei dem ein Cholinoxydase bildender Mikroorganismus, der zum Genus Arthrobacter gehört,kultiviert wird und die Cholinoxydase aus der Kulturmasse isoliert wird.

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Cholin oder Betainaldehyd geschaffen werden.

Erfindungsgemäß soll für eine flüssige, Cholin oder Betainaldehyd enthaltende Probe ein Analyseverfahren geschaffen werden, bei dem die Probe mit Cholinoxydase behandelt wird und das so freigesetzte Wasserstoffperoxid, das Betain oder der verbrauchte Sauerstoff bestimmt werden.

Erfindungsgemäß soll ein klinisches, diagnostisches Verfahren und ein Reagens für die Analyse von Cholin, Betain-

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aldehyd, Cholinderivat oder Betainaldehydderivat in KörperflUssigkeiten geschaffen werden.

Erfindungsgemäß wird Arthrobacter globiformis B-0577 FERM-P Nr. 3518 in einem für die Antibiotika- oder Enzym-Erzeugung üblichen Medium kultiviert. Für eine industrielle Produktion ist eine submerse Belüftungskultur bevorzugt.

Bevorzugt werden an sich übliche Medien für Mikroorganismen verwendet. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maiseinweichflüssigkeit, Sojabohnenpulver, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid o.a., verwendet werden. Assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Melassen, Glucose, Stärkehydrolysate o.a., können bevorzugt verwendet werden. Verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogenphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat, und Antischaummittel können gegebenenfalls verwendet werden. Die Zugabe von Cholin zu dem Medium aktiviert die Erzeugung von Cholinoxydase. Durch die Zugabe von 0,5 bis Λ% Cholin kann eine um das Zehnfache höhere Produktivität erhalten werden.

Die KuItürtemperatur kann in dem Bereich liegen, wie er für das Wachstum mikrobieller Zellen und der Enzymerzeugung üblich ist, bevorzugt beträgt sie 25 bis 30⁰C. Die Kulturzeit kann variieren, abhängig von den Bedingungen, und beträgt im allgemeinen 15 bis 50 Stunden. Die Kultur kann natürlich beendigt werden, wenn die Cholinoxydase-Produktion eine maximale Potenz erreicht hat.

Cholinoxydase ist ein endo-Enzym, das in den Zellen der Mikroorganismen vorkommt.

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Die Extraktion der Cholinoxydase aus der Kulturmasse erfolgt folgendermaßen. Die kultivierte Masse bzw. Kulturmasse (diese Ausdrücke werden im folgenden synonym verwendet) wird filtriert und die nassen Zellen werden in einem Puffer, wie bis-HCl-Puffer suspendiert und anschließend mit Lysozym, Ultraschall und einer französischen Presse (french press) behandelt. Die Lysozym-Behandlung erfolgt bevorzugt für die Ausbeute und spezifische Aktivität des Enzyms. Die so erhaltene rohe Cholinoxydase wird durch für Protein und Enzym bekannte Isolier- und Reinigungsverfahren gereinigt. Beispielsweise wird bevorzugt eine fraktionierte Ausfällung durch Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol und ein Aussalzen durch Ammoniumsulfat durchgeführt. Eine weitere Reinigung kann z.B. durch Elektrophorese oder Chromatographie erfolgen, wobei die rohe Cholinoxydase in tris-HCl-Puffer gelöst wird und unter Verwendung von ^ionenaustauschern, wie vernetztes Diäthylamino-äthylcellulose- oder -dextran-gel, oder von Gelfiltrationsmitteln, wie Dextrangel oder Polyacrylamidgel, chromatographiert wird. Gereinigtes Cholinoxydasepulver kann durch Gefriertrocknung hergestellt werden.

Die erfindungsgemäße Cholinoxydase besitzt die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften.

(1) Enzymwirkung

Cholin wird unter Bildung von Betainaldehyd oxydiert und Betainaldehyd wird zu Betain oxydiert.

Bei der Oxydation von 1 Mol Cholin wird 1 Mol Betainaldehyd und 1 Mol Wasserstoffperoxid freigesetzt. Das 1 Mol Betainaldehyd wird weiter unter Bildung von 1 Mol Betain und 1 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert. Schließlich setzt 1 Mol Cholin 1 Mol Betain und 2 Mol Wasserstoffperoxid frei. 1 Mol Betainaldehyd setzt 1 Mol Betain und 1 Mol Wasserstoffperoxid frei.

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(2) Enzymversuch

In 0,30 ml Reaktionsgemisch, das 0,05 ml (0,2 Mol) TTis-HCl-Puffer (pH 8,o), 0,05 ml (3 mg/ml) 4-Aminoantipyrin, 0,10 ml(0,1# ) Phenol, 0,10 ml (2/u/mg) Peroxydase, 0,10 ml (0,1 Mol) Cholinchlorid und 0,10 ml destilliertes Wasser enthält, gibt man 5/ul Enzymlösung und inkubiert 5 min bei 37°C. Für die Beendigung der Reaktion werden 2,5 ml Äthanol zugegeben.

Eine Enzym-Aktivitätseinheit wird als die Aktivität des Enzyms definiert, die 1 /uMol Wasserstoffperoxid/min freisetzt. Die Enzymaktivität (Einheiten/ml) wird durch die folgende Gleichung berechnet:

Einheiten/ml = AA^₈₀/min χ 14

worin A A^₈₀ die Änderung pro Minute in der Absorption bei 480 nm bedeutet.

(3) Substratspezifizität

Die relative Aktivität auf verschiedene Substrate ist wie folgt:

Substrat Relative Aktivität

Cholin 100,0

Betainaldehyd 50,0

N-Methylaminoäthanol 3,6

Dimethyläthanolamin 5,2

Monoäthanolamin 0,4

Diäthanolamin 0,0

Triäthanolamin __ 3,6

Das Enzym besitzt eine höhere Aktivität für Cholin und Betainaldehyd.

(4) Optimaler. pH

pH 8, wie in Fig. 1 dargestellt; Cholin wird als Substrat verwendet. _{? 0} g _{8 A 5} / _{0 7 5 7}

(5) Optimale Temperatur

etwa 4O°C, wie in Fig. 2 dargestellt; Cholin wird als Substrat verwendet.

(6) pH-Stabilität

Für einen pH-Wert von 6 bis 7 wird Dimethylglutarsäure-Puffer, für einen pH-Wert von 7 bis 8 T.ris-HCl-Puffer und für einen pH-Wert von 9 bis 10 Glycin-NaOH-Puffer verwendet. Zu 25 mMol jedes Puffers (0,1 ml) gibt man 5 ,ul Enzymlösung (Protein 10/Ug/ml) und läßt 30 min bei 37°C stehen. Nach der Einstellung des pH-Wertes durch Zugabe von 0,5 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 0,05 ml) wird die Enzymaktivität bestimmt. Cholin wird als Substrat verwendet. Aus Fig. 3 geht hervor, daß der stabile pH-Wert bei etwa pH 8 liegt.

(7) Wärmestabilität

Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem man 10 mMol T:ris-HCl-Puffer (1 ml, pH 8,0), der Enzym (Protein 10/Ug/ml) enthält, unter Verwendung von Cholin als Substrat 10 min bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Wie aus Fig. 4 erkennbar ist, ist das Enzym bei etwa 40°C stabil und die Aktivität nimmt über 4O⁰C schnell ab.

(8) Einfluß von verschiedene!Verbindungen

Der Einfluß verschiedener Verbindungen auf das Enzym wird bestimmt, indem man 5 mMol Metallsalz oder 0,1% Gew./Vol.Detergens zugibt.

Zugegebene Substanz * Relative Aktivität CaCl₂ 101,0

MgCl₂ 100,0

FeCl₃ 0,0

ZnCl₂ 7,9

MnCl₂ 97,7

709845/0757 ³⁰'⁷

Zugegebene Substanz ReI.Aktivität

MoCl₂ 58,0

KCl 93,2

NaCl 96,6

NH^Cl 100,0

LiCl 96,6

BaCl₂ 103,4

Triton X-100 (Warenzeichen) 95,5

Adekatol SO-120 105,7

Natriumlaurylsulfat 94,3

Natriumdeoxycholat 94,3

Tween 20 96,6

Natriumlauryl-benzolsulfonat 91,0

Kation DT 205 65,9

keine Zugabe 100,0

(9) Molekulargewicht

84 000 + 2100 (Sephadex G-150-Gelfiltration).

(10) Isoelektrischer Punkt

4,6 (Elektrophorese unter Verwendung eines Ampholyten der Träger-Art).

(11) Elektrophorese

Durch Amidoschwarz wird das Enzym bei der Scheiben-Elektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamidgel (pH 8,3) verfärbt. Man beobachtet eine einzige, dunkelblaue Bande, wie in Fig. 5-1 dargestellt.

Die Bande des Enzyms wird weiterhin festgestellt, indem man das Gel, das die elektrophoretisch behandelte Probe enthält, in das folgende Reaktionsgemisch 20 bis 30 min bei 37⁰C stellt:

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	ZO	2711
	- J6 -
		1,0 ml
Reaktionsgemisch (insgesamt	10 ml)	2,0 ml
0,2 Mol Tris-HCl-Puffer		1,0 ml
Farbstoff"*"		6,0 ml
0,1 Mol Substratlösung
destilliertes Wasser

+ der Farbstoff enthält 0,1 Mol Tris-HCl-Puffer (10 ml), 5 mg/ml o-Dianisidin-äthanollösung (0,3 ml) und Peroxydase (10 Einheiten).

++ wäßrige Lösung aus Cholinchlorid oder Betainaldehyd.

Eine einzige rote Bande wird, wie in Fig. 5-2 dargestellt, beobachtet, wenn man Cholinchlorid als Substrat verwendet, und eine einzige, rote Bande wird ebenfalls, wie in Fig. 5-3 dargestellt, beobachtet, wenn man Betainaldehyd als Substrat verwendet. Die gefärbten Gele werden durch 7%ige Essigsäure nach dem Waschen mit Wasser fixiert.

Wie aus den Fig. 5-1» 2, 3 hervorgeht, sind die elektrophoretischen Mobilitäten an dem Gel identisch und zeigen eine einzige Bande, wodurch die gereinigte Cholinoxydase als einziges Protein identifiziert wird.

(12) Wirkungsmechanismus

0,5 ml eines Gemisches, das Cholin oder Betainaldehyd (0,01 bis 0,05/uMol), Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 200/uMol), 4-Aminoantipyrin (150 /Ug), Phenol (200/Ug), Peroxydase (0,2 Einheiten) und Cholinoxydase (0,25 Einheiten) enthält, wird 25 min bei 37°C inkubiert und jdann wird die Absorption bei 480 nm nach der Zugabe von 2,5 ml Äthanol gemessen.

Eine Standardkurve wird hergestellt, indem man aliquote Teile an Wasserstoffperoxid anstelle von Cholin oder Betain zugibt.

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Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, worin das Ergebnis unter Verwendung von Cholin als Substrat, das Ergebnis unter Verwendung von Betainaldehyd als Substrat und Δ Λ das Ergebnis unter Verwendung von Wasserstoffperoxid anstelle des Substrat darstellen. Aus Fig. 6 geht hervor, daß das Enzym die Umsetzung katalysiert, bei der 1 Mol Cholin 2 Mol Wasserstoffperoxid freisetzt und bei der 1 Mol Wasserstoffperoxid aus 1 Mol Betainaldehyd freigesetzt wird.

Der Sauerstoffverbrauch wird durch eine Sauerstoffelektrode bestimmt und zeigt, daß 2 Mol Sauerstoff bei der Oxydation von 1 Mol Cholin und 1 Mol Sauerstoff bei der Oxydation von 1 Mol Betainaldehyd verbraucht werden.

Das Betain wird quantitativ bestimmt, indem man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 1 einstellt, das Gemisch auf das 10Ofache nach Behandlung mit Aktivkohle konzentriert und dann nach dem Reinecke-Salzverfahren analysiert. 1 Mol Betain wird aus 1 Mol Cholin oder 1 Mol Betainaldehyd gebildet.

Wie zuvor erwähnt, erfordert die erfindungsgemäße Cholinoxydase kein Coenzym für die Oxydation von Cholin und Betainaldehyd, und das Substrat reagiert direkt mit Sauerstoff unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid. Außerdem besitzt das Enzym andere physiko-chemische Eigenschaften als bekannte Enzyme. Dadurch wird bestätigt, daß die Cholinoxydase ein neues Enzym ist, verglichen mit der bekannten Cholindehydrogenase und Betainaldehyddehydrogenase.

Die neue Cholinoxydase kann für die Analyse von flüssigen, Cholin oder Betainaldehyd enthaltenden Proben verwendet werden.

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SÄ

- ie -

Weiterhin kann Cholinoxydase für die Bestimmung der Reinheit von Cholin und Betainaldehyd, die quantitative Bestimmung von Derivaten von Cholin und Betainaldehyd und die Aktivität des Enzyms, das auf die Derivate von Cholin oder Betainaldehyd unter Bildung von Cholin oder Betainaldehyd wirkt, verwendet werden.

Beispielsweise kann man eine Cholin oder Betainaldehyd enthaltende Probe, z.B. eine wäßrige Lösung oder ein Medium von Cholin oder Betainaldehyd oder eine wäßrige Lösung, die Cholin oder Betainaldehyd, die von ihren Derivaten freigesetzt wurden, verwenden. Besondere Beispiele sind Blut, Serum, Körperflüssigkeit, Gewebehomogenat u.a. Die Cholinoxydase kann somit für die klinische Diagnose direkt oder zusammen mit anderen chemischen oder enzymatischen Systemen verwendet werden.

Beispiele von Cholinderivaten sind physiologische Phospholipide, wie Lysolecithin, Lecithin und Sphingomyeline, biologische Substanzen, wie Acetylcholin, Cytidinphosphatcholin und Phosphorylcholin, oder synthetische Verbindungen, wie Benzoylcholin, Propionylcholin, Butylcholin und Succinylcholin. Diese Substanzen sind Cholinderivate, die Cholin durch chemische oder enzymatische Einflüsse freisetzen. Ein Beispiel für die Freisetzung von Cholin aus seinen Derivaten ist z.B. ein chemisches Verfahren, wie eine alkalische oder saure Hydrolyse, oder ein enzymatisches Verfahren, wie eine Kombination aus Phospholipase C, erhalten aus Clostridium welchii oder Bacillus cereus, und alkalischer Phosphatase, erhalten aus Rinder-, Schweine- oder Küken-Dünndarmmucosa, Rinderleber oder E.coli; Phospholipase D, erhalten aus Kraut, Streptomyces hachijoensis A 1143 oder Streptomyces chromofuscus A-0848; und Cholinesterase, erhalten aus Rinderblutzellen, dem Zitteraal, Pferdeserum oder Menschenserum. Die oben erwähnten Enzyme und ihre Herkunft

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sind nur Beispiele und sollen keine Beschränkung darstellen, und es können Enzyme, die Phospholipase G» alkalische Phosphatase-, Phospholipase D- oder Cholinesterase-Aktivität besitzen, verwendet werden. Die Umsetzung von Lecithin mit Phospholipase C und alkalischer Phosphatase kann als Beispiel dienen, da Lecithin zu Diglycerid und Phosphorylcholin durch Phospholipase C hydrolysiert wird und das freigesetzte Phosphorylcholin zu anorganischem Phosphor und Cholin durch die Wirkung der alkalischen Phosphatase gespalten wird. Die Phospholipase D hydrolysiert Lecithin zu Phosphatidsäure (phosphatidic acid) und Cholin. Benzoylcholin wird durch Cholinesterase zu Benzoesäure und Cholin hydrolysiert. Diese enzymatischen Verfahren sind nur Beispiele, bei denen Cholin oder Betainaldehyd aus ihren Derivaten freigesetzt wird und die mit Vorteil verwendet werden können. Die enzymatische Vorbehandlung der Derivate von Cholin und Betainaldehyd kann getrennt unter Freisetzung von Cholin und Betainaldehyd erfolgen, oder, wenn die enzymatische Vorbehandlung sehr kurz und einfach ist, kann sie gleichzeitig mit der Zugabe der Cholinoxydase erfolgen. Cholinoxydase kann als Pufferlösung oder eingekapselt in Mikrokapseln oder in immobilisierter Form verwendet werden. Die Menge an zugegebener Cholinoxydase beträgt etwa 1 Einheit oder bevorzugt 1,5 bis 5 Einheiten, und die Reinheit soll so hoch wie möglich sein; es ist Jedoch nicht immer erforderlich, daß eine Qualität allerhöchster Reinheit verwendet wird.

In dem inkubierten Gemisch aus Probe und Cholinoxydase werden Wasserstoffperoxid und Betain freigesetzt und dementsprechend wird die Menge an Sauerstoff darin verringert. Die Bestimmung des Sauerstoffs erfolgt bevorzugt nach einem Sauerstoff-Elektrodenverfahren. Betain kann bevorzugt nach dem Reineckate-Verfahren oder nach dem gaschromatographischen Verfahren des veresterten Betains erfolgen. Wasserstoffperoxid wird bevorzugt nach einem colorimetrischen Verfahren un-

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ter Verwendung eines Reaktionssystems mit einem oder mehreren Farbstoffreagentien durchgeführt. Bevorzugte colorimetrische Verfahren sind z.B. die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit quaternären Titanverbindungen und Xylenolorange oder mit Phenol, 4-Aminoantipyrin und Peroxydase. Bei der letzteren Reaktion inhibiert das Vorhandensein des Phenols die Aktivität von Cholinoxydase und es wird somit in einer so geringen Menge wie möglich verwendet. Die Menge an 4-Aminoantipyrin liegt über 1/2 Mol oder bevorzugt über 2 Mo!,entsprechend dem freigesetzten Wasserstoffperoxid, und die Menge an Peroxydase liegt über 0,1 Einheiten oder bevorzugt über 0,2 bis 0,5 Einheiten. 4-Aminoantipyrin kann durch 4-Aminophenazon ersetzt werden. Die Reagentien können zuvor als Lösung hergestellt werden. Wasserstoffperoxid kann ebenfalls quantitativ durch ein Gemisch aus 2,6-Dichlorphenol, Indophenol und Peroxydase, Guajakol und Peroxydase oder Homovanillinsäure und Peroxydase bestimmt werden.

Von den obigen quantitativen Analysen . des Wasserstoffperoxids, Betains und Sauerstoff ist die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid -, bei

der ein Gemisch aus Peroxydase und Farbstoffmittel verwendet wird, bevorzugt, da sie genau und leicht durchzuführen ist.

Dementsprechend kann Cholin oder Betainaldehyd in einer Probe quantitativ bestimmt werden, indem man die Menge an Wasserstoffperoxid, Betain oder Sauerstoff bestimmt und Standardkurven anfertigt. Die Reinheit von Cholin oder Betainaldehyd kann direkt bestimmt werden, oder man kann auch Derivate von Cholin leicht analysieren.

Die quantitative Bestimmung von Cholin kann ebenfalls durchgeführt werden, indem man die Menge an Zwischenprodukt Betainaldehyd oder die entsprechende Wasserstoffperoxidbildung bestimmt. Das Zwischenprodukt Betainaldehyd wird

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weiter durch Cholinoxydase unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxydiert, und daher können Fehler auftreten. Zur Vermeidung der Fehler wird ein Inhibitor zugegeben, wie ein Inhibitor, der mit Betainaldehyd eine Schiffsche Base bildet, oder ein solcher, der den Reaktionsweg von Betain ändert; zu diesem Zweck ist ein Aldehyddehydrogenase- und NAD- oder NADP-System bevorzugt.

Verschiedene Zusammensetzungen der Reagentien und Enzyme können je nach dem Zweck der Analyse zusammengestellt werden und diese Zusammensetzungen werden als Kit bzw. Besteck für die Analyse vorgesehen.

Bei den zuvor beschriebenen analytischen Verfahren wird das spezifische Enzym Phospholipase D, das eine Umsetzung des Phospholipids katalysiert und Cholin freisetzt, verwendet. Da diese Phospholipase D ein sehr spezifisches und vorteilhaftes Enzym für die quantitative Bestimmung von Cholin und seinen Derivaten bei der vorliegenden Erfindung ist, wird dieses Enzym im folgenden näher erläutert.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Phospholipase wird bevorzugt durch Züchten von Streptomyces hachijoensis A-11^3 oder Streptomyces chromofuscus A-0848 hergestellt; diese Stämme wurden im Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, als FERM-P Nr. 1329 und FERM-P Nr. 3519 hinterlegt.

Die taxonomischen Eigenschaften der Stämme Streptomyces chromofuscus A-0848 FERM-P Nr. 3519 und die physikochemisehen Eigenschaften von Phospholipase D sind die folgenden.

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Taxonomische Eigenschaften

(a) Morphologie

Nach den makroskopischen Bestimmungen ist das sporentragende Luftmyzelium grau und das Substratmyzelium ist gelblich-braun oder gelblich-orange. Es wird kein lösliches Pigment gebildet.

Die mikroskopischen Beobachtungen auf anorganischem Stärke-Agarmedium bei 30⁰C während 10 bis 15 Tagen Kultur sind wie folgt:

Luftmyzelium: Durchmesser 0,6 bis 0,8/u; gekrümmte und einfache Verzweigung; bildet Sporenketten; 1 bis 3 gewendelte Spiralen aus Sporenketten und weniger als 4 bis 5 gewendelte Spiralen; einige gekrümmte und gerade Sporenketten;

Sporen: kugelförmig oder elliptisch, 0,6 bis 0,8 χ 0,7 bis 0,9/U; stachelige Oberfläche;

Substratmyzelium: entwickelt mit gekrümmter Verzweigung;

Durchmesser 0,4 bis 0,6 /u; keine Zellteilung und kein Tragen von Sporen; keine flagellenartigen Sporen und Sporangium;

(b) Analyse des Gesamtmyzeliums (Diaminopimelinsäure)

Das während 6 Tagen auf Bennett's Medium in einer Schüttelkultur gezüchtete Myzelium wird entsprechend dem Verfahren von Becker et al [Appl.Microbiol., 12 (5), 421-423 (1964)] analysiert. LL-Diaminopimelinsäure wird nachgewiesen; die Mesoform konnte nicht festgestellt werden.

(c) Kultureigenschaften

In den verschiedenen, im folgenden aufgeführten Medien wird bei einer Temperatur unter 30°C während 20 Tagen gezüchtet. Abkürzungen: G = Wachstum; A = Luftmyzelium; S =

lösliches Pigment. _

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47

(1) Saccharosen!tratagar

G: Spur, keine Färbung; A: Spur; S: keins

(2) Glycerinnitratagar

G: mäßig - gut, pastellorange (4 ic); A: keins - Spur S: nackt dunkelgelb (Agc), Spur

(3) Glucoseasparaginagar

G: mäßig, bambusfarben (2fb) - amber (3 pe); A: schlecht mäßig, weiß (a); S: keins

(4) Glycerinasparaginagar

G: mäßig, goldbraun (3 pg - 3 pi); A: mäßig, silbergrau (3 fe) - naturfarben (3 dc); S: keins

(5) Anorganischer Stärke-Salz-Agar

G: mäßig - gut, goldbraun (3 pi) - nelkenbraun (3 pi); A: mäßig - gut, silbergrau (3 fe) - naturfarben (3 dc); S: keines

(6) Tyrosinagar

G: mäßig - gut, goldbraun (3 pg - 3 pi); A: mäßig - gut, silbergrau (3 fe) - naturfarben (3 dc); S: keins

(7) Glycerinstärkeglutamatagar

G: mäßig - gut, rostdunkelgelb (5 ge) - ahornfarben (4 le); A: mäßig, austernweiß (b) - hellgrau (c); S: keins

(8) Hafermehlagar

G: mäßig - gut, senfgold (2 ne)- goldbraun (3 Pg); Ai mäßig - gut, naturfarben (3 dc) - beigebraun (3 ig);

S: keines

(9) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

G: mäßig - gut, amber (3 Ic) - gelb-ahornfarben (3 ng); A: mäßig, silbergrau (3 fe) - beigebraun (3 ig) - beige (3 ge); S: keins

(10) Nähragar

G: mäßig, amber (3 pe); A: Spur - schlecht, weiß (a); S: keins

(11) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar

G: mäßig - gut, keine Farbe, umgekehrte Seite: Goldbraun (3 pg); A: keins; S: goldbraun (3 pg - 3 pi)

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(12) Tripton-Hefeextrakt-Medium

G: gut, amber (3 nc - 3 pc); A: keins; S: keins - goldbraun (3 pg)

(13) Glucose-Pepton-Gelatine-Medium

G: schlecht, goldbraun (3 pg); A: keins; S: goldbraun(3 pi)

(14) Entfettetes Milchmedium

G: gut - besser, hellamber (3 ic) - hell dunkelgelb (3 gc) A: keins; S: ahornfarben (4 Ie) - pastellorange (4 ic).

(d) Physiologische Eigenschaften (+ = positiv; - = negativ)

(1) melaninähnliche Pigmentbildung:

Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: + Tripton-Hefeextrakt-Medium : + Tyrosinagar:

(2) Gelatineverflüssigung: Glucose-Pepton-Gelatine-Medium: +

(3) Stärkehydrolyse; Stärke-anorganisches Salz-Medium: +

(4) Milch: Koagulation: -; Peptonisierung: +

(5) Verwendung der Kohlenstoffquelle:

D-Glucose, L-Arabinose, D-Mannit, L-Rhamnose, D-XyIose: +

Inosit, Raffinose: + Saccharose: -

(6) Wachstumstemperatur: 10 bis 47°C.

Das Luftmyzelium entwickelt sich aus dem Substratmyzelium ohne Spaltung und enthält viele Sporenketten. Die Eigenschaften des Durchmessers des Myzeliums und die Form der Sporen oder der Zellwände, die LL-Diaminopimelinsäure enthalten, ergeben, daß der Stamm zum Genus Streptomyces gehört. Die Eigenschaften, wie als gräuliches Luftmyzelium, spiralförmige Sporenketten, stachelige Sporenoberfläche, gelblichbraunes bis gelblich-oranges Substratmyzelium, keine lösliche Pigmentbildung, melaninähnliche Pigmentbildung auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agarmedium, keine melaninähnliche Pigmentbildung auf Tyrosinagarmedium und die Kohlenstoffquellenver-

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-⁴J-

Wendung verschiedener Kohlenstoffquellen zeigen, daß dieser Stamm zu Streptomyces chromofuscus (Preobrazhenskaya et al) Pridham et al gehört und als Streptomyces chromofuscus A-0848 bezeichnet wurde.

Die Züchtung des Stamms und die Erzeugung von Phospholipase D werden zweckdienlich,wie in dem folgenden Bezugsbeispiel 1 erläutert, durchgeführt.

Die physiko-chemischen Eigenschaften dieser Phospholipase D sind die folgenden.

(1) Enzymwirkung

Das Enzym katalysiert die Hydrolyse der Esterbindung bei Phosphat und basischen Stickstoffgruppen von Phospholipid und setzt Phosphorverbindungen und die entsprechende basische Stickstoffverbindung frei.

(2) Analyseverfahren

Zu einem Reagens, das 0,2 Mol Tric-HCl-Puffer (pH 8,0, 0,1 ml), 10 mMol Lecithinemulsion (0,1 ml), 0,1 Mol Calciumchlorid (0,05 ml), 1% Triton X-100 (0,1 ml) und 0,1 ml Wasser enthält, gibt man 0,05 ml Enzymlösung. Nach 10 min Inkubation bei 37°C wird das Gemisch zur Beendigung der Enzymreaktion gekocht und auf 37⁰C gekühlt. 4-Aminoantipyrin (3 mg/ml, 0,1 ml), Peroxydase (2 Einheiten/ml, 0,1 ml), 0,1?6 Phenol (0,1 ml), Cholinoxydase (12 Einheiten/ml, 0,1 ml) und 0,1 ml Wasser werden zugegeben. Nach der Inkubation bei 37°C während 20 min werden 2 ml 1%iges Triton X-100 zugegeben und dann wird die optische Dichte bei 500 nm bestimmt.

Eine Enzymaktivitäts-Einheit wird als die Aktivität des Enzyms definiert, die 1 /uMol Cholin/min freisetzt. Die Enzymaktivität (Einheit/ml oder E/ml) wird durch die Gleichung

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Einheiten/ml = AA₅₀₀ χ 0,55 angegeben, worin ΔAc_Oq ^die optische Dichte bei 500 nm bedeutet.

(3) Substratspezifizität

Die relative Aktivität auf verschiedenen Substraten ist wie folgt:

Substrat Relative Aktivität. %

Lecithin 51

Sphingomyelin 19

Lysolecithin 100

(4) pH-Stabilität

Eine Enzymlösung (1 mg/ml) wird 60 min bei 37°C auf verschiedenen Pufferlösungen inkubiert. pH 5: Acetatpuffer; pH 6 bis 7: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer; pH 8 bis 9: tris-HCl-Puffer; pH 10: Glycin-NaOH-Puffer; es werden jeweils 10 mMol verwendet und dann wird die Phospholipase D-Aktivität bestimmt. Wie aus Fig. 7 hervorgeht, ist das Enzym bei pH 7 bis 9 stabil.

(5) Optimaler pH

Wie aus Fig. 8 hervorgeht, beträgt der optimale pH des Enzyms pH 5 bis 8.

(6) Wärmestabilität

Enzymlösung (1 mg/ml) in 10 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wird 10 min bei 40, 50, 60, 70 bzw. 8O⁰C inkubiert. Wie aus Fig. 9 hervorgeht, ist das Enzym bis zu 70°C stabil.

(7) Enzymwirkung auf Serumphospholipide

Probe 1: 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,2 ml

im Handel erhältliches Serum 0,5 ml

0,1 Mol CaCl₂ 0,1 ml

60 E/ml Phospholipase D 0,1 ml

destilliertes Wasser 0,1 ml 709845/0757

27	16335	ml
0,2	ml	ml
0,5	ml	ml
0,1	ml	ml
0,1	ml	ml
2 Einheiten
0,1
0,2
0,5
0,1
0,2

3f7

Probe 2: 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) im Handel erhältliches Serum 0,1 Mol CaCl₂
60 E/ml Phospholipase D

Phosphatidat-phosphatase (erhalten aus Streptomyces mirabilis A-2313)

destilliertes Wasser

Probe 3: 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) im Handel erhältliches Serum 0,1 Mol CaCl₂
destilliertes Wasser

Die Proben 1, 2 und 3 werden 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend werden Chloroform-Methanol (2:1,6 ml) und Wasser (1 ml) gut vermischt. Das Gemisch wird 10 min bei 3000 ü/min zentrifugiert. Die abgetrennte Chloroformschicht wird im Vakuum getrocknet und an einer Dünnschichtplatte (Entwicklungsmittel: ChIoroform:Methanol:Wasser = 65:25:3) chromatographiert. Das Phospholipid auf der Platte wird identifiziert, indem man blaues Molybdänreagens aufsprüht. Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidyicholin, Sphingomyelin, Lysophosphatidylcholin und Phosphatidsäure werden auf Dünnschicht platten als Kontrolle chromatographiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt, worin folgende Bedeutungen verwendet werden:

1 = Probe 1; 2 = Probe 2; 3 = Probe 3; h - Standardphospholipid [Phosphatidyläthanolamin (A); Phosphatidyicholin (B); Sphingomyelin (C) und Lysophosphatidylcholin (E)]; 5 = Standardphospholipid [Phosphatidsäure(D)].

Aus Fig. 10 geht hervor, daß das Serum (Probe 3) Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidyicholin, Sphingomyelin und Lysophosphatidylcholin enthält. Das mit Phospholipase D (Probe 1) behandelte Serum zeigt nur Phosphatidsäure (Nr. 1). Das mit Phospholipase D und Phosphatidatphosphatase behandelte

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- 28 -

Serum (Probe 2) zeigt keinen Flecken (Nummer 2). Daher wird das Serum-Phospholipid durch Phospholipase D zu Phosphatidsäure hydrolysiert und die so gebildete Phosphatidsäure wird zu anorganischem Phosphat und Diglycerid durch Phosphatidatphosphatase hydrolysiert. Das Ergebnis zeigt, daß das Serum-Phosphatidyläthanolamin ein Substrat für diese Phospholipase D ist.

Die aus Streptomyces chromofuscus A-0848 erhaltene Phospholipase D ist hinsichtlich des optimalen pH-Werts, der pH-Stabilität und der WärmeStabilität besser als solche von Streptomyces hachijoensis A-1143. Weiterhin ist die durch St. hachijoensis A-1143 hergestellte Phospholipase D mit Phospholipase C verunreinigt, was nachteilig ist, da dadurch Nebenreaktionen auftreten. Erfindungsgemäß wird daher die durch St. chromofuscus A-0858 gebildete Phospholipase D bevorzugt bei der quantitativen Bestimmung von Phospholipid verwendet.

Im folgenden werden das Herstellungsverfahren von Cholinoxydase und analytische Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Cholinoxydase näher erläutert.

Beispiel 1

100 ml eines Mediums, das 1,096 Cholin, 0,5% KCl, 0,196 K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄.7H₂O, 0,25% Hefeextrakt, 1,0% lösliche Fischbestandteile und 0,1% Desform CA-200 in einem 500 ml Erlenmeyerkolben enthält, wird 20 min bei 120°C sterilisiert. Nach der Inokulation mit Arthrobacter globiformis B-0577 FERM-P Nr. 3518 wird 1 Tag bei 30⁰C eine Impfkultür kultiviert. Diese wird dann in 10 1 des gleichen, sterilisierten Mediums in ein 30 1 Fermentergefäß gegeben und 2 Tage bei 30⁰C und 200 U/min, Belüftung 20 l/min, kultiviert. Die Bakterienzellen, die durch Abzentrifugieren erhalten werden, werden 30 min bei 37°C und Rühren mit 1 1 einer Lösung gewaschen, die

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10 mMol T.ric-HCl-Puffer (pH 8,0), 2 mMol EDTA und 1% KCl enthält. Man gibt 200 mg Lysozymchlorid hinzu und rührt 30 min bei 37°C, Zu der durch Zentrifugieren bei 5000 U/min während 15 min erhaltenen, überstehenden Lösung gibt man 1 Aceton und trennt den unreinen Niederschlag ab. Aceton wird bis zu einer Konzentration von 65% zugegeben, dann wird der Niederschlag durch Abzentrifugieren während 15 min bei 5000 U/min abgetrennt. Der Niederschlag wird in 40 ml einer Lösung gelöst, die 10 mMol trie-HCl-Puffer (pH 8,0), 2 mMol EDTA und 1% KCl enthält. Der unlösliche Teil wird abzentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung gibt man 60 ml gesättigtes Ammoniumsulfat und rühr 15 min. Dann wird 15 min bei 12000 U/ min zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 15 ml einer Lösungsmittelmischung aus 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) und 2 mMol EDTA gelöst und mittels Durchleiten durch eine Sephadex G-25 Säule (Strömungsrate: 30 ml/h) entsalzt. Die entsalzte Lösung wird durch eine DEAE-Cellulose-Säule (2,0 x 7,0 cm, gepuffert auf pH 7,0) zur Adsorption des Enzyms geleitet. Es wird mit einer 0,2 bis 0,5 Mol KCl-Lösung gradientenartig eluiert. Das Eluat mit einer Konzentration von etwa 0,4 Mol KCl wird gesammelt (Strömungsrate: 1,4 ml/ min, je 6 ml-Fraktionen). Die aktive Fraktion (172 ml) wird durch eine Celluloseacetat-Membran während 7 h (Außenlösung: ein Gemisch aus 5 mMol Phosphatpuffer und 2 mMol EDTA) dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das so erhaltene Lyophilisat wird in einem Gemisch aus 10 mMol tris-HCl-Puffer (10 ml, pH 8,0), 2 mMol EDTA und 1% KCl gdöst und an Sephadex G-200-Säule (2,8 χ 9,5 cm, Strömungsrate: 0,18 ml/min, jeweils 6 ml-Fraktionen) chromatographiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 42 bis 48 werden gesammelt, gefriergetrocknet und erneut der Sephadex-Säulenchromatographie unterworfen.

Das so erhaltene, gefriergetrocknete Enzym zeigt bei der Elektrophorese eine einzige Proteinbande. Die Reinigungswerte sind die folgenden.

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	Gesamt einheit (E)	Gesamt protein (ms)	2716335
Reinigungsstufe	998	7680	Spezifische Aktivität (E/m*)
Rohextrakt	900	580	0,13
Acetonniederschlag	825	300	1,55
Ammoniumsulfatnieder schlag	420	115	2,75
DEAE-Cellulose	390	58,2	3,65
erstes Sephadex G-200	380	55,9	6,70
zweites Sephadex G-200			6,80
Beispiel 2

Quantitative Bestimmung von Cholin

0,5 ml eines Reaktionsgemisches aus Wasserstoffperoxid (0,01 bis 0,05/uMol), Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 22/uMol) , 4-Aminoantipyrin (150 /ul), Phenol (200 /Ug), Peroxydase (0,2 E) und Cholinoxydase (0,25 E) wird 25 min bei 37°C inkubiert. Dann gibt man 25 ml Äthanol hinzu und bestimmt die Absorption bei 480 nm zur Bestimmung einer Standardkurve für das Wasserstoffperoxid.

In dem obigen Reaktionsgemisch wird das Wasserstoffperoxid durch Cholinchlorid ersetzt und dann wird die Absorption nach dem gleichen Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Cholingehalts durch Vergleich mit der Standardkurve des Wasserstoffperoxids bestimmt.

Beispiel 3

Beispiel 2 wird wiederholt, wobei das Cholin durch Betainaldehyd ersetzt wird und die Reinheit des Betainaldehydreagens bestimmt wird.

B eisplel 4

Quantitative Bestimmung eines Phospholipids

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Reaktionsgemisch:

0,2 Mol T.ris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,15 ml

3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,50 ml

0,1% Phenol 0,30 ml

1% Triton X-100 0,30 ml

10 mMol CaCl₂ 0,30 ml

15 E/ml Cholinoxydase 0,10 ml

2 E/ml Peroxydase 0,10 ml 12 E/ml Phospholipase D 0,10 ml destilliertes Wasser 1,15 ml

insgesamt 3,00 ml

Durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigtes Eigelbiecithin oder im Handel erhältliches Serum werden mit dem Reaktionsgemisch 20 min bei 37⁰C inkubiert und dann werden bei 500 nm colorimetrische Messungen durchgeführt. Man erhält die in den Fig. 11 bzw. 12 dargestellten Ergebnisse (Fig. 11: Eigelbiecithin; Fig. 12: Handelsserum). Aus den Ergebnissen für das Lecithin in Fig. 11 wird das freigesetzte Cholin in Eigelbiecithin mit einer Standardkurve von Wasserstoffperoxid, wie zuvor erläutert, bestimmt, und somit kann die molare Menge an Eigelbiecithin durch die Menge an Cholin bestimmt werden. Nach dem gleichen Verfahren kann das Serum-Phospholipid quantitativ bestimmt werden. Die verwendete Phospholipase D wird durch Streptomyces chromofuscus A-0848 gebildet und die verwendete Menge liegt über 0,5 Einheiten, bevorzugt beträgt sie 1 bis 5 Einheiten.

Beispiel 5

Quantitative Bestimmung von Cholinesterase Reaktionsgemisch:

0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,05 ml

3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,05 ml 0,1% Phenol 0,10 ml

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2 E/ml Peroxydase 0,10 ml

20 E/ml Cholinoxydase 0,20 ml

50 mMol Benzoylcholin 0,02 ml

insgesamt 0,52 ml

Zu dem Reaktionsgemisch gibt man in 1Ofacher Verdünnung (physiologische Salzlösung) gesundes Menschenserum und inkubiert 30 min bei 37°C. Nach der Zugabe von 0,2 mMol (3,0 ml) Neostigminlösung (Inhibitor von Cholinesterase) wird das Gemisch 10 min bei Umgebungstemperatur stehengelassen und dann bei 500 mn colorimetrisch gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 dargestellt.

Die Serum-Cholinesterase-Aktivität kann durch die Menge an freigesetztem Cholin aus Benzoylcholin in einem Reaktionsgemisch bestimmt werden. Das freigesetzte Cholin wird durch das System aus Cholinoxydase, Peroxydase, 4-Aminoantipyrin und Phenol bestimmt.

Eine Cholinesterase-Aktivitätseinheit ist als die Aktivität definiert, die einer Enzymmenge entspricht, die in 1,0 ml Serum 2/uMol Wasserstoffperoxid/min bei 37°C freisetzt.

Aktivität (E/ml) = AA₅₀₀ZmIn χ 4,8.

Das Gemisch aus Cholinesterase und Benzoylcholin kann durch andere Gemische aus Cholinderivathydrolasen und Cholinderivaten ersetzt werden, und so wird ein quantitatives analytisches System für verschiedene Enzymaktivitäten und Cholinderivate geschaffen'.

Bezugsbeispiel

Herstellung von Phospholipase D

Ein Medium, das 2% Pepton, 2% Lactose, 0,196 NaCl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄.7H₂O und 0,5% Desform BC-51Y ent-

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hält, wird in einem 500 ml Erlenmeyerkolben (20 min bei 120°C sterilisiert) mit Streptomyces chromofuscus A-0848 FERM-P Nr. 3519 inokuliert und 3 Tage bei 26°C gezüchtet. Diese Impfkultur wird in 20 1 des gleichen Mediums in einen 20 1 Kolbenfermenter gegeben und aerob 2 Tage bei 26°C (300 U/min, 20 l/min) kultiviert. Das Kulturfiltrat zeigt eine Aktivität von 0,5 E/ml. 18 1 Kulturfiltrat werden bis auf 3 1 konzentriert und 2,4 1 Aceton werden zugegeben. Der Niederschlag wird abzentrifugiert. 2 1 Aceton werden zu der überstehenden Lösung gegeben und das ausgefallene Material wird gesammelt und anschließend in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Zu der Lösung gibt man 350 ml Aceton und trennt die ausgefallenen Verunreinigungen ab. 330 ml Aceton werden zu der überstehenden Lösung gegeben, der Niederschlag wird abgetrennt und in 200 ml reinem Wasser gelöst. Zu der Lösung gibt man erneut 200 ml gesättigtes Ammoniumsulfat. Nach dem Isolieren durch Zentrifugieren wird der Niederschlag in gereinigtem Wasser gelöst, durch Sephadex G-25 entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält rohes Pulver aus Phospholipase D (5 E/mg, 700 mg).

In den beigefügten Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 den optimalen pH-Wert von Cholinoxydase; Fig. 2 die optimale Temperatur für Cholinoxydase;

Fig. 3 die pH-Stabilität von Cholinoxydase;

Fig. 4 die Wärmestabilität von Cholinoxydase; Fig. 5 das elektrophoretische Muster von Cholinoxydase;

Fig. 6 Standardkurven für Cholin, Betaeinaldehyd und Wasserstoffperoxid;

Fig. 7 die pH-Stabilität von Phospholipase D; Fig. 8 den optimalen pH-Wert von Phospholipase D; Fig. 9 die Wärmestabilität von Phospholipase D;

Fig.10 das Dünnschichtchromatogramm der Phospholipase D-Wirkung auf Serum-Phospholipid;

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3ί

Fig. 11 das Ergebnis der quantitativen Analyse bei Eigelblecithin;

Fig. 12 das Ergebnis der quantitativen Analyse von Serum-Phospholipid; und

Fig. 13 das Ergebnis der quantitativen Analyse bei Menschenserum-Cholinesterase.

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Claims

Patentansprüche

1# Enzym-Cholinoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest die folgenden Eigenschaften besitzt:

(1) Substratspezifizität: eine spezifische Aktivität für eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH₃

CH,- N⁺ -

37 ^N - ^CH2 - ^R1

CH₃

worin R₁ eine -CHpOH- oder -CHO-Gruppe bedeutet,

(2) optimaler pH-Wert: pH 8 (Tris-HCl-Puffer),

(3) isoelektrischer Punkt: 4,6 (Elektrophorese unter Verwendung eines Ampholyten der Träger-Art),

(4) Molekulargewicht: 84 000 + 2100 (Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-150),

(5) Enzymwirkung: katalysiert die Reaktion (I) und/ oder (II)

^CH3_{N +} ^ ₊

CH₃-N -CH₂CH₂-OH + O₂ ► CH₃-N -CH₂CHO + H₂O₂ [I]

CH₃' CH₃'

^CH3_X + CH_{3x +}

CH₃-N -CH₂CHO + H₂O + O₂ »■ CH₃-N -CH₂COOH + H₂O₂ [II]

⁷ '

CH₃'
2. Cholinoxydase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optimale Temperatur etwa 40°C (Tris-HCl-Puffer) beträgt, der stabile pH-Wert bei etwa pH 8 (Tris-HCl-Puffer) liegt und die Wärmestabilität-etwa 40⁰C (Tris-HCl-Puffer) beträgt.
3· Verfahren zur Herstellung von Cholinoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Cholinoxydase erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus Arthrobacter gehört, kultiviert und die Cholinoxydase aus der kultivierten Masse isoliert.

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4. Verfahren nach Anspruch 31 dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium Cholin enthält.
5. Verfaren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Cholinoxydase erzeugende Mikroorganismus Arthrobacter globiformis B-0577 FERM-P Nr. 3518 ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der kultivierte Mikroorganismus, der zum Genus Arthrobacter gehört, einer Lysozymbehandlung zur Isolierung der Cholinoxydase aus der kultivierten Masse unterworfen wird.
7. Verfahren zur Bestimmung von Cholin oder Betainaldehyd, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Cholin oder Betainaldehyd enthaltende Probe mit Cholinoxydase behandelt und die freigesetzte Wasserstoffperoxydase, das Betain oder den verbrauchten Sauerstoff bestimmt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine flüssige, Cholin oder Betainaldehyd enthaltende Probe oder eine flüssige, ein Cholinderivat oder ein Betainaldehydderivat und ein Hydrolysereagens dafür enthaltende Probe verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholinderivat ein Phospholipid ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid Lecithin, Lysolecithin oder Sphingomyelin ist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysereagens Phospholipase D ist.

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12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipase D ein Enzym ist, das aus der Kultur von Streptomyces chromofuscus A-0848 erhalten wird.
13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholinderivat Benzoylcholin ist.
14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysereagens Cholinesterase ist.
15. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durchgeführt wird, indem man das Wasserstoffperoxid mißt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung des Wasserstoffperoxids unter Verwendung eines Systems durchgeführ t wird, das einen oder mehrere Farbstoffe enthält, die in Abhängigkeit von der Konzentration an Wasserstoffperoxid ihre Farbe ändern.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des Wasserstoffperoxids unter Verwendung von Peroxydase durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Peroxydase in einer Menge von 0,2 bis 0,5 Einheiten verwendet wird.
19· Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff in einer Menge verwendet wird, die, bezogen auf eine Menge von 1 Mol gebildetem Wasserstoffperoxid, einem zweifachen molaren Überschuß entspricht.
20. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das System 4-Aminoantipyrin, Phenol und Peroxydase ent-

^hält· 709845/0757
21. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholinoxydase in einer Menge von 1,5 bis 5 Einheiten verwendet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Phospholipid, Phospholipase D, Cholinoxydase,
4-Aminoantipyrin, Phenol und Peroxydase enthält.

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