DE2806674B2

DE2806674B2 - Immobilisierte Enzyme

Info

Publication number: DE2806674B2
Application number: DE2806674A
Authority: DE
Inventors: Masanori Fujimoto; Hideo Hirohara; Shigeyasu Nabeshima; Tsuneyuki Takatsuki Nagase
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1977-02-17
Filing date: 1978-02-16
Publication date: 1980-03-20
Also published as: FR2381059A1; CA1093991A; GB1568328A; US4247642A; DE2806674A1; NL7801736A; DE2806674C3; FR2381059B1

Description

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Pullulan mit einem Molekulargewicht von 1 χ IO⁴ bis 1 χ 10⁶ einsetzt. r,

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel I

Epichlorhydrin, Epibrom hydrin, ->»

Dichlorhydrin, Dibromhydrin,
Ethylenglykoldiglycidylether,
Triethylenglykoldiglycidylether,
Diglycidylether oder
1,6-Hexandioldiglycidylether ji

einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel II, 111 od-.riW „ι

2-Dimethylaminoethylchlon-j,
2-Diethylaminoethylclilorid,
2-Dimethylaminoisopropylchk.id,
2-Brom-5-diethylaminopentan, r>

2-Diphenylaminoethylchlorid,
3-(N,N-Dimethylphenylamino)-ethylchlorid,
3-Amino-1,2-epoxypropan,
3-Dimethylamino-l,2-epoxypropan,
3-Diethylamino-1,2-epoxypropan, w

3-Dibutylamino-1,2-epoxypropan.
3-Diphenylamine-1,2-epoxypropan,
3-(N,N-Dimethylphenylamino)-

1,2-epoxypropan,

N,N-(2,3-Epoxypropyl)-methylanilin,
2-Chlorethylamin,

ein Salz der vorstehend aufgeführten Verbindungen Chlorpropionsäure oder ein Salz dieser Carbonsäuren oder Chlormethansulfonsäure, Bromethansulfonsäure, Chlorethansulfonsäure oder ein Salz dieser Säuren einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile Pullulangel oder dar ionisierbare Pullulangel in Form von Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 bis 500 Mikron und mit einer Wasseraufnahme von 1 bis 50 g/g trockenes Gel einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym

Trypsin, Chymotrypsin, Lipase,
mikrobielle Protease, Esterase,
Cholinesterase, Urease, Bromelain,
Ribonuclease, Desoxyribonuclease,
Penicillinamidase, Aminoacylase,
/J-Galnctosidase, Glucoseisomerase,
Glucoseoxidase, Kreatinkinase,

Peroxidase, Papain, Jnvertase,
Pepsin,/3-Amylase, Isoamylase,
Maltase oder Uricase

verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung des Pullulans mit der Verbindung der allgemeinen Formel I in tinem Lösungsmittel und in Gegenwart von Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid oder Calciumhydroxid bei 10 bis 70⁰C durchgeführt worden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Wasser oder ein Gemisch von Wasser mit einem Alkohol oder Wasser mit Aceton verwendet worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile Pullulangel mit der Verbindung der allgemeinen Formel II, III oder IV in einem Lösungsmittel bei 5 bis 100°C umgesetzt worden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel

Wasser, Dimethylsulfoxid,
N.N-Dimethylformamid,
Ν,Ν-Dimethylacetamid, Benzol, Tcluol,
Chloroform oder Ethylacetat

verwendet worden ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel Wasser verwendet worden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Base ein Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid oder ein organisches Amin verwendet worden ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Base Natriumhydroxid verwendet worden ist.

Es ist bekannt, zur Herstellung immobilisierter Enzyme als Träger Cellulose-, Dextran- und Agarosege-Ie zu verwenden. An Cellulosegel immobilisierte Enzyme haben jedoch den Nachteil, daß bei fortgesetzter Verwendung das Cellulosegel allmählich in Lösung geht. Das immobilisierte Enzym ist also nicht über einen längeren Zeitraum haltbar. Ferner ist es schwierig, große Mengen Enzym pro Gewichtseinheit Cellulose zu immobilisieren. Vernetztes Dextran (Dextran-Gele) und Agarose-Gele können zwar verhältnismäßig große Mengen an Enzymen pro Gewichtseinheit immobilisieren, doch ist es schwierig, diese Träger mit dem gewünschten Polymerisationsgrad herzustellen. Aus diesem Grund sind Dextran- und Agarose-Gele sehr teuer, was ihren Einsatz in der Technik erschwert.

Aus der DE-OS 24 17 265 sind an Träger gebundene wasserunlösliche Enzymkomplexe bekannt, bei denen als Träger Naturschwamm benutzt wird. Da es sich bei diesem Träger um ein Naturprodukt handelt, ist es gemäß der DE-OS 24 17 265 nur schwer möglich, größere Mengen des Trägers mit den gleichen chemischen und physikalischen Eigenschaften zu erhalten. Auch kann bei der Verwendung eines aus einem Naturprodukt bestehenden Trägers dessen Molekulargewicht und Härte bzw. Wasseraufnahme nicht auf den jeweils gewünschten Wert eingestellt werden, wie dies bei synthetisch herstellbaren Trägern der Fall ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, immobilisierte Enzyme unter Verwendung spezieller Pullulan-Gele zu schaffen, bei denen die vorstehenden Nachteile vermieden werden und die sich durch eine hohe enzymatische Aktivität und Stabilität und annehmbaren Preis auszeichnen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung ist durch die Patentansprüche oefiniert.

Pullulan ist ein Polymeres von a-l,6-verknüpfter Maltotriose, einem Trimeren der Glucose. Ein hydrophiles Pullulan-Gel mit dreidimensional vernetzter Struktur wird durch Umsetzen von Pullulan mit einer difunktionellen Verbindung erhalten, die mit den Hydroxylgruppen in den Glucoseeinheiten unter Bildung von Etherbindungen reagiert. Ein ionisierbares Pijllulan-Gel wird durch Umsetzen des hydrophilen Pullulan-Gels mit einer Verbindung erhalten, die an einem Ende ihres Moleküls eine ionisierbare Gruppe und an ihrem anderen Ende eine funktioneile Gruppe aufweist, die mit den Hydroxylgruppen in den Glucoseeinheiten in Gegenwart einer Base Etherbindungen ausbildet.

Obwohl Pullulan aus Glucoseeinheiten aufgebaut ist, unterscheidet es sich grundlegend in seiner Struktur und in seinen Eigenschaften von den anderen bekannten Polysacchariden, wie Stärke oder Cellulose und deren Derivaten. Pullulan hat zahlreiche günstige Eigenschaften. Beispielsweise ist es in kaltem sowie in warmem Wasser leicht löslich, es bildet wäßrige Lösungen mit niedriger Viskosität, und es ist über lange Zeiträume stabil ohne zu gelieren oder zu altern im Vergleich zu wäßrigen Lösungen anderer Polysaccharide. Außerdem ist Pullulan ungiftig.

Die Verfahren zur Herstellung von hydrophilen Pullulan-Gelen und ionisierbaren Pullulan-Gelen werden nachstehend näher beschrieben.

Das hydrophile Pullulan-Gel ist in der DE-OS 26 27 125 beschrieben. Es wird durch Vernetzen von Pullulan mit einer difunktionellen Verbindung der allgemeinen Formel 1

X-Y—Z

hergestellt, in der X und Z Halogenatome oder Epoxygruppen darstellen uno Y einen gegebenenfalls durch Sauerstoffatome substituierten aliphatischen Rest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeutet. Das Molekulargewicht des eingesetzten Pullulans unterliegt keinen speziellen Beschränkungen, doch wird vorzugsweise ein Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewiciitvon 1 χ 10⁴ bis I χ 10⁶ verwendet.

Spezielle Beispiele für verwendbare difunktionelle Verbindungen der allgemeinen Formel I sind in Anspruch 4 aufgeführt.

Die Vernetzungsreaktion wird vorzugsweise in wäßriger Lösung oder einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem Alkohol oder Wasser und Aceton und in Gegenwart einer Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Calciumhydroxid, und gewöhnlich bei Temperaturen von 10 bis 70⁰C während 1 bis 24, vorzugsweise 2 bis 10 Stunden, durchgeführt. Unter sonst gleichen Bedingungen wird mit abnehmender Menge des Lösungsmittels und mit zunehmendem Molekulargewicht des eingesetzten Pullulans sowie mit zunehmender Menge an Verbindung der allgeme^:nen Formel I der Vet letzungsgrad größer, so daß härtere Kügelchen gebildet werden.

Die Härte der hydrophilen Kügelchen oder die Was^eraufnahme der K.ügelchen liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 g/g trockene Kügelchen. Kügelchen mit zu großer Wasseraufnahme sind mechanisch schwach, während bei sehr geringer Wasseraufnahme der Kügelchen das dreidimensionale Maschenwerk bzw. die Porengröße des vernetzter. Pullulans zu gering und außerdem die Zahl der zum Immobilisieren eines Enzyms verfügbaren Hydroxylgruppen sehr gering wird.

ίο Ein hydrophiles Gel in Kügelchenform ist als Träger zum Immobilisieren des Enzyms erwünscht. Ein derartiges Gel wird gewöhnlich durch Dispergieren einer wäßrigen, 20 bis 60 Gewichtsprozent Pullulan enthaltenden Lösung in einem flüssigen Medium hergestellt. Als flüssiges Dispergiermedium kommt beispielsweise η-Hexan, Heptan, Isuoctan, Benzol oder Toluol in Frage. Dieses flüssige Dispergiermedium ist mit üer wäßrigen Lösung nicht mischbar und es enthält einen Dispersionsstabilisator, wie Polyvinylacetat. Es

2(i bildet sich ein zweiphasiges Disp. rsionssystem, in der die wäßrige Lösung in Form von Tröpfchen vorliegt. Diese Dispersion wird unter Rühren mit eingestellter Geschwindigkeit mit der difunktionellen Verbindung der allgemeinen Formel I umgesetzt. Die Teilchengröße des erhaltenen Gels läßt sich empirisch vorherbestimmen. Da die Teilchengröße im allgemeinen eine bestimmte Verteilung aufweist, kann das Produkt gesiebt werden. Kugelförmige Perlen mit einem Durchmesser von 10 bis 500 Mikron sind als Träger zum

jn Immobilisieren von Enzymen bevorzugt.

Die Fixierung der Enzyme an das erfindungsgemäß eingesetzte hydrophile Pullulan-Gel erfolgt durch kovalente Verknüpfung der Hydroxylgruppen in den Glucoseeinheiten cder in einigen Fällen unter Verwen-

j-, dung einer difunktionellen Verbindung. Zur Herstellung immobilisierter Enzyme mit hoher enzymatischer Aktivität und guter Beibehaltung dir e: zymatischen Aktivität dienen vorzugsweise folgende Verfahren:

(1) Die Verknüpfung mittels eines Triazinylderivats unter Verwendung von Cyanurchlorid;

(2) die Verknüpfung über Azid-Bindungen;

(3) die Verknüpfung über Diazo-Bindungen;

(4) die Verknüpfung über ein Meiohalogenacetylderivat und

⁴' (5) die Verknüpfung durch Umsetzung mit einem Titan·. Zinn-, Zirkon-, Vanadium- oder Eisenchlorid.

Zur Herstellung von an ionisierbaren Pullulan-Gelen

immobilisierten Enzymen wird vorzugsweise ein Träger

in verwendet, der eine gewisse Härte aufweist, d. h. dessen Wasserwiederaufnahme 1 bis 50 g/g trockenes Gel beträgt, und dessen Kügelchen einen Durchmesser von 10 bis 500 Mikron aufweisen. Dieses ionisierbare Pullulangel w^;rd gemäß Anspruch 2 durch Umsetzen mit

-,-, einer Verbindung der allgemeinen Formel II, III oder IV hergestellt.

Das zur Herstellung des ionisierbaren Pullulan Gels eingesetzte hydrophile Pullulan-Gel ist hinsichtlich seiner Wasseraufnahme nicht besonders beschränkt. _hn Vorzugsweise wird ein hydrophiles Pullulan-Gel mit einer Wasseraufnahme von I bis 50 vorzugsweise 1 bis 30 g/g trockenes hydrophiles Gel verwendet. Vorzugs weise hat das hydrophile Pullulan-Gel die Form von Kügelchen m,' einem Durchmesser von ¹O bis 500 hi Mikron.

Spezielle Beispiele für Verbindungen der allgemeinen Formel II, III und IV, die mit dem hydrophilen Pullnlan-Gel in Gegenwart einer Base umgesetzt

werden können, sind in Anspruch 5 aufgeführt. Die Verbindungen der allgemeinen Formel II, III oder IV werden in mindestens stöchiometrischer Menge eingesetzt. Vorzugsweise werden '/so bis 10 Mol, insbesondere '/to bis 5 Mol dieser Verbindungen/Mol Glucosecin- , heil des Pullulans verwendet.

Beispiele für Basen, die bei der Umsetzung des hydrophilen Pullulan-Gels mit den Verbindungen der allgemeinen Formel II, III oder IV verwendet werden, sind Alkalimetallhydroxide, wie Natrium- und Kalium- n> hydroxid, [{^alkalimetallhydroxide, wie Calcium- und Magnesiumhydroxid, sowie in einigen Fällen organische Amine, wie Ethylendiamin. Dicthylcntriamin und Triethylamin. Besonders bevorzugt als Base ist Natriumhydroxid. Die Base wird im allgemeinen in der 0.1- bis ι. lOfachcn Menge, bezogen auf Mol eingesetzte Verbindung der allgemeinen Formel II. Ill oder IV, verwendet. Sofern während der Umsetzung eine llalogcnv asserstoffsäure freigesetzt wird, ist es erforderlich, die Base in ausreichender Menge zu verwenden, um den Ilalogen· ■" wasserstoff zu neutralisieren

Hinsichtlich der verwendbaren Lösungsmittel bestehen keine speziellen Beschränkungen, sofern sie die Umsetzung nicht ungünstig beeinflussen. Spezielle Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind : -

Wasser. Dimethvlsulfoxid.

N.N-Dimethylformamid. N.N-Dimcthy!acetamid.

Benzol. Toluol. Chloroform und F.thylacetat.

Das bevorzugte Lösungsmittel ist Wasser Die Rcak- :.■ tionsbedingungen unterliegen ebenfalls keinen speziellen Beschränkungen, im allgemeinen eignen sich Reaktionstemperaturen unterhalb 200 C. wobei in einigen Fällen bei Temperaturen oberhalb 100 C unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können. Deshalb wird eine Reaktionstemperatur von 5 bis 100 C bevorzugt.

Die Fixierung der Enzyme an das umisierbare Pullulan-Gel kann entweder nach ocr ionischen Bindungsmethode durch Adsorption oder durch kova- μ lente Verknüpfung erfolgen.

Bei der ionischen Bindungsmethode wird als Träger ein kationaktives oder anionaktives Pullulan-Gel verwendet, je nach dem isoelektrischen Punkt und dem pH-Optimum des zu immobilisierenden Enzyms. Bei- j-, spielsweise werden zur Immobilisierung von Enzymen mit einem isoelektrischen Punkt bei etwa 5 und einem pH-Optimum von etwa 7 kationenaktive Pullulan-Gele als Trager verwendet, beispielsweise Pullulan-Gele mit Diethylaminoethylgr..ppen. Während zur Immobilisie- -.,, rung ion Enzymen mit einem isoelek'.nschen Punkt um etwa 10. die im Neutralbereich ihr pH-Otimum haben, anionaktive Pullulan-Gele, wie carboxymethyliertes Pullulan-Gel als Träger verwendet werden.

In der ersten Stufe der Herstellung immobilisierter ^ Enzyme nach der ionischen Bindungsmethode wird also ein ionisierbares Pullulan-Gel in üblicher Weise, beispielsweise mit einer 0.02- bis 1 molaren Lösung von Salzsäure oder Natriumhydroxid behandelt, um die ionenaustauschenden Gruppen zu aktivieren, oder das <,,-, ionisierbare Pullulan-Gel wird auf das pH-Optimum des zu immobilisierenden Enzyms mittels einer Pufferlösung (0,02- bis 1 molar) eingestellt. In der nächsten Stufe wird das so behandelte ionisierte Pullulan-Gel eine ausreichende Zeit in eine das zu immobilisierende Enzym _b5 enthaltende Lösung gegeben, die gegebenenfalls gerührt wird. Danach wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und gewaschen. Vorzugsweise wird das Enzym bei Temperaturen von 0 bis 4O⁰C, insbesondere etwa 4° C. adsorbiert. Die bevorzugte Adsorptionszeit beträgt 1 bis 24 Stunden. Das auf diese Weise erhaltene immobilisierte Enzym enthält im allgemeinen höchstens etwa 100 mg Enzym/g trockenen Träger. Das immobilisierte Enzym zeigt eine hohe enzymatische Aktivität und ist stabil, sofern es nicht mit einer Salzlösung hoher lonenstärke gewaschen wird.

Bei der kovalenten Verknüpfung werden immobilisierte Enzyme mit hoher enzymaiischer Aktivität und guter enzymatischer Stabilität nach den üblichen Verfahren erhalten, die entweder die Reaktionsfähigkeit der im Pullulan-Gcl vorhandenen Hydroxylgruppen oder einer später in das Molekül eingebauten ionisierbaren Gruppe, beispielsweise einer primären oder sekundären Aminogruppe oder einer Carboxylgruppe, ausnützen. Diese Verfahren haben sich bereit·, zur Herstellung ionisierter Cellulose oder Dextran-Gele bewährt. Besonders günstige Methoden, die die Reaktionsfähigkeit der ursprünglich im Pulliilan-Gel vorhandenen Hydroxylgruppen oder einer später in das (jel eingeführten ionisierbaren Gruppe, beispielsweise einer prim.iren oder sekundären Aminogruppe oder einer Carl> ixylgruppc. ausnutzen, sind folgende Methoden:

(1) Die Vr xnüpfung über ein Triazinylderiva; mittels Cyanurchlorid:

(2) die Verknüpfung über eine Azid-Bindung:

(3) die Verknüpfung über eine Diazo-^indung:

(4) die Verknüpfung über ein Monchalogenacetyklerivat:

(5) die Verknüpfung über ein Carbodiimid und

(6) die Verknüpfung mit einem Träger unter Verwendung von Glutardialdehyd. Die kovalente Verknüpfung ist zwar schwieriger durchführbar, doch liefert sie stabilere immobilisierte Enzyme als die ionische Bindungsmethode.

Spezielle Beispiele für Enz\me. die erfindungsgemäß immobilisiert werden können, sind in Anspruch 7 aufgeführt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Teile und Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Eine Lösung von 40 Teilen Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 72 000 in 80 Teilen Wasser wird mit 12.5 g Natriumhydroxid versetzt. Dip erhaltene Lösung wird in ein Dispergiermedium aus IU Teilen Polyvinylacetat. 160 Teilen Toluol und 1,2 Teilen Sorbitanmonostearat gegeben. Das Gemisch wird bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 800 U/min gerührt, um die wäßrige Lösung zu feinen Tröpfchen zu zerteilen. 1 Stunde nach Beginn der Zugabe der wäßrigen Lösung zum Dispergiermedium werden 29 Teile Epichlorhydrin eingetragen, und das Gemisch wird 5 Stunden bei 50^cC umgesetzt. Sodann wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit Toluol und sodann mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wird ein hydrophiles Pullulan-Gel in Kügelchenform mit einer Wasseraufnahme von 2,35 g/g erhalten.

100 Teile des erhaltenen hydrophilen Pullulan-Gels werden in 480 Teilen einer wäßrigen Lösung dispergiert, die 110 Teile Natriumhydroxid enthält. Die erhaltene Dispersion wird unter Rühren bei Raumtemperatur (etwa 20^cC) tropfenweise innerhalb 4 Stunden mit einer

Lösung von 240 Teilen 2-Diethylaminoethylchlorid-hydrochlorid in 220 Teilen Wasser versetzt. Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch noch weitere 14 Stunden umgesetzt. Das entstandene Reaktionsprodukt wird abfiltriert und mit Wasser und Methanol gewaschen. Es wird ein Diethylaminoethyl-Pullulan-Gel (O':AE-Pullulan-Gel) in Kügelchenform erhalten. Die Kügelchen haben in trockenem Zustand einen Durchmesser von 37 bis 149 Mikron und eine Wasseraufnahme von 2,8 g/g. Der Amingehalt beträgt 2,7 mÄq/g gemessen durch Leitfähigkeitstitration.

Mit dem erhaltenen DEAE-Pullulan-Gel wird technische Pronasc F. nach der ionischen Bindungsmethode folgendermaßen immobilisiert.

I g trockenes DEAE-Pullulan-Gel wird zunächst mit 0.1 normaler Natronlauge behandelt und sodann zur Abtrennung von überschüssigem Natriumhydroxid granalien mit Wasser gewaschen. !>as erhaltene aktivierte DEAE-Pullulan-Gel wird in 20 ml eines 0,02molaren Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,0 eingetragen, der 50 mg technische Pronase E gelöst enthält. Die Adsorption des Enzyms wird bei 4¹C während 5 Stunden unter gelindem Rühren durchgeführt. Sodann wird das DEAE-Pullulan-Gel auf einer Glasfilternutsche abfiltriert und gründlich mit 0,02molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt und aufbewahrt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nni ergibt, daß 39 mg Pronase E am Träger a'..orbiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei 30°C und einem pH-Wert von 7,0 mittels eines pH-stat-Geräts bestimmt. Es wird N-Benzoyl-L-argininethylester (BAEE) als Substrat verwendet. Unter den Bedingungen des Vorliegens von überschüssigem Substrat gegenüber dem Enzym beträgt die spezifische Aktivität 3.2 mMol/mg· min. Dieser Wert entspricht 35% der enzymatischen Aktivität in der Lösung vor der Immobilisierung. Die enzymatische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird 5mal unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben gemessen. Beim 5. Versuch beträgt die enzymatische Aktivität noch etwa 73% der enzymatischen Aktivität des ersten Versuchs.

Beispiel 2

70 mg Pronase E werden in 25 ml einer 4°C kalten 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 1,0 g (Trockengewicht) des gemäß Beispiel 1 hergestellten DEAE-PuIIulan-Gels versetzt. Zur Adsorption des Enzyms wird das Gemisch bei etwa 4'C langsam gerührt. Sodann wird die immobilisierte Pronase E nacheinander mit 0,05molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5, einer 0,1 molaren Kochsalzlösung und vollentsalztem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 49 mg Pronase E am Träger adsorbiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei 40⁰C und einem pH-Wert von 6,0 mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von DL-Lysinmethylester als Substrat bestimmt Sie beträgt 37% der Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 3

100 mg technisches Papain werden in 30 ml einer 0,02molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 bei 4°C gelöst.

Gemäß Beispiel I wird ein hydrophiles Pullulan-Gel in Kügelchenform mit einer Wasseraufnahme von 2,5 g/g unter Verwendung der gleichen Ausgangsverbindungen und unter den gleichen Reaktionsbedingungen hergestellt, jedoch werden 24,5Teile Epichlorhydrin eingesetzt. Eine Lösung von 30 Teilen des hydrophilen Pullulan-Gels, 30 Teilen Monochloressigsäure und 20 Teilen Wasser wird in 200 Teilen Methanol 6 Stunden bei 10°C gerührt. Es wird ein Carboxymethylpullulan-Gel (CM-Pullulan-Gel) in Kügelcheniorm erhalten. In trockenem Zustand haben die Kügelchen einen Durchmesser von 74 bis 149 Mikron und eine Wasseraufnahme von 2,9 g/g. Der Carboxylgruppengehalt beträgt 3.1 mÄq/g. gemessen durch Leitfähigkeitstitration.

Die vorstehend beschriebene Papainlösung wird mit

I IIIIUIUII W\li •^IHl/l UIIU

ΛίΛΛ \_J K. I I I ΙΛ1. I I

wird zur Adsorption des Enzyms bei t C langsam .'Ii gerührt. Sodann wird das immobilisierte Enzym gemäß Beispiel 2 gewaschen. Filtrat und Waschlöungen werden vereinigt. Die Menge des Proteins wird nach der Methode von Lowry bestimmt. Die Menge des immobilisierten Enzyms beträgt 30.1 mg. Die spezifische r, Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei 40⁰C und einem pH-Wert von 6,2 mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von BAEE als Substrat bestimmt. Sie beträgt 1,70 μΜοΙ/mg· min. Dies entspricht 23% der enzymatischen Aktivität in der Lösung vor der in Immobilisierung. Bei der Messung der spezifischen Aktivität des immobilisierten Enzyms und des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung liegen 2x10' Mol Ethylendiamintetraessigsäure,

5x10 ' Mol Cystein und 0,15 Mol Natriumchlorid vor.

Beispiel 4

50 mg technisches gereinigtes Trypsin werden in 30 ml einer 0,02molaren Tris-Salzsäure-Pufferlösung (enthaltend Calciumchlorid in einer Konzentration von

id 0,02molar) bei 4°C gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 1,0 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten CM-PuIIulan-Gels versetzt, und das Gemisch wird 3 Stunden bei etwa 4⁰C langsam gerührt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität des Proteins in der wiedergewonne-

r> nen Lösung ergibt, daß 22 mg Trypsin immobilisiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts bei 30⁰C und einem pH-Wert von 7,5 in Gegenwart von Calciumchlorid in einer Konzentration von 0,02molar gemessen. Sie

->i> beträgt 5,5 μΜοΙ/mg-min. Dies entspricht 21% der enzymatischen Aktivität in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 5

Glucoseisomerase mit einer Aktivität von 7500 Einheiten und einem Proteingehalt von 84 mg (bestimmt nach Lowry) wird in 25 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5 gelöst Das Glucoseisomerase-Präparat ist durch Vermählen lebender Zellen

W) von Streptomyces phaeochromogenes. Zentrifugieren in der Kälte und Reinigen des Überstandes durch Acetonfällung hergestellt worden.

Ein DEAE-Pullulan-Gel in Kügelchenform mit einem Durchmesser in trockenem Zustand von 39 bis 149

b5 Mikron, einer Wasseraufnahme von 3,0 g/g und einem Diethylaminoethylgruppengehalt von 2,5 mÄq/g, gemessen durch Leitfähigkeitstitration, wird folgendermaßen hergestellt: 32 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten

hydrophilen Pullulan-Gels werden in einer Lösung von 35 Teilen Natriumhydroxid in 150 Teilen Wasser eingeweicht und dispergiert. Sodann wird die erhaltene Dispersion tropfenweise mit einer Lösung von 68 Teilen 2-Diethylaminoethyl(-hlorid-hydrochlorid in 40 Teilen Wasser versetzt. Die Umsetzung wird 18 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt.

3,0 g des auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen DEAE-Pullulan-Gels v/erden in die vorstehend beschriebene F.nzymlösung eingetragen, und das Gemisch wird 10 Stunden bei 60 U/min und bei einer Temperatur von etwa 15°C geschüttelt. Nach beendeter Adsorption wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und gründlich mit einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Aufgrund der Messung der enzymatischen Aktivität und des Proteingehalts des Filtrats sind 71 mg des Proteins am Träger gcijuniicM. Die eii/.yuiaii&ciiu Akiiviiäi der immobilisierten Glucoseisomerase beträgt 6980 Einheiten.

Die erhaltene immobilisierte Gliicoseisomerase wird in eine ummantelte Kolonne mit einem Innendurchmesser von 1,0 mm gefüllt. Bei einer Temperatur im Mantel von 60"C wird vom Kopf der Kolonne eine 54gewichtsprozentige wäßrige Lösung von kristalliner Glucose, die Magnesiumionen in einer Konzentration von 5x10 'molar enthält, und die auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt ist. mittels einer Pumpe durch die Kolonne geleitet. Die Strömungsgeschwindigkeit (Raumgeschwindigkeit) wird auf 2 Std.~ ' eingestellt. Die Kolonne wird ununterbrochen betrieben. Die Umwandlung in Fructose beträgt innerhalb der ersten 350 Stunden konstant 51.5%, und danach nimmt sie langsam ab. Die Halbwertszeit beträgt etwa 50 Tage.

Anm. I

Eine Einheit Glucoseisomerase ist die Menge Enzym, die 1 mg/Std. Fructose bildet, wenn die Isomerisierung mit 0,1 molarer D-Glucose als Substrat in Gegenwart von 0,05molarem Phosphatpuffer und 0,005molarem Phosphatpuffer und 0,005molarem MgSO₄ · 7 H₂O bei 70⁰C und einem pH-Wert von 7,0 während 1 Stunde durchgeführt wird.

Anm. 2

Die quantitative Bestimmung der Fructose wird nach der Cystein-Carbazol-Schwefelsäuremethode gemäß der JAS-Prüfnorm durchgeführt.

In den nachstehenden Beispielen wird die Aktivität der Glucoseisomerase und die Menge an entstandener Fructose in gleicher Weise bestimmt, wie dies vorstehend beschrieben ist.

Beispiel 6

Glucoseisomerase mit einer Aktivität von 7600 Einheiten und einem Proteingehalt von 70 mg, die gemäß Beispiel 5 gereinigt worden ist, wird in 25 ml einer 0,05mo!aren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,65 gelöst.

10 Teile des gemäß Beispiel 3 hergestellten hydrophilen Pullulan-Gels werden in 100 Teile einer wäßrig alkalischen Lesung von /J.y-Epoxypropyltrimethylammoniumchlorid eingetragen, das durch Epoxidation von 30 Teilen y-Chlor-^-hydroxypropyltrimethylammoniumchlorid mit 6 Teilen Natriumhydroxid hergestellt worden ist Es wird ein 0-HydroxypropyltrimethyI-aminopulIulan-Gel in Kügelchenform erhalten. Der Teilchendurchmesser beträgt in trockenem Zustand 39 bis 149 Mikron. Die Wasseraufnahme beträgt 2,8 g/g. und das Gel enthält 0,57 mÄq/g /3-Hydroxypropyltrimethylaminogruppen (/Ϊ-ΗΡΤΜΑ), bestimmt durch Leitfähigkeitstitration.
3,0 g des erhaltenen jS-HPTMA-Pullulan-Gels werden

> in die vorstehend beschriebene Enzymlösung eingetragen. Das Gemisch wird 10 Stunden bei 15 bis 20⁰C und 80 U/min geschüttelt. Nach beendeter Adsorption wird das immobilisierte Enzym gemäß Beispiel 5 gewaschen. Aufgrund der Bestimmung der enzymatischen Aktivität

in in der Waschlösung sind 65 mg Protein am Träger adsorbiert. Die enzymatische Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 7110 Einheiten.

Die erhaltene immobilisierte Glucoseisomerase wird in eine ummantelte Kolonne mit einem Innendurchmes-

ii ser von 1,5 mm gefüllt. Bei einer Manteltemperatur von 65°C wird vom Kopf der Kolonne eine 54gewichtsp,ozentigc wäßrige Lösung von kristalliner Glucose (enthaltend 5 χ iö · fvioi MgSO₄ · 7 H2O und eingestellt auf einen pH-Wert von 7,65) mittels einer Pumpe bei

j" einer Raumgeschwindigkeit von 2 Std. ' hindurchgeleitet. Die Umwandlung in Fructose beträgt über einen Zeitraum von 350 Std. konstant 53,5%.

Beispiel 7

.>> 100 mg /J-Galactosidase — gewonnen als extracelluläres Enzym aus Aspergillus oryzae und gereinigt durch Alkoholumfällung — werden in 25 ml einer 0,02molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 5,5 gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 1,0 g des gemäß Beispiel 5 hergestellten DEAE-Pullulan-Gels versetzt. Das Gemisch wird 10 Stunden bei 4°C und 60 U/min geschüttelt. Nach beendeter Adsorption wird das immobilisierte Enzym mit einer 0,02molaren Citrat-Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 5,5 und vollent-

n salztem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist. Die Messung der UV-Adsorptionsintensität des Proteins in der Waschlösung ergibt, daß 40 mg Enzym am Träger adsorbiert sind. Die Bestimmung des Proteins nach der Methode von Lowry ergibt einen

in Wert von 43 mg adsorbiertes Enzym. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird bei 30⁰C und einem pH-Wert von 4,5 an 5gewichtsprozentiger Lactoselösung als Substrat gemessen. Sie beträgt 1,70 μΜοΙ/mg · min. Die Aktivität wird durch colorimetrische Bestimmung der entstandenen Menge an Glucose gemessen, die bei der Umsetzung mit einem Reagens aus Glucoseoxidase, Peroxidase und Farbstoff gebildet wird.

_₍₎ Beispiele

2 g gemäß Beispiel 1 hergestelltes DEAE-PuIIulan-Gel werden in 25 ml In Natronlauge eingetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 20° C) gerührt. Nach dem Abfiltrieren der überschüssigen Natronlauge wird das erhaltene DEAE-Pullulan-Gel 5 Minuten bei Raumtemperatur in 25 ml Dioxan eingetragen. Sodann wird das Gel mit 20 ml einer Dioxanlösung versetzt, die 4 g Cyanursäurechlorid enthält. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt Nach 1

bo Minute wird das Gemisch mit 25 ml Eiswasser und hierauf mit 25 ml Essigsäure versetzt, um die Reaktion abzubrechen. Danach wird die Lösung abfiltriert und das erhaltene s-Triazinyl-DEAE-PuIlulan-Gel rasch mit kaltem Aceton und eiskaltem Wasser gewaschen und unmittelbar darauf zur Immobilisierung verwendet, die folgendermaßen durchgeführt wird.

Das erhaltene s-Triazinyl-DEAE-Pullulan-Gel wird in eine Lösung eingetragen, die 170 mg Pronase E in 20 ml

einer Phosphatpufferlösung enthält. Die Lösung wird auf 4^CC und einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, und das Gemisch wird 5 Stunden gerührt. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 0,2 normaler Natronlauge auf 8,0 eingestellt, und die Temperatur soll 4°C nicht übersteigen. Nach 5stündiger Umsetzung wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mit 5molarer Kochsalzlösung, 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 und kaltem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist. Das Piltrat und die Waschlösungen werden vereinigt. Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 66 mg Pronjse ^c. am trockenen Träger immobilisiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts an einer 20gewichtsprozentigen Lösung von DL-Lysinmethylester als Substrat bei 30°C und einem pH-Wert von 6.0 bestimmt. Sie beträgt 2,'W μΜοΙ/mg ■ min. Dies entspricht 60% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vor dem Immobilisieren.

Beispiel 9

1,0 g gemäß Beispiel I hergestelltes DEAE-PuIIulan-Gel werden in 35 ml Wasser eingetragen. Sodann wird das Gemisch bei 4 C unter Rühren mit 1.0 g Bromcyan versetzt. Hierauf wird 5 normale Natronlauge eingetropft, um den pH-Wert auf 11,0 einzustellen. Sobald keine weitere Abnjhme des pH-Wertes mehr erfolgt, wird das Gel abfiltriert und rasch mit einer 0.1 molaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8.0 gewaschen. Das erhaltene, mit Bromcyan aktivierte DEAE-Pullulan-Gel wird in 10 ml einer O.lmolaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen, die 80 mg Pronase E enthält. Das Gemisch wird 2 Stunden unter gelindem Schütteln gerührt. Zur Desaktivierung nicht umgesetzter aktiver Gruppen wird die erhaltene immobilisierte Pronase mit dem lOfachen ihres Volumens Wasser gewaschen und sodann in eine l.Omolare Ethanolaminlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur (etwa 2O⁰C) wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mehrmals mit einer 0,1 molaren Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,0, die I Mol/Liter Natriumchlorid enthält, einer O.lmolaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8.0. die 1 Mol/Liter Natriumchlorid enthält, sowie kaltem Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt. Die Messung der bV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 31mg Pronase E/g trockenes Gel immobilisiert sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts mit DL-Lysinmethylester als Substrat bei 40°C und einem pH-Wert von 6,0 und einer Substratkonzentration von 20 Gewichtsprozent bestimmt. Sie beträgt 3,12 μΜοΙ/mg - min. Dies entspricht 52% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vorder Immobilisierung.

Beispiel 10

Unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 8 werden 2,0 g des gemäß Beispiel 6 hergestellten j3-HPTMA-Puliulan-Gels mit Cyanurchlorid umgesetzt und gewaschen. Es wird ein s-Triazinyl-^-HPTMA-Pullulan-Gel erhalten. Dieses Gel wird in 25 ml einer 0.05mo!aren Phosphatpufferlösung eingetragen, die 60 mg einer Glucoseisomerase (110 Einheiten/mg) aus Streptomyces phaeochromogenes enthält. Die Immobilisierung und das Waschen erfolgt gemäß Beispiel 8. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird foig:-dermaßen bestimmt: Das Gel wird in 50 ml einer 0,05molaren Phosphatpufferlösung vom pH Wert 7,65 und mit einem Magnesiumionengehalt von 0,005 Mol/Liter, die 0,1 Mol/Liter Glucose uitiiält, 1 Stunde bei 70⁰C geschüttelt. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 6270 Einheiten. Das immobilisierte Enzym wird in eine ummantelte Kolonne mit eimern Durchmesser von 12 mm gefüllt. Durch den Mantel wird 60°C warmes Wasser geleitet. Durch die Kolonne wird 54gewichtsprozentige (3 Mol/Liter) Glucoselösung vom pH-Wert 7,5. die 0,005 Mol/Liter Magnesium« >ncn enthält, in einer Raumgeschwindigkeit von 3.0 Std. ^! geleitet. Der Fructosegehalt der abfließenden Lösung wird nach der Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Die Umwandlung von Glucose in Fructose beträgt 52%.

2 g gemäß Beispiel 3 hergestelltes CM-Piillulan-Gel -'Ii werden in 40 ml Methanol eingetragen und durch Einleiten von gasförmigem Chlorwasserstoff in den Methylester überführt. Der Methylestur wiro mit Hydrazin-hydrat zum Hydrazid umgesetzt, das mittels 3prozentiger Natriumnitritlösung in das Azid überführt _>■> wird. Das erhaltene Azid wird sofort in 25 ml einer Phosphatpufferlösung eingetragen, die 1000 Sumner-Einheiten technischer Urease enthält, und 12 Stunden bei 4⁰C gelinde geschüttelt. Nach beendeter Umsetzung wird das immobilisierte Enzym mit 5molarer Kochsalz- !Ii lösung. 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6.7 und destilliertem Wasser gewaschen. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird colorimetrisch nach D. D. Van Slyke u. Mitarb.. ]. Biol. Chcm.. Bd. 154 (1944). S. 623. bestimmt. Sie beträgt 500 Sumner-Einheiten.

Beispiel 12

2.0 g gemäß Beispiel 5 hergestelltes DEAE-PuIIulan-Gel werden gemä- Beispiel 8 mit Cyanursäurechlorid umgesetzt und gewaschen. Es wird ein ⁱ. Tria/.inyl-.1Ii DEAE-Pullulan-Gel erhalten.

Gemäß Beispiel 8 werden 400 mg der in Beispiel 7 verwendeten /J-Galactosidase aus Asper.^;llus oryzae zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms \erwendet. Es werden 120 mg Enzym/g trockenen Träger 4') gebunden. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 2.2 μΜοΙ/mg ■ min. gemessen bei 30 C und einem pH-Wert von 4.5 mit Sprozentiger Lactoselösung als Substrat.

-_n B e i s ρ i e I 13

Aus Pullulan mit einem Durchsehnittsmolekulargewicht von 100 000 wird durch Vernetzung mit Epichlorhydrin ein hydrophiles Pullulangel in Kügelchenform hergestellt, dessen Teilchengröße in trockenem Zustand 37 bis 74 Mikron und dessen Wasseraufnahme 3,5 g/g beträgt. 2 g des hydrophilen Pullulangels werden in 25 ml 1 η Natronlauge eingetragen und 15 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 2O⁰C) gerührt. Nach dem Abfiltrieren der überschüssigen Natronlauge

bo wird das so behandelte hydrophile Pullulangel in 35 ml Dioxan eingetragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Hierauf werden 20 ml einer Dioxanlösung zugegeben, die 4 g Cyanursäurechlorid enthalten, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur kräftig gerührt.

b5 Nach 1 Minute wird das Reaktionsgemisch mit 25 ml Eiswasser und sodann rasch mit 25 ml Essigsäure versetzt, um die Reaktion abzubrechen. Nach dem Abfiltrieren des Lösungsmittels wird das erhaltene

hydrophile s-Triazinyl-PuUuIan-Gel rasch mit kaltem Aceton und Eiswasser gewaschen und unmittelbar danach zur Immobilisierung eines Enzyms eingesetzt Die Immobilisierung wird folgendermaßen durchgeführt:

Das Gel wird in eine Lösung von 165 mg Pronase E in 20 ml einer 4" C kalten Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen und 5 Stunden gerührt. Der pH-Wert wird mit 0,2 η Natronlauge auf 8,0 eingestellt Die Temperatur soll 4° C nicht übersteigen. Nach 5stündiger Umsetzung wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mit 5molarer Kochsalzlösung, 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 und kaltem Wasser gewaschen, bis die Waschlösung proteinfrei ist Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 76 mg Pronase E/g trockenes Gel gebunden sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von DL-Lvsinmeihyiesier als Substrat bei 30⁰C, einen pH-Wert von 6,0 und einer Substratkonzentration von 10 Gewichtsprozent beträgt 233 μΜοΙ/mg - min. Dies entspricht 52% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Beispiel 14

Gemäß Beispiel 13 wird ein hydrophiles Pullulangel in Kügelchenform mit einer Teilchengröße von 37 bis 74 Mikron in trockenem Zustand und einer Wasseraufnahme von 2.7 g/g aus Pullulan mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 100 000 durch Vernetzung mit Epichlorhydrin hergestellt. 2 g des erhaltenen hydrophilen Pullulan-Gels werden mit Cvanursäurechlorid umgesetzt und gewaschen. Es wird ein hydrophiles s-Triczinyl-Pullulan-Gel erhalten. Dieses Gel wird in 25 ml einer 0,05molaren Phosphaipufferlösung eingetragen, die 60 mg Glucoseisomerasc (110 Einheiten/mg) aus Streptomyces phaeochromogenes enthält. Die Immobilisierung und das Waschen wird gemäß Beispiel 13 durchgeführt. Zur Bestimmung der Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms wird das Gel in 50 ml einer 0.05molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,5, die 0,005molar Magnesiumionen enthält, die 0.1 Mol Glucose enthält. I Stunde bei /0°C geschüttelt. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms beträgt 4950 Einheiten. Ein Anteil des i:i,mobilisierten Enzyms entsprechend 3500 Einheiten wird in eine ummantelte Kolonne mit einem Durchmesser von 8 mm gefüllt. Durch den Mantel wird 70"C warmes Wasser geleitet. Durch die Kolonne wird in einer Raumgeschwindigkeit von 3.5 Std. ' eine 3molarc Glucoselösung vom pH-Wert 7,5, die 0,005 Mol Magnesiumionen enthält, hindurchgf leitet. Die Fructose in der abfließenden Lösung wird nach der Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Die Umwandlung von Glucose in Fructose beträgt 52%.

Beispiel 15

Durch Umsetzung von Pullulan mit einem Durch· Schnittsmolekulargewicht von 60 000 mit Epichlorhydrin wird ein hydrophiles Gel mit einer Teilchengröße von 74 bis 125 Mikron in trockenem Zustand und einer Wasseraufnahme von 5,6 g/g hergestellt. 2 g des erhaltenen hydrophilen Pullulan-Gels werden in 2 η Natronlauge eingetragen und sodann mit Monochloressig säure in einem Gemisch von Wasser und Methanol carboxymethyliert. Das carboxymelhyliertc hydrophile Pullulangel wird hierauf mit Methanol unter Verwendung von Chlorwasserstoffgas in den Methylester überführt. Der Methylester wird sodann mit Hydrazinhydrat zum Hydrazid und hierauf mit 3prozentiger

ϊ Natriumnitritlösung zum Azid umgesetzt Das erhaltene Azid wird sofort in 25 ml einer Phosphatpufferlösung eingetragen, die 1000 Sumner-Einheiten einer technischen Urease enthält, und 12 Stunden bei 4° C gelinde geschüttelt Nach beendeter Umsetzung wird das

in erhaltene immobilisierte Enzym mit 5molarer Kochsalzlösung. 0,1 molarer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,7 und destilliertem Wasser gewaschen. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms wird colorimetrisch nach der Methode von Van Slyke bestimmt. Sie beträgt 480

π Sumner-Einheiten.

Beispiel 16 2 g des in Beispiel 14 eingesetzten hydrophilen

incffi Jw ■ uiiüian-vjCiS WCTviCH in *.v ΓΠι CiHC" usiGXauiGSüng eingetragen, die 25 g Bromessigsäure enthält. Das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gelinde geschüttelt. Sodann wird das Gemisch langsam und tropfenweise mit 17 ml Bromacetylbromid versetzt.

j-, Nach beendeter Zugabe wird das Gemisch weitere 6 Stunden gerührt Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsprodukt mit eiskalter. 0.1 molarer Natriumcarbonatlösung und Eiswasser gewaschen. Es wird ein bromacetyliertes hydrophiles Pullulangel erhalten. Das

«ι erhaltne Gel wird in eine 0.2molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8.5 eingetragen, die 100 mg A.ninoacylase (10 000 Einheiten/g) enthält und 18 Stunden bei 5* C gelinde gerührt. Das erhaltene immobilisierte Enzym wird mehrmals mit Phosphatpuf-

i-, ferlösung vom pH-Wert 7.0 gewaschen und sodann auf seine Aktivität untersucht. Es wird die Menge an L-Methionin bestimmt, wenn das immobilisierte Enzym bei 37³C mit einer 0.2molaren Lösung (pH-Wert 7.0; enthaltend 0.5χ 10 ■' M CoC!:) von N-Acelyl-DL-me-

4(i thionin als Substrat behandelt wird. Die Aktivität beträgt 370 Einheilen und das Ausmaß der Immobilisierung 37%. Die Aktivitätsmessung wird lOmal wiederholt. Beim 10. Versuch beträgt die Aktivität immer noch 92% der Anfangsaktivität.

Beispiel 17

1.0 g des in Beispiel 15 eingesetzten hydrophilen Pullulan-Gels werden in 10 ml einer I5gewichttprozen-

,(i tigen Titantetrachloridlösung eingetragen. Das Gemisch wird 5 Minuten kräftig gerührt. Danach wird das Gel abfiltriert und gründlich mit Wasser sowie einer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5.0 gewsschen. Das erhaltene hydrophile Gel mit Titanchloridgruppen wird

·,·, in eine 0.1 molare Succinatpufferlösung vom pH-Wen 5.0 eingetragen, die 100 mg Invertase enthält. Das Gemisch wird 18 Stunden bei 4⁰C gerührt. Das erhaltene immobilisierte Enzym wird mit 0.5molarer Kochsalzlösung und 0,1 molarer Succinatpufferlösung

mi gründlich gewaschen. Die Aktivität des erhaltenen immobilisierten Enzyms beträgt 720 Einheiten, gemessen bei 55"C mit einer Iprczentigen Sucroselösung in 0,1 molarer Succinatpufferlösung.

Anm.

Eine Einheit der Inveriaseaktivität entspricht der Menge an Enzym, die I μΜοΙΰΙυοοίβ/πιίη bei 55'C und einen pH-Wert von 5,0 freisetzt.

030 112/401

Beispiel 18

1,0 g gemäß Beispiel 15 eingesetztes hydrophiles Pullulan-Gel werden in 40 ml Wasser eingetragen. Nach Zusatz von 1,0 g Bromcyan wird das Gemisch unter Kühlung bei 4° C gerührt Der pH-Wert wird durch tropfenweise Zugabe von 5 η Natronlauge auf 11,0 eingestellt Unmittelbar nachdem der pH-Wert nicht weiter abnimmt, wird das Gel abfiltriert und rasch mit 0,1 molarer Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 gewaschen. Das so erhaltene hydrophile, mit Bromcyan aktivierte Gel wird in 10 ml einer 0,1 molaren Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen, die 80 mg Pronase E enthält Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gelinde geschüttelt Zur Desaktivierung der nicht umgesetzten aktiven Gruppen wird das erhaltene inunobilisierte Enzym mit dem lOfachen Volumen Wasser gewaschen und hierauf in eine

!,Omolare Ethanolaminlösung vom pH-Wert 8,0 eingetragen. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird das immobilisierte Enzym abfiltriert und mehrmals mit 0,1 molarer Acetatpufferlösung vom pH-Wert 4,0, die 1 molar Natriumchlorid ist, 0,1 molarer Boratpufferlösung vom pH-Wert 8,0, die 1 molar Natriumchlorid ist sowie kaltem Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt Die Messung der UV-Absorptionsintensität bei 280 nm ergibt, daß 33 mg Pronase E/g trockenes Gel gebunden sind. Die spezifische Aktivität des immobilisierten Enzyms wird mittels eines pH-stat-Geräts unter Verwendung von DL-Lysinmethylester als Substrat bei 40⁰C, einem pH-Wert von 6,0 und einer Substratkonzentration von 10 Gewichtsprozent gemessen. Sie beträgt 2,76 μΜοΙ/ mg · min. Dies entspricht 46% der spezifischen Aktivität des Enzyms in der Lösung vor der Immobilisierung.

Claims

Wert O, 1, 2 oder 3 hat und Z\ die vorstehende Bedeutung hat, oder einem Salz dieser Verbindung, oder mit einer Verbindung der allgemeinen Formel IV

HaI-CH₂-CH₂-(NH-CH₂-CHj)_n-NH₂

(iv)

in der π den Wert 0,1,2 oder 3 hat und Hai ein Halogenatom ist, oder einem Salz dieser in Verbindung hergestellt worden ist.