AT392288B - Verfahren zur herstellung von moranolinderivaten - Google Patents

Description

AT 392 288 B

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Oligoglucosylmoranolinderivaten der allgemeinen Formel

worin R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen aufweisen kann, bedeutet und n eine ganze Zahl von Null bis 15 ist.

Von den Verbindungen der Formel (I) kann ein Gemisch, in dem n = Null bis 15 ist, durch Behandeln beispielsweise mit Glucoamylase (a-l,4-Glucanglucohydrolase EC 3.2.1.3) (vgl. JP-OS 57/058890) in hoher Ausbeute in eine Verbindung der allgemeinen Formel

worin R die obige Bedeutung hat, umgewandelt werden oder die Verbindung (III) kann in hoher Ausbeute aus einem Gemisch von (I) unter Anwendung fraktionierter Kristallisation mit einem polaren Lösungsmittel (vgl. JP-OS 59/237326) erhalten werden. Im übrigen ist (III) eine Verbindung (I), in der n Null ist.

Die Verbindung (III) weist eine ausgezeichnete inhibitorische Wirkung gegen den Anstieg des Blutzuckerspiegels bei Zuckerbelastung auf und ist ein sehr nützliches Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes mellitus (JP-OS 56/081595). Dementsprechend bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Ausgangsstoffen für die Erzeugung von nützlichen Arzneimitteln an.

Zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) ist es bekannt, Cyclodextringlycosyltransferase (EC 2.4.1.19) auf eine wässerige, Cyclodextrin oder lösliche Stärke und ein Moranolinderivat der allgemeinen Formel -2-

AT 392 288 B

CH20H R

OH worin R die obige Bedeutung hat, enthaltende Lösung einwirken zu lassen, wobei ein Gemisch von Oligoglucosylmoranolinderivaten der Formel (I) erhalten wird.

Diese Cyclodextringlycosyltransfeiase (nachstehend als "CGTase" bezeichnet) ist jedoch sehr teuer, so daß ein Bedarf an einem Verfahren besteht, durch das das Enzym wiedergewonnen und durch Rückführen wiedererhalten werden kann. Da außerdem CGTase eine amphotere Substanz ist, sind zum Abtrennen des Enzyms viele Vorbehandlungen erforderlich, um durch die enzymatische Reaktion reines (I) (das eine basische Substanz ist) aus dem Reaktionsgemisch zu erhalten. Außerdem ist bei der Erzeugung im großtechnischen Maßstab unabdingbar ein Verfahren notwendig, das wiederholt über lange Zeit angewendet werden kann, aber der Einsatz von Enzymen, die für diesen Zweck in instabilem Zustand vorliegen, ist aus technischer Sicht äußerst schwierig.

Ausgehend vom Stand der Technik wurden erfmdungsgemäß gründliche Untersuchungen durchgeführt, wobei gefunden wurde, daß das obige Problem durch Festlegen der CGTase gelöst werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß Cyclodextringlycosyltransferasc in eingeschlossener oder gebundener Form eingesetzt wird.

Der hier verwendete Ausdruck ''festgelegte" CGTase bezieht sich sowohl auf die eingeschlossene als auch die gebundene Form (siehe "Immobilized Enzyme", herausgegeben von Ichiro Chibata, veröffentlicht von Kodansha).

Wenn bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die eingeschlossene Form verwendet wird, kann beispielsweise CGTase auf einem Trägerstoff eingeschlossen sein. Als Trägerstoff für eingeschlossene CGTase wird vorzugsweise ein polymeres Gel verwendet, beispielsweise synthetisches hochmolekulares Polyacrylamidgel und Polyvinylalkoholgel. Die CGTase kann auch in Polysaccharid eingeschlossen sein, das durch Quellen ein Gel wird (wie K-Carrageenan). Der Trägerstoff kann erforderlichenfalls durch Zusatz von Glutaraldehyd oder Hexamethylendiamin physikalisch verstärkt werden. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren nach einer solchen physikalischen Verstärkung durchgeführt wird, läuft der Kontakt mit der Reakdonslösung glau ab, ohne die enzymadsche Reaktion zu behindern, so daß diese Verfahrensweise zu bevorzugen ist. Für das Trägermaterial werden kugelförmige Körper beispielsweise mit einem Durchmesser von 1 mm bis 1 cm hergestellt und in eine Säule eingefüllt, durch die man die Reakdonslösung umlaufen läßt, wodurch die Cyclodextrin oder lösliche Stärke und (II) enthaltende Lösung unter Gewinnung von (I) mit der CGTase in Kontakt gebracht wird.

Was die eingeschlossene Form betrifft, kann die Rohenzymlösung als solche ohne Reinigung der CGTase verwendet werden, und deshalb kann solch eine Methode noch vorteilhafter sein.

Bei der Anwendung von gebundenen Formen im erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise die kovalente Bindung, die Ionenbindung oder die physikalische Adsorption benutzt werden. Bei Anwendung der kovalenten Bindung im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine kovalente Bindung mit einem unlöslichen Träger hergestellt, der eine Gruppe aufweist, die beispielsweise mit der Amino- oder Carboxylgruppe eine kovalente Bindung eingehen kann, worauf die Bindung an den Träger zustandekommt. Beispielsweise wird CGTase nach der Reinigung mit beispielsweise Polysaccharid, wie CNBr-Cephalose, umgesetzt, das erhaltene gebundene Produkt in wässeriger Lösung suspendiert und mit einer wässerigen Lösung von (II) und einer Cyclodextrin oder lösliche Stärke enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht, wobei (I) erhalten wird.

Selbst in diesem Fall wird gemäß der vorliegenden Erfindung jeder Träger, der CGTase binden kann, vom Ausdruck "Festlegung" umfaßt.

Bei der wiederholten und kontinuierlichen Verwendung von Enzymen hätte ein Fachmann auf die Idee kommen können, diese Enzyme festzulegen. Erfindungsgemäß wurde jedoch erstmals die Idee aufgegriffen, CGTase festzulegen und auf die Verbindungen nach der Erfindung anzuwenden. Außerdem wurde erstmals festgestellt, daß die festgelegte CGTase eine stabile enzymatische Aktivität während eines langen Zeitraumes, wie mehr als 120 Tage, aufweist, wie später noch erläutert wird.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen im einzelnen beschrieben. -3-

AT 392 288 B

Bezufrsheispiel

Reifung von Bacillus macerans 100 ml eines Kulturmediums (pH 7), das 1 % Getreideweiche, 1 % lösliche Stärke, 0,5 % Ammoniumsulfat und 0,5 % Calciumcarbonat enthielt, wurden in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und 15 min durch Erhitzen auf 120 °C sterilisiert. Drei Platinösen B. macerans ΠΌ-3490-Stamm, der auf einem 1 % Pepton, 0,5 % Hefe, 0,3 % Glucose, 1,5 % Glycerin, 0,3 % Natriumchlorid, 2,5 % Leberpulver (Oxoid, Warenzeichen) und 1,5 % Agar enthaltenden Schrägmedium gut gewachsen war, wurden übergeimpft und 3 Tage bei 37 °C der Schüttelkultur unterzogen. Die kultivierte Flüssigkeit (600 ml) wurde in einen Schüttelfermenter (Inhalt 301) übergeimpft, der 18 1 des Mediums mit derselben Zusammensetzung enthielt, und 3 Tage lang bei 37 °C unter ausreichendem Schütteln und Belüften kultiviert, wobei nach dem Zentrifugieren eine 130 bis 150 Einheiten enthaltende Enzymlösung als überstehende Flüssigkeit erhalten wurde.

Einheit der Cyclodextringlvcosvltransferase-Aktivität

In 0,05 M Acetatpuffer (pH 5,5) wurde zur Herstellung einer Substratlösung in einem Anteil von 0,7 % lösliche Stärke (Qualität für biochemische Forschung; hergestellt von Nakarai Kagaku KK) gelöst. Zu 950 μΐ dieser Substratlösung wurden 50 μΐ Enzymlösung zugesetzt; es wurde 10 min bei 40 °C umgesetzt und die Reaktion durch Zusatz von 0,5 ml 0,5 n Essigsäure abgebrochen. Zu 100 μΐ der Reaktionslösung wurden 0,8 ml Jodlösung (0,01 M Jod gelöst in 0,25 M wässeriger Kaliumjodidlösung) und 3 ml Wasser zugegeben und das Gemisch gerührt, und die Extinktion bei 660 nm wurde gemessen, wobei ein AT-Wert erhalten wurde. Auf gleiche Weise wurden 50 μΐ Wasser und 0,5 ml 0,5 n Essigsäure zu 950 μΐ Substratlösung zugesetzt, Jodlösung wurde zu 100 μΐ dieser Lösung zugesetzt und die Extinktion bei 660 nm gemessen, wobei ein AR-Wert erhalten wurde.

AR-AT 1 Einheit =-x 100 x 2

AR 1 Einheit bedeutet jene Aktivität, die eine Abnahme der Extinktion um 1 %/min bei 40 °C von 1 ml Enzymlösung verursacht.

Herstellung der Rohenzvmlösung

Die kultivierte Lösung von B. macerans IFO 3490 wurde zentrifugiert, die überstehende Lösung gefriergetrocknet und dann in einem kleinen Anteil Wasser gelöst, wobei eine konzentrierte Enzymlösung erhalten wurde. Diese wurde bei 5 °C gut gegen Wasser dialysiert, um niedermolekulare Substanzen zu entfernen, und die innere Lösung als Rohenzymlösung verwendet. Erforderlichenfalls wird sie gefriergetrocknet und das erhaltene Pulver verwendet

Herstellung des Enzvms

Die Rohenzymlösung wurde bis zu einer Sättigung von 0,25 zu Ammoniumsulfat zugesetzt, mit Celite filtriert und das Filtrat an Maisstärke adsorbiert Es wurde mit 0,033 M Natriumhydrogenphosphat eluiert und das Eluat mit Ammoniumsulfat ausgesalzt (0 bis 0,6 Sättigung). Dann wurde dialysiert, die dialysierte Lösung mit DEAE-Cellulose der Säulenchromatographie unterzogen, mit Wasser gewaschen und eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und der Säulenchromatographie mit Sephadex G-75 unterzogen, wobei gereinigtes Enzym erhalten wurde (vgl. S. Kitahata et al., Arg. Biol. Chem., 38,387-393,1974).

Beispiel 1: (1) In einer 0,9 %igen wässerigen Natriumchloridlösung wurde K-Carrageenan bei 65 °C zur Herstellung einer 5 %igen Lösung (Masse/Volumen) gelöst. Diese Lösung (100 ml) wurde auf 65 °C erwärmt. In 400 ml Wasser wurden 33 g lyophilisierte rohe Cyclodextringlucosyltransferase (4150 Einheiten/g) gelöst und die Lösung auf 30 °C erwärmt. Beide Lösungen wurden vereinigt, zu 4000 ml einer 0,3 M wässerigen Lösung von CaC^ unter Rühren zugetropft und die erhaltene kugelförmige festgelegte Cyclodextringlucosyltransfeiase über Nacht bei 5 °C stehengelassen. Diese wurde zum Entfernen von Flüssigkeit durch ein grobes Sieb gegeben, und es wurden Teilchen mit kreisförmigen und elliptischen Seiten von einigen mm Durchmesser erhalten. Sie wurden zu 4000 ml einer 2,5 %igen wässerigen Glutaraldehydlösung zugesetzt und das Gemisch 40 min lang vorsichtig gerührt. Dann wurde es zu 4000 ml einer 0,5 %igen wässerigen Hexamethylendiaminlösung zugesetzt, worauf 30 min dieselbe Behandlung folgte. Es wurde zum Entfernen von Flüssigkeit durch ein grobes Sieb gegeben und mit Wasser gewaschen, wobei ein körniger Feststoff erhalten wurde. -4-

AT 392 288 B (2) 50 g des obigen körnigen Feststoffes (Naßmasse) wurden in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 30 cm gegeben. Eine 3 g Moranolin und 12 g α-Cyclodextrin in 200 ml Wasser enthaltende und auf pH 5,7 eingestellte Lösung ließ man 72 h bei 40 °C bei einer Geschwindigkeit von 20 ml/h durch die Säule umlaufen. Die Reaktionslösung wurde gesammelt, mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz (Dowex 50W x 2; H+, 50 ml) behandelt, gründlich mit Wasser gewaschen, mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 8,7 g Pulver erhalten wurden. Dieses wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei festgestellt wurde, daß es sich um ein Gemisch von 11 % Moranolin und 89 % Oligoglucosylmoranolin handelte.

Die Bedingungen bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie waren wie folgt:

Sumipax R741 (Nucleosil 5 NH2,5 |im, 4 mm Innendurchmesser x 25 mm Höhe); Entwickler: Acetonitril-

Wasser (65:35); Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min; RI-Nachweis (ERC-7510, hergestellt von Eimer Optical Co.); Datenverarbeitung: Modell 655-60, hergestellt von Hitachi Ltd.

Beispiel 2: (1) 105 mg mittels Sephadex G-75-Säulenchromatographie gereinigte Cyclodextringlucosyltransferase wurden in 30 ml 0,1 M wässeriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, die 0,5 M Natriumchlorid und aktiviertes Trägermaterial (entsprechend 3 g des lyophilisierten Produktes) von CNBr-Cephalose 4B enthielt. Die CNBr-Cephalose 4B, die als aktiviertes Trägermaterial verwendet wurde, wurde hergestellt, indem 3 g lyophilisierte CNBr-Cephalose 4B (handelsüblich) auf ein Glasfilter gegeben und dann wiederholt gewaschen und mit 600 ml ImM Salzsäure gequollen wurden. Das Produkt wurde 3 h bei 25 °C durch Schütteln umgesetzt und danach das erhaltene Pulver mit Wasser gewaschen und 2 h mit 30 ml 0,5 M Äthanolamin bei Raumtemperatur behandelt. Das Produkt wurde gut mit 0,1 M wässeriger Natriummonohydrogenphosphatlösung, die 0,5 M Natriumchlorid enthielt, und dann gründlich mit Wasser gewaschen, wobei ein pulverförmiger Feststoff erhalten wurde. (2) 18 g lösliche Stärke wurden in 200 ml heißem Wasser gelöst, 3 g Moranolin darin gelöst und das Gemisch auf pH 5,7 eingestellt. Dann wurde 1 g des zuvor erhaltenen Pulvers zugegeben und das Gemisch 3 Tage bei 40 °C gerührt. Die Reaktionslösung wurde abfiltriert, durch 50 ml eines stark sauren Ionenaustauscherharzes (Dowex 50W x 1; H+) geschickt, die Säule gründlich mit Wasser gewaschen, mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 6,9 g Pulver erhalten wurden.

Dieses wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch von 18 % nicht-umgesetztem Moranolin und 82 % Oligoglucosylmoranolin bestand.

Beispiel 3: 50 g (Naßmasse) der auf die im Beispiel 1 (1) beschriebene Weise erhaltenen Teilchen wurden in eine Säule (2,5 cm Innendurchmesser x 30 cm Höhe) gegeben und eine Lösung (pH 5,7) von 1,4 g N-Methylmoranolin und 22,4 g α-Cyclodextrin in 200 ml Wasser bei 40 °C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h 100 h durch die Säule umlaufen gelassen. Die Reaktionslösung wurde gesammelt, durch 50 ml eines stark sauren

Ionenaustauscherharzes (Dowex 50W x 2; H+) geschickt, die Säule gründlich mit Wasser gewaschen und mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 3,5 g Pulver erhalten wurden.

Dieses wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch von 15 % nicht-umgesetztem N-Methylmoranolin und 85 % Oligoglucosyl-N-methylmoranolin bestand.

Beispiel 4: 18 g lösliche Stärke wurden in 200 ml heißem Wasser gelöst, dann wurden 3 g N-Methylmoranolin darin gelöst und die Lösung auf pH 5,7 eingestellt. Es wurde 1 g des auf die in Beispiel 2 (2) angegebene Weise erhaltenen Pulvers zugesetzt und das Gemisch 3 Tage bei 40 °C geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde filtriert, mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz (Dowex 50W x 2, H+, 50 ml) behandelt, das Harz gründlich mit Wasser gewaschen, mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 6,3 g Pulver erhalten wurden.

Dieses wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch aus 21 % N-Methylmoranolin und 79 % Oligoglucosyl-N-methylmoranolin bestand. -5-

Claims (1)

1. AT 392 288 B Beispiel 5: Eine durch Lösen von 3 g Moranolin und 12 g α-Cyclodextrin in 200 ml Wasser erhaltene Lösung (pH 5,7) ließ man 3 Tage bei 40 °C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h durch eine Säule umlaufen (2,5 cm Innendurchmesser x 30 cm Höhe), in der sich 50 g (Naßmasse) der Teilchen gemäß Beispiel 1 (1) befanden, wie sie in Beispiel 1 (2) verwendet wurden. Die Reaktionslösung wurde gesammelt, durch ein stark saures Ionenaustauscherharz (Dowex 50 W x 2; ff*") geschickt, das Harz gründlich mit Wasser gewaschen, mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 8,7 g Pulver erhalten wurden. Dieses wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch aus 11 % Moranolin und 89 % Oligoglucosylmoranolin bestand. Dieser Vorgang wurde insgesamt 40-mal während insgesamt 120 Tagen wiederholt. Das nach dem 40. Vorgang erhaltene Pulver wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch aus 11 % Moranolin und 89 % Oligoglucosylmoranolin bestand. Beispiel 6: 50 g (Naßmasse) der auf die im Beispiel 1 (1) beschriebene Weise erhaltenen Teilchen wurden in eine Säule gefüllt (2,5 cm Innendurchmesser x 30 cm Höhe) und dann ließ man eine Lösung, die durch Auflösen von 2 g N-(2-Hydroxyäthyl)moranolin und 32 g α-Cyclodextrin in 300 ml Wasser und anschließendes Einstellen auf pH 5,7 erhalten worden war, 100 h bei 40 °C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h umlaufen. Die Reaktionslösung wurde gesammelt, durch ein stark saures Ionenaustauscherharz (Dowex 50W x 2; H+, 50 ml) geschickt, das Harz gründlich mit Wasser gewaschen, mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 4,8 g Pulver erhalten wurden. Dieses wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei festgestellt wurde, daß es aus einem Gemisch von 17 % nicht-umgesetztem N-(2-Hydroxyäthyl)moranolin und 83 % 01igoglucosyl-N-(2-hydroxyäthyl)moranolin bestand. Beispiel 7: 50 g (Naßmasse) der auf die im Beispiel 1 (1) beschriebene Weise erhaltenen Teilchen wurden in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 30 cm gefüllt und eine durch Lösen von 2 g N-(2,3-Dihydroxypropyl)moranolin und 32 g α-Cyclodextrin in 300 ml Wasser erhaltene Lösung ließ man nach Einstellen des pH-Wertes auf 5,7 100 h lang durch die Säule bei 40 °C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h umlaufen. Die Reaktionslösung wurde gesammelt, durch ein stark saures Ionenaustauscherharz (Dowex 50W x 2; H+, 50 ml) geschickt, das Harz gründlich mit Wasser gewaschen, mit 1 n Ammoniakwasser eluiert und das Eluat im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, wobei 4,8 g Pulver erhalten wurden. Dieses wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert, wobei gefunden wurde, daß es aus einem Gemisch aus 20 % nicht-umgesetztem N-(2,3-Dihydroxypropyl)moranolin und 80 % 01igoglucosyl-N-(2,3-dihydroxypropyl)moranolin bestand. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Oligoglucosylmoranolinderivaten der allgemeinen Formel

   -6- 5 AT 392 288 B worin R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe, die eine oder mehrere Hydroxylgruppen aufweisen kann, und n eine ganze Zahl von Null bis 15 ist, wobei man Moranolin der allgemeinen Formel 10 15

   ,(Π) 20 worin R die obige Bedeutung hat, und eine Cyclodextrin oder lösliche Stärke enthaltende wässerige Lösung auf festgelegte Cyclodextringlycosyltransferase einwirken läßt, dadurch gekennzeichnet, daß Cyclodextringlycosyltransferase in eingeschlossener oder gebundener Form eingesetzt wird. -7-