JPH11511328A - ステロイドレセプター共活性化因子組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、SRC-1ポリペプチド、かようなポリペプチドをコードする核酸、かような核酸を含む組織及び動物、かようなポリペプチドに対する抗体、かようなポリペプチドを利用するアッセイ法、及び上述のものすべてに関連する方法に関する。SRC-1ポリペプチド又はそのフラグメントを細胞に提供することにより転写を強化及び抑制する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ステロイドレセプター共活性化因子組成物および使用方法 発明の属する技術分野 本発明は、ステロイドレセプター共活性化因子−１（steroid receptor coact ivator-one）（"SRC-1"）と命名された新規タンパク質、SRC-1をコードするヌク レオチド配列、並びに一つあるいはそれ以上のステロイドレセプターの活性の増 加（augmenting）またはダウン制御に有用な様々な生成物および方法に関する。 発明の背景 本発明の背景についての以下の記載は、本発明の理解を助けるために提供され 、本発明が従来の技術であることを認めるものではない。 転写は、ＲＮＡ分子がＲＮＡポリメラーゼIIによって仲介される相補的塩基対 合によってＤＮＡ鋳型上に形成される、基礎的な生物学上のプロセスである。蓄 積された証拠は、数多くの一般的な転写因子がプロモーター−ＤＮＡエレメント において決まった順序の組み立てを経て、ＲＮＡポリメラーゼIIの結合および標 的遺伝子の転写の開始を確実にすることを示す（概説として、Zawel，L．および Reinberg，D.，1995、Ann．Rev．Biochem.，64，533-561、を参照のこと）。 転写の活性化は、基本的転写機構の一つまたはそれより多くの成分と活性化因 子との直接相互作用によって成し遂げることができる。活性化因子と基本的転写 機構との間の直接相互作用は、様々な活性化因子について記載されている（Stri nger，K．F．ら、1990，Nature，345，783-785；Kashanchi，F．ら、1994，Natu re，367，295-299；Sauer，F．ら、1995，Nature，375，162-164）。 活性化因子による最適なトランス活性化には、おそらくアダプターまたは共通 活性化因子と呼ばれるさらなる因子が必要であろう。これらの因子は、中心とな る転写機構の一般的転写因子と活性化因子を架橋または安定化するにあたって、 鍵となる調節的役割を演ずるらしい。活性化因子がもう一つのトランス活性化因 子（transactivator）による標的遺伝子のトランス活性化を抑圧（squelch）ま たは阻害（inhibit）する能力は、それらがトランス活性化プロセスに必要とさ れる限定量の共因子（cofactor）と競合することを示唆し、さらに、共活性化因 子が有用なトランス活性化機能に必要であるという概念を助長する(Flanagan, P．M．ら、1991，Nature，350，436-438)。 ステロイドレセプターは、基本的転写機構との相互作用により転写を抑制する と主張されてきた。しかしながら、抑圧がステロイドレセプタースーパーファミ リーの仲間内でも起こることが発見されたことは、さらなる因子または共活性化 因子がこのスーパーファミリーの仲間による有効なリガンド−誘発性標的遺伝子 発現に重要であることを示す［Meyer，M．E．ら、1989，Cell，57，433-442；Co nneely，O．M．ら、1989、「ニワトリのプロゲステロンレセプターのプロモータ ー特異的活性化ドメイン（Promoter specific acitivating domain of the chic ken progesterone receptor）」、”Gene Regulation by Steroid Hormones IV ”，A．K．Roy，およびJ．Clark編、New York，Berlin，Heidelberg，London，P aris，Tokyo：Springer-Verlag，220-223；Bocquel，M．T．ら、1989，Nucleic Acids Res.，17，2581-2594；Shemshedini，L．ら、1992，J．Biol．Chem.，261 ，1834-1839］。このスーパーファミリーに関するそのような機能的な共活性化 因子は、以前に同定されたことがない。 ステロイドレセプターは、ホルモン応答遺伝子を制御し、それにより細胞の増 殖および分化を含む様々な生物学的プロセスに影響を与える、リガンド誘発性転 写因子のスーパーファミリーに属する。ステロイド／甲状腺ホルモンレセプター スーパーファミリーは、ヒートショックタンパク質とのそれらの特徴的関係、Ｄ ＮＡへの結合、およびそれらのリガンド−依存性トランス活性化機能に基づいて 、二つの型（ＡおよびＢと称する）に分けることができる（Tsai，M.-J．および O’Malley，B．W.，1994，Ann．Rev．Biochem．，63，451-486）。 一つのステロイドレセプター、ヒトのプロゲステロンレセプター（hPR）は、 細胞内では二つのイソ型（isoforms）（120kDaのPR_Bおよび94kDaのPR_A）として 発現する。Ａイソ型は、PRの短い方の転写物であり、ＢレセプターのＮ-末端１ ６４アミノ酸の大部分が欠けている（Kastner，P.ら、1990，EMBO J.，9，1603- 1614；Wei，L．L.ら、1987，Biochem.，26，6262-6272）。それらは、インビト ロでは、類似したリガンド特異性およびＤＮＡ−結合アフィニティーを示すが、 二つのイソ型のレセプターの転写活性は、完全な細胞でアッセイした場合に、異 なるプロモーター特異性および細胞特異性を示す（Chalepakis，G．ら、1988、C ell，53，371-382；Tora，L．ら、1988，Nature，333，185-188；Tung，L.ら、1 993，Mol．Endocrinol.，7，1256-1265）。 他のステロイドレセプタースーパーファミリーの仲間のように、hPRsは、Ｃ- 末端にリガンド結合ドメイン（LBD）および中央に位置するＤＮＡ結合ドメイン （DBD）を含むモジュラー（modular）タンパク質である。ｈＰＲ内の二つの領域 は、転写の活性化の機能（acivation functions）（AFs）を含むと考えられてい る。一つは、Ｎ-末端（AF１）に位置し、もう一つ（AF２）は、LBD内に位置する （Tora，L.ら、1989，Cell，59，477-487；Gronemeyer，H.，1991，Ann．Rev．G enet.，25，89-123）。最近の結果は、hPR_Bに特異的な164アミノ酸フラグメント は、全長のレセプターの最大のトランス活性化に必要とされる、さらなる活性化 機能を含むであろうことを示唆している（Sartorius，C．A.ら、1994，Mol．End ocrinol.，8，1347-1360）。 ステロイドレセプターの活性化は、ＤＮＡホルモン−応答エレメント（hormon e-responsive elements）（HREs）との特異的結合を促進して標的遺伝子の発現 を変調させる、レセプターの構造的機能的変化を含む複雑な多段階プロセスであ る（概説としてTsai，M.-J．およびO'Malley，B．M.，1994，Ann．Rev．Biochem .，63，451-486を参照のこと）。このように、ステロイドレセプターは、それら の究極のトランス活性化機能を達成するために、かなり複雑な多段階活性化プロ セスを経なければならない。 共活性化因子は、核ステロイドレセプター機能に広くかかわっている。ステロ イドレセプタースーパーファミリーの仲間同士による転写干渉実験から、共活性 化因子は限定されており、インビボではレセプタータンパク質と直接的または間 接的のいずれかで相互作用して転写を変調させることが示唆されている。しかし ながら、上記のように、このスーパーファミリーに関するそのような機能的な共 活性化因子は、以前には、同定されたことがなかった。 発明の概要 本発明は、SRC-1ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、 そのような核酸を含む細胞、そのような遺伝子生成物に対する抗体、そのような ポリペプチドを用いるアッセイ、および前述のすべてに関係する方法に関する。 特に、本発明は、一つまたはそれより多くのステロイドレセプターの活性を増加 またはダウン制御するための方法に関する。 本発明は、我々がステロイドレセプター共活性化因子−１またはSRC-1と命名 した、新規のタンパク質の分離および特徴づけを基本とする。我々は、SRC-1活 性の変調が治療的手段として有用であると断定し、従って、本発明は、他のトラ ンス活性化因子の活性の変調を含む、ステロイドホルモンの応答および活性の変 調に有用な様々な薬剤および方法を提供する。 分離し、精製し、および／または富裕にしたSRC-1ポリペプチドおよび／また は核酸を用いると、ステロイドレセプターをトランス活性化することができ、そ れによって生物体または細胞内の転写レベルを促進することができる。当業者は 、本明細書中に記載された方法を用いて、適当な物質の投与を行うことができる 。例えば、一つまたはそれ以上のトランスフェクトされ、そして／または形質転 換された細胞を用いて、ステロイドレセプター活性が含まれる遺伝子療法を基本 とした治療を行うことができる。ステロイドレセプター活性にかかわる疾患また は健康状態の例としては、米国特許出願08/479,913、1995年６月７日出願（ここ に、任意の図面を含むその全体を参照として編入する）に記載されたような、悪 性の内分泌再生系、炎症性および免疫性障害が含まれる。その他の疾患および健 康状態の例は、Physicians' Desk Referenceのような当業者らが入手できる参考 資料に列挙されており、内分泌疾患、リュウマチ疾患、コラーゲン障害、皮膚病 、アレルギー状態、眼病、胃腸病、呼吸疾患、血液疾患、乳癌、子宮内膜炎、癌 を含む高増殖性疾患およびその他を含む。代わりに、本発明の方法を用いて、転 写を阻害することもできる。例えば、切除型SRC-1を、レセプター活性の支配的 な負のインヒビター（dominant negative inhibitor）として用いることができ る。 本明細書には、hPRトランス活性化機能に必要とされるタンパク質［以後、ス テロイドレセプター共活性化因子−１（steroid receptor coactivator-one）（ SRC-1）と呼ぶ］をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび特徴について記載 している。SRC-1は、ホルモン−依存性様式でhPRのリガンド結合ドメイン（LBD ）と直接的かつ特異的に相互作用する。レセプタータンパク質へのアンタゴニス トRU486の結合は、この相互作用を破壊する。ステロイドレセプターとSRC-1の 共発現（coexpression）では、基本活性を変化させることなく細胞標的遺伝子の ホルモン誘発性転写を増強（＞10倍）する。さらに、SRC-1の過剰発現は、PR-仲 介トランス活性化を抑圧するＥＲの能力を逆行させることができる。最終的に、 レセプターと相互作用する能力を残す切除型SRC-1の共発現は、結果として、レ セプター活性の支配的な負の阻害をもたらす。このように、SRC-1は、標的遺伝 子上でのステロイドレセプターの十分なリガンド依存性活性を確保する共活性化 因子としての性質を満たすタンパク質をコードする。 従って、第一の態様では、本発明は、SRC-1ポリペプチドをコードする分離さ れ、富裕にされ、または精製された核酸を特徴とする。 「SRC-1ポリペプチド」とは、図１の全長のアミノ酸配列に示す２５（好まし くは３０、より好ましくは３５、最も好ましくは４０）またはそれより多くの隣 接するアミノ酸または本明細書中に記載されたようなその機能的誘導体を意味す る。ある態様では、５０、１００、４２５、４３０、４３５、４４０またはそれ より多くのアミノ酸からなるポリペプチドが好ましい。SRC-1ポリペプチドは、 ポリペプチドの機能的活性が残っている限りにおいて、全長の核酸配列または全 長の核酸配列の任意の部分によってコードされうる。そのような機能的活性は、 例えば、（１）アゴニスト特異的様式でPRと相互作用する能力、（２）プロモー ターの基本活性を変化させることなくホルモン誘発性転写活性を強化する能力、 （３）一つまたはすべてのステロイドレセプターのトランス活性化を刺激する能 力、（４）薬剤投与量依存性様式でhPR活性化のER抑圧を逆行させる能力、およ び／または（５）支配的な負の様式でレセプター活性を阻害する切除型SRC-1ポ リペプチドの能力、であることができる。好ましくは、アミノ酸配列は、図１に 示す配列と実質的に類似しているか、またはそのフラグメントである。実質的に 類似した配列は、図１の配列に対して少なくとの９０％の同一性（好ましくは少 なくとも９５％、最も好ましくは９９−１００％）の同一性を持つであろう。 「同一性」とは、それらの類似性または関係を測定する配列の性質を意味する 。同一性は、同一残基数を全残基数で割り、そして得られた数に１００をかける ことによって測定される。このように、正確に同一の配列を持つ２つのコピーは 、１００％の同一性を持つが、保存性のあまり高くない配列および欠失、付加、 ま たは置換を含む配列は、同一性の程度がより低いであろう。当業者らは、配列同 一性の決定にいくつかのコンピュータープログラムが利用できることを認識して いるであろう。 核酸に関して「分離する」とは、互いに結合した２（好ましくは２１、より好 ましくは３９、最も好ましくは７５）またはそれより多くのヌクレオチドからな る一つのポリマーを意味し、天然の起源から単離された、または合成されたＤＮ ＡまたはＲＮＡを含む。本発明のある実施態様では、例えば、１２０２、１２２ １、１２３９、１２７５、またはそれより多くのヌクレオチド、および／または 、図１に示すの全長の配列と少なくとも５０％、６０％、７５％、９０％、９５ ％、または９９％の同一性を持つ、より長い核酸が好ましい。本発明の分離され た核酸は、自然界では純粋または独立した（separated）状態では見い出されな いという意味では唯一のものである。用語「分離された」の使用は、自然発生の 配列がその正常な細胞環境から切り離されたことを示す。従って、配列は、無細 胞溶液内にあるか、または異なる細胞環境内に置かれていると良い。この用語は 、配列が存在する唯一のヌクレオチド鎖であることを意味するものではないが、 それと自然に関係する非ヌクレオチド物質を実質上含まない（少なくとも約９０ −９５％純粋）ことを意味するものでもなく、従って、分離された染色体とは意 味を異にするつもりである。 核酸に関する用語「富裕にする（enriched）」の使用では、具体的ＤＮＡまた はＲＮＡ配列が、正常細胞あるいは疾病細胞または配列を採取した細胞内より、 興味ある細胞内または溶液内に存在する全ＤＮＡまたはＲＮＡの有意に高い画分 （２−５倍）を構成することを意味する。このことは、存在するヒトの他のＤＮ ＡまたはＲＮＡ量の選択的減少、または特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量の選 択的増加、またはその２つの組み合わせに起因する。しかしながら、富裕にする は、存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含まないことを意味するつもりはな く、興味ある配列の相対量が有意に増加していることに注目すべきである。用語 「有意」とは、増加の程度がそのような増加を作り出す人々に有益であることを 示すために用いられ、一般的には、他の核酸と比較して少なくとも約２倍、より 好ましくは少なくとも５から１０倍あるいはそれ以上の増加を意味する。また、 この用語は、その他の起源からのＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味す るつもりでもない。その他の起源のＤＮＡとは、例えば、酵母または細菌のゲノ ムからのＤＮＡ、またはpUC19のようなクローニングベクターを含んでよい。こ の用語は、ウイルス感染のような自然発生の出来事、または一つのｍＲＮＡレベ ルがその他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増加する癌型増殖とは区別される。 即ち、この用語は、ヒトが所望される核酸の割合を上昇させるために介入するそ れらの状況のみをカバーすることを意味する。 また、ヌクレオチオド配列が精製された型であることは、いくつかの目的のた めに有益である。核酸に関する用語「精製された」は、（均一調製のように）絶 対的純度を要求しているわけではなく、代わりに、配列が自然環境内より比較的 より純粋である（例えばmg/mlに換算して、自然レベルと比較してこのレベルが 少なくとも２−５倍多いべきである）ことの表示を意味する。ｃＤＮＡライブラ リーから分離された個々のクローンは、電気泳動で均一になるまで精製すること ができる。これらのクローンから得られたクレームのＤＮＡ分子は、全ＤＮＡか らまたは全ＲＮＡから直接得ることができた。ｃＤＮＡクローンは、自然発生で はなく、むしろ好ましくは、部分精製した自然発生の物質（ｍＲＮＡ）の操作を 通して得られる。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築は、合成物質（ｃ ＤＮＡ）の創作を含み、そして純粋な個々のｃＤＮＡクローンは、ｃＤＮＡライ ブラリーを持つ細胞のクローン選択によって合成ライブラリーから分離すること ができる。従って、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの構築および完全なｃ ＤＮＡクローンの分離を含む方法によって、自然のメッセージのおおよそ１０⁶ 倍の精製度が得られる。このように、少なくとも一桁の大きさ、好ましくは２桁 または３桁、より望ましくは４桁または５桁の大きさの精製度がはっきりと期待 される。 望ましい実施態様では、分離された核酸は、図１の全長アミノ酸配列に示した 核酸配列、その機能的誘導体を含むか、本質的にからなるか、あるいはからなる 、またはその少なくとも７５、９０、１０５、１２０、１４０、４７５、４９０ 、５０５、５２０または５５０の隣接するアミノ酸をコードする；ＳＲＣ−１ポ リペプチドは、少なくとも２５、３０、３５、または４０の隣接するＳＲＣ−１ ポ リペプチドのアミノ酸を含むか、本質的にからなるかあるいはからなる。核酸は 、ｃＤＮＡクローニングによって、または減法ハイブリダイゼーションによって 天然の起源から分離することができる；天然起源は、哺乳動物（ヒト）の血液、 精液、または組織であって良く、そして核酸は、トリエステル法によって、また は自動ＤＮＡシンセサイザーを用いることによって、合成することができる。さ らなるその他の好ましい実施態様では、核酸は、保存領域または唯一の領域、例 えば、同定およびさらなるポリペプチドのクローニングを容易にするハイブリダ イゼーションプローブの設計、さらなるポリペプチドのクローニングを容易にす るＰＣＲプローブの設計、およびポリペプチド領域に対する抗体を得ることに有 用な領域である。 「保存された核酸領域」は、個々の核酸配列がより低いストリンジェンシー（ stringency）条件下でハイブリダイズすることが出来る、SRC-1ポリペプチドを コードする２つまたはそれより多くの核酸上に存在する領域を意味する。SRC-1 ポリペプチドをコードする核酸のスクリーニングに適当なストリンジェンシーの より低い条件の例は、Abeら、J．Biol．Chem.，19：13361（1992）（任意の図面 を含むその全体を参照としてここに編入する）に提供されている。好ましくは、 保存領域は２０ヌクレオチドのうち５より多くないヌクレオチドが異なる。 「唯一の（unique）核酸領域」とは、その他のいかなる自然発生ポリペプチド をコードする配列内にも存在しないSRC-1ポリペプチドをコードする全長の核酸 内に存在する配列を意味する。そのような領域は、好ましくは、SRC-1ポリペプ チドをコードする全長の核酸内に存在する３０または４５の隣接するヌクレオチ ドを含む。特に、唯一の核酸領域は、好ましくは、哺乳動物起源のものである。 また、本発明では、サンプル中のSRC-1ポリペプチドまたはSRC-1をコードする 核酸を検出するための核酸プローブの特徴を示す。核酸プローブは、図１に示し た配列またはそれの機能的誘導体とハイブリダイズするであろう核酸を含む。検 出されるSRC-1ポリペプチドは、図１に示したアミノ酸配列の任意の与えられた 数の隣接するアミノ酸を含むか、からなるか、または本質的にからなる。 「含む（comprising）」とは、含む（including）を意味するが、言葉「含む 」の後に続くものに限定されない。従って、用語「含む」の使用は、列挙された エ レメントが必要または強制的であることを示すが、その他のエレメントは随意で あり、そして存在していても良いし、またはしていなくても良い。「からなる（ consisting of）」とは、含む（including）を意味し、且つ、句「からなる」の 後に続く場合に限定される。即ち、句「からなる」は、列挙されたエレメントが 必要または必須であることを示し、他のエレメントが存在してはならない。「実 質的にからなる（consisting essentially of）」は、句の後に列挙された任意 のエレメントを含むことを意味し、列挙されたエレメントに関する開示に具体的 に示される活性あるいは作用を干渉しないか、または構築するその他のエレメン トに限定される。従って、句「実質的にからなる」は、列挙されたエレメントが 必要または強制的であることを示すが、その他のエレメントは随意であり、且つ それらが列挙されたエレメントの活性または作用に影響するか否かによって、存 在しても良いし、または存在しなくても良い。 好ましい実施態様では、核酸プローブは、図１に示す全長の配列の少なくとも １２、２５、５０、７５、９０、１００、１２０、１５０、４１２、４２５、４ ５０、４７５、４９０、５００、５２０、または５５０の連続するアミノ酸また はその機能的誘導体をコードする核酸とハイブリダイズする。ストリンジェンシ ーの低いかまたは高い様々なハイブリダイゼーション条件を、所望する特異性お よび選択性に応じて用いることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼー ション条件下では、相補性の高い核酸配列のみハイブリダイズする。好ましくは 、そのような条件は、２０の隣接するヌクレオチドの内１または２のミスマッチ を持つ核酸のハイブリダイゼーションを妨げる。 プローブを用いる方法は、ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で核 酸プローブとサンプルを接触させることにより、サンプル内のSRC-1 ＲＮＡの存 在または量を検出すること、およびSRC-1 ＲＮＡと結合するプローブの存在また は量を検出することを含む。プローブとSRC-1ポリペプチドをコードする核酸配 列の間に形成される核酸の二重らせんは、検出される核酸の配列の同定に用いる ことができる（例として、Nelsonら、Nonisotopic DNA Probe Techniques，275 頁、Academic Press，San Diego，Kricka編、1992、を参照のこと、この文献は 、任意の図面を含むその全体をここに参照として編入する）。そのような方法を 成 し遂げるキットを構築し、その中に核酸プローブを配置した容器手段を含ませる ことができる。 また、本発明は、好ましくは、細胞または生物体内の組換え核酸の特徴を示す 。本発明は、SRC-1ポリペプチドをコードする精製された核酸を含む組換え細胞 または組織も提供する。組換え核酸は、図１に示す配列またはその機能的誘導体 、および宿主内での転写の開始に有効なベクターまたはプロモーターを含んでよ い。代わりに、組換え核酸は、細胞内で機能する転写開始領域、SRC-1ポリペプ チドをコードするＲＮＡ配列と相補的な配列、および細胞内で機能する転写終止 領域を含むこともできる。そのような細胞では、核酸は、そのゲノムの制御エレ メントの調節下にあっても良いし、または外因性プロモーターを含む外因性制御 エレメントの調節下にあっても良い。「外因性（exogenous）」とは、インビボ ではSRC-1ポリペプチドのコード配列に転写によって通常は結合しないプロモー ターを意味する。 その他の態様では、本発明は、SRC-1ポリペプチドをコードするトランス遺伝 子またはSRC-1ポリペプチドの発現に影響を与える遺伝子を含むトランスジェニ ックなヒトでない哺乳動物を提供する。そのようなトランスジェニックなヒトで ない哺乳動物は、特に、（即ち、さらなる遺伝子、アンチセンス核酸、またはリ ボザイムの導入を通して）SRC-1ポリペプチドを誘導する、SRC-1ポリペプチドの 発現を制御する効果を研究するインビボでの試験系として有用である。 「トランスジェニック動物」とは、細胞内に人工的に挿入されたＤＮＡを含む 細胞を持つ動物であって、このＤＮＡは細胞から発育する動物のゲノムの一部分 になる。好ましいトランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、 ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡ は、ヒトSRC-1ポリペプチドをコードすることが出来る。動物内での自然発現は 、レセプターの発現の減少に効果的な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを提 供することにより、減少させることができる。 その他の態様では、ステロイドリガンドは、分子スイッチを活性化し（本明細 書中および米国特許出願07/939,246、1992年９月２日提出および08/479,913、19 95年６月７日提出、に記載されており、両方共、任意の図面を含むその全体を参 照としてここに編入する）、そしてSRC-1ポリペプチドおよびそれによって、ス テロイド療法を強化する卓越した生理応答を提供する。SRC-1ポリペプチドの発 現は、SRC-1のコード領域を含む構成的に活性なプロモーターによって御してよ い。遺伝子スイッチは、同じプラスミド内または異なるプラスミド内のどちらか に随意に提供してよい。SRC-1のプロモーターは遺伝子スイッチにより制御され てよく、その結果リガンドはSRC-1および興味ある遺伝子の両方を活性化する。 その他の態様では、本発明は、標的遺伝子の転写を増加させる方法を提供する 。転写とは、ＤＮＡからＲＮＡに遺伝情報を変換するプロセスを指す。方法は、 SRC-1ポリペプチドをコードする核酸を前記の標的遺伝子を含む細胞に提供する 段階を含む。増加は、転写されていない最初のレベルからであっても、または転 写の存在前のレベルからであっても良い。標的遺伝子は、SRC-1によってトラン ス活性化される任意の遺伝子でありうる。転写のレベルは、この技術分野で既知 の方法を用いて測定してよい；例えば、転写のレベルは、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ活性を測定することによって評価してよい。SRC-1 核酸またはポリペプチドそれ自身を細胞に提供すると、そのようなミネラルコル チコイド（mineral corticoid）（MR）、アンドロゲン（AR）、エストロゲン、 プロゲステロン、ビタミンＤ、COUP-TF、シス−レトニック酸（cis-retonic aci d）、Nurr-1、甲状腺ホルモン、ミネラルコルチコイド、グルココルチコイド− α、グルココルチコイド−β、およびオーファン（orphan）レセプターのような 、任意のステロイドレセプターの転写活性を増加させることができる。 好ましい実施態様では、この方法は、標的遺伝子を含む細胞への遺伝療法に核 酸カセットの発現を制御する分子スイッチを提供する段階も含んでよい。分子ス イッチは、修飾されたリガンド結合ドメインに連結させた天然のステロイドレセ プターＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましくは、SRC-1ポリペプチドは、図１の 全長のアミノ酸配列、または全長の配列の少なくとも７００、８００または９０ ０の隣接したアミノ酸、またはSRC-1の相互作用に必須のドメインを含むフラグ メントが含まれる。スイッチは、好ましくは、本明細書中に記載するように、組 織特異的である。 また、この方法は：（１）分子スイッチを核酸カセットに取り付けて、遺伝子 療法に用いるための核酸カセット／分子スイッチ複合体を形成し；（２）治療さ れる動物またはヒトに薬学的投与量の核酸カセット／分子スイッチ複合体を投与 し；（３）修飾されたリガンド結合部位に結合する薬学的投与量のリガンドを動 物またはヒトに投与することによって、分子スイッチを入れたり切ったりし；そ して、（４）動物またはヒトは薬学的投与量のリガンドを与えられた後に、核酸 を転写してタンパク質を産生することを含んでよい。米国特許出願第07/939,246 、1992年９月２日出願、および国際特許公報WO93/23431、1993年11月25日公告に は、これらの段階が記載され、「核酸カセット」および「プラスミド」のような 用語についての定義が提供されており、その両特許は、任意の図面を含むその全 体をここに参照として編入する。 分子スイッチおよび核酸カセットは、同一のまたは別々のプラスミド上にあっ て良く、標的細胞内に同時に注入されても、また別々に注入されても良い。同様 に、分子スイッチおよびSRC-1ポリペプチドをコードする核酸は、同一または別 々のプラスミド上にあって良く、標的細胞内に同時に注入されても、また別々に 注入されても良い。 その他の態様では、本発明は、核酸カセットに連結させた分子スイッチを含む 物質の組成物を提供する。カセット／分子スイッチ複合体は、カセット内の核酸 を転写でき、そして必要時に標的細胞内で翻訳されるようにベクター内に配置さ れ配列され方向付けられる。分子スイッチは、SRC-1ポリペプチドのコード領域 を持つプラスミド内の本質的に活性なプロモーターを制御する。 また、本発明は、標的遺伝子の転写を減少させる方法を特徴とする。本方法は 、前記の標的遺伝子を含む細胞内にSRC-1ポリペプチドの支配的な負のインヒビ ターをコードする核酸を提供することを含む。支配的な負のインヒビターは、好 ましくは、実施例８の約１５０アミノ酸からなる長いフラグメントのような、全 長の配列のＮ切除型フラグメントによりコードされる。 その他の態様では、本発明は、修飾されたSRC-1ポリペプチド、修飾された結 合ドメインに連結された天然のSRC-1活性化ドメインを含む前記のポリペプチド を含む、遺伝子治療における核酸カセットの発現を制御する分子スイッチを提供 する。この実施態様では、SRC-1核酸は、分子スイッチの一部を形成する。従っ て、リガンド結合ドメイン（例えば、プロゲステロンレセプターの変異LBD）に 連結したトランス活性化ドメイン（例えば、VP-16）に連結したステロイドレセ プターのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、GAL-4）を含む、前記のスイッチ内に一 つの置換を企図する。置換は、VP-16またはその他のあるトランス活性化ドメイ ンを、SRC-1の相互作用必須ドメインで置き換えることを含む。用語「必須相互 作用ドメイン（essential interaction domain）」は、その他の転写因子および 薬剤と共に、相互作用に要求されるSRC-1の部分をさし、当業者らは、当技術分 野で既知の技術を用いて、必須相互作用ドメインを配置させることができる。 また、本発明は、修飾されたSRC-1ポリペプチド分子スイッチを核酸カセット に取り付けて、遺伝子治療に用いられる核酸／分子スイッチ複合体を形成し、そ して薬学的投与量の核酸カセット／分子スイッチ複合体を治療される動物または ヒトに投与する段階を含む、遺伝子治療における核酸カセットの発現を制御する 方法の特徴を示す。 その他の態様では、本発明は、核酸カセットに連結させた修飾SRC-1ポリペプ チド分子スイッチを含む物質の組成物の特徴を示し、その中で、複合体は、カセ ット内の核酸を標的細胞内で転写でき、必要時に翻訳できるようにベクター内に 配置され方向付けられる。 また、本発明は、（ステロイドレセプター活性の修飾を必要とするような本明 細書中に記載された疾病のような）SRC-1関連疾病または健康状態を治療する方 法であって、細胞内にSRC-1コード配列を含む発現ベクターを挿入し、インビト ロで細胞を増殖させ、そして、そのような治療を必要とする患者内に細胞を注入 する段階からなる前記の治療方法の特徴を示す。 上記の本発明の要約は制限されず、また本発明のその他の特徴および長所は、 以下に記載した好ましい実施態様および請求の範囲から明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、SRC-1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。左に示す数字 は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の番号（括弧内）と一致する。アミノ酸配列の 始まりを示す下線を引いたメチオニンは、推定される翻訳開始部位である。Ｓお よびＴ（Ｎ）およびＱ（￥￥￥）残基に富むタンパク質の領域および終止コドン （＊）も示す。 好ましい実施態様の説明 本発明は、SRC-1ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、 そのような核酸を含む細胞、組織および動物、そのようなポリペプチドに対する 抗体、そのようなポリペプチドを用いるアッセイ、ならびに前記のすべてに関係 する方法に関する。 酵母の２−ハイブリッド系は、ヒトのプロゲステロンレセプター（hPR）のリ ガンド結合ドメインの活性化機能と相互作用するタンパク質を同定するために用 いられる。Ｂリンパ球ｃＤＮＡ発現ライブラリーからの０．８ｋｂのｃＤＮＡに よってコードされるタンパク質は、２−ハイブリッド系およびPRを発現するバキ ュロウイルスを用いるインビトロでの相互作用アッセイの両方で証明されるよう に、アゴニスト特異的様式でレセプターと特異的に相互作用することが見い出さ れた。リガンドを含まないレセプターまたはアンタゴニストRU486に結合したレ セプターとの相互作用は、有意により低い。 計算による大きさ114.1kDaのタンパク質をコードする全長のｃＤＮＡを単離し た。哺乳動物細胞でのhPRとこのｃＤＮＡの共発現（coexpression）は、結果と してプロモーターの基本的活性を変化させることなく、ホルモン誘導の転写活性 を＞１０倍に強化する。さらに、このｃＤＮＡは、GR（グルココルチコイド）、 ER（エストロゲン）、TR、RXR、およびオーファンレセプターを含む、試験され たステロイドレセプターのすべてのトランス活性化を刺激する。それ故、このｃ ＤＮＡをステロイドレセプター共活性化因子−１（steroid receptor coactivat or-one）（SRC-1）と命名する。また、SRC-1は、GAL4-VP16およびSp1のトランス 活性化を刺激する。これに対して、CREBおよびE2Fのような核因子の転写活性は 、影響を受けない。さらに、SRC-1の共発現は、エストロゲンレセプターの能力 を逆行させ、服用量依存様式でhPRによる活性化を抑圧する。最終的に、Ｎ-末端 切除型のSRC-1は、ステロイドレセプタートランス活性化における支配的な負の レプレッサーとして作用する。まとめると、我々の結果から、SRC-1はリガンド 依存性ステロイドレセプタースーパーファミリーの全トランス活性化活性に必要 とされる共活性化因子をコードすることが示される。 上に指摘したように、我々は、ステロイドレセプター共活性化因子（SRC-1） タンパク質をクローン化し同定するために、酵母の２−ハイブリッド系を成功裡 に用いた。SRC-1は、２つのｍＲＮＡ種として分析したすべてのヒトの組織およ び細胞系内で発現する。有力な一つのｍＲＮＡは、乳房組織に見出される。グル タミンに富む領域を除いては、予想される１０６１アミノ酸のオープンリーディ ングフレームは、明白な転写調節ドメインを含まない。SRC-1は、多くの他のタ ンパク質より、高いグルタミン（１０．６％）、セリン（１２．２％）およびロ イシン（９．２％）残基を示す。SRC-1のＣ-末端側の半分は、レセプター相互作 用領域を含み、セリンおよびスレオニン含有量が豊富なより親水性のＮ−末端側 の半分と比較すると、比較的疎水性である。 Ｉ．多段階のステロイドレセプタートランス活性化におけるSRC-1の役割 タンパク質が共活性化因子として作用するか否かを決定するアッセイ（Dynlac ht，B．D．ら、1991，Cell，66，563-576；Flanagan．P．M．ら、1991，Nature, 350，436-438）から、SRC-1は真に共活性化因子であることが示される。第一に 、共活性化因子は、基本活性を変化させることなく、有効な活性化因子−依存性 転写を可能にするべきである（Dynlacht，B．D．ら、1991，Cell，66，563-576 ）。この研究に示されるように、哺乳動物細胞でのSRC-1の過剰発現は、結果と して、プロモーターの基本活性を変化させることなく、hPR依存性トランス活性 化を＞１０倍に増強させる。第二に、共活性化因子は、２つのトランス作用因子 （transacting factors）が存在する場合に認められる抑圧現象を逆行させるは ずである（Flanagan，P．M.ら、1991，Nature，350，436-438）。事実、hERの過 剰発現は、結果として、hPRトランス活性化を１／１９倍に減少させた。SRC-1を 加えると、hPRトランス活性化へのhERの抑圧効果は投与量依存様式で１／１６倍 までに逆行した。それ故、我々はSRC-1がステロイドレセプターの真の共活性化 因子であると結論付ける。SRC-1は、PRのER抑圧を完全に逆行させることはでき ないので、さらなる因子を、標的遺伝子の十分なステロイドレセプタートランス 活性化を確立するために、SRC-1と協力して参加させることも可能である。 II．SRC-1およびステロイドレセプタートランス活性化におけるリガンドの役割 SRC-1は、Ａ型およびＢ型の両方のステロイドレセプターの共通活性化因子と して働くと考えられる。これらの結果から、SRC-1は、レセプターがＤＮＡに結 合した後の（数）段階で作用すると考えられる。この仮説と一致するが、我々は 、多分Ａ型レセプターのリガンド−非依存性活性化経路により、ホルモン不在下 でも部分的なトランス活性化が可能な細胞系内で、Ａ型レセプターが過剰発現さ れる場合に（Smith，D．L.ら、1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90，6120-6 124）、SRC-1も、リガンド−非依存性様式でトランス活性化するその能力を増加 させることを見い出した。レセプターの基本活性は、再び変化しないまま残った 。同様に、リガンド不在下で細胞特異的基本活性を示すTRおよびRXRのようなＢ 型レセプターのトランス活性化もまた、それらのリガンドを含まない状態でSRC- 1によって影響を受けた。さらに、これらのデータから、SRC-1はレセプターがそ れらの同起源のHREsと結合した後の（数）段階で作用すると考えられる。多分、 SRC-1は、基本的転写機構と共にレセプター相互作用を促進することにより、レ セプター活性を高めるであろう。 SRC-1がPRのトランス活性化へのRU486のアンタゴニストとしての影響を変化さ せることができないと言う発見は、重要な所見である。この結果は、SRC-1は、 アンタゴニスト存在下ではインビトロおよび完全細胞内の両方で、PRと効果的に 相互作用しないとの我々の所見と一致する。我々およびその他の人々は、おそら く、変化した構造がアンタゴニスト−レセプター複合体をレセプター仲介トラン ス活性化に必要とされるその他の因子と相互作用することのできないようにする との事実により、アンタゴニストRU486がレセプタートランス活性化能力を損な うレセプター分子内の明確な配座の変化を誘導することを、以前から示唆してき た（El-Ashry，D.ら、1989，Mol．Endocrinol.，3，1545-1558；Vegeto，E.ら、 1992，Cell，69，703-713；Allan，G．F.ら、1992a，J．Biol．Chem.，267，195 13-19520；Allan，G．F.ら、1992b，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89，11750-1 1754；DeMarzo，A．M.ら、1992，Biochem.，31，10492-10501）。 我々の最近の発見は、アゴニストにより誘導される正確な配座の変化がその共 活性化因子、SRC-1、と相互作用するレセプターに必要であることを実証する。S RC-1は転写開始を確立するアゴニスト結合レセプター複合体を好んで認識し識別 するらしいので、SRC-1と効果的に相互作用するアンタゴニスト結合レセプター の無能力は、完全な細胞へのホルモンアンタゴニスト投与の生物学的結果、導か れると、我々は主張する。 III．SRC-1はステロイドレセプタースーパーファミリーの共活性化因子である ステロイドレセプタートランス活性化因子を強める細胞内タンパク質の存在は 、生物学的研究および遺伝学的研究の両方から示唆されている（Meyer，M．E.ら 、1989，Cell，57，433-442；Bocquel，M．T.ら、1989，Nucleic Acids Res.，1 7,2581-2594；Conneely，O．M.ら、1989、「ニワトリのプロゲステロンレセプタ ーのプロモーター特異的活性化ドメイン(Promoter specific activating domain s of the chicken progesterone receptor)」、Gene Regulation by Steroid Ho rmones IV，A．K．RoyおよびJ．Clark編、（New York，Berlin，Heidelberg，Lo ndon，Paris，Tokyo：Springer-Verlag）、220-223；Tasset,D.ら、1990，Cell ，62，1177-1187；Shemshedini，L．ら、1992，J．Biol．Chem.，261，1834-183 9；Berkenstam，A．ら、1992，Cell，69，401-412）。最近の研究では、酵母タ ンパク質SSN6（McDonnell，D．P．ら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89 ，10563-10567）、SPT6（Baniahadら、1995），（Baniahmad，C．ら、1995,Mol ．Endocrinol.，9，34-43）、SIN3（Nawaz，Z．ら、1994，Mol．Gen．Genet.，2 45，724-733）、SNF2/SWI2（Yoshinaga，S．K.ら、1992，Science，258，1598-1 604；Chiba，H.ら、1994，Nucleic Acids Res.，22，1815-1820；Laurent，B．C .ら、1993，Genes and Dev.，7，583-591）およびER、PRおよびGRの制御タンパ ク質としての可能性のあるヒトのhbrmタンパク質相同体（Muchardt，C．およびY aniv，M.，1993、EMBO J.，12，4279-4290；Singh，P.ら、1995，Nature，374， 562-565）が同定された。 これらの因子のあるものは、活性化因子と同等に機能して、クロマチン構造に 影響を及ぼすことにより転写を強化し、それにより、遺伝子転写へのクロマチン の抑制影響を和らげると考えられる。クロマチンに影響を及ぼすヌクレオソーム の構造の変化も、ステロイド−ホルモン作用に包含される（Archer，T．K.ら、1 992，Science，255，1573-1576；Schi1d，C.ら、1993，EMBO J.，12，423-433； Truss，M.ら、1995，EMBO J.，14，1737-1751）。ステロイドレセプターのトラ ンス活性化へのこれらの因子の影響は、間接的な影響であるかもしれない。 hbrmタンパク質の配列分析から、様々な転写因子であるタンパク質−タンパク 質の相互作用に重要であると考えられるブロモドメイン（bromodomain）の間の 保存されたドメインの存在が示された（Haynes，S．R.ら、1992，Nucleic Acids Res.，20，2603）。さらに、それは、ＤＮＡ複製の期間中のクロマチンの脱縮 合（decondensation）にかかわることが知られている推定のヘリカーゼドメイン を含む（Laurent，B．D.ら、1993，Genes and Dev.，7，583-591）。GRトランス 活性化をアップ制御（upregulate）するhbrmタンパク質の能力は、Rbタンパク質 、細胞周期制御タンパク質、の共発現に依存し、そして再び、クロマチン構造の 変化を伴うことができる（Singhら、1995）。さらに、タンパク質を含むマウス のブロモドメイン、TIF-1（Le Douarin，B.ら、1995，EMBO J.，14，2020-2033 ）、ヒトのアダプターSug-1の相同体、甲状腺レセプター相互作用タンパク質、T rip-1（Leeら、1995b）、ならびにその他のTrips（Seol，W．ら、1995，Mol．En docrinol.，9，72-85；Leeら、1995a）が分離され、そしてこれらはリガンド− 依存性ステロイドレセプタートランス活性化のモジュレーター（modulator）お よび／またはメディエーター（mediator）として包含されてきた。 リガンド−依存性相互作用の証拠は、これらのタンパク質の大多数に関して提 供されるが、共通活性化因子機能を示す明確な証拠は示されていない。リガンド −依存性様式で、ERと物理的に相互作用するその他のほとんど特徴付けられてい ないタンパク質も記載されてきたが、その機能的役割については評価されていな い（Halachmi，S.ら、1994，Science，264，145-1458；Cavailles，V.ら、1994, Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91，10009-10013）。SRC-1は、上記のタンパク質 に対するいかなる有意な相同体も共有せず、また、同様の機能的規範的（canoni cal）なドメインも含まない。それ故、SRC-1が転写の速度を変化させるメカニズ ムは異なるらしい。 ステロイドレセプターの共活性化因子としてのSRC-1の役割はこの報告で証明 されるが、我々はクロマチン構造への潜在的影響を除外することはできない。に もかかわらず、我々の証拠は、SRC-1がレセプタータンパク質と直接接触するこ とにより作用して、その活性を修飾することを示す。レセプター仲介転写を刺激 し、異なるステロイドレセプター間の抑制を逆行させるSRC-1の能力は、これら の相互作用が関連しており、インビボで多分生じることを確証させる。ステロイ ドレセプターが転写開始前の複合体を安定化できるという以前の所見（Tsai，S. Y.ら、1990，J．Biol．Chem.，265，17055-17061；Klein-Hitpass，L.ら、1990, Cell，60，247-257）は、SRC-1がこのプロセスを促進できることを我々に推測さ せる。 レセプター−相互作用領域を含むＮ-末端切除型のSRC-1が支配的な負の様式で 作用するという所見は、SRC-1のＮ-末端領域が基本的転写機構および／またはＲ ＮＡポリメラーゼそれ自身との相互作用に応答することを示唆する。これらの相 互作用は、多段階のステロイドレセプタートランス活性化過程でのキーとなる制 御事実を示す。 IV．SRC-1ポリペプチドをコードする核酸 本明細書中に記載された分離された核酸分子と機能的に等価なものは、本発明 の範囲内に含まれる。遺伝子コードの縮重は、同じアミノ酸を特定しよって同じ タンパク質を生じるはずの他のコドンによる、特定のコドンの置換を許容する。 メチオニンおよびトリプトファンを除いて、既知のアミノ酸は、一つより多くの コドンによりコードされうるため、実質上、核酸配列を変えることができる。従 って、SRC-1遺伝子の部分または全体を合成して、図１に示す配列とは明らかに 異なる核酸配列を提供することもできる。しかしながら、それによってコードさ れるアミノ酸配列は保存されるはずである。 さらに、核酸配列は、結果として、図１に示す核酸の式の５'-末端および／ま たは３'-末端に少なくとも一つのヌクレオチドを付加、欠失または置換すること から生ずるヌクレオチド配列およびその誘導体を含んでよい。そのような付加、 欠失または置換がヌクレオチド配列によってコードされる図１のアミノ酸配列を 変えない限り、任意のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、この点に関して 用いることができる。例えば、本発明は、本発明の核酸配列またはその誘導体の ５'-末端に開始コドンとしてATGを付加すること、または本発明のヌクレオチド 配列またはその誘導体の３'-末端に終止コドンとしてTTA、TAGまたはTGAを付加 することから生じる任意の核酸配列を含むつもりである。さらに、本発明の核酸 分子は、必要であれば、その５'-末端および／または３'-末端に付加した制限エ ンドヌクレアーゼ認識部位を持つことができる。 与えられた核酸配列のそのような機能的変化は、それに融合させた外来の核酸 配列によってコードされた異種タンパク質の分泌および／またはプロセシングを 促進する機会を与える。遺伝子コードによって許されるSRC-1遺伝子のヌクレオ チド配列およびそのフラグメントの変異のすべては、それ故に、本発明に含まれ る。 さらに、コドンを欠失すること、または縮重コドン以外のコドンによって一つ あるいはそれより多くのコドンを置換して、構造的に修飾されたポリペプチドで あるが、未修飾の核酸分子によって産生されるポリペプチドと実質的に同一の有 効性または活性を持つポリペプチド、を作り出すことことも可能である。当技術 分野で認識されているように、核酸分子間の差が遺伝子コードの縮重と関係して いない場合も、二つの核酸分子はそのような生成物を生じさせるので、２つのポ リペプチドは、機能的に等価である。 Ｖ．SRC-1検出用核酸プローブ 本発明の核酸プローブは、通常のハイブリダイゼーション方法により、本発明 のその他の核酸分子を得るための、適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリーの プローブとして用いてよい。染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、この 技術分野で認識された方法に従って、適当な細胞から調製してよい（参照、”Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual”、第二版、Sambrook，FritschおよびM aniatis編、Cold Spring Harbor Laboratory，1989）。 別法として、興味あるポリペプチドのアミノ酸配列のＮ-末端およびＣ-末端部 分と関連するヌクレオチド配列を持つ核酸プローブを得るために、化学合成を行 う。このようにして、合成された核酸プローブは、本発明のフラグメントを得る ために適当な染色体またはｃＤＮＡライブラリーを用いて、認知されたＰＣＲ技 術に従って、本質的に、ＰＣＲプロトコール、”A Guide to Methods and Appli cations”、Michaelら編、Academic Press，1990に従って行われるポリメラーゼ 鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いることができる。 当業者らは、この技術分野に既知のコンピューターアライメント（alignment ）法および配列分析法を用いて、本明細書中に開示された配列に基づいて、容易 に そのようなプローブを設計することができる（参照、”Molecular Cloning：A L aboratory Manual”、第二版、Sambrook，FritschおよびManiatis編、Cold Spri ng Harbor Laboratory，1989）。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、 放射能標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光およびそ の類似標識等のような標準的標識技術によって標識することができる。ハイブリ ダイゼーション後、既知の方法を用いて、プローブを可視化することもできる。 本発明の核酸プローブは、この技術分野で既知の技術を用いて作り出されるプ ローブのような、ＲＮＡならびにＤＮＡプローブを含む。核酸プローブは、固体 支持体上に固定化することができる。そのような固体支持体の例としては、これ らに限定されるわけではないが、ポリカーボネートのようなプラスチック、アガ ロースおよびセファロースのような炭水化物複合体、ならびにポリアクリルアミ ドおよびラテックスビーズのようなアクリル樹脂が含まれる。そのような固体支 持体に核酸プローブをカップリングさせる技術は、この技術分野では良く知られ ている。 本発明の核酸プローブ化法に適当な試験サンプルとしては、例えば、細胞ある いは細胞の核酸抽出物、または体液が含まれる。上記の方法に用いられるサンプ ルは、アッセイフォーマット、検出法、およびアッセイされる組織、細胞または 抽出物の種類に基づいて変わるであろう。細胞の核酸抽出物を調製する方法は、 この技術分野では良く知られており、用いられる方法に適合するサンプルを得る ために、容易に適合させることもできる。 VI．SRC-1を検出するためのプローブを基本とした方法およびキット サンプル内のSRC-1の存在を検出する一つの方法は、ａ）ハイブリダイゼーシ ョンが起こるような条件下で、上記の核酸プローブと前記サンプルを接触させ、 そして、ｂ）前記核酸分子に結合した前記プローブの存在を検出する、ことを含 む。当業者は、上記のような既知の技術に従って、核酸プローブを選択するであ ろう。試験されるサンプルには、これらに限定すべきではないが、ヒト組織のＲ ＮＡサンプルが含まれる。 サンプル内のSRC-1の存在を検出するキットは、中に上記の核酸プローブを配 置した少なくとも一つの容器手段を含む。さらに、キットは、一つあるいはそれ より多くの以下の物：洗浄剤および結合した核酸プローブの存在を検出する能力 を持つ試薬：を含む他の容器を含むんでよい。検出試薬の例としては、これらに 限定されるわけではないが、放射能標識されたプローブ、酵素標識されたプロー ブ（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）およびアフィニテ ィ標識されたプローブ（ビオチン、アビジンまたはストレプトアビジン）が含ま れる。 詳細には、仕切られたキットは、分かれた容器内に試薬が含まれる任意のキッ トを含む。そのような容器は、小ガラス容器、プラスチック容器または細長い一 片のプラスチックまたは紙を含む。そのような容器では、サンプルおよび試薬が 互いに汚染されることがないように、一つの区画からもう一つの区画に試薬を効 率よく移すことが可能であり、また、それぞれの容器の試薬または溶液を一つの 区画からもう一つの区画に定量様式で加えることができる。そのような容器には 、試験サンプルを受け入れるであろう容器、アッセイに用いられるプローブまた はプライマーを含む容器、（リン酸緩衝塩類溶液、トリス−バッファーおよびそ の類似溶液のような）洗浄剤を含む容器、ハイブリダイズしたプローブ、結合し た抗体、増幅された生成物、またはその類似物等を検出するために用いられる試 薬を含む容器、を含むであろう。当業者は、本発明に記載された核酸プローブを 、この技術分野で周知の確立されたキットフォーマットの一つの中に容易に取り 込みうることを、容易に認識するであろう。 VII．SRC-1核酸分子を含むＤＮＡ構築物およびこれらの構築物を含む細胞 また、本発明は、５'から３'、宿主細胞内での転写の開始に有効なプロモータ ー、および上記の核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子に関する。さらに、本発明は 、ベクターおよび上記の核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。また、本発 明は、細胞内で機能する転写領域、上記のポリペプチドに関係するアミノ酸配列 をコードするＲＮＡ配列に相補的な配列、および前記細胞内で機能する転写終止 領域、を含む核酸分子に関する。上記の分子は、単離された、および／または精 製されたＤＮＡ分子であってよい。 また、本発明は、上記の核酸分子を含む細胞または生物体に関する。ペプチド は、ペプチドを発現するように変化させた細胞から精製することができる。細胞 が、遺伝子操作を通して、正常では生成しない、または正常では低いレベルでし か生成しないタンパク質を生成するように作られた場合、その細胞は、「所望の ペプチドを発現するように変化させた」と言われる。当業者は、ゲノム、ｃＤＮ Ａ、または合成配列のいずれかを、真核細胞または原核細胞のいずれかの内に導 入し発現させる方法に容易に適合させることができる。 ＤＮＡのような核酸分子は、それが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチ ド配列を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に 「機能するように連結されている」ならば、ポリペプチドを「発現する能力を持 つ」と言われる。機能するような連結とは、ＤＮＡ制御配列および発現させよう とするＤＮＡ配列が遺伝子配列の発現を許すような方法で結合される連結である 。遺伝子配列の発現に必要な制御領域の正確な姿は、生物体によって変わりうる が、一般的には、原核生物では、（ＲＮＡ転写の開始を直示する）プロモーター 、ならびに、ＲＮＡに転写された場合に合成開始の信号を出すＤＮＡ配列の両方 を含む、プロモーターを含むであろう。そのような領域は、標準的には、TATAボ ックス、キャッピング配列、CAAT配列およびその類似配列等のような、転写およ び翻訳の開始を含むそのような５'-非コード配列を含むであろう。 所望であれば、SRC-1をコードする配列の３'非コード領域を、上記の方法によ って得ることができる。この領域を、終止およびポリアデニル化のような、その 転写終止制御配列として残すこともできる。従って、SRC-1遺伝子をコードする ＤＮＡ配列に本来隣接する３'−領域を残すことによって、転写終止シグナルを 提供することができる。転写終止シグナルが発現宿主細胞内で充分に機能しない 場合には、後に、宿主細胞内で機能する３'領域に置き換えることもできる。 （プロモーター領域配列およびSRC-1配列のような）２つのＤＮＡ配列は、２ つのＤＮＡ配列間の連結の姿が、（１）結果としてフレームシフト変異の導入を 生じない、（２）SRC-1遺伝子配列の転写を直示するプロモーター領域配列の能 力を妨害しない、または（３）プロモーター領域配列によって転写されるSRC-1 遺伝子配列の能力を妨害しない、場合に、機能するように連結されていると言わ れる。従って、プロモーターがそのＤＮＡ配列の転写をもたらす能力を持つなら ば、プロモーター領域はＤＮＡ配列に機能するように連結されているであろう。 このように、SRC-1遺伝子を発現するためには、適当な宿主によって認識される 転写および翻訳シグナルが必要である。 本発明は、原核細胞かまたは真核細胞のいずれかでの、SRC-1遺伝子（または その機能的誘導体）の発現を包含する。原核生物宿主は、一般的には、組換えタ ンパク質の生成に非常に有効かつ便利であり、それ故、SRC-1遺伝子の好ましい 発現系の一つの型である。原核生物は、大腸菌の様々な株によって代表されるこ とが最も多い。しかしながら、その他の細菌の株を含む、その他の微生物の株も また、用いることができる。 原核生物系では、宿主に適合する種から誘導された複製部位および調節配列を 含むプラスミドベクターを用いることができる。適当なプラスミドベクターの例 としては、pBR322、pUC118、pUC119、およびその類似物等が含まれて良く；適当 なファージまたはバクテリオファージのベクターには、γgt10、γgt11およびそ の類似物等が含まれて良く；さらに、適当なウイルスベクターには、pMAM-neo、 pKRCおよびその類似物等が含まれて良い。好ましくは、本発明の選択されたベク ターは、選択された宿主細胞内で複製する能力を持つ。 認知された原核生物宿主には、大腸菌、バチルス（Bacillus）、ストレプトマ イセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）、サルモネラ（Salmo nella）、セラチア（Serratia）、およびその類似物等が含まれる。しかしなが ら、そのような条件下では、ペプチドは、グルコシル化されないであろう。原核 生物宿主は、発現プラスミド内のレプリコンおよび調節配列と適合しなくてはな らない。 原核生物細胞内でSRC-1（またはその機能的誘導体）を発現させるためには、 機能する原核生物プロモーターにSRC-1配列を機能するように連結させることが 必要である。そのようなプロモーターは、構成的であるか、またはより好ましく は、制御能力を持つ（即ち、誘導可能または抑制可能）かのいずれかであってよ い。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージλのintプロモータ ー、pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のblaプロモーター、およびpBS322の クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のCATプロモータ ー、ならびにその類似プロモーターを含む。誘発性原核生物プロモーターの例と しては、バクテリオファージλの主要な右および左プロモーター（Ｐ_LおよびＰ_R ）、大腸菌のtrp、recA、lacZ、lacIおよびgalプロモーター、枯草菌のα−アミ ラーゼ（Ulmanenら、J．Bacteriol.，162：176-182，1985）およびζ−２８−特 異的プロモーター（Gilmanら、Gene sequence，32：11-20、1984）、バチルス（ Bacillus）のバクテリオファージのプロモーター（Gryczan，The Molecular Bio logy of the Bacilli，Academic Press，Inc.，NY，1982）ならびにストレプト マイセスプロモーター（Wardら、Mol．Gen．Genet.，203：468-478，1986）が含 まれる。原核生物のプロモーターは、Glick（J．Ind．Microbiot.，1：277-282 ，1987）；Cenatiempo（Biochemie，68：505-516，1986）；およびGottesman（A nn．Rev．Genet.，18：415-442，1984）に論評されている。 また、原核細胞内での適当な発現は、遺伝子配列−コード配列の上流にリボゾ ーム結合部位の存在を必要とする。そのようなリボゾーム結合部位は、例えば、 Goldら、Ann．Rev．Microbiol.，35：365-404，1981、に開示されている。調節 配列、発現ベクター、形質転換法およびその類似物等の選択は、遺伝子の発現に 用いられる宿主細胞の型に依存する。本明細書中に用いられる「細胞」、「細胞 系」および「細胞培養」は、交換して用いることもでき、そのような名称のすべ ては子孫を含む。従って、言葉「形質転換体（transformants）」または「形質 転換細胞（transformed cells）」は、伝達回数に関係なく、それから誘導され た一次従属細胞および培養物を含む。また、すべての子孫のＤＮＡ含有量は、あ らかじめ考えうる突然変異または不注意による突然変異によって、正確には同一 ではないことが分かる。しかしながら、定義したように、突然変異した子孫は、 最初に形質転換された細胞のそれと同じ機能性を持つ。 本発明の発現システムに用いることのできる宿主細胞は、それらが興味あるSR C-1ペプチドの発現に用いるに適当である限り、厳密には制限されない。従って 、ATCCカタログに見出されるような任意の主要なヒト細胞系を用いることができ る。適当な宿主には、時として、真核生物細胞が含まれても良い。望ましい真核 生物宿主には、例えば、酵母、真菌、昆虫細胞、インビボまたは組織培養物中の いずれかの哺乳動物細胞が含まれる。宿主として有用であろう哺乳動物細胞には 、ヒーラ（HeLa）細胞、VEROあるいはCHO-K1のような繊維芽細胞起源の細胞、ま たは リンパ系起源の細胞およびそれらの誘導物が含まれる。望ましい哺乳動物宿主細 胞には、正確な翻訳後プロセシングによりよい能力を提供することのできる、SP 2/0およびJ558Lが含まれる。 さらに、植物細胞もまた、宿主として入手可能であり、また、カリフラワーモ ザイクウイルス３５Ｓおよび１９Ｓ、ノパリンシンターゼプロモーターならびに ポリアデニル化シグナル配列のように、植物細胞に適合する調節配列もまた、入 手可能である。その他の好ましい宿主は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ の幼虫である。宿主として昆虫細胞を用いると、ショウジョウバエのアルコール デヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる（Rubin，Science，240：1 453-1459，1988）。代わりに、昆虫細胞内で大量のSRC-1を発現させるために、 バキュロウイルスベクターを巧みに処置することもできる（Jasny，Science，28 3：1653，1987；Millerら、Genetic Engineering，1986，Setlow，J．K.ら編、P lenum、第８巻、277-297頁）。 解糖系酵素をコードする活性な発現される遺伝子配列から採用されたプロモー ターおよび終止エレメントが、グルコースを多く含む培地内で酵母を増殖させた 場合に、大量に作り出される、任意の一連の酵母遺伝子配列の発現システムを用 いることができる。また、既知の解糖系遺伝子配列は、非常に有効な転写調節シ グナルを提供することができる。酵母は、翻訳後のペプチド修飾を遂行すること ができると言う、実質的な利点を提供する。酵母内での所望のタンパク質の生産 に利用することのできる強いプロモーター配列および高コピー数のプラスミドを 用いる、数多くの組み換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母は、クローン化された哺 乳動物遺伝子配列上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチド（例 えば、プレ−ペプチド）を分泌する。哺乳動物宿主に関して、SRC-1を発現する いくつかの可能なベクターシステムを入手することができる。 宿主の性質に応じて、広範囲の転写および翻訳制御配列を用いることができる 。転写および翻訳制御シグナルは、アデノウイルス、ウシのパピローマウイスル 、シトメガロウイルス、パポバウイルス、またはその類似ウイルス等のような、 調節シグナルが高レベルに発現される特別な遺伝子配列と関係する、ウイルスを 起源として誘導することができる。代わりに、アクチン、コラーゲン、ミオシン 、 およびその類似物等のような、哺乳動物発現生成物からのプロモーターを用いる こともできる。抑制または活性化を許す、転写開始制御シグナルを選択すること ができ、そうすることによって遺伝子配列の発現を修飾することができる。温度 感受性の制御シグナルは興味深く、温度を変化させることによって、発現を抑制 あるいは開始することができるか、または（代謝のような）化学制御に委ねるこ ともできる。用いることのできるその他の制御シグナルは、米国特許第5,364,79 1号および米国特許出願07/939,246、1993年９月２日提出（その両方をここに任 意の図面を含むその全体を参照として編入する）に記載されている。 真核生物宿主内でのSRC-1の発現は、真核生物の制御領域の使用を必要とする 。そのような領域は、一般的には、ＲＮＡ合成の開始を直示するに充分なプロモ ーター領域を含むであろう。好ましい真核生物プロモーターには、例えば、マウ スのメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Hamerら、J．Mol．Appl．G en.，1：273-288，1982）、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight，C ell，31：355-365，1982）；SV40初期プロモーター（Benoistら、Nature，Londo n，290：304-310，1981）；酵母のgal4遺伝子配列プロモーター（Johnstonら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA，79：6971-6975，1982；Silverら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，81：5951-5955，1984）が含まれる。 真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードするコドンで開始され る。このため、真核生物のプロモーターとSRC-1をコードするＤＮＡ配列との間 の結合が、メチオニンをコードする能力を持つ（例えば、ＡＵＧ）いかなる介在 コドンをも含まないことを確実にするのが好ましい。そのようなコドンの存在は 、結果として、（もし、ＡＵＧコドンがSRC-1コード配列として同一のリーディ ングフレーム内にあるならば）融合タンパク質の形成、または（もしＡＵＧコド ンがSRC-1コード配列として同一のリーディングフレーム内にないならば）フレ ームシフト突然変異のいずれかを生じる。 SRC-1核酸分子および機能するように連結されたプロモーターは、直鎖状分子 、またはより好ましくは、閉環した共有結合の環状分子のいずれであってもよい 、複製しないＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子として、レシピエントの原核細胞また は真核細胞のいずれかの内に導入することが出来る。そのような分子は、自律複 製 の能力を持たないので、遺伝子の発現は、導入された配列の一過性の発現を通し て起こりうる。代わりに、恒常的な出現は、宿主染色体内に導入されたＤＮＡ配 列の組込みを通して起こりうる。 宿主細胞染色体内に所望の遺伝子配列を組み込む能力を持つベクターを用いる こともできる。それらの染色体内に導入されたＤＮＡを安定に組込んだ細胞もま た、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする一つまたはそれより多くの マーカーを導入することによって、選択することができる。マーカーは、原栄養 体に栄養要求性宿主、生命致死剤耐性、例えば抗生物質、あるいは銅のような重 金属、またはその類似物等を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子 配列は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接連結できるか、または同時トランス フェクション（cotransfection）によって同一細胞内に導入できるかのいずれか である。また、さらなるエレメントも、タンパク質を結合する一本鎖ｍＲＮＡの 最適な合成のために必要であろう。これらのエレメントには、スプライスシグナ ル、ならびに転写プロモーター、エンハンサーおよび終止シグナルが含まれて良 い。そのようなエレメントを組み込むｃＤＮＡ発現ベクターは、Okayama，Molec ．Cell Biol.，3：280，1983、に記載されたそれらを含む。 導入された核酸分子は、レシピエント宿主内の自律複製できるプラスミドまた はウイルスベクター内に取り込むことができる。広範囲の任意のベクターを、こ の目的のために用いることができる。特別なプラスミドまたはウイルスベクター の選択に重要な因子は、ベクターを含むレシピエント細胞を、ベクターを含まな いそれらのレシピエント細胞から認別でき選択できる簡単さ；特定の宿主内で所 望されるベクターのコピー数；および、異なる種の宿主細胞間でベクターを「シ ャトル」できることを望むか否か；を含む。 好ましい原核生物ベクターには、例えば、pBR322、ColE1、pSC101、pACYC184 、πVXのような、大腸菌内で複製できるそれらのようなプラスミドが含まれる。 そのようなプラスミドは、例えば、Sambrook（参照、”Molecular Cloning：A L aboratory Manuar”、第二版、Sambrook，FritschおよびManiatis編、Cold Spri ng Harbor Laboratory，1989）によって開示されている。バチルス（Bacillus） プラスミドには、pC194、pC221、pT127、およびその類似プラスミドが含まれる 。 そのようなプラスミドは、Gryczan、”The Molecular Biology of the Bacilli ”、Academic Press，NY、1982、307-329頁、に開示されている。適当なストレ プトマイセスのプラスミドには、p1J101（Kendallら、J．Bacteriol.，169：417 7-4183，1987）、およびΦC31のようなストレプトマイセスのバクテリオファー ジ（Chaterら、”Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology ”、Akademiai Kaido,Budapest，Hungary，1986、45-54頁）が含まれる。シュー ドモナスのプラスミドは、Johnら、Rev．Infect．Dis.，8：693-704，1986およ びIzaki，Jpn．J．Bacteriol.，33：729-742，1978、に論評されている。 好ましい真核生物のプラスミドには、例えば、BPV、ワクシニア、SV40、２− ミクロンサークル（２−micron circle）、アデノウイルス、レトロウイルス、 およびその類似プラスミド、またはそれらの誘導体等が含まれる。そのようなプ ラスミドは、この技術分野では良く知られている（Botsteinら、Miami Wntr．Sy mp.，19：265-274，1982；Broach，”The Molecular Biology of the Yeast Sac charomyces：Life Cycle and Inheritance”，Cold Sring Harbor Laboratory． Cold Spring Harbor，NY，445-470頁、1981；Broach，Cell，28：203-204，1982 ；Bollonら、J．Ctin．Hematol．Oncol.，10：39-48，1980；Maniatis，Cell Bi ology：A Comprehensive Treatise”、第３巻、Gene Sequence Expression，Aca demic Press，NY，563-608，1980）。 ひとたび、構築物を含むベクターまたは核酸分子が発現するように調製された ならば、任意の様々な適当な手段、例えば、形質転換、トランスフェクション、 接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カル シウム沈殿、直接マイクロインジェクション、およびその類似方法、によって、 ＤＮＡ構築物を、適当な宿主細胞内に導入することができる。ベクターを導入し た後、レシピエント細胞を、ベクター含有細胞の増殖を選択する、選択培地内で 増殖させる。クローン化された遺伝子分子の発現は、結果としてSRC-1またはそ のフラグメントを生産する。このことは、形質転換された細胞内で、または分化 するこれらの細胞の導入に続いて（例えば、神経芽腫細胞またはその類似細胞へ のブロモデオキシウラシルの投与によって）、起こる。本発明のペプチドを形成 するために、様々なインキュベーション条件を、用いることができる。最も好ま しい条件は、生理学的条件をまねた条件である。 VIII．精製されたSRC-1ポリペプチド その他の態様では、本発明は、分離されたか、富裕にされたか、または精製さ れたSRC-1ポリペプチドの特徴を示す。 ポリペプチドに関する「分離された」とは、天然の起源から分離されたか、ま たは合成された、ポリペプチドを含む、互いに複合した２（好ましくは７、より 好ましくは１３、最も好ましくは２５）またはそれより多くのアミノ酸の一つの ポリマーを意味する。ある態様では、図１に示す４０２、４０７、４１３または ４２５の複合したアミノ酸を持つそれらのような、より長いポリペプチドが好ま しい。本発明の分離されたポリペプチドは、自然界では純粋または分離された状 態では見つからないと言う意味で、ユニークである。用語「分離された」の使用 は、自然発生の配列がその正常な細胞環境から切り離されていることを意味する 。それ故、配列は、無細胞溶液内にあるか、または異なる細胞の環境内に置かれ ていてよい。用語は、配列が存在する唯一のアミノ酸鎖であることを意味するも のではなく、それと自然界で関係する非アミノ酸物質を実質上含まない（少なく とも約９０−９５％純粋）ことを意味するものでもない。 ポリペプチドに関する用語「富裕にされた」の使用は、具体的なアミノ酸配列 が、正常細胞内あるいは病気の細胞内または配列を採取した細胞内より、興味あ る細胞または溶液内に存在する全アミノ酸全体の有意により高いフラクション（ ２−５倍）を構成することを意味する。このことは、存在する他のアミノ酸量が 優先的に減少すること、または興味ある特定のアミノ酸配列の量が優先的に増加 すること、またはこの２つの組み合わせ、を原因として生じうる。しかしながら 、富裕にされたは、存在する他のアミノ酸配列がないことを意味するものではな く、ちょうど、興味ある配列の比較量が有意に増加していることを意味するもの であることを特記しておかねばならない。用語「有意に」は、ここでは、増加の 程度がそのような増加を作り出す人にとって有効であることを示すために用いら れ、一般的には、他のアミノ酸と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは 少なくとも５−１０倍、またはそれより多い増加を意味する。また、用語は、そ の他の起源からのアミノ酸がないことを意味するものでもない。その他の起源 のアミノ酸とは、例えば、酵母、細菌ゲノム、またはpUC19のようなクローニン グベクターによってコードされるアミノ酸を含む。用語は、所望の核酸の割合を 上昇させるために人が介入するそのような状況のみをカバーすることを意味する 。 また、アミノ酸配列が精製された型であることは、いくつかの目的のために有 利である。ポリペプチドに関する用語「精製された」は、［均質標品（homogene ous preparation）のような］絶対的純度を要求せず；代わりに、配列が、天然 環境内より比較的純粋である（天然のレベルと比較して、このレベルが、例えば ｍｇ／ｍｌでは、少なくとも２−５倍大きいべきである）、と言う徴候を示す。 特に、少なくとの１桁の大きさ、好ましくは２または３桁、そしてより好ましく は４または５桁の大きさの精製が期待されている。物質は、好ましくは、機能的 に有意のレベル、例えば、９０％、９５％、または９９％の純度で、汚染物質を 含まない。 望ましい実施態様では、SRC-1ポリペプチドは、図１に示す全長配列の少なく とも２５、３０、３５、４０、５０、４２５、４３０、４３５、４４０または４ ５０の連続するアミノ酸、またはその機能的誘導体を含む。 その他の態様では、本発明は、組み換えSRC-1ポリペプチドまたはそのユニー クなフラグメントを含むポリペプチドについて記載する。「ユニークなフラグメ ント」とは、いかなるその他の自然発生ポリペプチドにも存在しない全長のSRC- 1ポリペプチド内に存在するアミノ酸配列を意味する。好ましくは、そのような 配列は、全長配列内に存在する６の連続するアミノ酸を含む。より好ましくは、 そのような配列は、全長配列内に存在する１２の連続するアミノ酸を含む。さら により好ましくは、そのような配列は、全長配列内に存在する１８の連続するア ミノ酸を含む。 「組換えSRC-1ポリペプチド」とは、その位置（例えば、自然中に見出される のと異なる細胞または組織内に存在する）、純度または構造のいずれかで、自然 発生のポリペプチドとは異なるような、組換えＤＮＡ技術によって生産されるポ リペプチドを含むことを意味する。一般的には、そのような組換えポリペプチド は、自然界で正常に認められる量とは異なる量で細胞内に存在することになる。 本発明のペプチドを得るために、この技術分野で知られている様々な方法論を 用いることができる。ペプチドは、ペプチドを自然に生成する組織または細胞よ り精製することができる。代わりに、上記の分離核酸フラグメントは、任意の生 物体内でSRC-1タンパク質を発現するために用いることができた。本発明のサン プルは、細胞、細胞のタンパク質抽出物あるいは膜抽出物、または生体液を含む 。サンプルは、アッセイフォーマット、検出方法、およびサンプルとして用いら れる組織、細胞または抽出物の姿を基にして、代わるであろう。 任意の真核生物体は、起源生物体が本発明ペプチドを自然に含む限りにおいて 、前記の本発明のペプチドの起源として用いることができる。ここで用いられる ように、「起源生物体」とは、サブユニットが発現され最終的に分離される生物 体にかかわらず、サブユニットのアミノ酸配列が誘導される元来の生物体をさす 。 当業者は、自然の不純物を含まないペプチドを得るためにタンパク質を分離す る既知の方法を容易に理解するであろう。これらには、限定するわけではないが 、限外ろ過クロマトグラフィー、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、および 免疫−アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。 IX．SRC-1ポリペプチドに結合アフィニティーを持つ抗体および抗体を含むハイ ブリドーマ もう一つの態様では、本発明は、SRC-1ポリペプチドに特異的な結合アフィニ ティを持つ抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）の特徴を 示す。抗体は、SRC-1ポリペプチドと特異的に結合する能力を持つアミノ酸配列 を含む。「特異的結合アフィニティー」とは、抗体が、特定条件下で他のポリペ プチドと結合するより高い特異性でSRC-1ポリペプチドと結合することを意味す る。 SRC-1ポリペプチドに特異的な結合アフィニティーを持つ抗体は、サンプルを 免疫複合体を形成するような条件下で抗体と接触させ、そしてSRC-1ポリペプチ ドと結合した抗体の存在および／または量を検出することによる、サンプル内の SRC-1ポリペプチドの存在および／または量を検出する方法に用いることができ る。そのような方法を実行する診断用キットは、抗体を含む第一容器手段、およ び抗体の結合相手および標識の複合体を含む第二容器手段を含むように、構築す ることができる。 その他の態様では、本発明は、SRC-1ポリペプチドに特異的結合アフィニティ ーを持つ抗体を生成するハイブリドーマの特徴を示す。「ハイブリドーマ」とは 、抗体、例えばSRC-1抗体を分泌する能力を持つ固定化細胞系（immortalized ce ll line）を意味する。好ましい実施態様では、SRC-1抗体は、SRC-1ポリペプチ ドを特異的に結合する能力を持つアミノ酸の配列を含む。 本発明は、SRC-1ポリペプチドと結合アフィニティーを持つ抗体に関する。ポ リペプチドは、図１に示したアミノ酸配列、あるいはその機能的誘導体、または それの少なくとも９の連続するアミノ酸（好ましくは、それの少なくとも２０、 ３０、３５、または４０の連続するアミノ酸）を持つことができる。 また、本発明は、SRC-1ポリペプチドに特異的な結合アフィニティーを持つ抗 体に関する。そのような抗体は、SRC-1ポリペプチドとの結合アフィニティーを 、もう一つのポリペプチドへの結合アフィニティーと比較することによって分離 することができる。SRC-1に選択的に結合するそれらは、SRC-1とその他のポリペ プチドの間の識別を必要とする方法に用いるために、選択されるであろう。その ような方法には、これらに限定されるわけではないが、その他のポリペプチドを 含む組織内でのSRC-1発現の変化の分析が含まれる。 本発明のSRC-1タンパク質は、抗体の生成のため、薬剤組成物の同定に用いる ため、およびＤＮＡ／タンパク質相互作用を研究するため、様々な手順および方 法に用いることができる。 本発明のSRC-1ペプチドは、抗体またはハイブリドーマを作り出すために用い ることができる。当業者は、抗体が所望されるならば、そのようなペプチドが本 明細書中に記載の方法に従って生成され、そして免疫原として用られるであろう ことを、認識しているであろう。本発明の抗体には、モノクローナルおよびポリ クローナル抗体、ならびにこれらの抗体のフラグメント、およびヒト化型が含ま れる。本発明の抗体のヒト化型は、キメラ化またはCDR移植のようなこの技術分 野で既知の方法の一つを用いて、作り出すことができる。また、本発明は、上記 のモノクローナル抗体またはその結合フラグメントを作り出すハイブリドーマに 関する。ハイブリドーマは、特異的モノクロナール抗体を分泌する能力を持つ固 定化細胞系である。 一般的に、モノクローナル抗体およびハイブリドーマを調製する技術は、この 技術分野は周知である（Campbell、”Monoclonal Antibody Technology：Labora tory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”，Elsevier Scienc e Publishers，Amsterdam，The Netherland，1984；St．Grothら、J．Immunol． Methods，35：1-21，1980）。抗体を生産することが知られている任意の動物（ マウス、ウサギ、およびその類似動物等）は、選択されたポリペプチドで免疫化 することが出来る。免疫化の方法は、この技術分野では周知である。そのような 方法には、ポリペプチドの皮下または腹膜内注射が含まれる。当業者は、免疫化 に用いたポリペプチドの量は、免疫化される動物、ポリペプチドの免疫原性およ び注射部位に基づいて変化するであろうことを認識する。 ポリペプチドは、ペプチドの免疫原性を増加するために、修飾したり、または アジュバント内に投与したりすることができる。ポリペプチドの免疫原性を増加 させる方法は、この技術分野で周知である。そのような方法は、（グロブリンま たはβ−ガラクトシダーゼのような）異種タンパク質との、または免疫化中のア ジュバントの包含を通しての、抗原の結合を含む。 モノクローナル抗体に関しては、免疫化した動物から脾臓細胞を取り除き、SP 2/0-Ag14メラノーマ細胞のようなメラノーマ細胞と融合させ、モノクローナル抗 体生成ハイブリドーマ細胞になるようにさせる。この技術分野で周知の数多くの 方法の内の任意の一つを用いて、所望の特徴を持つ抗体を生成するハイブリドー マ細胞を同定することができる。これらは、ELISAアッセイ、ウエスタンブロッ ト分析、またはラジオイムノアッセイでのハイブリドーマのスクリーニングを含 む（Lutzら、Exp．Cell Res.，175：109-124，1988）。所望の抗体を分泌するハ イブリドーマをクローン化し、当技術分野で既知の方法を用いて、そのクラスま たはサブクラスを決定する(Campbell，"Monoclonal Antibody Technology：Labo ratory Technique in Biochemistry and Molecular Biology"、上記、1984)。 ポリクローナル抗体に関しては、抗血清を含む抗体を免疫化した動物から分離 し、上記の方法の一つを用いて所望の特異性を持つ抗体の存在についてスクリー ニングする。上記の抗体は、検出可能なように標識することが出来る。抗体は、 ラジオアイソトープ、アフィニティー標識（ビオチン、アビジンまたはその類似 物等）、酵素標識（西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、お よびその類似酵素等）、蛍光標識（FITCまたはローダミンおよびその類似物等） 、常磁性原子、ならびにその類似物等の使用を通して検出可能なように標識する ことが出来る。そのような標識を成し遂げる方法は、この技術分野では周知であ る（例えば、Stembergerら、J．Histochem．Cytochem.，18：315，1970；Bayer ら、Meth．Enzym.，62：308，1979；Engvalら、Immunot.，109：129，1972；God ing，J．Immunol．Meth.，13：215，1976を参照のこと）。本発明の標識された 抗体は、特異的ペプチドを発現する細胞または組織を同定するために、インビト ロで、インビボで、および原位置でのアッセイに用いることができる。 また、上記の抗体は、固体支持体上に固定化する（immobilized）こともでき る。そのような固体支持体の例としては、ポリカルボン酸のようなプラスチック 、アガロースおよびセファロースのような炭水化物複合体、ポリアクリルアミド のようなアクリル樹脂、ならびにラテックスビーズが含まれる。そのような固体 支持体に抗体をカップリングさせるための技術は、この技術分野では周知である （Weirら、”Handbook of Experimental Immunology”、第４版、Blackwell Sci entific Publications，Oxford，England、第10章、1986；Jacobyら、Meth．Enz ym.，34，Academic Press，N．Y.，1974）。本発明の固定化された抗体は、イン ビトロで、インビボで、および原位置でならびにイムノクロマトグラフィーに用 いることができる。 さらに、当業者は、現在利用できる方法、ならびに抗体に関して上に開示され た技術、方法およびキットを容易に適合させて、合理的に設計された抗ペプチド −ペプチドを作り出すために、特異的ペプチド配列を結合する能力を持つペプチ ドを作り出すことができる（例えば、Hurbyら、"Application of Synthetic Pep tides：Antisense Peptides"、Synthetic Peptides，A User's Guide，W．H．Fr eeman，NY，289-307，1992、およびKaspczakら、Biochemistry，28：9238-9239 、1989、を参照のこと）。 抗ペプチド−ペプチドは、疎水性基および非荷電極性基を維持しながら、SRC- 1ペプチド配列内に見い出される塩基性アミノ酸残基を酸性残基と置換すること によって作り出すことができる。例として、リジン、アルギニンおよび／または ヒスチジン残基をアスパラギン酸またはグルタミン酸と置換し、グルタミン酸残 基をリジン、アルギニンまたはヒスチジンで置換する。 Ｘ．抗体に基づくSRC-1検出法及びキット 本発明は、試料中のSRC-1ポリペプチドを検出する方法であって、ａ）免疫複 合体が形成されるような条件下で試料を上記の抗体と接触させる段階と、ｂ）ポ リペプチドと結合した前記抗体の存在を検出する段階とを含む方法を包含する。 詳しく述べると、この方法は被検試料を本発明の抗体の一つ以上とインキュベー トして抗体が被検試料と結合したかどうかを調べる。試料中のSRC-1レベルが正 常レベルから変化している場合は疾患が考えられる。 抗体と被検試料とをインキュベートする条件は一定ではない。インキュベーシ ョン条件は、測定に用いる方式と、用いる検出方法、および測定に用いる抗体の 性質に依存する。一般に利用できる免疫測定方式（放射免疫測定法、酵素結合免 疫吸着検査法、オークターロニー拡散法、ロケット免疫蛍光検査など）のいずれ についても本発明の抗体の使用に適するように容易に変更しうることは当業者な ら認めるであろう。かような測定法の例は、Chard、「An Introduction to Radi oimmunoassay and Related Techniques」Elsevier Science Publishers社（オラ ンダ国アムステルダム）（1986年）、Bullock他、「Techniques in Immunocytoc hemistry」Academic Press社（米国フロリダ州オーランド）第１巻（1982年）、 第２巻（1983年）、第３巻（1985年）、Tijssen、「Practice and Theory of En zyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular B iology」Elsevier Science Publishers社（オランダ国アムステルダム）（1985 年）などに見られる。 本発明の免疫測定被検試料には、細胞、細胞のタンパク質又は膜の抽出物、或 いは血液、血清、血漿、尿などの生体液が含まれる。また、上記の方法で使用す る被検試料は測定方式、検出方法の性質、測定試料に用いられる組織、細胞、抽 出物の種類によって変化する。細胞のタンパク質又は膜の抽出物を調製する方法 は当技術分野では周知であり、利用する系で使用に耐える試料が得られるように これを変更することは容易である。 キットには、上記検出方法の施行に必要な試薬が全て含まれる。このキットは （１）上記の抗体を封じ込めた第１の容器手段と（２）抗体の結合相手と標識を 備える結合体とを封じ込めた第２の容器手段を含む。別の好ましい実施形態では 、このキットは洗浄試薬及び結合抗体の存在を検出しうる試薬の中から一つ以上 を封じ込めた１個以上のその他の容器をさらに含む。 検出試薬は、標識二次抗体、或いは一次抗体が標識されている場合は、これに 代わるものとして、標識抗体と反応しうる発色試薬、酵素試薬、又は抗体結合試 薬を含むが、これらに限定されない。この区画化キットは核酸プローブキットに ついて上記のとおりであってよい。本発明に記載の抗体が当技術分野で周知の既 成のキット方式のひとつに容易に組み込みうることは当業者なら容易に理解でき るであろう。 XI．SRC-1と相互作用を行なう化合物の分離 本発明はSRC-1ポリペプチドと結合しうる化合物の検出を行なう方法であって 、化合物をSRC-1と共にインキュベートする段階と、SRC-1と結合した化合物を検 出する段階を含む方法にも関する。この化合物は複雑な混合物、例えば血清、体 液、細胞抽出物などの中に存在する。 また、本発明はSRC-1活性のアゴニスト（作用物質）又はアンタゴニスト（拮 抗物質）を検出する方法であって、化合物が存在する状態でSRC-1を産生する細 胞をインキュベートする段階と、SRC-1の活性レベルの変化を検出する段階とを 含む方法にも関する。この方法で確認される化合物からは、その存在を示す活性 変化が生じる。この化合物は複雑な混合物、例えば血清、体液、細胞抽出物など の中に存在する。いったんこの化合物を確認すると、これは当技術分野で周知の 技術を使用すれば分離しうる。 本発明は、哺乳動物中でSRC-1に伴う活性をアゴニスト処理（刺激）又はアン タゴニスト処理する方法であって、前記アゴニスト処理又はアンタゴニスト処理 を果たすのに十分な量のSRC-1に対するアゴニスト又はアンタゴニストを前記哺 乳動物に投与する段階を含む方法をも包含する。SRC-1のアゴニスト又はアンタ ゴニストで哺乳動物の疾患を治療する方法であって、SRC-1に伴う機能をアゴニ スト処理又はアンタゴニスト処理するのに十分な量のアゴニスト又はアンタゴニ ストを哺乳動物に投与する段階を含む方法も、本出願に包含される。 XII．トランスジェニック動物 本発明に関連するトランスジェニック動物の作製には種々の方法が利用できる 。ＤＮＡは、細胞分裂開始後に、雄性前核と雌性前核が融合する前に受精卵の前 核内に注入することができ、或いは胚細胞（例えば２細胞胚細胞）内に注入する ことができる（Brinster等、Proc ．Nat．Acad，Sci．USA 82: 4438-4442（1985 年））。胚細胞にウイルスを、特に本発明の無機イオン受容体ヌクレオチド配列 を持つように修飾したレトロウイルスを感染させることが可能である。 胚細胞の内部細胞集団に由来し、安定培養された多能性幹細胞を培養時マニピ ュレーションを行なって本発明のヌクレオチド配列を取り込ませることができる 。里親に移植して満期を迎えさせる胚盤胞への移植を通じてトランスジェニック 動物の作製が可能である。トランスジェニック実験に適した動物はCharles Rive r社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）、Taconic社（米国ニューヨーク 州ジャーマンタウン）、Harlan Sprague Dawley社（米国インディアナ州インデ ィアナポリス）などの標準的な供給元から入手することができる。 齧歯動物胚のマニピュレーション法と受精胚前核へのＤＮＡのマイクロインジ ェクションとは当業者には周知である（Hogan等、前掲）。魚類、両生類の卵、 鳥類に対するマイクロインジェクションについてはHoudebine及びChourrout、Ex perientia 47: 897-905（1991年）に詳しい。ＤＮＡを動物組織に導入するその 他の方法が米国特許第4945050号（Sandford他、1990年７月30日）に記載されて いる。 例示にすぎないが、トランスジェニックマウスを作製するには雌マウスを誘導 して排卵過度にする。雌を雄と同居させ、交配した雌をＣＯ ₂ 窒息又は頸椎脱臼 により屠殺し、切除した卵管から胚を回収する。周囲の卵丘細胞を取り除く。次 いで前核胚を洗浄し、注入の時まで保存する。周期が無作為の成体雌マウスを精 管切除を施術した雄とつがわせる。被移植雌は移植提供雌と同時に雄と組み合わ せる。次いで胚を外科的に移植する。トランスジェニックラットの作成法はマウ スと同様である。Hammer等、Cell 63:1099-1112（1990年）参照のこと。 胚幹（ES）細胞の培養方法と、培養後に電気穿孔法、リン酸カルシウム／ＤＮ Ａ沈殿法、直接注入法などの方法を用いてES細胞へＤＮＡ導入を行なうことによ るトランスジェニック動物の作製方法も当業者には周知である。例えば、「Tera tocarcinomas and Embryonic Stem Cells ，A practical Approach 」E.J．Robert son編、IRL Press社（1987年）参照のこと。 無作為遺伝子組込みの場合、本発明の配列を含むクローンを耐性をコードする 遺伝子と同時トランスフェクトする。別法として、ネオマイシン耐性をコードす る遺伝子を本発明の配列と物理的に連結する。所望のクローンのトランスフェク ション及び分離は当業者には周知のいくつかの方法のいずれか一つにより行なわ れる（E.J．Robertson、前掲）。 ES細胞に導入されたＤＮＡ分子も同種組換えを通して染色体にトランスフェク トされる（Capecchi、Science 244: 1288-1292（1989年））。組換え事象（即ち 新しい耐性）のポジティブ選択（即ち新しい耐性及びガンシクロビル耐性）とそ の後のＰＣＲによる所望のクローンの確認がCapecchi（前掲）及びJoyner等（Na ture 338: 153-156（1989年））により記載されており、その教示を本明細書の 一部とする。この方法の最終段階は、標的ES細胞を胚盤胞に注入し、この胚盤胞 を偽妊娠雌に移植することである。得られたキメラ動物を飼育し、サザンブロッ ト法により子孫を分析して導入遺伝子を持つ個体を識別する。非齧歯類哺乳動物 とその他の動物を作製する方法が他の研究者により考察されている。Houdebine 及びChourrout、（前掲）、Pursel等、（Science 244:12811288（1989年））、 及びSimmsl等、（Bio/Technology 6:179-183（1988年））参照のこと。 XIII．遺伝子治療 SRC-1又はその遺伝子配列は遺伝子治療にも有用である（Miller、Nature 357: 455-460,（1992年）に総説されるとおり）。Millerは、進歩の結果ヒト遺伝子治 療の実際的な手法がもたらされ、ここに初めて肯定的な成果が示されたと述べて いる。遺伝子治療の基礎科学についてはMulligan、Science 260:926-931,（1993 年）に記載がある。 好ましい一実施形態では、SRC-1をコードする配列を含む発現ベクターを細胞 に導入し、この細胞を試験管内で培養した後に患者に多量に注入する。別の好ま しい一実施形態では、選択したプロモーター（例えば強力なプロモーター）を含 むＤＮＡ部分を、このプロモーター部分が細胞内SRC-1遺伝子の発現を強化する ように細胞内SRC-1を含む細胞に導入する（例えばプロモーター部分が細胞内SRC -1遺伝子と直接結合するようにプロモーター部分を細胞に導入する）。 この遺伝子治療には、腫瘍を標的としたSRC-1ｃＤＮＡを含むアデノウイルス 、組換え細胞の移植による全身性のSRC-1増加、又は裸のSRC-1ＤＮＡの適当な組 織への注入などの使用を含めてもよい。 標的細胞集団は、タンパク質複合体の活性を調節すべく形を変えた複合体成分 を一つ以上導入することにより変更しうる。例えば、細胞内の複合体成分活性を 低下又は抑制することにより、体の異常をもたらす異常なシグナル形質導入事象 が減少、抑制又は逆行される。異常な有害シグナル形質導入事象を抑制するため 、他のタンパク質成分と相互作用を行なう能力があるが、シグナル形質導入では 機能できない成分の欠失変異体又はミスセンス変異体を使用しうる。 組換えSRC-1タンパク質をコードするヌクレオチド配列（例えばｃＤＮＡ）の 標的細胞集団（例えば腫瘍細胞）への送達にはレトロウイルス、ワクシニアウイ ルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、数種類のＲＮ Ａウイルス、ウシ乳頭腫ウイルスなどに由来するウイルス発現ベクターを使用し うる。当業者には周知の方法を使用してコード配列を含む組換えウイルスベクタ ーを構築しうる。例えばManiatis他、「Molecular Cloning: A Laboratory Manu al 」（Cold Spring Harbor Laboratory社、米国ニューヨーク（1989年））、及 びAusubel他、「Current Protocols in Molecular Biology」（Greene Publishi ng Associates and Wiley Interscience社、米国ニューヨーク（1989年））に記 載の技術を参照のこと。これに代わるものとして、裸のＤＮＡとして、或いは標 的細胞に送達するための再構成系例えばリポソーム又はその他の系で、タンパク 質配列をコードする組換え核酸分子を使用しうる（例えばFeigner等、Nature 33 7：387-8（1989年）参照）。他にヒト遺伝子治療に使用できるものとしては、プ ラスミドＤＮＡを細胞に直接導入する方法が数種類存在し、これらの方法ではプ ラスミドＤＮＡをタンパク質と複合させることにより細胞上の受容体にＤＮＡの ターゲティングを行なう。Miller（前掲）を参照のこと。 最も簡単な形態では、遺伝子導入はマイクロインジェクション法を通じて微量 のＤＮＡを単に細胞の核に注入することにより施行しうる（Capecchi MR，Cell 22：479-88（1980年））。組換え遺伝子がひとたび細胞に導入されると細胞の通 常の転写翻訳機構によりこの遺伝子が認識され、遺伝子産物が発現される。ＤＮ Ａを比較的多数の細胞に導入する目的で他の方法も試みられた。これらの方法に は、ＤＮＡをcaPO₄と共沈させ、飲作用により細胞に取り込むトランスフェクシ ョン（Chen C.及びOkayama H.、Mol ．Cell Biol. 7:2745-52（1987年））、細胞 を高電圧のパルスに曝して穴を膜内部に導入する電気穿孔法（Chu G.等、Nuclei c Acids Res. ，15:1311-26（1987年）、標的細胞と融合する親油性の小胞にＤＮ Ａを封入するリポフェクション／リポソーム融合（Feigner PL．等、Proc ．Natl ．Acad．Sci．USA ，84:7413-7（1987年）、発射体と結合したＤＮＡを用いる粒 子衝撃（Yang NS.等、Proc ．Natl．Acad．Sci. 87:9568-72（1990年）などが含 まれる。ＤＮＡを細胞に導入する別の一方法はＤＮＡを化学修飾タンパク質と結 合させることである。 アデノウイルスタンパク質がエンドソームを不安定にし、ＤＮＡの細胞内への 取り込みを強化することができることも明らかにされた。ＤＮＡ複合体を含む溶 液にアデノウイルスを添加すること、或いはタンパク質架橋剤を用いてアデノウ イルスと共有結合したポリリジンにＤＮＡを結合することは組換え遺伝子の取り 込みをかなり改善する（Curiel DT等、Am ．J．Respir．Cell．Mol．Biol.，6:24 7-52（1992年））。 本明細書中で使用する「遺伝子導入」とは、外来の核酸分子を細胞内に導入す る過程の意味である。遺伝子導入は通常、その遺伝子によりコードされる特定の 産物の発現を可能にするために行なう。この産物にはタンパク質、ポリペプチド 、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素活性化ＲＮＡなどが含まれる 。遺伝子導入は培養細胞中で、或いは動物への直接投与により行なう。一般に、 遺伝子導入は非特異相互作用又は受容体による相互作用による核酸の標的細胞と の接触、膜を通すかエンド部位−シスによる核酸の細胞内への取り込み、及び原 形質膜から細胞質への核酸の放出の各プロセスを含む。発現には、それらに加え て細胞の核内への核酸の移動及び転写に適した核酸因子との結合が要求される。 本明細書中で使用する「遺伝子治療」とは、遺伝子導入の一形態であり、本明 細書中で使用する遺伝子導入の定義に含まれ、特に生体内又は試験管内で細胞か ら治療産物を発現する遺伝子導入である。遺伝子導入は後に患者に移植する細胞 について生体外で行なうことができ、また、核酸又は核酸‐タンパク質複合体を 患者に直接投与することによっても行なうことができる。 別の好ましい実施形態では、核酸配列が特定の組織中のみで発現する、SRC-1 をコードする核酸配列を有するベクターが提供される。組織特異遺伝子発現を達 成する方法は1992年11月３日出願、1993年５月13日公開の国際公開第WO93/09236 号に述べられている。 前記の以前の全ベクターにおいて、本発明の態様は、さらに、上で定義した核 酸配列の一部又は全部の追加、削除又は変更を、ベクターに含まれる核酸配列が 含んでよいことである。 別の好ましい実施形態では遺伝子置換を述べる。本明細書中で使用する「遺伝 子置換」とは、動物の生体内で発現することができ、それによって動物体内に欠 失又は欠損している内因性遺伝子の機能を提供若しくは増強しうる核酸配列を提 供する意味である。 SRC-1をコードする核酸配列は、例えばSRC-1をコードする核酸配列の裸のＤＮ Ａとしての外来性送達や特異担体と会合したＤＮＡによって、或いは適当な送達 ビヒクル、例えばリポソームによりイオン電気泳動、電気穿孔法、その他の薬理 学的に承認された送達方法の使用によって、所望の組織に対する核酸発現ベクタ ー中などで、予防的に投与したり、上に挙げた障害を有する患者に投与すること ができる。投与経路には筋肉内、静脈内、エアロゾル、経口（錠剤又は丸剤）、 局所、全身、眼、坐剤、腹腔内及び／又は髄腔内などが含まれる。 使用しうる送達方法としては次に挙げるものなどがある。 ａ．リポソームへの封入、 ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入、 ｃ．ほとんどの核タンパク質において見られる核標的部位を利用する核区画への 局在化、 ｄ．後に再移植又はトランスフェクト細胞を投与する生体外細胞のトランスフェ クション、 ｅ．ＤＮＡ輸送系 SRC-1核酸配列は、動物から細胞を取り出し、SRC-1核酸配列で形質導入し、動 物に再移植する細胞外手法を利用して投与しうる。動物から肝細胞を取り出し、 試験管内で肝細胞をSRC-1核酸配列により形質導入し、動物に再移植することに よる細胞外手法により肝臓に到達できる（例えばウサギについてはWilson、Hum ．Gene Ther. 3: 179-222，1992年に記載され、これを参照により本明細書の一 部とする）。 SRC-1核酸配列を細胞内に送達するために使用しうる非ウイルス技術は多く、 それには直接的な裸のＤＮＡの取り込み（例えばWolff等、Science 247: 1465-1 468（1990年）など）、受容体によるＤＮＡの取り込み、例えば肝臓内のアシア ログリコプロテインに取り込まれるアシアロオロソムコイドにカップリングした ＤＮＡの使用するもの（Wu及びWu、J ．Biol．Chem. 262: 4429-4432，1987年、W u等、J ．Biol．Chem. 266: 14338-14342（1991年）など、リポソームによる送達 （例えばKaneda等、Expt ．Cell Res. 173: 56-69（1987年）、Kaneda等、Scienc e 243: 375-378，1989年、Zhu等、Science 261: 209-211（1993年）など）など が含まれる。これらの物理的方法の多くは、互いに組み合わせることもウイルス 技術と組み合わせることも可能であり、受容体によるＤＮＡの取り込みの強化は 、例えばその受容体をアデノウイルスと組み合わせて使用することによって達成 できる（Curiel等、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88: 8850-8854（1991年）、Cr istiano等、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90: 2122-2126（1993年））。 SRC-1、或いはSRC-1ポリペプチド又はSRC-1タンパク質をコードする核酸は増 殖する細胞を支持する移植素子を介して投与してもよい。このようにすると細胞 は移植素子中にとどまり、本発明の有用な治療剤をそれまでどおり提供する。 「タンパク質」の語は、ペプチド結合により互いに結合した５〜５０個のアミ ノ酸から成る化合物を表す。「アミノ酸」は、重合してタンパク質となるサブユ ニットであり、普遍的に見られるアミノ酸は１２種類ある。アミノ酸の一般式は H₂N-CHR-COOHであり、式中、Ｒ基はハロゲン原子（アミノ酸のグリシンにある） から複素環（アミノ酸のトリプトファンにある）に至るいずれかでありうる。 XV．誘導体 また、本明細書中で提供するのはSRC-1の機能性誘導体である。「機能性誘導 体」の意味は「化学誘導体」、「フラグメント」、「変異体」、「キメラ」又は 「ハイブリッド」であり、これらの用語は以下で定義する。機能性誘導体は、タ ンパク質の機能、例えば複合体に特異的な抗体との反応性、酵素活性、又は非触 媒ドメインによる結合活性などの少なくとも一部を保持し、それによってこの誘 導体の本発明による有用性が可能となる。 「化学誘導体」は、通常はタンパク質の一部ではない付加的な化学成分を含む 。タンパク質又はペプチドの共有結合修飾は本発明の範囲内に含まれる。かよう な修飾は、以下で述べるようにペプチドの標的アミノ酸残基を選択した側基又は 末端基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることにより分子に導入される。 最も共通には、システイニル残基をクロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα ‐ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させてカルボキシメチル又はカ ルボキアミドシメチル誘導体を得る。システイニル残基はブロモトリフルオロア セトン、クロロアセチルリン酸、Ｎ‐アルキルマレイミド、３‐ニトロ‐２‐ピ リジルジスルフィド、メチル‐２‐ピリジルジスルフィド、ｐ‐クロロメルクリ ベンゾエート、２‐クロロメルクリ‐４‐ニトロフェノール、又はクロロ‐７‐ ニトロベンゾ‐２‐オキサ‐１，３‐ジアゾールとの反応により誘導される。 ヒスチジル残基はヒスチジル側基に対して比較的特異的であるため、ｐＨ5.5 〜7.0でジエチルピロカルボネートと反応させることにより誘導される。臭化ｐ ‐ブロモフェナシルも有用であり、反応はｐＨ6.0で0.1Ｍカコジル酸ナトリウム 中で行なうことが好ましい。 リシニル（lysinyl）残基及びアミノ末端残基をコハク酸又はその他のカルボ ン酸無水物と反応させる。これらの物質による誘導体化にはリシニル残基の電荷 を反転させる効果がある。残基を含む第１級アミンの誘導体化に適したその他の 試薬としては、イミド酸メチルピコリンなどのイミドエステル、リン酸ピリドキ サール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ‐メチル イソ尿素、２，４‐ペンタンジオンなどがあり、グリオキシル酸エステルとのト ランスアミナーゼ触媒反応によっても誘導体化される。 アルギニル残基は１種類又は数種類の従来の試薬により修飾され、この試薬の 中にはフェニルグリオキサール、２，３‐ブタンジオン、１，２‐シクロヘキサ ンジオン及びニンヒドリンなどがある。グアニジン官能基のｐＫaが高いため、 アルギニン残基を誘導体化するには反応をアルカリ性条件で行なう必要がある。 さらに、これらの試薬はリシン基並びにアルギニンαアミノ基と反応する。 チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応 によるスペクトル標識導入のための修飾の周知の標的である。最もありふれた場 合では、Ｎ‐アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを用いてそれぞれＯ ‐アセチルチロシル化学種及び３‐ニトロ誘導体を生成させる。 カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は１‐シクロヘキシル‐３ ‐（２‐モルフォリニル（４‐エチル）カルボジイミドや１‐エチル‐３‐（４ ‐アゾニア‐４，４‐ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド （Ｒ’‐Ｎ-Ｃ‐Ｎ‐Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。さらに、アス パルチル残基及びグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラ ギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。 グルタミニル残基及びアスパラギニル残基は頻繁にアミド分解して対応するグ ルタミル残基及びアスパルチル残基になる。別法としては、これらの残基を弱酸 性条件下でアミド分解する。これらの残基のどちらの形態も本発明の範囲内に該 当する。 ２官能物質による誘導体化は、例えば水に不溶性の支持マトリクスやその他の 高分子担体へのペプチドの架橋などに有用である。よく使用される架橋剤として は、例えば１，１‐ビス（ジアゾアセチル）‐２‐フェニルエタン、グルタルア ルデヒド、Ｎ‐ヒドロキシスクシニミドエステル例えば４‐アジドサリチル酸な ど、３，３’‐ジチオビス（プロピオン酸スクシニミジル）などのジスクシニミ ジルエステルを含むホモ２官能物質、及びビス‐Ｎ‐マレイミド‐１，８‐オク タンなどの２官能マレイミドなどがある。メチル‐３‐（ｐ‐アジドフェニル） ジチオールプロピオイミデートなどの誘導体化剤は光が存在すると架橋を形成で きる光活性化可能な中間体を生じる。これに代わるものとして、臭化シアンで活 性化された炭水化物などの反応性の水溶性マトリクス、及び米国特許第3,969,28 7号、第3,691,016号、第4,195,128号、第4,247,642号、第4,229,537号、及び第4 , 330,440号に記載の反応性基質がタンパク質の固定化に用いられる。 その他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又 はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側基、アルギニン側基及 びヒスチジン側基のαアミノ基のメチル化（Creighton，T.E．「Proteins: Stru cture and Molecular Properties 」W.H．Freeman & Co.，米国サンフランシスコ 、pp．79-86（1983年））、Ｎ‐末端アミンのアセチル化などに加え、場合によ りＣ‐末端カルボキシル基のアミド化などがある。 かような誘導体化成分は安定性、吸収、生物学的半減期等を改善しうる。この 成分はタンパク質等の望ましからぬ副作用をいずれも選択的に除去するか弱めう る。かような効果を媒介しうる成分は、例えば「Remington's Pharmaceutical S ciences 」18版、Mack Publishing Co.，米国ペンシルバニア州イーストン（1990 年）などに開示されている。 「フラグメント」の語は、タンパク質のアミノ酸配列に由来し、由来元である 完全長のポリペプチドよりも長さが短いポリペプチドを示すために使用する。か ようなフラグメントは、例えば完全長のポリペプチドのタンパク分解切断により 作製される。このフラグメントは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を修飾し てＣ末端、Ｎ末端の、及び／又は未修飾配列内の、１個以上の部位にある１個以 上のアミノ酸を欠失させることにより組換えにより得ることが好ましい。かよう なフラグメントは本来のタンパク質の特徴的部分を一つ以上保持していると理解 される。かような保持された特徴には、触媒活性、基質特異性、無傷細胞中の他 の分子との相互作用、調節機能、本来のタンパク質又はそのエピトープに特異的 な抗体との結合などが含まれる。 本発明の範囲内にあることを目的としている別の機能性誘導体は、本来のポリ ペプチドと比べて１個以上のアミノ酸が欠失しているか、付加又は置換されたα アミノ酸を含むかのいずれかである「変異体（variant）」ポリペプチドである 。この変異体は天然タンパク質をコードするＤＮＡのコード配列を適当に修飾し てＣ末端、Ｎ末端の、及び／又は未修飾配列内の、１個以上の部位にある１個以 上のアミノ酸に対するコドンを付加、除去、及び／又は修飾することにより天然 タンパク質から得られる。上に述べたように、付加、置換及び／又は追加された ア ミノ酸を有するかような変異体は本来のタンパク質の特徴的部分を一つ以上保持 していると理解される。 欠失、挿入及び／又は置換アミノ酸を有するタンパク質の機能性誘導体は当業 者には周知の標準的な技術を用いて調製される。例えば、その配列をコードする ＤＮＡ中のヌクレオチドを、修飾されたコード配列が修飾されるように修飾した 後、上で述べたような技術を用いてこの組換えＤＮＡを原核性の、或いは真核性 の宿主細胞中で発現する、部位指向性変異誘発技術（Adelman他（1983年）DNA 2 ：183により例示されたものなど）を用いて修飾タンパク質を作製する。これに 代わるものとして、アミノ酸が欠失、挿入及び／又は置換されたタンパク質は、 当技術分野で周知の方法を用いて直接化学合成により簡便に調製される。機能性 誘導体は通常、本来のタンパク質と質的に同じ生物活性を示す。 XVI．投与 本明細書中で使用する投与とは、ベクター又はＤＮＡ担体の体内への導入経路 を表す。投与には静脈内、筋肉内、局所又は経口の送達方法が含まれる。投与は 標的組織に直接に、或いは全身送達を通じて行ないうる。 特に本発明は、疾患の治療のため、或いは特異的な核酸配列をいずれも発現で きる製剤化ＤＮＡ発現ベクターの投与のために使用できる。また、投与には上で 考察した調節可能なベクターの投与も含めうる。ベクターのかような投与は疾患 の治療に使用しうる。好ましい実施形態は、標的組織への直接注入又は全身投与 による。 ２番目の重要な段階はＤＮＡベクターが遺伝子産物を発現しうる標的細胞の核 にＤＮＡベクターを送達することである。これは本発明では製剤により達成され る。この製剤は精製ＤＮＡベクター又は脂質、タンパク質、炭水化物、合成有機 化合物又は合成無機化合物などの他の製剤成分と会合したＤＮＡベクターから成 る。かような製剤成分の例は、リポソーム生成能を有する脂質、陽イオン脂質、 親水性ポリマー、ポリカチオン（例えば、プロタミン、ポリブレン、スペルミジ ン、ポリリジンなど）、標的細胞表面の受容体を認識するペプチド又は合成リガ ンド、エンドソーム溶解誘発能を有するペプチド又は合成リガンド、物質の標的 を核に定める能力を有するペプチド又は合成リガンド、ゲル、徐放マトリクス、 可溶又は不溶の粒子、並びにここに挙げていないその他の製剤成分などを含むが 、これらに限定されない。これには遺伝物質の細胞内への送達、取り込み、その 物質の細胞内での安定性、及び／又は発現を強化するための製剤成分が含まれる 。 選択したいずれのベクター構築物の送達及び製剤化も、発現ベクターの特定の 用途に依存する。一般に、使用される各ベクター構築物の特定の製剤は、まず特 定の標的組織に関するベクター取り込みに焦点が当てられ、しかる後に有効性が 立証される。取り込みの検討には、ベクターの細胞内取り込みと選択した組織特 異的ＤＮＡの発現を評価するための取り込み測定が含まれるであろう。また、か ような測定によると取り込み後の標的ＤＮＡの局在化も決定され、発現タンパク 質の定常濃度の維持に必要な条件が設定される。次いで、有効性及び細胞毒性の 試験を行なうことができる。細胞毒性には細胞生存度のみならず細胞機能も含め ることになる。 液腔に関連する細胞によるＤＮＡ取り込みは、精製ＤＮＡ調製物を単に液腔内 に注入した後に細胞外空間からＤＮＡを取り込む独特の能力を有する。この方法 によるＤＮＡの発現は数ヶ月間持続させることが可能である。 エンドサイトーシスを受けるナノメーターオーダーの大きさの微粒子複合体に よると、細胞外空間由来の外来遺伝子を取り込む細胞の種類が増える。 また、製剤にＤＮＡとの非共有複合体形成能を有するＤＮＡ輸送体を含ませて 細胞膜を通してＤＮＡの輸送を指向させることも可能である。これにはエンドサ イトーシスと強化したエンドソームの分泌とを含む段階の配列を含めてもよい。 この輸送体は核膜を通じてＤＮＡも輸送することが好ましい。例えば、これによ りその全て（図面を含む）を参照により本明細書の一部とする次の出願を参照の こと。（１）Woo他、「ＤＮＡ輸送系及び使用方法」という名称の1992年３月20 日出願の米国特許出願第07/855389号、（２）Woo他、「ＤＮＡ輸送系及び使用方 法」という名称の1993年３月19日出願のPCT/US93/02725、及び（３）Woo他、「 ＤＮＡ輸送系及び使用方法」という名称の1993年11月14日出願の一部継続出願（ 弁理士出願証明書番号は第205/012号が付与されているが米国特許出願番号はま だ付与されていない）。 さらに、送達は細胞又は組織に特異的なプロモーターを含むことにより細胞特 異的又は組織特異的でありうる。さらに、安定化誘導受容体分子を提供するため にｍＲＮＡ安定化配列（３'UTR）を使用することもできる。かような安定化配列 はｍＲＮＡの半減期を長くし、細胞又は組織に対して特異的としうる。上に述べ たことは、「発現ベクター系及び使用方法」という名称の1994年３月９日出願の 米国特許第5,298,422号（Schwartz他）及び米国特許出願第08/209846号（Schwar tz他）でさらに詳細に考察されている。これらは両方とも図面を含むその全体を 参照により本明細書の一部とする。内皮特異的配列に関する情報が1993年11月１ 日出願の米国特許出願第08/146930号及び1993年11月１日出願の米国特許出願第0 8/147777号に提供されており、その両方とも図面を含むその全体を参照により本 明細書の一部とする。また、筋肉特異的配列に関する情報が米国特許出願第08/4 72809号に提供されている。 ＤＮＡ輸送系を含む好ましい投与法では、ＤＮＡとの非共有的結合能を有する 結合分子であって表面リガンドと共有結合したものを備えたＤＮＡ結合複合体を ＤＮＡ輸送系が有する。この表面リガンドは、細胞表面受容体との結合能と、エ ンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ポトサイトーシスによる細胞取り込み刺 激能を有する。これに加えて、第二ＤＮＡ結合複合体がＤＮＡとの非共有的結合 能を有し、核リガンドと共有結合している。この核リガンドは核膜を通した輸送 系の認識輸送能を有する。そのうえ、第三ＤＮＡ結合複合体で、これも非共有的 結合能を有するものを使用してもよい。この第三結合分子はエンドサイトーシス 後にエンドソーム溶解又はエンドソームからの複合体の解離強化を誘発するエレ メントと共有結合している。この結合分子はスペルミン、スペルミン誘導体、ヒ ストン、陽イオンペプチド及び／又はポリリジンとすることができる。Szoka，C .F.，Jr.等、Bioconjug．Chem．4:85-93（1993年）、Szoka，C.F.，Jr.等、P.N. A.S.，90:893-897（1993年）も参照のこと。 遺伝子の直接的な運搬は極めて効果的であった。実験によると、結合組織への ＤＮＡの直接注入により、この遺伝子が注入領域で発現したことが明らかにされ ている。変異受容体を含むプラスミドを関節に注入すると、長期間にわたり遺伝 子が発現する。この注入されたＤＮＡでは、染色体外での非組込み状態が持続す るらしい。この運搬手段は好ましい実施形態である。 送達に使用する製剤はリポソーム又は陽イオン脂質によってもよい。リポソー ムは脂質から成る小胞であって細胞膜を構成する脂質と同様に配列したものであ る。それには水溶性化合物を捕捉するための直径0.05から数ミクロンの大きさの 含水間隙がある。いくつかの研究によると、リポソームは核酸を細胞に送達する ことができ、その核酸は生物活性を保持することが明らかにされている。DOTMA を組み入れた製剤などの陽イオン脂質製剤はＤＮＡ発現ベクターを細胞に送達し 、対応するタンパク質の産生をもたらすことが明らかにされた。脂質製剤は毒性 が無く、組成物の状態で生体分解性である。この製剤は長い循環半減期を示し、 組織を標的に定めるために認識分子をその表面に容易に結合させうる。最後に、 懸濁液状であれ凍結乾燥品であれ、リポソームを基本とする製剤の製造の経済性 が優れていることから、この技術が薬物送達システムとして経済的に成り立つこ とが立証された。Szoka，F.C.，Jr.等、Pharm．Res.，7：824-834（1990年）、S zoka，F.C.，Jr.等、Pharm．Res.，9：1235-1242（1992年）を参照のこと。 選択されたこの送達法によると薬剤は核又は細胞質に蓄積され、最適な薬用量 が得られよう。この投与量は疾患の種類と投与経路によって異なるが、１〜1000 μg/kg体重の間であろう。このレベルは標準的な方法により容易に求められる。 これは、ある程度は最適な薬用量に依存する。治療期間は疾患の症状経過全体に わたるが、持続的な場合もあり得る。投与回数は疾患の種類、処方、及び臨床試 験の有効性データによる。 ベクターに関しては、ベクターの薬理学的用量と、適当な種類の細胞における 遺伝子発現レベルとは（１）タンパク質産生レベルを上昇させるか、（２）タン パク質産生を低下又は停止させるか、（３）タンパク質の作用を抑制するか、（ ４）特定種類の細胞の増殖又は蓄積作用を抑制するか、（５）特定種類の細胞の 増殖又は蓄積を誘発するのに十分なタンパク質又はＲＮＡを含むが、これらに限 定されない。一例として、関節内での炎症性細胞の蓄積を引き起こすタンパク質 が産生される場合、このタンパク質の発現を抑制したり、このタンパク質の作用 を阻害、変質、又は変化させうる。 実施例 実施例は非限定的なものであり、本発明の様々な態様と特徴を表すものにすぎ ない。以下の実施例ではSRC-1の単離及び特性決定を具体的に説明し、SRC-1がス テロイド受容体のコアクティベーターであることを示す証拠を提供する。 実験方法 緩衝液及び溶液に用いた試薬はいずれもアメリカ化学会認証グレードである。 必要に応じ、分子グレード試薬を使用した。組換えＤＮＡの実験操作はすべて標 準的な方法により行なった（Ausubel，F.M.他、「Short Protocols In Molecula r Biology 」Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons、米国ニュ ーヨーク（1992年））。プラスミドＤＮＡ構築物はプラスミドＤＮＡ単離キット （QIAGEN社）を用いて調製と精製を行ない、デアザジデオキシＮＴＰ及びSequen aseバージョン2.0（US．biochemical社）を用い、配列により確認した。 プラスミドの構築 GAL4_DBD-PR_LBDキメラタンパク質はｐＡＳ１酵母発現プラスミド中で構築した （Durfee，T.等、Genes and Dev. 7，555-569（1993年））。プライマーCGCCATG GTCCTTGGAGGT（上鎖）及びプライマーAAGTCGACACATTCACTTTTTATGAAAGAGAAG（下 鎖）と共にTaqポリメラーゼ（Promega社）を使用してベクターYEphPR_B中のhPR_B のアミノ酸631〜933由来のコード配列（Vegeto，E.等、Cell 69，703-713（1992 年））を増幅した。 これらのプライマーは制限酵素部位のＮｃｏＩとＳａｌＩを増幅産物の５'末 端と３’末端に含めるべく設計した。増幅は40サイクル（94℃２分間、45℃２分 間、72℃３分間）及び最後に72℃10分間延長した製造条件に従って行なった。次 いで増幅産物をＮｃｏＩとＳａｌＩで二重消化し、ゲル精製を行なってベクター pAS1のＮｃｏＩ‐ＳａｌＩ部位に挿入した（Durfee等、Genes and Dev. 7，555- 569（1993年））。２ハイブリッドスクリーニングを行なうため、Y190酵母株中 でキュアリングと選択を行なうためのシクロヘキシミドマーカーを含むpAS1-cyh ベクターにＮｃｏＩ‐ＳａｌＩインサートを移した。以前に記載されたように（ Weigel，N.L.等、Endocrinol. 6，1585-1597（1992年））、Ｃ２６２モノクロー ナル抗体を用いるドットウェスタン免疫ブロット法とホルモン結合測定法により 酵母中のGAL4_DBD-PR_LBD融合タンパク質の正確な発現を測定した。 試験管内で転写と翻訳を行なうため、SRC-1（．８）ｃＤＮＡのＸｈｏＩフラ グメントをpT7BSalIベクターのＳａｌＩ部位中にクローン化した（Baniahmad，A .等、Proc ．Natl．Acad，Sci．USA 90，8832-8836（1993年））。SRC-1mutはSRC -1（．８）ＢａｍＨＩ‐ＢｇｌＩＩフラグメントをpABWgal哺乳動物発現ベクタ ー中にクローン化することにより構築した（Baniahmad，A.等、Proc ．Natl．Aca d，Sci．USA90 ，8832-8836（1993年））。 哺乳動物発現ベクターとそのレポータープラスミドは、hPR_B（Vegeto，E.等、Cell 69，703-713（1992年））及びERE2-TATA-CAT（Beckman，J.M.等、Mol ．End ocrinol. 7，1266-1274（1993年））、hER（Smith，C.L.等、Proc Natl ．Acad． Sci．USA 90，6120-6124（1993年））及びERE2-TATA-CAT（Beckman，J.M.等、Mo l ．Endocrinol. 7，1266-1274（1993年））、hGR（Giguere，V.等、Cell 46，64 5-652（1986年））、hTR（Umesono，K.等、Cell 65，1255-12661（1991年））、 マウスRXR（tong等（1994年）、DR4-tk-CAT及びDR1-tk-CAT（Cooney，A.J.等、J ．Biol，Chem. 268，41524160（1993年）、E2F及びE2F-tk-CAT（Helin，K.等、M ol ．Cell．Biol. 13，6501-6508（1993年））、Sp1及びSp1-tk-CAT（Courey，A. J.及びTjian，R.の論文Cell 55，887-898（1988年））、CREB及びCRE-tk-CAT（C hrivia，J.C.等、Nature 365，855（1993年））、GAL4VP16及び17mer-tk-CAT（B aniahmad，A.等、EMBO J. 11，1015-1023（1992年）について以前から記載され ており、上記参考文献は図面も全て含めて参照により本明細書の一部とする。 ２ハイブリッドスクリーニング Durfee，T.等、（Genes and Dev．7，555-569（1993年））が記載したようにG AL4_DBD-PR_LBD発現プラスミドを含む酵母Y190株を酵母発現ベクターpACT中に構築 したヒトＢリンパ球ｃＤＮＡ発現ライブラリで形質転換し、１０^-6Ｍのプロゲス テロンが存在する状態でこの形質転換株を相互作用タンパク質についてスクリー ンした。陽性クローンから得たライブラリｃＤＮＡプラスミドを回収し、本明細 書中に示したようにGAL4_DBD-PR_LBD又は空の発現ベクターを含むY190細胞を再度 形質転換した。 液体培地中の形質転換株の−−ガラクトシダーゼ活性はＯ‐ニトロフェニル− −Ｄ‐ガラクトピラノシド（ONPG）を基質に用いて記載されたように測定した（ Ausubel，F.M.,他、「Short Protocols In Molecular Biology」Greene Publi shing Associates and John Wiley & Sons、米国ニューヨーク（1992年））。相 互作用タンパク質の特異性は、SRC-1（．８）ｃＤＮＡを含むY190細胞をpAS1-SN F、pAS1-pS3、pAS1-CDK又はpAS1-ラミンを含むY187株と交配することにより評価 し、これらの２倍体細胞の−−ガラクトシダーゼ活性はフィルターリフト法又は 液体培養測定法により測定した（Ausubel，F.M.他、「Short Protocols In Mole cular Biology」New York: Greene Publishing Associates and John Wiley & S ons（1992年）、Durfee，T.等、Gene and Dev．7，555-569（1993年））。 試験管内タンパク質‐タンパク質相互作用 以前に記載されたように組換えバキュロウイルスグルタチオン-S-トランスフ ェラーゼhPR_A（GST-hPR_A）をGST-セファロースビーズに連結することにより、受 容体に特異的なアフィニティー樹脂を構築した（Baniahmad，A.等、Mol．Cell B iol．15，76-86（1995年））。GST-PR_A融合タンパク質は、標準的方法に従ってP R_AｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターを挿入することにより構築した（Be ckman，J.M.等、Gene 146，285289（1994年））。１０^-8Ｍのホルモン（プロゲ ステロン又はRU486）を回収24時間前に無傷の細胞に添加することにより受容体 を活性化した。次いで受容体を全細胞抽出物として調製し、精製前に１０^-6Ｍの ホルモンにより30℃でさらに15分間処理した。およそ400μgの総タンパク質を懸 濁液状GST-セファロースビーズ（ファルマシア）20μｌと共に４℃で２時間イン キュベートした。次いで樹脂をNENT緩衝液（100ｍＭ NaCl、１ｍＭ EDTA、0.5％ NP40及び0.5％粉乳を含む20ｍＭトリス-OH、ｐＨ8.0）で２回洗浄し、転写緩衝 液（60ｍＭ NaCl、１ｍＭジチオスレイトール、６ｍＭ MgCl₂、0.1ｍＭ EDTA及 び10％グリセロールを含む20ｍＭ HEPES、ｐＨ7.9）でさらに２回洗浄した。 その後、精製した受容体を含むビーズを試験管内で転写、翻訳を行なった［³⁵ Ｓ］met-SRC-1（．８）（Promega社）の粗製溶解産物25μｌと混合し、転倒型回 転器を使用して転写緩衝液200μｌ中で４℃１時間、相互作用を起こさせた。相 互作用の後、ビーズをNENT緩衝液で１回洗浄し、粉乳を含まないNENT緩衝液で３ 回洗浄し、転写緩衝液で２回洗浄した。次いで結合したタンパク質を10ｍＭトリ ス-OH緩衝液（ｐＨ7.6）に溶解した0.2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で溶出 し、SDS-PAGEで分画し、Baniahmad，C等、Mol．Endocrinol，9，34-43（1995年 ） に記載された様にして、³⁵Ｓに関する蛍光間接撮影を行なった。インプットレー ンは各反応に用いた粗製分解産物の全量の10％を表す。ビーズ中の受容体量はア フィニティー樹脂から溶出しSDS-PAGEで分画したGST-hPR_Aのクーマジーブルー染 色により推定した。 ＲＮＡ解析 Ausubel，F.M.他、「Short Protocols In Molecular Biology」Greene Publis hing Associates and John Wiley and Sons米国ニューヨーク（1992年）に記載 されているように、様々なヒト器官に由来するポリ（Ａ）⁺RNA又は様々な細胞株 から単離したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを含むノーザンブロット膜を、５×１０⁵cpm/ml の［32Ｐ］の無作為に開始反応させた（randam primed）標識SRC-1（.８）Ｘｈ ｏｌインサートと共に、50％ホルムアミド中42℃で36時間ハイブリダイズした。 ハイブリダイゼーション後、0.25倍SSC、0.1％SDS中65℃で最終洗浄を行なった 膜についてコダックX-OMAT造影フィルムを用いたオートラジオグラフ法を施行し た。 SRC-1をコードする完全長ｃＤＮＡのクローニング SRC-1（.８）の確認に続いてＸｈｏｌ挿入ＤＮＡを使用して6ZAP（Pereira，F .等、Biochem ．Biophys．Res．Commun. 175，831-838（1992年））中に構築した 線維芽細胞ライブラリを標準的な方法（Ausubel，F.M.他、「Short Protocols I n Molecular Biology 」Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons 、米国ニューヨーク（1992年））に従ってスクリーンした。数個のクローンが確 認、単離された。配列を比較したところ、それらのうち２個（1.4ｋｂの154‐22 ａと2.3ｋｂの154‐25）が約3.6ｋｂのSRC-1の３'最末端を包含することが明ら かになった。クローン154‐22ａには、さらにSRC-1と無関係の0.8ｋｂの５'配列 が含まれていたが、これはＸｈｏｌ（充填）インサートをpABWgalベクター中に サブクローン化することにより切断した。残ったSRC-1の５'末端配列については 、6gt11前方プライマー及び埋め込みプライマーGGAATTCCCGACGTTGTGCCAACAを含 む１０⁹個のファージを用いて、6gt11ヒーラ（HeLa）ライブラリー（クローンテ ック社）からのＰＣＲ増幅によりクローニングを行なった。 増幅はＴａｑポリメラーゼを用い、二段階の製造条件下で行なった。まず、94 ℃１分間、72℃１分間、72℃２分間増幅を行なった後、71℃〜67℃まで１サイク ル毎に１°、アニーリング温度を順次低下させながらさらに５サイクルの増幅を 行なった。次いで、増幅を29サイクル（94℃１分間、64℃１分間、72℃）続け、 最後に72℃５分間延長した。直接ＰＣＲ産物か１％アガロースゲルで精製した＞ 1.6ｋｂのサイズの産物のいずれかを用いてpCRII TA-クローニングベクター（In vitrogen社）中にＰＣＲ産物をクローン化した。埋め込みオリゴをプライマーに 用いて、0.6ｋｂから2.2ｋｂの範囲のクローンの配列を決定した。増幅したｃＤ ＮＡのうち154‐22ａの５’末端に対する相同配列を含むものを陽性とした。増 幅したｃＤＮＡのうち最長のものから得られたＥｃｏＲＩ（一部）及びＢｓｍＩ インサートを154‐22ａから得られたＢｓｍＩ‐ＳａｌＩインサートに連結した 後、哺乳動物発現ベクターpBK-CMV（Strategene社）のＥｃｏＲＩ‐Ｘｈｏｌ部 位中に再連結した。SRC-1のＰＣＲ増幅オープンリーディングフレームの配列は 、２個の独立したＰＣＲ増幅産物から得られたデータを表す。クローン154‐25 （2.3ｋｂ）由来のSRC-1の３’末端非翻訳領域は含まれていなかった。 一時的なトランスフェクション及びＣＡＴアッセイ 細胞は10％（vol/vol）ウシ胎子血清を加えたダルベッコのイーグル変更培地 中で維持した（Smith，C.L.等、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90，6120-6124（1 993年））。トランスフェクションの前日に１０⁵個の細胞を100ｍｍのペトリ皿 に播種し、４〜６時間後にNutridoma-SR（ベーリンガーマンハイム）を加えた無 血清培地に交換した。トランスフェクションにERを使用する場合はフェノールレ ッドを含まない培地を使用した（Smith，C.L.等、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90，6120-6124（1993年））。ステロイド受容体をコードする哺乳動物発現ベク ター又はその他の転写制御因子をＣＡＴレポーター５μgと共にヒーラ細胞をト ランスフェクトした。ヒーラ細胞のトランスフェクションにはリポフェクチン（ ギブコBRL）を選択した。以前から記載されているように（Denner，L.A.等、Sci ence 250，1740-1743(1990年)）、CV1細胞及びLmtk-細胞はポリブレン（シグマ ）を用いてトランスフェクトした。 トランスフェクション後、過剰のＤＮＡを取り除き、図の説明に示したように ホルモンを含む培地で細胞を42時間処理した。次いで細胞を回収し、タンパク質 を凍結融解により全体細胞抽出物として調製した。抽出物中のレポーターＣＡＴ 活性は100μCiの［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコールと基質として４ｍＭアセチルコ エンザイムＡとを用いて測定し、タンパク質含量により標準化した。抽出物中の 活性は、［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコールのモノアセチル化体及びジアセチル化体 への変換率を測定することにより計算した（Ausubel，F.M.他、「Short Protoco ls ln Molecular Biology」Greene Publishing Associates and John Wiley & s ons、米国ニューヨーク（1992年））。 実施例１ PR相互作用タンパク質の分離及び特性決定 ヒトPRにはそのリガンド結合ドメインのＣ末端にリガンド誘発性トランス活性 化機能がある（Meyer，M.E.等、EMBO J. 9，3923-3932（1990年）、Gronemeyer ，H.、Ann ．Rev．Genet. 25，89-123（1991年））。PRのホルモン結合ドメイン と特異的に相互作用を行なうタンパク質をコードするｃＤＮＡを単離するため、 発明者等は酵母２ハイブリッド系を使用した。なお、この系の記載はすでにDurf ee，T.等、Genes and Dev. 7，555-569（1993年）にあるが、図面も含めたその 全体を参照により本明細書の一部とする。我々は、キメラタンパク質をまずベク ターpAS1中の酵母転写因子GAL4_DBDとhPRのヒンジ及びLBD（PR_LBD、アミノ酸362 〜933）を包含する領域との間に構築した。次いでGAL4_DBD-PR_LBD融合タンパク質 を含む酵母Y190細胞を酵母GAL4活性化ドメイン（GAL4_AD）と融合したＢリンパ球 ｃＤＮＡライブラリで形質転換した。 酵母Y190株は、PR_LBDと相互作用を行なうタンパク質をコードするｃＤＮＡを スクリーンする二重レポーター系を提供する。即ち、ヒスチジン原栄養のための HIS3と−−ガラクトシダーゼ活性のためのLacZであり、両方とも染色体に統合さ れ、その発現はGAL4プロモーターにより調節される。GAL4_DBD-PR_LBDとｃＤＮＡ によりコードされるタンパク質でGAL4_AD（アミノ酸768〜880）と融合したものと の相互作用があると、ガラクトース誘発性UASGプロモーターの調節の下で、染色 体に統合されたHIS3遺伝子及びLacZ遺伝子が転写される。細胞は、X-gal及び１ ０^-6Ｍのプロゲステロンを混在させてヒスチジン原栄養性があり表現型が青色で ある細胞の選択培地で培養した。１０^-6Ｍのプロゲステロンを混在させてスクリ ーンした酵母のコロニーおよそ６０万個から陽性クローン７個が得られた。これ らのクローンはGAL4_DBDと融合したときp53、ラミン、CDKN、SNF1などの他の無関 係なタンパク質と相互作用しなかったため、PR_LBDとの相互作用は特異的であっ た。 １０^-6Ｍのプロゲステロンを混在させたときにPR_LBDとの相互作用が最も強か ったもの１個［SRC-1（.８）］を単離した７個のｃＤＮＡから選び、それ以降の 研究に供した。ガラクトシダーゼの活性はPR_LBDがＧＡＬ４活性化ドメインと融 合したSRC-1（.８）ｃＤＮＡと同時発現したときだけに見られた。SRC-1（.８） もPR_LBD融合タンパク質も単独で発現したときには活性がなかった。２ハイブリ ッド系で相互作用を行なうことが記載された二種類のタンパク質、SNF1及びSNF4 を陽性対照に使用した（Durfee等、Genes and Dev. 7:555-569（1993年））。GA L4_DBD-PR_LBD構築物がLacZレポーターを活性化できない原因が発現しなかったこ とによる可能性を排除するため、GAL4_DBD-PR_LBD融合タンパク質レベルを測定し た。hPRのＣ末端中の最終14アミノ酸を認識するＣ２６２抗hPRモノクローナル抗 体（Weigel，N.L.等、Mol ．Endocrinol. 6，1585-1597（1992年））を用いて行 なうドットウェスタン免疫ブロッティング法によると、GAL4_DBD-PR_LBD融合タン パク質は酵母細胞の中で正しい仕方で発現していた。これに加え、リガンド結合 測定法によるとGAL4_DBD-PR_LBD融合タンパク質の酵母細胞中での発現量は0.93±0 .1２（Ｘｎ＝７±標準誤差）ピコモル／mg‐タンパク質であった。 実施例２ SRC-1はリガンド依存的に受容体と相互作用を行なう 我々は、SRC-1（.８）のPRとの相互作用がホルモン依存性であったかどうかを 調べた。まず、酵母２ハイブリッド系で相互作用を行なった。GAL4_DBD-PR_LBD及 びSRC-1を発現する酵母細胞を１０^-6Ｍのプロゲステロンを含む選択培地、ホル モンを含まない選択培地、１０^-5ＭのRU486を含む選択培地で培養し、実施例１ と同様に−−ガラクトシダーゼ活性を測定した。相互作用は、受容体がリガンド と結合していない場合もRU486と結合している場合も有意に弱まった。プロゲス テロンとRU486は両方とも単独ではPR_LBD又はSRC-1（．８）の活性に影響がなか った。また、これらのリガンドはSNF1/SNF4陽性対照に対してさしたる影響が見 ら れなかった。 無傷の細胞に見られるリガンド依存性の相互作用が受容体タンパク質との直接 相互作用によることをさらに実証するため、PR_Aを用いた試験管内結合測定も行 なった。本明細書中に記載の通り、hPR_AｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクタ ー中のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）配列と融合させてSf9昆虫細 胞での発現に適したGST-PR_A融合タンパク質を生成させた。即ち、１０^-6プロゲ ステロン又はRU486が存在する条件と存在しない条件の下で放射性同位標識［³⁵ Ｓ］met SRC-1（.８）をグルタチオン‐セファロースビーズと結合したバキュロ ウイルス発現精製GST-PR_A融合タンパク質と共にインキュベートした。GST-PR_Aを グルタチオン‐セファロースビーズと連結し、結合研究用のアフィニティーマト リクスに使用した。次いで結合した放射性同位標識［³⁵Ｓ］met SRC-1（.８）を 溶出し、15％SDSを用いたPAGEで分析して、本明細書中に記載した様に蛍光間接 撮影に供した。グルタチオン‐アフィニティーカラムから溶出したGST-PR_Aは、S DS-PAGE分析によると実際に全長形態で発現していることが示唆された。 試験管内で転写、翻訳した［³⁵Ｓ］SRC-1（.８）は、受容体にプロゲステロン が結合しているとGST-PR_Aアフィニティーカラムに保持された。リガンドと結合 していない受容体又はRU486と結合した受容体では相互作用が有意に弱くなって いることが観察された。PR_Aがないと、GSTタンパク質カラムに結合はほとんど、 或いはまったく見られなかった。 このように、SRC-1（.８）のPRとの相互作用は生体内と試験管内とでリガンド 依存的に起こり、この相互作用にはリガンド結合ドメインが関与した。発明者等 の結論は、GAL4_DBDと融合したPR_AのＮ末端領域（アミノ酸165〜656）が２ハイブ リッド系でSRC-1（.８）と相互作用を行なわなかったという観察によりさらに実 証された。 実施例３ 全長SRC-1の分離 全長ｃＤＮＡを入手するため、従来法によりSRC-1（.８）ｃＤＮＡをプローブ として繊維芽細胞ライブラリのスクリーニングを行なった。SRC-1の３'末端のほ とんどを包含する1.4ｋｂ及び2.3ｋｂの２個のクローンを分離した。SRC-1の５' 末端（2.2ｋｂ）は、本明細書中に述べたように埋め込みプライマーを用いてヒ ーラ細胞ライブラリからＰＣＲによりクローン化した。試験管内での転写、翻訳 後に、予測分子量が114.1ｋＤａで、SDS-PAGEによるみかけの分子量が約125ｋＤ ａの１０６１アミノ酸のオープンリーディングフレームを含む5.6ｋｂのｃＤＮ Ａがこれら３個の単離クローンの配列から明らかになった。 BLASTアルゴリズムを用いた当配列の比較は、アミノ酸605〜1005がhin-2遺伝 子と相同であることを示す。この遺伝子は、生体内でのヒト免疫不全ウイルス１ 型プロモーター挿入配列の解析により確認した（アクセス番号第U19179号）。配 列比較からhin-2遺伝子には54塩基対の挿入配列が含まれることが明らかになっ た。このＤＮＡ挿入配列により14アミノ酸下流に停止コドンが導入され、その結 果SRC-1が完了せずに終結する。これに加えて、SRC-1の部分ＤＮＡ配列を無作為 に単離した（アクセス番号第T56159号及び第U19179号）。これらの部分ｃＤＮＡ は機能の記載がない。アミノ酸レベルでのSRC-1配列比較からは、既知のいずれ のタンパク質とも相同性が見られなかった。673番目の残基と758番目の残基の間 に顕著なグルタミン豊富領域（31.4％Ｑ）が見られた。SRC-1のＮ末端（258〜35 0番目の残基）は、セリン及びトレオニンが豊富であった（22.6％Ｓ、11.8％Ｔ ）。さらに、ロイシン及びプロリンの含量が顕著な領域があった（9.2％Ｌ、9.6 ％Ｐ）。 実施例４ SRC-1ｍＲＮＡの発現 ヒト組織及び細胞株由来のポリＡ⁺ＲＮＡを用いたノーザンブロット分析を施 行してSRC-1ｍＲＮＡのサイズと分布を測定した。［³²Ｐ］放射性同位標識SRC-1 （.８）ｃＤＮＡによりハイブリダイゼーションを行なった。アクチンｍＲＮＡ の添加量と完全性を調節するため、このＲＮＡの分析を行なった。SRC-1は、心 臓、胎盤、肺、肝臓、平滑筋、腎臓、膵臓などを含む種々の組織中でおよそ5.5 ｋｂと7.5ｋｂの二種類のｍＲＮＡとして発現する。脳では、SRC-1は主に7.5ｋ ｂｍＲＮＡとして発現した。分析を行なったその他のヒト組織（脾臓、胸腺、前 立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、白血球など）のすべて、並びに細胞株（ヒーラ 、CV-1及びJurkat）で同様に二種類のｍＲＮＡが見られたが、発現レベルでいく ら か変異していた。 実施例５ SRC-1の一時的発現はリガンド結合ｈＰＲのトランス活性化を刺激する 標的遺伝子発現の受容体トランス活性化におけるSRC-1の役割をさらに調べる ため、哺乳動物の細胞株で一時的なトランスフェクション測定法を行なった。全 長SRC-１及びhPR_Bに対する哺乳動物発現ベクターと、クロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（CAT）レポーター遺伝子と連結したE1bアデノウイルス のTATAボックス、即ちPRE2-TATA-CATの前に挿入したプロゲステロン応答性ＤＮ Ａエレメント（PRE）を２コピー含むプラスミドとをヒーラ細胞に同時トランス フェクトさせた。 詳しく述べると、２×１０^-8Ｍのプロゲステロン作用物質R5020が混在しない 条件下若しくはそれが混在する条件下で、0.5μｇのhPR_B哺乳動物発現プラスミ ド及び３μｇのSRC-1又は空の発現ベクターと共に、５μｇのPRE2-TATA-CAT又は ERE2-TATA-CATレポータープラスミドでヒーラ細胞に一時的に形質導入した。細 胞をトランスフェクションの42時間後に回収し、８μｇのタンパク質抽出物を用 いてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）の活性を測定し た。 リガンドと結合していないhPRは、SRC-1が存在していても存在していなくても レポーターに関して最小限の活性を有する。プロゲステロン作用物質R5020を添 加すると、約５倍のhPR活性が誘導された。しかしながら、ホルモンの存在下でS RC-1全長ｃＤＮＡをhPRと共に同時発現させると、ホルモンで誘導した受容体活 性の14.0±3.3（Ｘｎ＝７±平均値の標準誤差）倍の誘導が見られた（７回の実 験の平均値）。 SRC-1とhPRの同時発現により見られた刺激がhPRだけに依存してレポーターの 基底活性に間接的に依存しないことをさらに確認するため、PREレポーター構築 物をEREレポーターのERE2TATA-CATと置き換えた。 詳しく述べると、２×１０^-8Ｍのプロゲステロン作用物質R5020のみ、又は４ ×１０-8ＭのRU486との組み合わせが混在しない条件下若しくはそれが混在する 条件下で、SRC-1又は空の発現ベクターと共にPRE2-TATA-CAT及びhPR_Bをヒーラ細 胞にトランスフェクトさせた。 PR結合部位がないと、リガンドの有無に関わらずSRC-1はレポーター構築物の 活性に影響がなかった。これらの結果より、SRC-1によるhPRのトランス活性化の 強化はリガンド結合受容体を介して起こり、単独では基底転写機構に影響を及ぼ さないことが示唆される。発明者等は拮抗物質RU486と結合したhPRのトランス活 性化に及ぼすSRC-1の影響を調べた。ここでも、SRC-1は作用物質R5020が存在す る状態でhPRの活性を強化した。RU486を無傷の細胞に添加すると、ホルモン誘導 性のhPRのトランス活性化が阻害された。SRC-1を拮抗物質結合受容体と共に同時 発現してもレポーター遺伝子のRU486拮抗受容体活性を少しも増強又は回復する ことができなかった。 総合すると、これらの知見はSRC-1がアゴニスト結合受容体タンパク質に直接 作用してその転写活性を調節するが、基底プロモーターには大きな影響を及ぼさ ず、共活性化因子の一般的な定義を満たす。さらには、ステロイド受容体の共活 性化因子は生体内でＤＮＡと結合したアゴニスト受容体複合体とアンタゴニスト 受容体複合体とを識別しうるという証拠が提供されている。 実施例６ SRC-1は受容体の抑圧（squelching）を逆行させることによりhPRに対して共活性 化因子として作用する SRC-1の共活性化機能を実証するため、過剰の活性化因子が一定限度の核の共 活性化因子のプールを封鎖する特性を活用するために提案されたさらに厳密な共 活性化因子のアッセイ法（Flanagan，P.M.等Nature 350，436-438（1991年）） 、を利用した。ＥＲの過剰な発現により、ＰＲに依存する細胞内の転写活性が抑 圧（squelch）される可能性があることがそれ以前から報告されている（Meyer， M.E.等、Cell 57，433-442（1989年）及びA.K．Roy及びJ．Clark編「Gene Regul ation by Steroid Hormones IV.」（Springer Verlag出版、ニューヨーク、ベル リン、ハイデルベルク、ロンドン、パリ、東京）pp．220-223収載のConneely，O .M.等、「ニワトリプロゲステロン受容体のプロモーター特異性活性化ドメイン 」（1989年））。この知見から、これら二種類の受容体が標的遺伝子をトランス 活性化するのに必要な共通の制限因子の存在が示唆される。我々は、SRC-1の同 時 発現がこの抑圧を逆行させうるか否かを調べた。 hPR及びhER発現ベクター各１μｇとPRE2-TATA-CAT５μｇ及び少量から多量に わたるSRC-1とでヒーラ細胞をトランスフェクトした。次いで細胞をリガンドR50 20及び／又はE2（２×１０^-8）に暴露し、42時間後に40μｇのタンパク質抽出物 を用いてCAT活性を測定した。クロラムフェニコールのモノアセチル化体及びジ アセチル化体への変換率を求めた。この値は独立した３回の実験の平均値を表す （Ｘｎ＝３±平均値の標準誤差）。 hPRによるホルモン誘導性転写活性はリガンド結合hERの同時発現に際して約19 倍抑制される。SRC-1を添加すると、この抑圧は用量依存的に約16倍反転した。 アッセイ中に抑圧されていない残存PRの増強によってこの上昇を説明しうるであ ろうか。発明者等はそう思わない。エストロゲンが存在すると16倍回復するのに 比べ、SRC-1が最高濃度（２μｇ）のときPRトランス活性化が約５倍刺激される のが観察されるからである。活性化のかような量的差異は抑圧の逆行を強く示し ている。結論として、SRC-1はPR及びERの効率のよいトランス活性化に必要な制 限因子である。 実施例７ SRC-1は共活性化因子である SRC-1は、ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバー二種類間の抑圧逆 行能をもつことから、ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバー全般の共 活性化因子であることが示唆された。事実、Ｎ末端切断型のSRC-1であるSRC-1（ .８）もバキュロウイルス発現GST-ER及びGST-TRと試験管内で相互作用を行なう ことが可能であった。そこで、その他の細胞内受容体の転写活性に及ぼすＳＲＣ ‐１発現の影響を調べた。 存在が示されている種々のステロイド受容体をコードするｃＤＮＡ0.5μｇと 、それらのステロイドと同起源であってPR/PRE2-TATA-CAT、ER/ERE2-TATA-CAT、 GR/PRE2-TATA-CAT、TR-/DR4-tk-CAT、RXR/DR1-tk-CATなどのレポーターを含むHR E５μｇ、さらには３μｇのSRC-1又は空の発現ベクターでヒーラ細胞を同時トラ ンスフェクトした。次いでそれらと対応するリガンド（PR：R5020、ER：エスト ラジオール、GR：デキサメタゾン、TR：トライアック、RXR：９‐シス‐レチノ イン酸）の濃度を２×１０^-8Ｍとしたもので細胞を処理した。14μｇのタンパク 質抽出物を用いて受容体のCAT活性を測定した。 SRC-1はPR並びにER、GR、TR、RXRと同起源のＤＮＡ応答エレメントを通してそ れらの転写活性を強化しうる。従って、SRC-1は今まで調べてきた核受容体スー パーファミリーのいずれについても共通の共活性化因子であると思われる。 上で述べたように、１μＭフォルスコリン（Fsk）が存在しない場合と存在す る場合とでキメラGAL4-VP16／UAS_G-tk-CAT、Sp1/Sp1-tk-CAT、E2F/E2F-tk-CAT、 CREB/CRE-tk-CAT、加えてSRC-1又は空の発現ベクターでヒーラ細胞をトランスフ ェクトした。レポーターのCAT活性を測定した。各アッセイは独立した少なくと も２回の実験に対応する。 SRC-1の活性スペクトルを測定するため、選んだトランス活性化因子に及ぼす その影響を調べた。SRC-1はUAS_Gエレメントを通じてGAL4-VP16キメラタンパク質 の転写活性を強化することが観察された。程度は低いが、SRC-1はSp1転写活性も 強化しうる。これに対して、SRC-1はE2FやE47などの他の核因子の転写活性を変 化させることはなかった。我々は、SRC-1がCREB（Chrivia，J.C.等、Nature 365 ，855（1993年）などの無関係の誘導転写因子の転写活性に影響を及ぼしうるか どうかを調べた。 CREBの活性はフォルスコリンを無傷の細胞に添加することにより誘導すること ができた。SRC-1の同時発現はCREBの基底転写活性にもフォルスコリン刺激転写 活性にも影響を及ぼさなかった。従って、SRC-1は受容体のステロイド／甲状腺 スーパーファミリーのメンバーの活性は強化するが、あらゆるクラスのトランス 活性化因子に共通の共活性化因子というわけではない。 実施例８ SRC-1の切断型Ｃ末端領域はステロイド受容体機能の支配的な負の調節因子であ る SRC-1の作用機構をさらに解明するため、SRC-1のＮ末端欠失変異体のSRC-1（. ８）が受容体トランス活性化に及ぼす影響を調べた。この受容体と結合する領域 を含む865〜1061番目のアミノ酸配列を哺乳動物発現ベクターに対するフレーム にクローン化し、外来性AUGコドンが得られた。 ５μｇのステロイド受容体ｃＤＮＡ発現ベクターとそのレポーター、PR/PRE2- tk-CAT及びTR§/DR4-tk-CAT、加えて１０μｇのSRC-1（.８）又は空の発現ベク ターでLmtk- 細胞をトランスフェクトした後、ホルモン（２×１０^-8）で処理し た。レポーターCAT活性は60μｇのタンパク質抽出物を用いて測定した。 hPRのホルモン誘導転写活性はSRC-1（.８）の同時発現によりLmtk- 細胞中で 効率よく減弱しうる。また、SRC-1（.８）はＴＲのリガンド誘導転写活性も抑制 する。ホルモンが結合していない受容体については大して影響がなかった。SRC- 1（.８）はヒーラ細胞とCV-1細胞中のhPRの転写活性も同程度に阻害した。切断 型SRC-1（.８）にステロイド受容体機能の支配的な負の調節因子として作用する 能力があることから、SRC-1がステロイド受容体標的遺伝子発現の真正の共活性 化因子であることがさらに示唆される。また、これらの結果から、転写活性化に 関するSRC-1の機能領域に対して予備的な見透しが与えられる。 本発明を説明するため若干の実施形態及び実施例を使用したが、本発明の範囲 又は精神から逸脱することなく、提示した実施形態及び実施例を変更できること は当業者には明白であろう。 特許参考文献と非特許参考文献を含めて、これまで参照により本明細書の一部 としなかった参考文献がいずれの場合も参照により本明細書の一部とされること は明らかである。 その他の実施形態は以下の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ツァイ，ソフィア・ワイ アメリカ合衆国テキサス州77005，ヒュー ストン，シャーロット 6014 (72)発明者 オナテ，セルジオ アメリカ合衆国テキサス州77025，ヒュー ストン，ブレースメイン 8020，ナンバー 1605

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．SRC-1ポリペプチドをコードする、単離、濃縮又は精製した核酸。 ２．核酸がヒト核酸である請求の範囲第１項の核酸。 ３．核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも２５の連続するアミノ酸を コードする請求の範囲第１項の核酸。 ４．核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも５０の連続するアミノ酸を コードする請求の範囲第１項の核酸。 ５．核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも１００の連続するアミノ酸 をコードする請求の範囲第１項の核酸。 ６．核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも４２５の連続するアミノ酸 をコードする請求の範囲第１項の核酸。 ７．試料中のSRC-1ポリペプチドの欠失を探査する核酸プローブ。 ８．SRC-1ポリペプチドが図１に示したアミノ酸配列の少なくとも２５の連続 するアミノ酸を含む請求の範囲第７項のプローブ。 ９．SRC-1ポリペプチドが図１に示したアミノ酸配列の少なくとも５０の連続 するアミノ酸を含む請求の範囲第７項のプローブ。 10．SRC-1ポリペプチドが図１に示したアミノ酸配列の少なくとも１００の連 続するアミノ酸を含む請求の範囲第７項のプローブ。 11．SRC-1ポリペプチドが図１に示したアミノ酸配列の少なくとも４２５の連 続するアミノ酸を含む請求の範囲第７項のプローブ。 12．SRC-1ポリペプチドをコードする組換え核酸と、宿主細胞中で転写を開始 する効果のあるベクター又はプロモーターとを含む物質の組成物。 13．組換え核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも２５の連続するアミ ノ酸をコードする請求の範囲第12項の組成物。 14．組換え核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも５０の連続するアミ ノ酸をコードする請求の範囲第12項の組成物。 15．組換え核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも１００の連続するア ミノ酸をコードする請求の範囲第12項の組成物。 16．組換え核酸が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも４２５の連続するア ミノ酸をコードする請求の範囲第12項の組成物。 17．SRC-1ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むヒト以外のトランスジ ェニック哺乳動物。 18．導入遺伝子が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも２５の連続するアミ ノ酸をコードする請求の範囲第17項のトランスジェニック哺乳動物。 19．導入遺伝子が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも５０の連続するアミ ノ酸をコードする請求の範囲第17項のトランスジェニック哺乳動物。 20．導入遺伝子が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも１００の連続するア ミノ酸をコードする請求の範囲第17項のトランスジェニック哺乳動物。 21．導入遺伝子が図１に示したアミノ酸配列の少なくとも４２５の連続するア ミノ酸をコードする請求の範囲第17項のトランスジェニック哺乳動物。 22．標的遺伝子の転写を増強する方法であって、標的遺伝子を含む細胞にSRC- 1ポリペプチドをコードする核酸を提供する段階を含む方法。 23．遺伝子治療における核酸カセットの発現を調節する分子スイッチを標的遺 伝子を含む細胞に提供する段階であって 分子スイッチが修飾されたリガンド結合ドメインと連結したＤＮＡ結合ドメイ ンを含む段階 をさらに含む請求の範囲第２２項の方法。 24．スイッチが組織特異的である請求の範囲第２３項の方法。 25．分子スイッチを核酸カセットと結合させて、遺伝子治療で使用する核酸カ セット／分子スイッチ複合体を形成する段階をさらに含む請求の範囲第23項の方 法。 26．薬理学的用量の核酸カセット／分子スイッチ複合体を治療対象の動物又は ヒトに投与する段階をさらに含む請求の範囲第25項の方法。 27．修飾したリガンド結合部位に結合する薬理学的用量のリガンドを動物又は ヒトに投与することにより分子スイッチをオン、オフする請求の範囲第26項の方 法。 28．薬理学的用量のリガンドを動物又はヒトに投与した後に核酸配列が転写さ れてタンパク質を産生する請求の範囲第27項の方法。 29．分子スイッチ及び核酸カセットが別々のプラスミド上にあり、標的細胞に 同時注入される請求の範囲第28項の方法。 30．分子スイッチ及びSRC-1ポリペプチドをコードする核酸が別々のプラスミ ド上にあり、標的細胞に同時注入される請求の範囲第29項の方法。 28．核酸カセットと連結した分子スイッチを含む物質の組成物であって、カセ ット／分子スイッチ複合体がカセット中の核酸が標的細胞中で転写でき、かつ必 要に応じ翻訳できるようにベクター中で位置的、経時的に配向され、分子スイッ チがSRC-1ポリペプチドのコード領域をもつプラスミド中の活性プロモーターを 構成的に調節する組成物。 29．標的遺伝子の転写を減弱する方法であって、標的遺伝子を含む細胞にSRC- 1ポリペプチドの最も有力な負の抑制因子を提供する段階を含む方法。 30．遺伝子治療において核酸カセットの発現を調節するための分子スイッチで あって、 修飾したSRC-1ポリペプチドを含み、ポリペプチドが修飾結合ドメインと連結 した天然SRC-1ＤＮＡ結合ドメイン を含む分子スイッチ。 31．遺伝子治療において核酸カセットの発現を調節するための方法であって、 請求の範囲第30項の分子スイッチを結合させて遺伝子治療で使用する核酸／分子 スイッチ複合体を形成する段階と、薬理学的用量の核酸／分子スイッチ複合体を 治療対象の動物又はヒトに投与する段階とを含む方法。 32．核酸カセットと連結した分子スイッチを含む物質の組成であって、複合体 がカセット中の核酸が標的細胞中で転写でき、かつ必要に応じ翻訳できるように ベクター中で位置的に配向されている組成。 33．SRC-1をコードする配列を含む発現ベクターを細胞に挿入する段階と、こ の細胞を試験管内で培養する段階と、この細胞をかような治療が必要な患者に注 入する段階とを含む、SRC-1関連疾患又は健康状態を治療する方法。