Der Übergang
von vegetativem Wachstum zur Blüte
stellt den wichtigsten Schritt im Entwicklungszyklus einer Pflanze
dar, da die zeitliche Kontrolle des Blühzeitpunkts entscheidend für ihren
reproduktiven Erfolg ist. Daher haben die meisten Pflanzen zum Teil
sehr komplexe Mechanismen entwickelt, um den Blühzeitpunkt abhängig von
Umwelteinflüssen
sowie dem eigenen Entwicklungsstadium exakt steuern zu können.
Die
molekulargenetische Analyse der Blühzeitpunktkontrolle hat in
den letzten Jahren ein mannigfach verschaltetes Netzwerk aus verschiedenen Stoffwechselwegen
identifiziert, welche die Blütenbildung
regulieren (Übersichten
in [1–3]).
So spielen die Photoperiode, der circadiane Rhythmus, die Lichtqualität, der Einfluss
niedriger Temperaturen (Vernalisation), die Verfügbarkeit bzw. Aktivität von Phytohormonen
oder auch die Chromatinstruktur für die Kontrolle des Blühzeitpunkts
eine wichtige Rolle.
Die
Aufklärung
dieser Regulationsmechanismen ist insbesondere bei Kultur- und Nutzpflanzen von
großer
Bedeutung, um Strategien zur Optimierung des Ertrags entwickeln
zu können.
Eine Beschleunigung des Blühbeginns
könnte
zum Beispiel die Aussaat bestimmter Nutzpflanzen auch in Regionen
ermöglichen,
in denen die Wachstumssaison aufgrund der klimatischen Verhältnisse
ansonsten zu kurz wäre.
Im Gartenbau ist häufig
die Blüte,
und nicht der Same oder die Frucht das gewünschte Produkt, sodass auch
hier eine schnellere Blütenbildung vorteilhaft
wäre. In
vielen Fällen
ist aber auch eine Verzögerung
oder gar Verhinderung der Blütenbildung
erwünscht,
wie etwa beim Anbau von Grünfutter
(u.a. Alfalfa, Klee), Kohlgewächsen,
Spinat oder Salat, um dadurch die Ernteerträge zu steigern. Gleiches gilt
für Pflanzen,
bei denen die Wurzeln oder Wurzelknollen geerntet werden, also z.B.
für Kartoffeln,
Karotten oder Zuckerrüben.
Bei letzteren würde eine
Verhinderung der Blütenbildung
weiterhin dazu führen,
dass mehr Energie zur Zuckerproduktion verwendet werden könnte als
unter normalen Umständen.
Mittlerweile
konnten mehrere Regulatoren der Blühzykluskontrolle identifiziert
und molekulargenetisch charakterisiert werden, und zwar primär in Arabidopsis
thaliana, dem verbreitetsten pflanzlichen Modellorganismus. Das
U.S. Patent [4] offenbart die Klonierung und Charakterisierung des
LHY-Gens aus A. thaliana, dessen Überexpression zur einer verzögerten Blüte unter
Langtagbedingungen führt.
Der endogene LHY-Promotor reguliert dabei die Transkription in Abhängigkeit
vom circadianen Rhythmus und der Photoperiode. Ein weiterer Regulator
dieser Gruppe, der "Flowering
Locus T" (FT) aus
A. thaliana, ist in der U.S. Patentanmeldung [5] offenbart. Eine heterologe Überexpression
dieses Gens in Pflanzen hat im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen
deutlich früheren
Blühzeitpunkt
zur Folge, während
die Expression eines FT-Antisensemoleküls eine Verzögerung der
Blüte hervorruft.
Die internationale Patentanmeldung [6] beschreibt die Isolation
und Charakterisierung des Hd3a-Gens, eines Orthologs des FT-Gens
im Reis.
Die
Blütenbildung
wird auch abhängig
vom Entwicklungsstadium der Pflanze gesteuert. Diese Kontrolle erfolgt über den "autonomen" Regulationsweg.
Eine Steuerkomponente dieser Stoffwechselkaskade, das RNA-bindende
Protein FPA, wird in der Internationalen Patentanmeldung [7] offenbart.
Die transgene Expression des FPA-Gens führt dabei zu einer Induktion
der Blütenbildung
sowohl unter Lang- als auch Kurztagbedingungen. FPA scheint weiterhin auch
die Genexpression von FLC zu beeinflussen, einem potentiellen Bindeglied
der autonomen und der Vernalisations-abhängigen Kaskade.
Die
Europäische
Patentanmeldung [8] beschreibt schließlich die Klonierung und Charakterisierung
von MPC1, einem weiteren Regulator der Blütenbildung in A. thaliana,
sowie seinem Ortholog Os-MPC1 aus Reis. Transgene Pflanzen ohne
funktionelles MPC1 bilden unmittelbar nach der Keimung Blüten aus
("super early flowering"). Die Faktoren, welche
die Genexpression von MPC1 steuern, sind bislang allerdings noch
unklar.
Obwohl
durch die heterologe Expression der oben beschriebenen Regulatoren
transgene Pflanzen mit veränderten
Blüheigenschaften
generiert werden können,
sind diese häufig
anfälliger
gegenüber
Umweltfaktoren als vergleichbare Wildtyppflanzen, da eine Verkürzung bzw.
Verlängerung
der Periode bis zur Blüte
einen massiven Eingriff in die Entwicklung einer Pflanze darstellt,
der nicht nur mit der gewünschten Änderung
des Blühzeitpunkts,
sondern auch mit einer Reihe weiterer, phänotypisch oft nicht wahrnehmbarer
physiologischer Konsequenzen einhergeht. So muss zum Beispiel eine
verfrühte
Blüte einer
Pflanze unter klimatisch unvorteilhaften Bedingungen nicht zwangsläufig zu
den gewünschten
höheren
Erträgen
führen,
da der gentechnisch modifizierte Organismus seinem "normalen" Entwicklungszustand "voraus" ist und dadurch
aufgrund unzureichend ausgebildeter Schutzmechanismen anfälliger gegen
Witterungseinflüsse
und insbesondere gegen Schädlingsbefall
wird, da für
pathogene Organismen wesentlich geringere Barrieren zu überwinden
sind.
Aufgabe
der Erfindung ist es daher, ein neuartiges Verfahren zur Regulation
des Blühzeitpunkts von
Pflanzen bereitzustellen, mit Hilfe dessen diese Einschränkung umgangen
werden kann, sodass nach heterologer Expression dieser Regulatoren
die jeweiligen Wirtspflanzen weniger anfällig gegen Pathogenbefall sind.
Dieses
Ziel wird mit Hilfe eines Verfahrens zur Steuerung des Blühzeitpunkts
einer transgenen Pflanze gemäß Anspruch
1 über
die Expression von regulatorischen Proteinen erreicht, deren funktionelle Aktivität in der
Kontrolle des Blühzeitpunkts
von Pflanzen und der gleichzeitigen Vermittlung einer erhöhten Resistenz
gegen Pathogene liegt.
Die
Erfindung beruht dabei auf dem überraschenden
Befund, dass die erzwungene konstitutive Expression der hier offenbarten
Proteine aus der PCC1-Familie in Pflanzen nicht nur zu einer deutlich verfrühten Blütenbildung,
sondern auch zur Resistenz gegenüber
dem Oomyceten Hyaloperonospora parasitica (Falscher Mehltau) führte.
Die
Proteine bzw. die korrespondierenden Gene der Erfindung wurden dabei
im Rahmen von Mikroarray-Experimenten identifiziert [9]. Gesucht wurde
dabei nach Genen, deren Expression in Arabidopsis thaliana nach
Behandlung mit einem Pathogen (Pseudomonas syringae pv. tomato)
erhöht
war. Dabei wurde eine cDNA (EST163B24T7) isoliert, deren Expression
sich nach der Exposition innerhalb von 10 Minuten um den Faktor
drei erhöhte.
Weitere Experimente zeigten, dass diese cDNA in unbehandelten Pflanzen
auch einer circadianen Kontrolle mit einem Expressionsmaximum am
Tagesende unterliegt, die jedoch nach Kontakt mit einem Pathogen zugunsten
einer längerfristigen
erhöhten
Expression aufgehoben wird, d.h. die Pathogenkontrolle ist gegenüber der
circadianen Kontrolle epistatisch. Daher wurde das Gen als PCC1
für "Pathogen and Circadian
Controlled" bezeichnet.
Das
PCC1-Gen (SEQ ID Nr. 1) ist auf Chromosom 3 von A. thaliana lokalisiert
(Genlocus-Bezeichnung: At3g22231) und kodiert ein Protein aus 81
Aminosäuren
(SEQ ID Nr. 2; Accession Number: NM_113121), zu dem in anderen Organismen
keinerlei strukturelle Homologe in den Datenbanken gefunden wurden.
In
A. thaliana wurden fünf
weitere Proteine mit signifikanter Homologie zu PCC1 (33–65% Aminosäureidentität, 41–73% Aminosäureähnlichkeit; siehe 1)
identifiziert: At3g22240 (SEQ ID Nr. 4), At2g32190 (SEQ ID Nr. 6;
Accession Number: AY088012), At2g32200 (SEQ ID Nr. 8), At2g32210 (SEQ
ID Nr. 10; Accession Number: AY074358) und At1g05340 (SEQ ID Nr.
12). Die sechs Proteine besitzen neben einer analogen Genstruktur
mit drei Exons und zwei Introns nicht nur eine ähnliche Größe (68–81 Aminosäuren), sondern auch zwei hochkonservierte
Bereiche im zentralen Bereich der Sequenz (PPPI/LGYPT bzw. VETN/KSKG), die auch eine funktionelle Bedeutung
dieser Sequenzmotive nahe legen. Detaillierte Struktur-Funktionsanalysen
der Proteine liegen bislang allerdings noch nicht vor.
Die
heterologe Expression von PCC1 führt zu
einer deutlich verfrühten
Blüte der
Wirtspflanzen, was in Verbindung mit dem circadianen Muster der Genexpression
eine Funktion im Rahmen der Regulation der Photoperiode möglich erscheinen
lässt.
Die schnellere Induktion der Blütenbildung
geht einher mit einer erhöhten
Resistenz gegen Pathogenbefall. Der Begriff Pathogen bezeichnet
in diesem Zusammenhang einen beliebigen Organismus, der eine Pflanze
infizieren und in ihrer Entwicklung beeinträchtigen kann, d.h. phytopathogene
Bakterien, Viren, Nematoden, Insekten und Pilze.
Eine
erhöhte
Pathogenresistenz einer transgenen Pflanze, in der ein Protein gemäß der Erfindung
exprimiert wurde, bezieht sich immer auf den Vergleich mit der unbehandelten
Wildtyppflanze. Eingeschlossen in die Erfindung sind daher alle
Proteine, die einer transgenen Wirtspflanze neben einem veränderten
Blühverhalten
eine teilweise oder vollständige
Resistenz gegenüber
mindestens einem Pathogen verleihen.
Die
Erfindung umfasst Verfahren zur Steuerung des Blühzeitpunkts einer transgenen
Pflanze, die das Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das für PCC1 (At3g22231; SEQ ID Nr.
2; Accession Number: NM_113121), At3g22240 (SEQ ID Nr. 4), At2g32190
(SEQ ID Nr. 6; Accession Number: AY088012), At2g32200 (SEQ ID Nr.
8), At2g32210 (SEQ ID Nr. 10; Accession Number: AY074358) oder At1g05340
(SEQ ID Nr. 12), wobei insbesondere PCC1 (SEQ ID Nr. 2) bevorzugt
wird (siehe auch 1), kodiert und dessen heterologe
Expression um die Aktivität
des korrespondierenden Polypeptids nach oben bzw. unten zu regulieren
umfasst.
Die
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind
nicht auf Nukleinsäuresequenzen
von Arabidopsis thaliana beschränkt,
sondern schließen
alle Nukleinsäuremoleküle ein,
die ein Protein gemäß der Erfindung
kodieren. Ein hier gemäß dem Verfahren nach
Anspruch 1 verwendetes Nukleinsäuremolekül kann "operativ" mit einer regulatorischen
Sequenz verknüpft sein,
um die Expression des Nukleinsäuremoleküls zu ermöglichen.
Ein
Nukleinsäuremolekül wird als "fähig zur Expression einer Nukleinsäuresequenz" bezeichnet, wenn
es Sequenzelemente umfasst, die Informationen hinsichtlich der Regulation
von Transkription und/oder Translation enthalten, und diese Elemente "operativ" mit der das Polypeptid
kodierenden Nukleinsäuresequenz
verknüpft
sind. Eine operative Verknüpfung
ist eine Verknüpfung,
bei der die regulatorischen Sequenzelemente und die proteinkodierende Sequenz
derart verbunden sind, dass Genexpression möglich ist. Die genaue Beschaffenheit
der zur Genexpression erforderlichen regulatorischen Bereiche kann
zwischen verschiedenen Spezies variieren. In der Regel umfassen
diese Bereiche jedoch einen Promotor, der in der Regel aus dem Promotor
per se besteht, i.e. DNA-Elemente, welche die Transkriptionsinitiation
steuern, sowie aus DNA-Elementen, die nach ihrer Transkription in
mRNA den Beginn der Translation regulieren. Solche Promotoren schließen normalerweise
5' nicht-kodierende
Sequenzen ein, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt
sind, wie zum Beispiel die -35/-10-Elemente und das Shine-Dalgarno Element
in Prokaryonten oder die TATA-Box, CAAT-Sequenzen und 5'-Capping-Elemente
in Eukaryonten. Diese Regionen können
ferner auch Enhancer- oder Repressorelemente enthalten sowie translatierte
Signalsequenzen, um die native Polypeptidkette in ein spezielles
Kompartiment der Wirtszelle zu dirigieren Zusätzlich können auch die 3' nicht-kodierenden
Regionen regulatorische Elemente enthalten, die an der Termination
der Transkription, der Polyadenylierung o.ä. beteiligt sind. Falls diese
Terminationssequenzen in einer speziellen Wirtszelle nicht oder
nur unzureichend funktionell sind, können sie durch Signale ersetzt werden,
die in der betreffenden Zelle ausreichend funktionell sind.
Ein
Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung
kann demnach eine regulatorische Sequenz, insbesondere eine Promotorsequenz
umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung eine
Promotorsequenz sowie eine Transkriptionsterminationssequenz. Hinsichtlich
der Promotorsequenz kann es sich um einen konstitutiven oder einen induzierbaren
Promotor handeln. Geeignete prokaryontische Promotoren sind zum
Beispiel der lacUV5-Promotor oder der T7-Promotor. Beispiele für geeignete
eukaryontische Promotoren sind der SV40-Promotor oder der CMV-Promotor.
Besonders bevorzugt werden jedoch Nukleinsäuremoleküle, die regulatorische Sequenzen
aus Pflanzen umfassen [11, 12]. Geeignete pflanzliche Promotoren
sind zum Beispiel die 35S RNA und 19S RNA Promotoren des Cauliflower
Mosaic Virus, der durch Licht induzierbare Promotor der kleinen
Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase
(RUBISCO) oder die Promotoren der Nopalin- und Octopinsynthase auf
dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, die auch in Pflanzen
aktiv sind. Ein Beispiel eines pflanzlichen Terminators ist die
3'-untranslatierte Region
(UTR) der kleinen RUBISCO Untereinheit. Weiterhin wurden Systeme
beschrieben, die eine Expression nach Aufbringen von Substanzen
auf die Pflanze (z. B. Steroidhormone) ermöglichen.
Ein
Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung
kann dabei mit der regulatorischen Sequenz in Sense- oder in Antisense-Orientierung verknüpft sein.
Eine Verknüpfung
in Sense-Orientierung
führt zur
Transkription eines mRNA-Moleküls
und in weiterer Konsequenz zur Synthese eines Polypeptids der PCC1-Familie.
Eine Verknüpfung
in Antisense-Orientierung dagegen hat die Synthese eines zur mRNA komplementären RNA- Moleküls (i.e.
antisense RNA) zur Folge, das als genetisches Werkzeug zur Inhibierung
der Genexpression eingesetzt werden kann, wobei auch Fragmente des
Nukleinsäuremoleküls zur Inhibierung
ausreichen.
Die
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können ferner
in einem Vektor oder einem anderen Klonierungsvehikel enthalten
sein, wie zum Beispiel Phagen, Phagemiden, Cosmiden, Baculoviren
oder künstlichen
Chromosomen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül in einem
Vektor enthalten, insbesondere in einem Expressionsvektor. Ein derartiger
Expressionsvektor kann neben den oben bereits beschriebenen regulatorischen
Sequenzen und der Nukleinsäuresequenz, die
ein Pflanzenprotein gemäß der Erfindung
kodiert, Replikations- und Kontrollsequenzen umfassen, die von einem
Organismus stammen, der mit dem zur Expression verwendeten Wirt
kompatibel ist, sowie weiterhin mindestens einen Selektionsmarker,
der einen selektierbaren Phänotyp
auf eine transformierte Zelle überträgt. Eine
große
Zahl geeigneter Vektoren, z.B. pBluescript, pUC18, pET oder pcDNA3,
ist detailliert beschrieben und kommerziell erhältlich. Insbesondere bevorzugt
werden Vektoren, die zur Genexpression in Pflanzen geeignet sind.
Beispiele derartiger Vektoren sind Ti-Plasmide, Ri-Plasmide, Shuttle-Vektoren
wie pPZP221 oder Pflanzenviren, z.B. der Cauliflower Mosaic Virus
[11, 12].
Die
Nukleinsäuremoleküle, die
ein Protein gemäß der Erfindung
kodieren, und insbesondere ein Vektor, der die kodierende Sequenz
eines solchen Proteins enthält,
können
gemäß dem Verfahren
aus Anspruch 1 in eine entsprechende Pflanze eingebracht und zur
Expression gebracht werden.
Das
Klonieren in einen zur Expression in Pflanzen geeigneten Vektor
kann dabei entweder mit einem Nukleinsäuremolekül, das nur ein Protein aus der
PCC1-Familie kodiert, durchgeführt
werden oder mit einem Nukleinsäuremolekül, in dem
das Protein operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist.
Der so erhaltene rekombinante Vektor kann in der Folge mittels verschiedener
etablierter Verfahren in Pflanzenzellen eingebracht werden [11,
12]. Eine routinemäßig verwendete
Methode ist die Transformation mittels Agrobacterium tumefaciens,
einem Bodenbakterium, das in infizierten Pflanzen die Bildung von
Wurzelhalsgallen auslöst.
Dabei inseriert es einen Teil seiner DNA, die sogenannte T-DNA,
die auf dem Ti-Plasmid ("tumor
inducing") kodiert
ist, in das Genom der Wirtszelle. Durch Insertion einer heterologen
DNA in die T-DNA Region verliert das Ti-Plasmid seine Virulenz und
kann als "Genfähre" zur Transformation
von Pflanzenzellen eingesetzt werden. Alternative Transformationsverfahren
umfassen zum Beispiel Elektroporation, Mikroinjektion, DNA-Präzipitation
mit Polyethylenglykol und Hochgeschwindigkeitsbeschuss der Zellen
mit Partikeln, welche die heterologe DNA in ihrem Inneren oder auf ihrer
Oberfläche
tragen. An die Transformation schließt sich die Regeneration der
vollständigen transgenen
Pflanze an. Diese kann u.a. ausgehend von einer einzelnen Pflanzenzelle,
einem Protoplasten, Kallus oder Gewebeabschnitt oder dem Samen erfolgen.
Nahezu jede Pflanze kann aus Zellen, Geweben oder Teilen vollständig regeneriert
werden. Die dazu erforderlichen Techniken sind zum Beispiel in den Übersichten
[11, 12] detailliert beschrieben.
Als "Targetpflanzen" können dabei
sowohl monokotyle als auch dikotyle Spezies verwendet werden. Von
besonderer Bedeutung sind Kultur- und Nutzpflanzen, bei denen die
gezielte Modulation des Blühzeitpunkts
bzw. eine erhöhte
Pathogenresistenz eine Ertragssteigerung und damit einen wirtschaftlichen
Vorteil mit sich bringt. Beispiele solcher Pflanzen sind Getreide
(Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais), Kartoffeln, Raps, Sojabohnen,
Zuckerrüben,
Klee, Karotten, Sonnenblumen oder Baumwolle, oder auch Blütenpflanzen/Schnittblumen.
Demnach
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Steuerung des Blühzeitpunkts
einer transgenen Pflanze, das die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung
in eine Pflanze, und
- (b) heterologe Expression des Nukleinsäuremoleküls aus
- (a), um die Aktivität
des korrespondierenden Polypeptids nach oben bzw. unten zu regulieren.
Die
Regulation der Genexpression kann dabei auf transkriptioneller,
post-transkriptioneller, translationeller oder post-translationeller
Ebene erfolgen. So kann zum Beispiel durch Einbringen einer zweiten
oder weiterer Kopien eines Gens aus der PCC1-Familie in eine Pflanze
die PCC1-Aktivität erhöht werden,
was wiederum zu einer schnelleren Induktion der Blütenbildung
führt.
Die Expression einer Nukleinsäuresequenz,
die nur einen Teil eines Proteins gemäß der Erfindung kodiert, kann
aber andererseits auch zu einer Verzögerung des Blühzeitpunkts führen, indem
dieses Peptid mit der Funktion des endogenen Proteins interferiert.
Ein solches Peptid wird als dominant-negative Mutante bezeichnet.
Enthält eine
Pflanze eine transgene Kopie eines endogenen Gens (bzw. die Kopie
eines Fragments davon) in Sense-Orientierung,
d.h. in der gleichen Orientierung wie die endogene Kopie, kann dies
zu einer transkriptionellen Inaktivierung ("silencing") beider Genkopien führen, weshalb man bei diesem
Phänomen
auch von Cosuppression spricht (Übersichten
in [15, 16]). Alternativ kann die Genexpression eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung
aber auch durch die Expression eines Antisensemoleküls herunterreguliert werden
(Übersichten
in [17, 18]). Ein Antisense-Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung ist in umgekehrter
Orientierung zur endogenen Kopie der Sequenz kloniert. Seine Transkription
führt daher
zu einem RNA-Molekül,
das zur mRNA des endogenen Gens komplementär ist, d.h. diese mRNA binden
und deren Translation verhindern kann. In den letzten Jahren wurde
mit der RNA-Interferenz (in Pflanzen auch als "posttranscriptional gene silencing" bezeichnet) eine
weitere Methode zur Verminderung der Genexpression beschrieben,
die auf der Aktivität
doppelsträngiger
RNA basiert (Übersichten
in [19, 20]). Verantwortlich für
diesen Prozess sind 21–25
Nukleotide lange siRNAs ("small
interfering RNAs"),
die an die zu inaktivierende endogene Nukleinsäuresequenz binden und deren
Degradation durch Rekrutierung eines spezifischen Enzymkomplexes
einleiten. Solche siRNAs können
entweder in vivo aus transkribierten DNA-Vorläufermolekülen hergestellt oder chemisch
synthetisiert und anschließend
in die Zellen eingeschleust werden.