DE69001484T2

DE69001484T2 - Verwendung von menschlichen BCDF für die Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von Thrombocytopenia.

Info

Publication number: DE69001484T2
Application number: DE90100371T
Authority: DE
Inventors: Yukio Akiyama; Toshio Dr Hirano; Toshiyuki Ishibashi; Hideo Kimura; Tadamitsu Kishimoto; Akira Okano
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1989-01-13
Filing date: 1990-01-09
Publication date: 1994-01-05
Anticipated expiration: 2010-01-10
Also published as: JPH03101624A; JP2805224B2; EP0378171A2; EP0378171A3; KR960000395B1; EP0378171B1; US5310550A; US5126325A; DE69001484D1; KR900011474A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von humanem B-Zell-Differenzierungsfaktor (kurz "hBCDF") zur Herstellung von Zusammensetzungen zur Behandlung van Thrombozytopenie (Thrombozyten-Defizienz).
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung von Zusammensetzungen zur Behandlung von Thrombozytopenie, die als wirksamen Inhaltsstoff humanes BCDF enthalten.
Faktoren zur Differenzierung reifer B-Zellen zu Antikörper produzierenden Zellen in Menschen und Mäusen werden insgesamt als B-Zell-Differenzierungsfaktor (BCDF) bezeichnet.
Humanes BCDF besitzt eine Aktivität, die im menschlichen Körper wichtig ist. Eine kürzlich durchgeführte umfassende Forschungsarbeit führte zur Bestimmung der BCDF codierenden DNA-Sequenz und der Aminosäuresequenz von BCDF (Japanische Patentanmeldungen OPI Nr. 42688/88 und 56291/88). Darüber hinaus wurde humanes BCDF erfolgreich in E. Coli hergestellt (Japanische Patentanmeldung OPI Nr. 157996/88).
Es wurde gefunden, daß humanes BCDF als immunotherapeutisches Mittel verwendet werden kann, das in der Behandlung infektiöser Krankheiten und Krebserkrankungen wirksam ist (Japanische Patentanmeldungen Nr. 289007/87, OPI 63527/89).
Die Erfinder haben auch gefunden, daß humanes BCDF ein wirksames, unterstützendes Mittel bei Knochenmarkstransplantations-Therapie ist. (Japanische Patentanmeldung Nr. 289007/87 und Europäische Patentanmeldung Nr. 89 110 835.9 (= EP-A-350641). Bis jetzt wurde jedoch noch kein Bericht über pharmazeutische Wirkungen von humanem BCDF auf die Thrombozytopoiese gefunden, um eine Defizienz an Thrombozyten zu heilen.
Es wurde vorgeschlagen BCDF alternativ auch als BSF-2 oder Interleukin-6 (IL-6) zu bezeichnen (Nature 324 (1986), 73; EMBO J. 6 (1987), 1219). In der vorliegenden Beschreibung wird jedoch der herkömmliche Ausdruck "BCDF" verwendet. Das erfindungsgemäß verwendete humane BCDF besitzt darüber hinaus keine Interferon-Aktivität und ist daher von IFN-β&sub2; verschieden, das Interferon-Aktivität aufweist (veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 0-220 574).
Zunächst wird eine kurze Darstellung der Thrombozytopoiese und Thrombozytopenie gegeben und im Anschluß daran die derzeitige Standardtherapie für Thrombozytopenie kurz erläutert.
Thrombozyten sind eine Sorte von Blutzellen, die für den Mechanismus der Blutstillung in lebenden Organismen eine wichtige Rolle spielen. Thrombozyten heften sich an beschädigtes Gewebe, koagulieren dort und setzen gleichzeitig intrazelluläre Komponenten frei, die eine Reihe von Koagulationsreaktionen induzieren.
Es sind verschiedene Formen von Thrombozytopenie bekannt, die eine Verringerung der Thrombozyten-Zahl bewirkt, wie erbliche Thrombozytopenie, idiopathische thrombozytopenische Purpura, aplastische Anämie, usw.. Sekundäre Thrombozytopenie, die durch generelle Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, Verabreichen von Arzneimitteln, die Hämatopoiese verhindern oder durch ähnliche Behandlungen induziert wird, stellt eine klinisch bedeutsamere Form von Thrombozytopenie dar.
In vielen Fällen wird sekundäre Thrombozytopenie durch Chemotherapie, Radiotherapie, Knochenmarks-Transplantation usw. verursacht, die bei Krebspatienten durchgeführt wird, was zu einer verminderten Bildung von Knochenmarks-Megakaryozyten führt. Sekundäre Thrombozytopenie ist eine gefährliche Krankheit, die die Genesung des Patienten beeinträchtigt und durch Blutungen manchmal zum Tod führt.
Eine Thrombozytopenie-Therapie, die gegenwärtig sehr häufig angewendet wird, beinhaltet Transfusion von Thrombozyten, um die Thrombozyten-Zahl bei einem Wert von mehr als 20000/ul zu halten. Im Falle einer Knochenmarks-Transplantation hingegen werden beispielsweise mehrere Monate benötigt, um die Thrombozyten-Zahl auf normale Werte zu bringen, so daß wiederholte Transfusion von Thrombozyten erforderlich ist, deren HLA (Humanes-Leukozyten-Antigen) jedoch nicht kompatibel ist. Als Folge werden anti-Thrombozyten-Antikörper gebildet, und in vielen Fällen steigt, sogar nach Transfusion von Thrombozyten, die Zahl der Thrombozyten nicht an. Zusätzlich besteht die Gefahr einer Cytomegalovirus-Infektion usw.. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß interstitielle Pneumonie eine der drei häufigsten Ursachen von postoperativem Tod darstellt, wird die Anzahl der Thrombozyten-Transfusionen bevorzugt so klein wie möglich gehalten. Thrombozytopoiese ist der Vorgang, bei dem Megakaryozyten-Vorläuferzellen, die von multipotenten Stammzellen abstammen, über Megakaryoblasten in Megakaryozyten umgewandelt werden, aus denen sich dann Thrombozyten entwickeln.
Es wird angenommen, daß diese physiologische Thrombozytopoiese durch humorale Faktoren kontrolliert wird.
Wenn daher die Thrombozytopoiese des Patienten selbst durch Ergänzung derartiger humoraler Faktoren aus einer externen Quelle verbessert werden kann, würde eine Blutung ohne Transfusion von Thrombozyten verhindert werden. Es kann daher erwartet werden, daß ein derartiges Verabreichen von geeigneten, humoralen Faktoren zur grundlegenden Behandlung von Thrombozytopenie wirksam wäre. Von den humoralen Faktoren, die an der Thrombozytopoiese beteiligt sind, wird behauptet, daß Faktoren wie Thrombopoietin (TPO), Megakaryozyten stimulierender Faktor (TSF), Thrombozytopoiese stimulierender Faktor (TSF) usw. die Reifung und Differenzierung von Megakaryozyten in vivo fördern wurden, wobei diese Substanzen selbst noch nicht erforscht sind ("IGAKU-NO-AYUMI" Progress in Medicine 143 (1987), 528).
Andererseits wurde berichtet, daß Megakaryozyten-Koloniestimulierender Faktor (Meg-CSF) und Megakaryozyten-Koloniepotenzierender Faktor (Meg-POT) zur Bildung von Megakaryozyten- Kolonien in vitro erforderlich sind (Medical Immunology 14 (1987), 463).
Bezüglich des Meg-CSF wurde in den letzten Jahren gezeigt, daß IL-3, GM-CSF, EPO usw. Meg-CSF-Aktivität aufweisen ("JIKKEN IGAKU" Experimental Medicine 5 (1987), 822). Die Anwesenheit der anderen Faktoren wurde jedoch nur durch verschiedene physiologische Aktivitäts-Nachweissysteme für möglich gehalten.
Sparrow et al., Leukemia Research Vol. 11, Nr. 1 (1987), 31-36 offenbaren, daß Interleukin-3 die in vitro Proliferation und Differenzierung von Knochenmarks-Vorläuferzellen stimuliert. Dieser Artikel erwähnt, daß ein zweiter Faktor, der in Maus-Lungen-konditioniertem Medium oder serumfreiem, P388D1- Zellen-konditioniertem Medium gefunden wurde und als Megakaryozyten-potenzierender Faktor bezeichnet wird, allein die Koloniebildung nicht stimuliert, jedoch zusammen mit Interleukin-3 zur Steigerung der Zellgröße synergistisch wirkt. Der Artikel gibt jedoch keine Informationen über die Natur dieses Faktors oder das Verfahren seiner Herstellung und Isolierung.
Die Aminosäuresequenzen, DNA-Sequenzen und andere Parameter dieser Faktoren sind natürlich ebenfalls unklar. Es war infolgedessen noch nicht möglich, reine Produkte im industriellen Maßstab herzustellen, die zur Verwendung als Arzneimittel geeignet sind. Noch bemerkenswerter ist, daß es keinen Bericht darüber gibt, daß das in vivo Verabreichen dieser Faktoren die Thrombozyten-Zahl im peripheren Blut erhöhen würde.
Es wurde kein Faktor gefunden, der die Thrombozytopoiese stimuliert und bei Verabreichen an den Patienten die Thrombozyten-Produktion des Patienten selbst fördert.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher eine Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die die Thrombozytopoiese eines Patienten fördert, der an Thrombozytopenie leidet und so ein Mittel zur Behandlung von Thrombozytopenie zur Verfügung zu stellen.
Als ein Ergebnis intensiver Untersuchungen zur Lösung des vorstehenden Problems haben die Erfinder gefunden, daß (1) humanes BCDF die Megakaryozyten-Kolonie-Bildung in vitro mit IL-3 synergistisch steigert, usw. und Reifung und Differenzierung von Megakaryozyten selbst induzieren kann, und daß (2) das in vivo Verabreichen von humanem BCDF die Thrombozyten-Zahl im peripheren Blut erhöhen kann. Damit wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von humanem B-Zell-Differenzierungsfaktor oder seinem biologischen Aquivalent zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie.
Das erfindungsgemäß verwendete humane BCDF weist die folgende Aminosäuresequenz (I) oder (II) auf, die beispielsweise in den Japanischen Patentveröffentlichtingen OPI Nr. 42688/88 und 56291/88 und der Japanischen Patentanmeldung Nr. 289007/87 gezeigt ist. Aminosäuresequenz (I)
oder, Aminosäuresequenz (II):
Die Aminosäuresequenz (I) stellt die von humanem BCDF dar wahrend Aminosäuresequenz (II) ein Polypeptid darstellt, das eine durch Anfügen eines Alanins an das N-terminale Ende von humanem BCDF erhaltene Struktur aufweist (nachstehend als humanes Ala-BCDF bezeichnet). Das erfindungsgemäß verwendete humane BCDF weist jedoch nicht notwendigerweise die durch die vorstehend beschriebenen Aminosäuresequenzen (I) oder (II) gezeigte Struktur auf. In der vorliegenden Erfindung können biologische Äquivalente von hBCDF verwendet werden, die Derivate der Aminosäuresequenz (I) oder der Aminosäuresequenz (II) sind und durch Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von Aminosäuren erhältlich sind, wobei die Derivate Aktivität von humanem BCDF aufweisen.
Das heißt, solche, die eine Struktur aufweisen, die durch Anfügen einer oder mehrerer Aminosäuren an humanes BCDF am N- terminalen Ende und/oder am C-terminalen Ende gebildet werden und solche, die eine Struktur aufweisen, bei der eine oder mehrere Aminosäuren der Struktur von humanem BCDF durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, können ebenfalls als das erfindungsgemäße BCDF verwendet werden, so lange sie die Aktivität von humanem BCDF aufweisen. Vorzugsweise wird humanes BCDF oder humanes Ala-BCDF verwendet. Der Gehalt an humanem BCDF oder seines biologischen Äquivalents in der Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie beträgt erfindungsgemäß 0,0001 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 1,0 Gew.-%.
Desweiteren kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie, die als wirksamen Inhaltsstoff das humane BCDF enthält, auch ein herkömmliches Stabilisierungsmittel wie Serumalbumin und einen Arzneimittelträger wie Mannitol enthalten.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie kann außerdem, zusätzlich zu dem humanen BCDF, als Hilfsmittel auch ein oder mehrere, von BCDF verschiedene Zytokine enthalten, beispielsweise IL-3, IL-1, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO und Meg-CSF.
Wenn (ein) derartige(s) Hilfsmittel mit eingeschlossen ist/sind, können die Wirkungen der Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie synergistisch verstärkt werden. Dies, da IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO und Meg-CSF die Förderung von hämatopoietischen Funktionen verstärken können. Die Menge dieser zuzusetzenden Hilfsmittel ist nicht besonders beschränkt, kann aber, bezogen auf humanes BCDF als 100%, im Bereich von 0,0001 bis 200000 Gew.-% liegen.
Wie bereits bemerkt, ist die Zugabe dieser Hilfsmittel nicht notwendigerweise auf den vorstehend beschriebenen Bereich beschränkt, sondern kann je nach Zustand und Alter des Patienten in geeigneter Weise bestimmt werden.
Die Hilfsmittel wie IL-3 müssen nicht immer als Arzneimittel zusammen mit humanem BCDF zur gleichen Zeit verabreicht werden. D.h. diese Hilfsmittel können zu einer geeigneten Zeit vor oder nach dem Verabreichen der Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie verabreicht werden, die als wirksamen Inhaltsstoff humanes BCDF enthält.
Die erfindungsgemäß hergestellte Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie kann natürlich in Kombination mit einer Thrombozyten-Transfusions-Therapie angewandt werden.
Die Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie kann als intravenöse Injektion oder als intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht werden. D.h. die Zusammensetzung kann in jeder Art und Weise verabreicht werden.
Zur Herstellung medizinischer Zusammensetzungen von humanem BCDF können die in den Japanischen Patentanmeldungen Nr. 289007/87 und 147594/88 beschriebenen Verfahren verwendet werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete humane BCDF kann jedes BCDF sein, das nach bekannten Verfahren in humanen T-Zellen, B-Zellen oder Fibroblasten (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82. (1985), 5490) hergestellt wird, oder durch Kultivieren von Transformanten, die durch Transformation eines geeigneten Wirts wie E.Coli, Hefe, Affenzellen (COS-Zellen), Hamsterzellen oder Bakterien mit einer rekombinanten DNA erhalten werden, die ein humanes BCDF codierendes Gen und einen geeigneten Vektor umfaßt. Darüber hinaus kann auch aus Blut oder Urinproben aufgereinigtes humanes BCDF verwendet werden.
Bezüglich der Details dieser Herstellungsverfahren wird auf die Japanischen Patentanmeldungen OPI Nr. 115024/86, 42688/88, 56291/88 und 157966/88 verwiesen.
Die in der vorliegenden Erfindung hergestellte Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombozytopenie, die als den wirksamen Inhaltsstoff humanes BCDF enthält, beschleunigt die Reifung und Differenzierung von Megakaryozyten und erhöht die Thrombozyten-Zahl im peripheren Blut. Durch diese Wirkungen ist die Zusammensetzung bei der Behandlung eines an Thrombozytopenie leidenden Patienten wirksam, insbesondere eines Krebspatienten nach einer Chemotherapie, Radiotherapie und Knochenmarks-Transplantations-Therapie und eines Patienten mit schwachen Widerstandskräften gegen virale Infektionen nach einer Thrombozyten-Transfusion.

Beispiel 1

Beschleunigung von Megakaryozyten-Koloniebildung durch humanes BCDF

Knochenmarkszellen wurden in herkömmlicher Weise aus den Oberschenkelknochen von C57BL/6 Mäusen isoliert.
Aus den Knochenmarkszellen wurden 7,5x10&sup4; von nicht adhärenten Zellen in 1ml Iskove's modifiziertem Dulbecco Medium kultiviert, das 1% Rinderserumalbumin, 360 ug/ml Eisen gesättigtes humanes Transferrin, 0,98 ug/ml Cholesterin, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 0,3% Agar enthielt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde das Medium mit humanem BCDF in verschiedenen Konzentrationen ergänzt, und mit Medium, das mit 2,5% Pokeweed-Mitogen-stimulierten Maus-Milzzellen konditioniert worden war (einfach als PWM-SCM bezeichnet, das Meg-CSF Aktivität besitzt)
Nach 7 Tagen in Kultur bei 37ºC wurden die Agarscheiben auf Objektträger aus Glas transferiert und mit 2% (v/v) Glutaraldehyd fixiert.
Megakaryozyten-Kolonien wurden nach histochemischer Färbung auf Acetycholinesterase (AchE) gezählt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Weiterhin wurden anstelle von PWM-SCM 20 U/ml Maus-IL-3 (von Genzym Co., Ltd hergestellt) zugegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Bei alleiniger Verwendung von humanem BCDF, war die Fähigkeit Megakaryozyten-Kolonien zu bilden gering, wobei humanes BCDF jedoch, konzentrationsabhängig, bei gleichzeitiger Anwesenheit von PWM-SCM oder Maus IL-3 mit Meg- CSF Aktivität, die Bildung von Megakaryozyten-Kolonien induzierte.
Ein ähnlicher Effekt wurde auch bei humanen Knochenmarkszellen beobachtet. D.h. verglichen mit der alleinigen Zugabe von IL-3 (100 U/ml) stieg die Zahl der Megakaryozyten-Kolonien um den Faktor 2,5 an, wenn humanes BCDF (100 ng/ml) zusammen mit humanem IL-3 (100 U/ml) vorhanden war. Tabelle 1 Humanes BCDF (ng/ml) Zahl der Megakaryozyten-Kolonien Tabelle 2 Humanes BCDF (ng/ml) Maus-IL-3 Zahl der Megakaryozyten-Kolonien

Beispiel 2

Förderung der Reifung/Differenzierung von Megakaryozyten durch humanes BCDF

Nach dem Verfahren von Beispiel 1 isolierte Maus-Knochenmarkszellen wurden durch intrinsische Cholinesterase inaktiviert und 1x10&sup5; Zellen in 0,2 ml serumfreiem, flüssigem Medium kultiviert, das verschiedene Konzentrationen von humanem BCDF enthielt.
Nach viertägiger Inkubation bei 37ºC wurde die Magakaryozyten-Zahl in den Knochenmarkszellen durch die Zahl der AchE- positiven Zellen bestimmt, das ein für Maus-Megakaryozyten spezifisches Enzym ist. Außerdem wurde das Ausmaß der Reifung/Differenzierung untersucht, wobei als Parameter der Durchmesser der Megakaryozyten und die AchE-Aktivität verwendet wurde. Wie in den Tabellen 3 und 4 gezeigt, steigert humanes BCDF allein, konzentrationsabhängig, den Durchmesser von Megakaryozyten und die AchE-Aktivität.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, erhöhte die Zugabe von 200 ng/ml humanem BCDF zu dem Ein-Zell-Kultursystem, in dem isolierte, einzelne Megakaryozyten für einen Tag in 1 ul flüssigem Medium gehalten wurden, den Durchmesser von Megakaryozyten beträchtlich.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß humanes BCDF direkt auf Megakaryozyten wirkt, um die Reifung/Differenzierung von Megakaryozyten zu induzieren.
Flüssigkultur, Bestimmung der AchE-Aktivität und Ein-Zell- Kultur wurde gemäß den in BLOOD 67 (1986), 1512 und J. Clin. Invest. 79 (1987), 286 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Tabelle 3 Humanes BCDF (ng/ml) Zahl an Megakaryozyten Mittlerer Durchmesser (um) Tabelle 4 Humanes BCDF (ng/ml) AchE-Aktivität (AU) Tabelle 5 Menge an Zellen mit vergrößertem Zelldurchmesser* (%) Anfänglicher Zelldurchmesser (um) Keine Zugabe von BCDF Zugabe von BCDF (200 ng/ml) * Zahl der Zellen mit vergrößertem Durchmesser/Gesamtzahl der Zellen

Beispiel 3

Reifung von Maus-Knochenmarks-Megakaryozyten durch in vivo Verabreichen von humanem BCDF und Anstieg der Thrombozyten-Zahl im peripheren Blut

5 bis 10 ug humanes BCDF wurde in 100 ul 1% Mausserum enthaltendem PBS gelöst. Die Lösung wurde während 5 Tagen 4 bis 7 C57BL/6-Mäusen (männlich, 6 bis 7 Wochen alt) zweimal am Tag in 12 stündigen Intervallen intraperitoneal verabreicht. Der Kontrollgruppe wurde durch vierzig minütige Hitzebehandlung bei 100ºC inaktiviertes humanes BCDF in ähnlicher Weise verabreicht. Vier Tage nach der letzten Gabe wurde den Mäusen der Oberschenkelknochen entnommen. Der Oberschenkelknochen wurde mit 10% Formalin fixiert, dehydriert, in Kunststoff eingebettet, der Länge nach in Schnittpräparate zerteilt und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um die Auswirkungen von humanem BCDF auf Knochenmarks-Megakaryozyten zu bestimmen.
Wie in Tabelle 6 gezeigt, stieg die Megakaryozyten-Zahl als Folge, im Vergleich zur Kontrollgruppe, nicht wesentlich an, wobei sich jedoch in der mit humanem BCDF behandelten Gruppe der Durchmesser der Megakaryozyten erheblich vergrößerte. Diese Tatsache zeigte daher die BCDF induzierte Stimulation der Megakaryozyten-Reifung von Megakaryozyten. Tabelle 6 Anzahl Megakaryozyten Gruppe Zahl (/mm²) Bereinigte Zahl Durchmesser der Megakaryozyten (um) Tage Kontrolle * signifikant für p = 5%
4 bis 8 Mäusen wurden in ähnlicher Weise 5 Tage lang 0,5 bis 10ug humanes BCDF intraperitoneal verabreicht. Vier Tage nach der letzten Gabe wurde aus dem Herzen mittels einer mit EDTA behandelten Spritze Blut entnommen und die Thrombozytenzahl mit einem Blut-Autoanalysator (von Coaltar Co., Ltd. hergestellt) bestimmt. Wie in Tabelle 7 gezeigt, stieg die Thrombo-zyten-Zahl in Abhängigkeit von der Dosis an humanem BCDF an. Wie in Tabelle 8 gezeigt, zeigte sich darüber hinaus am vierten Tage nach der Gabe, als experimentelles Ergebnis der Blutabnahme im Verlauf der Zeit, eine bemerkenswerte Auswirkung von humanem BCDF. Tabelle 7 Thrombozyten-Zahl (x10&sup4;/ul) Dosis an humanen BCDF Kontrollgruppe mit BCDF behandelte Gruppe zweimal/Tag Tage *: signifikant bei p = 5% **: signifikant bei p = 1% Tabelle 8 Thrombozyten-Zahl (x10&sup4;/ul) Tag nach Verabreichen Kontrollgruppe mit BCDF behandelte Gruppe * : signifikant bei p = 1%

Beispiel 4

Wiederherstellung der Thrombozyten-Zahl im peripheren Blut von an Thrombozytopenie erkrankten Mäusen durch in vivo Verabreichen von humanem BCDF

70ug humanes BCDF (10ug/Maus/Tag x 7 Tage) wurden fünf Mäusen (5) DBA/2 Mäusen (weiblich, 8 Wochen alt) mittels einer von Alza Co., Ltd hergestellten, subkutan implantierten Osmose- Pumpe kontinuierlich verabreicht. Aus dem Herzen der Mäuse wurde im Verlauf der Zeit peripheres Blut isoliert und die Thrombozyten-Zahl im Blut mit einem automatischen hämatologischen Analysator (Toa Medical Electronic Co., Ltd.) bestimmt. Verglichen mit der Kontrollgruppe, der humanes Albumin verabreicht wurde (80±6 x 10&sup4;/ul) betrug die Thrombozyten-Zahl in der 7 Tage lang mit humanem BCDF behandelten Gruppe 97±14 x 10&sup4;ul, was einen statistisch signifikanten Anstieg zeigt.
Darüber hinaus wurde kein signifikanter Anstieg der Thrombozyten-Zahl verzeichnet, wenn humanes BCDF verabreicht wurde, das durch 40 minütige Hitzebehandlung bei 100ºC inaktiviert worden war.
Die Auswirkung kontinuierlicher Perfusion mit humanem BCDF wurde ebenfalls in Mäusen verzeichnet, die an durch Verabreichen chemotherapeutischer Mittel induzierter Thrombozytopenie litten.
D.h. in Mäusen, denen intravenös 150mg/kg 5-FU injiziert worden waren, stieg, verglichen mit der Kontrollgruppe, die Thrombozyten-Zahl 5 Stunden nach Verabreichen von 5-FU in der Gruppe an, der humanes BCDF mit einer Osmose-Pumpe subkutan verabreicht wurde. Dieses Ergebnis ist in Tabelle 9 gezeigt.
Weiterhin wurde in Mäusen, die mit 4,0 Gy Röntgenstrahlen bestrahlt wurden, verglichen mit der Kontrollgruppe, auch in der Gruppe eine deutlich beschleunigte Wiederherstellung der Thrombozyten-Zahl festgestellt, der nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen humanes BCDF mittels einer Osmose-Pumpe subkutan verabreicht wurde. Dieses Ergebnis ist in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 9 Thrombozyten-Zahl (x 10&sup4;/ul) Tag nach Verabreichen von 5-FU Kontrollgruppe mit BCDF behandelte Gruppe Experiment signifikant bei p = 5% Tabelle 10 Thrombozyten-Zahl (x 10&sup4;/ul) Tag nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen Kontrollgruppe mit BCDF behandelte Gruppe signifikant bei p = 5%

Beispiel 5

Anstieg der Thrombozyten-Zahl im peripheren Blut von Affen durch in vivo Verabreichen von humanem BCDF

Humanes BCDF wurde in 1% hitze-inaktiviertes autologes Serum enthaltendem PBS gelöst. Die Lösung wurde Cynomolgus-Affen (Macaca fascicularis, weiblich, 2,8 bis 3,8 Kg Gewicht) in 12 Stunden-Intervallen an 14 aufeinanderfolgenden Tagen zweimal täglich in einer Dosis von jeweils 2ml subkutan verabreicht. Blut wurde aus der Vene abgenommen und die Blutzell-Zahl mit einem automatischen, hämatologischen Analysator (Toa Medical Electronic Co., Ltd.) gemessen. Wie in Tabelle 11 gezeigt stieg die Thrombozyten-Zahl im Verlauf der Zeit durch Verabreichen von humanem BCDF in Dosen von 5ug/kg/Tag und 10ug/kg/Tag (Verabreichen durch Teilung in zwei Portionen pro Tag) und erreichte einen maximal 2 bis 2,3 mal höheren Wert als vor der Gabe. Der Anstieg ging etwa 2 Wochen nach der Gabe auf den ursprünglichen Wert zurück. Durch Verabreichen einer Dosis von mehr als 20 bis 80ug/kg/Tag erhöhte sich in ähnlicher Weise auch die Thrombozyten-Zahl um einen Faktor von 2,2 bis 2,5. Die von mit BCDF behandelten Affen stammenden Thrombozyten wiesen eine normale Fähigkeit zur Koagulation auf.
Darüber hinaus wurde mittels morphologischer Untersuchung von Knochenmark eine Stimulierung der Knochenmarks-Megakaryozytenpoiese bei Verabreichen von humanem BCDF festgestellt.
Andererseits wurde, wie in Tabelle 11 gezeigt, bei einer Dosis von 5 bis 40 ug/Kg/Tag, kein Anstieg der Leukozyten-Zahl verzeichnet. Um die Zahl an Leukozyten, wie Granulozyten, zu erhöhen, war eine Dosis von mehr als 80ug/Kg/Tag erforderlich.
Desweiteren wurde bei einer Dosis von 5 bis 500ug/Kg/Tag kein Anstieg der Erythrozyten-Zahl festgestellt.
Eine derartig spezifische Thrombozyten-Zahl erhöhende Aktivität von Humanem BCDF wurde ebenfalls im Fall intravenösen Verabreichens festgestellt.
Wie oben bemerkt wurde offenbart, daß humanes BCDF die Aktivität zeigt, die Thrombozyten-Zahl auch in Affen bei in vivo Verabreichen von humanem BCDF zu erhöhen. Tabelle 11 Blutzellzahl im peripheren Blut Tage nach Verabreichen von BCDF BCDF Dosis (ug/kg/Tag) vor Verabreichen Thrombozyten-Zahl (x10&sup4;/ul) Leukozyten-Zahl (x10²/ul) Erythrozyten-Zahl (x10&sup5;/ul)
Humanes BCDF wurde jeden Tag von Tag 0 an bis Tag 13 subkutan verabreicht (geteilt in zwei Portionen pro Tag).

Claims

1. Verwendung von humanem B Zell-Differenzierungsfaktor, der die folgende Aminosäuresequenz (I) oder (II) aufweist, oder eines biologischen Äquivalentes davon, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Thrombocytopenia, wobei das biologische Äquivalent ein Derivat der Aminosäuresequenz (I) oder (II) darstellt, das durch Substitution, Deletion, Insertion oder Addition von Aminosäuren erhältlich ist und wobei das Derivat Aktivität von humanem BCDF besitzt : Aminosäuresequenz (I) : Aminosäuresequenz (II)

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung weiterhin, zusätzlich zu humanem BCDF eine oder mehrere Hilfskomponente(n) umfaßt, weiche unter wenigstens einem aus Interleukin 3, Interleukin 1, Interleukin 4, Interleukin 5, Granulocyten-Kolonie-stimulierendem Faktor, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor, Erythropoetin und Megakaryocyten-Kolonie-stimulierendem Faktor ausgewählt werden.

3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin der humane B Zell Differenzierungsfaktor in einem Prokaryonten produziert wird.