CZ339899A3 - Ztracené bednění stropů - Google Patents

Abstract

Ztracené bednění stropů podle vynálezu spočívá v tom, že j sestává z betonové podhledové stropní desky (1), na níž jsou | kolmo umístěna betonová žebra (2), přičemž podhledová i stropní deska (1) je vyztužena armovacími dráty (3). Ztracené j bednění stropů je vyrobeno z betonu připraveného z jemného písku frakce 0-5 mm a cementu třídy 325 až 500. Tloušťka podhledové stropní desky (1), výška a tloušťka žeber (2)je ' přímo závislá na délce podhledové stropní desky (1), a šířka » podhledové stropní desky (1)je nepřímo závislá na délce podhledové stropní desky (1). Ztracené bednění stropů podle 1 vynálezu slouží jako bednění pro vytvoření betonových stropů, ale samo o sobě není nosnou částí stropů.

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje použití proteinů nebo jejich částí, které řídí dělení buněk. Přednostně se popisují proteiny řídící dělení buněk, které se váží na proteiny podobné retinoblasomu. Více se upřednostňují cykliny, zvláště pak cykliny typu D a geny je kódující, které slouží k produkci rostlin s upravenými fenotypy, zvláště pak rostlin s upravenou rychlostí růstu nebo rostlin obsahujících části s upravenou rychlostí růstu a/nebo s upravenou relativní velikostí nebo rostlin se změněnou architekturou. Vynález se také popisuje rostlinné buňky a rostliny exprimující takovou DNA.

Dosavadní stav techniky

Všechny eukaryontní buňky podstupují při svém dělení stejné série kroků. Termín „buněčný cyklus odráží přirozenost a univerzálnost těchto kroků. Replikace DNA (S) a dělení buněk je v eukaryontním buněčném cyklu normálně dočasně odděleno fázemi „gap (G1 a G2) v sekvenci G1-S-G2-M. Toto uspořádání umožňuje řídit kritické postupy replikace DNA a mitózu. Tyto zdůrazňované cytologické kroky buněčného cyklu jsou uspořádané série přechodně organizovaných molekulárních a buněčných postupů, které definují směr a pořadí cyklu. Postup buněčného cyklu se pravděpodobně reguluje u všech eukaryontů hlavními řídícími jednotkami, které operují ve fázi G1 až S a na rozhraní fází G2 až M. Průchod těmito řídícími body vyžaduje aktivaci kináz závislých na cyklinu (CDK), jehož katalytická aktivita a substrátová specifita se stanovují specifickými regulačními podjednotkami, které jsou známy jako cykliny a interakcemi s jinými proteiny, které regulují stádium fosforylace komplexu (popisuje se v publikaci Atherton-Fessier • · · · · et al., 1993, Semín. Call Biol. 4: 433-442; Solomon, 1993

Curr. Opin. Cell. Biol. 5: 180-186). V pučících a dělících se kvasinkách jsou obě fáze Gl až S a G2 až M tranzice řízeny jedním CDK, kódovaným genem cdc2+ u Schizosaccharomyces pombe a u Saccharomyces cerevisiae CDC28. Asociace p34^cdc2 (p34^cdc2 v pučících kvasinkách) s různými partenry cyklinů odlišuje dva řídící body (popisuje se v publikaci Nasmyth 1993 Curr. Opin. Cell. Biol. 5: 166-179). V savčích buňkách dochází ke komplexnější situaci. Zde existuje alespoň šest příbuzných, ale odlišných, CDK (kódovaných geny cdc2/cdkl, cdk2, cdk3, cdkain4, cdk5 a cdk6) odlišné úlohy. Každý CDK je ve spojení s jedním nebo více partnery podobnými cyklinu (popisuje se v publikacích Fang and Newport 1991 Cell 66: 731-742; Meyerson et al. 1991 Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 56: 177-186; Meyerson et al. 1993 EMBO J. 11: 2909-2917; Xiong et al., 1992 Cell 71: 505-514; Tsai et al. , 1993a Development 119: 10291040; Van den Heuvel and Harlow, 1993 Science 262: 2050-2054;

Meyerson and Harlow, 1994 Mol. Cell. Biol. 14: 2077-2086). Cykliny typu B jsou hlavní třída, která se podílí na přechodu G2 a M a spojují se s p34^cdc2 nebo s jeho přímými homology (popisuje se v publikaci Nurse 1990 Nátuře 344: 503-508).

Cyklin B je jeden ze dvou cyklinů, o kterých se původně píše, že se akumulují ve vejcích obratlovců během interfáze a rychle se ničí během mitózy (popisuje se v publikaci Evans et al., 1983 Cell 33: 389-396) a je komponentem faktoru podporujícího stárnutí u xenopus (Murray et al. 1989 Nátuře 339: 280-286).

Pak se identifikovaly homology cyklinu B u mnoha eukaryontních druhů. Cyklin A je také široce rozšířen u vícebuněčných organizmů a jeho přesná úloha není známa, ačkoli maximální výskyt naznačuje určitou funkci v S fázi (popisuje se v publikaci Pines, 1993 Trends Biochem. Sci. 18: 195-197).

U kvasinek S. cerevisiae je nejlépe popsána tranzice fáze

Gl na S. Genetické studie definují bod ve fázi Gl, který se nazývá START. Po průchodu bodu START buňky přechází do fáze • ·· · · · ·<

S a procházejí celý cyklus dělení, jehož výsledkem jsou dvě dceřinné buňky opět ve fázi Gl (popisuje se v publikaci Hartwell, 1974 Bacteriol. Rev. 38: 164-198; Nasmyth 1993 Curr. Opin. Cell. Biol. 5: 166-179). Produkty tří genů cyklinu Gl v S. cerevisiae nazývaných CLN1, CLN2 a CLN3 jsou v principu omezujícími komponenty průchodu bodu START (Richardson et al., 1989 Cell 59: 1127-113; Wittenberg et al., 1990 Cell 62: 225237; Tyers et al., 1993 EMBO J. 12: 1955-1968). Transkripce CLN1 a CLN2 se aktivuje ve fázi Gl a akumulace proteinových produktů na kritické hraniční .množství pomocí pozitivní mechanizmu zpětné vazby vede k aktivaci kinázy p34^CDC28 a průchodem bodem START (Dirick and Nasmyth, 1991 Nátuře 351: 754-757) . Cykliny Gl se pak degradují, jako důsledek motivů PĚST, na své primární sekvence, které jsou výsledkem rychlého rozkladu proteinu (popisuje se v publikacích Rogers et al., 1986 Science 234: 364-368; Lew et al., 1991 Cell 66: 11971206, Reed, 1991 Trends Genet. 7: 95-99).

Cykliny Gl kvasinek S. cerevisiae jsou alespoň částečně v nadbytku, protože kvasinkové kmeny, ve kterých jsou deletovány dva ze tří genů cyklinů Gl a třetí je řízen galaktózou regulovaným promotorem, vykazují fenotyp, kdy růst je závislý na galaktóze. Takové kmeny se používají pro identifikaci klonů cDNA mušky Drosophila a lidí, které zachraňují tento cln-deficitní fenotyp na glukózových plotnách, když dojde k potlačení jediného kvasinkového genu CLN (Koff et al., 1991 Cell 66: 1217-1228; Lahue et al. , 1991 Genes Dev. 5: 2166-2175; Leopold and O'Farrell, 1991 Cell 66: 1207-1216; Lew et al., 1991 Cell 66: 1197-1206, Xiong et al., 1991 Cell 65: 691-699). Tímto způsobem se stanovila lidská cDNA kódující tři nové třídy cyklinů C, D a E. Ačkoli tyto cykliny vykazují pouze omezenou homologii s kvasinkovými proteiny CLN, prokázalo se, že důležitou úlohu při porozumění řídících jednotek, které působí v savčích buňkách během fáze Gl a v restrikčním bodě na rozhraní fází Gl a S (popisuje se • · · · · ·· ·· * · · · · ··· ······ · · · · · · · • · · · ···· • · · · · · · · · · · v publikacích Pardee, 1989 Science 246: 603-608; Matsushime et al., 1992 Cell 71: 323-334; Koff et al. 1992 Science 257:

1689-1694; Koff et al., 1993 Science 260: 536-539; Ando et al. 1993 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 8571-9575; Quelle et al. , 1993 Genes Dev. 7: 1559-1571; Tsai et al., 1993b Oncogene 8:

1593-1602) . Cyklin E může působit jako komponent omezující rychlost na pomezí fáze Gl a S ( popisuje se v publikacích Ohtsubo and Roberts, 1993 Science 259: 1908-1912; Wimmel et al., 1994 Oncogene 9: 995-997), zatímco závislost množství cyklinu D na sérových růstových faktorech (Matsushime te al. 1991 Cell 65: 701-713; Baldin et al., 1993 Genes Dev. 7: 812821; Sewing et al., 1993 J. Cell. Sci. 104: 545-555) naznačuje, že cykliny typu D mohou tvořit vazbu mezi těmito signály a pokračováním buněčného cyklu.

Důležitým faktorem, který se podílí na regulaci postupu buněčného cyklu u savců je gen způsobující náchylnost k retinoblastomu, který kóduje retinoblastomový protein (Rb). Rb se váže a deaktivuje rodinu transkripčních faktorů E2F prostřednictvím schopnosti deaktivovat většinu jeho potenciálu řídit buněčné dělení ve fázi Gl. Je známo, že transkripční faktory E2F zapínají geny cyklinu E a fáze S a zvyšují množství cyklinu E a/nebo E2F, což vede k replikaci (popisuje se v publikacích Nevins, 1992 Science 258: 424-429; Johnson et al., 1993 Nátuře 365: 349-352). Schopnost Rb deaktivovat E2F závisí na jeho stádiu fosforylace. Během fáze Gl se Rb vyskytuje ve fosforylovaném stádiu, ale v pozdní fázi Gl probíhá fosforylace Rb kinázami závislými na cyklinu, zvláště pak CDK4 v komplexu se svou podstatnou regulační podjednotkou cyklinem D (popisuje se v publikaci Pines, 1995Biochem. J. 308: 697-711; Pines, 1995 Adv. Cancer Res. 66: 181-212) a CDK2 v komplexu s cyklinem E (na rozhraní fází Gl/S) nebo cyklinem A (ve fázi S). Tyto vícenásobné fosforylace Rb způsobují uvolnění E2F, což podporuje transkripci genů S fáze.

• · * ·· ·· ·· • ···· · · · ♦ ···· · · · · · · · Z · • · · · ···· • · « ·«· · · · · ·

Rostlinné buňky se používaly při studiu buněčného růstu a dělení za účelem definice diskrétních fází eukaryontního buněčného cyklu (Howard and Pele, 1953 Heredity 6 (suppl.): 216-273), ale existuje nedostatek dat týkajících se řízení buněčného cyklu v rostlinných systémech. Rostlinné buňky, které přerušily dělení in vivo, což je způsobeno klidovým stádiem, nebo in vitro, což způsobil nedostatek nutrientů, zablokovaly základní řídící body ve fázích Gl a G2 (popisuje se v publikacích van't Hof nad Kovacs, 1972 In The Dynamics of Meristem Cell Populations, M. W. Miller and CC Keuhnert, eds (NY: Plenům pp 15-32; Gould et al., 1981 Protoplasma 106: 113; van't Hof, 1985 In the cell division eyele in plants, J. A. Bryant and D. Francis, eds (Cambridge: Cambridge University Press) pp 1-13). To je v obecném souladu s kontrolami, které fungují v jiných eukaryontních systémech. Ačkoli zralé rostlinné buňky se mohou nacházet buď v obsahu DNA ve fázi Gl nebo DNA ve fázi G2 (popisuje se v publikaci Evans and van' t Hof, 1974 Exp. And Development 7: 555-569; Gould et al., 1981 Protoplasma 106: 1-13), převládá obecně populace Gl. Řídící bod Gl je silnější v kultivovaných rostlinných buňkách, které strádají nedostatkem dusíku. Tyto buňky blokují fázi Gl (popisuje se v publikaci Gould et al., 1981 Protoplasma 106: 1-13). Existují silné analogie mezi základním řídícím bodem ve fázi Gl rostlinného buněčného cyklu, bodu START v kvasinkách a restrikčního bodu v savčích buňkách.

Testy s protilátkami nebo s histonovou kinázou HI se použily k identifikaci přítomnosti a lokalizace aktivních kináz příbuzných s CDC2 v rostlinných buňkách (popisuje se v publikacích John et al. 1989 Plant Cell 1: 1185-1193; John et al. , 1990 J. Cell. Sci. 97: 627-630; John et al. , 1991

Protoplasma 161: 70-74; Mineyuki et al., 1991 Protoplasma 162: 182-186; Chiatante et al., 1993 Plant Sci. 89: 13-21; Colasanti et al., 1993 Plant Cell 5: 1101-1111; John e al. 1993 ). Z velkého počtu rostlinných druhů zahrnujících hrách (popisuje se v publikaci Feiler and Jakobs, 1990 Proč. Nati.

vojtěšku (popisuje se

Acad. Sci. USA 87: v publikaci Hirt et al

Acad. Sci. USA 88: 61-69), Arabidopsis

5397-5401),

1991 Proč. Nati.

1636-1640; Hirt et al. , 1993 Plant J. 4:

(popisuje se v publikaci Ferreira et al., 1991 Plant Cell 3: 531-540; Hirayama et al., 1991 1991 Gene 105: 159-165), sóju (Miao et al., 1993 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 943-947),

Antirrhinum (popisuje se v publikaci Fobert et al., 1994 EMBO

J. 13: 616-624) a kukuřici (popisuje se v publikaci Colosanti et al. , 1991 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3377-3381) se izolovaly hybridizaci se sníženou přísností nebo nedostatečnou polymerázovou řetězcovou reakcí cDNA kódující funkční homology CDC2 kináz. Z dalších různých rostlinných druhů zahrnujících mrkev (popisuje se v publikaci Hata et al., 1991 EMBO J. 10:

2681-2688’ sóju (popisuje se v publikaci Hata et al., 1991

Proč. Nati. Acad sekvencí cDNA

EMBO J. 10: 2681-2688), Arabidopsis (Hemerly et al., 1992

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3295-3299; Day and Reddy, 1994 Biochim. Biophys. Acta Gene Struct. Express. 1218:115-118), vojtěšku (popisuje se v publikaci Hirt et al., 1992 Plant Cell

4: 1531-1538), Antirrhinum (popisuje se v publikaci Fobert et al., EMBO J. 13: 616-624) a kukuřici (Renaudin et al., 1994

Sci. USA 91: 7375-7379) se izolovala řada kódujících rostlinné mitotické cykliny s charakteristikami A- nebo B-typu nebo se smíšenými rysy A- a B-typu.

Autor publikace Soni et al. , 1995 Plant Cell 7: 85-103 identifikoval novou rostlinu kvasinek tří příbuzných cyklinů u Arabidopsis tak, že doplnil kvasinkový kmen s nedostatečným množství cyklinů Gl. Jednotlivé členy této rodiny vykazují tkáňově specifickou expresi a jsou konzervativní v jiných rostlinných druzích. Tvoří odlišnou skupinu rostlinných cklinů a pojmenovaly se jak cykliny typu δ, čímž se označila jejich podobnost se savčími cykliny typu D. Sekvenční vztah mezi cykliny δ a D zahrnuje sekvence N-konce LxCxE. Leucinu

předchází v pozici -1 nebo -2 aminokyselina a kyselým bočním řetězcem (D, E). Tento motiv se původně identifikoval v jistých virových onkoproteinech a silně se podílí při vazbě na protein retinoblastomu. Na základě analogie se savčím cyklinem D mohou tyto rostlinné homology zprostředkovat růstové a fytohormonální signály v cyklech rostlinných buněk. S tímto ohledem se ukázalo, že při opětné stimulaci buněk kultivovaných v suspenzi se rychle indukoval cyklin 53 pomocí růstového rostlinného regulátoru cytokininu. Cyklin 52 se indukoval zdrojem uhlíku. V publikaci Reunadin et al. 1996 Plant Molecular Biology 32: 1003-1018 se definovaly skupiny a názvosloví rostlinných cyklinů a cykliny 5 se nyní nazývají cykliny CycD.

V publikaci Dahl et al., 1995 Plant Cell 7: 1847-1857 se popisuje identifikace cyklinu (cycMs4) ve vojtěšce. Tento cyklin je příbuzný cyklinu vojtěšky 53.

V rostlinách se také identifikovaly proteiny podobné Rb. V publikaci Xie et al., 1996 EMBO J. 15. 4900-4908 a Grafi et al., 1996 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 8962-8967 se popisuje izolace a předběžná charakterizace homologu Rb pocházejícího z kukuřice.

V publikaci Doerner et al., 1996 Nátuře 380: 520-523 se popisuje ektopická exprese cyklinu typu B (cyclAt pocházející z Arabidopsis) za řízení promotoru z genu cdc2a v rostlině Arabidopsis. Transgenní rostliny „cdc2a silně exprimující transgen mají značně zvýšenou rychlost růstu kořenů. Růst a vývoj laterálních kořenů se urychlil následující indukcí kyselinou indolacetátovou v transgenních rostlinách vzhledem ke kontrolním rostlinám.

V publikací Hemerly et al., 1995 EMBO J. 14: 3295-3299 se popisuje transgenní rostlina tabáku a Arapidopsis exprimující kinázu divokého typu nebo její dominantní mutace. Tenro enzym je aktivní při mitóze (CDC2a). Rostliny stále nadměrně produkují CDC2a divokého typu nebo mutantní formu, u které se • · • · · · · · · · · · q · ···· · · · · · » · · · o · · · · « ···· ··· · ·· ·«·· ·· ·· předpokládá, že zrychlený buněčný cyklus nevykazuje podstatnou změnu vývoje. Mutantní CDC2a, která může zablokovat buněčný cyklus, exprimovaná v rostlině Arabidopsis zastavila dělení buněk. Získaly se některé rostliny tabáku stále produkují pozdější mutantní kinázu. Tyto rostliny obsahovaly podstatně méně buněk, ale tyto buňky byly větší.

Dokument PCT patent WO 92/09685 popisuje způsob řízení růstu rostlinné buňky zahrnující modulaci množství proteinu buněčného cyklu v rostlině po dobu a za podmínek vhodných pro řízení dělení buněk. Preferovaným proteinem identifikovaným v příkladech je kináza p34^cdc2 nebo podobné proteiny fungující při mitóze.

Dokument WO 93/12239 popisuje rostliny s pozměněnou stavbou a jinými fenotypickými účinky, zvláště pak předčasné období kvetu a větší množství květů. Tyto rostliny se získaly transformací genomem, který zahrnuje gen cdc25 pocházející z kvasinek, jako je Schizosaccharomyces pombe.

Dokument WO 97/47647 popisuje izolaci a charakterizaci rostlinné sekvence DNA, která kóduje protein retinoblastomu, jeho použití při řízení růstu rostlinných buněk, dále popisuje rostliny a/nebo rostlinné viry stejně jako použití vektorů, rostlin nebo zvířat nebo zvířecích buněk upravených prostřednictvím proteinu retinoblastomu rostlin.

Dokument US patent 5,514,571 popisuje použití cyklinu Dl jako negativního regulátora množení savčích buněk. Nadměrná exprese cyklinu Dl blokuje růst savčích buněk, zatímco exprese blokujícícho cyklinu Dl podporuje proliferaci buněk.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje postup získání rostliny se změněnými růstovými chrakteristikami nebo se změněnou architekturou, zvláště rostliny s omezenou nebo zvýšenou rychlostí růstu, rostliny, které dříve kvetou nebo rostliny, které vykazují

zvýšený počet květů u jedné rostliny nebo rostliny s větší velikostí orgánu zahrnující krok změny množství nebo funkční množství proteinu, který řídí dělení buněk. Tento protein je schopný se vázat nebo fosforylovat protein podobný Rb. Upřednostňuje se protein řídící dělení buněk obsahující vazebný motiv LxCxE nebo příbuzný motiv. Upřednostňuje se, aby se tento motiv nacházel v N-terminální části proteinu. Zvláště se upřednostňuje cyklin typu D.

Dále se popisuje způsob získání rostliny se změněnými růstovými charakteristikami nebo se změněnou architekturou obsahující krok změny množství nebo funkční .množství proteinu řídícího dělení buněk. Tento způsob se provádí začleněním chimérového genu do genomu rostlinných buněk, které obsahují následující operativně spojené fragmenty DNA:

a) v rostlinách exprimovatelnou oblast promotoru, zvláště oblast promotoru CaMV35S,

b) přepisovanou oblast DNA kódující RNA nebo protein, který v případě exprese buď zvyšuje nebo snižuje množství nebo funkční množství proteinu řídícího buněčné dělení, a

c) formaci 3'-konce a polyadenylační signál, který je funkční v rostlinných buňkách.

V souladu s vynálezem přepisovaná oblast DNA kóduje antimediátorovou RNA, ribozym nebo sense řetězec RNA, které, jsou-lí exprimovány, snižují, inhibují nebo předcházejí expresi proteinu řídícího dělení buněk, zvláště pak endogenní cyklin typu D.

Dále v souladu s vynálezem přepisovaná DNA kóduje protein řídící dělení buněk schopný vázat se na kapsovou doménu proteinu podobného Rb. Upřednostňuje se protein řídící dělení buněk obsahující vazebný motiv LxCxE, více se upřednostňuje cyklin typu D, zvláště pak cyklin typu D pocházející z rostlin. Nejvýhodnější je cyklin typu D vybraný ze skupiny fc ♦ • fcfcfc · fc · · • fcfc • ·

Arabidopsis thaliana CYCD1, Arabidopsis thaliana CYCD2, Arabidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD2/ Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuberosus CYCD3;1.

Dále v souladu s vynálezem přepisovaná RNA kóduje protein nebo peptid, který v případě své exprese zvyšuje uvedené funkční množství proteinu řídícího dělení buněk, zvláště pak proteinu nebo peptidů vybraného ze skupiny zahrnující mutantní cyklin typu D, část cyklinu typu D, cyklin typu D, který vykazuje mutací v boxu cyklinu, cyklin typu D2, který vykazuje substituci aminokyseliny 185 nebo aminokyseliny 155, cyklin typu D2, který vykazuje mutaci E185A nebo K155A, cyklin typu D, kde se odstranily sekvence PĚST, cyklin typu D, kde se vazebný motiv LxCxE se zaměnil nebo deletoval nebo cyklin typu D, kde se z vazebného motivu LxCxE odstranil C-zbytek.

Vynález dále popisuje uvedené chimérové geny.

Vynález dále popisuje rostlinné buňky, rostliny a jejich semena obsahující chimérové geny podle vynálezu a vykazující změny růstových charakteristik a/nebo změny architektury.

Vynález dále popisuje použití proteinu řídícího dělení buněk schopného vázat se na kapsovou doménu proteinu podobného Rb a/nebo schopného tyto proteiny fosforylovat, zvláště protein řídící dělení buněk obsahující vazebný motiv LxCxE v N-terminální části proteinu, zvláště pak cyklin typu D a geny ho kódující, k úprávě růstových charakteristik nebo architektury rostliny. Protein řídící dělení buněk kóduje chimérový gen začleněný do genomu buněk rostliny.

Termín „architektura rostliny znamená obecnou morfologii definovanou relativní velikostí, polohami a počtem několika částí rostlin (to znamená orgány, jako jsou například listy, inflorescence, zásobní orgány, jako jsou hlízy, kořeny, stonky, květy nebo části orgánů, jako jsou korunní plátek, kališní plátek, prašník, blizna, čnělka, řapík a podobně).

• φ ····

Termín „změnit architekturu rostliny znamená změnit morfologii, jako výsledek změny například počtu, velikosti a polohy orgánů nebo částí orgánů. Je zřejmé, že změna buď jednoho orgánu nebo jeho části nebo několika orgánů nebo jejich částí povede ke změně architektury rostliny. Toho lze dosáhnout změnou (to znamená zesílením nebo omezením) aktivity buněčného dělení v existujících meristémech a/nebo v primordiích orgánů nebo vytvořením merostémů de novo.

Termín „ko-suprese znamená postup transkripce a/nebo post-transkripční supresi akumulace RNA sekvenčně specifickým způsobem, což vede k potlačení exprese homologních endogenních genů nebo transgenů. Potlačení exprese endogenního genu se může dosáhnout zavedením transgenu, který obsahuje silný promotor operativně spojený s oblastí DNA, přičemž výsledná přepisovaná RNA je sense RNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 75 %, upřednostňuje se alespoň 80 %, s výhodou alespoň 85 %, výhodnější je alespoň 90 %, zvláště pak alespoň 95 % kódující nebo transkribované sekvence DNA (antikódující) genu, jehož exprese se potlačuje. Upřednostňuje se, aby přepisovaná oblast DNA nekódovala funkční protein. Zvláště je výhodné, když přepisovaná oblast nekóduje protein.

Termín „promotor exprimovatelný v rostlině znamená promotor, který je schopný řídit transkripci v rostlinné buňce. Může to být libovolný promotor rostlinného původu, ale také libovolný promotor, který nepochází z rostliny a je schopný řídit transkripci v rostlinné buňce. Mohou to být například virové nebo bakteriální promotory, jako je CaMV35S nebo promotory genu T-DNA.

Termín „exprese genu znamená proces, řízená regulačními oblastmi, zvláště pak přepisuje na RNA, která je biologicky aktivní. To znamená, že je schopna interakce s jinou nukleovou kyselinou nebo proteinem nebo je schopna se překládat na biologicky aktivní kde oblast DNA promotorem, se » · φ φφφφ φ φ

ΦΦ ·· φφ φφ φφ φφφφ φφ ·φ polypeptid nebo protein. Říká se, že gen kóduje RNA, když konečný produkt exprese genu je biologicky aktivní RNA, jako je například antimedíátorová RNA nebo ríbozym. Říká se, že gen kóduje protein, když konečný produkt exprese genu je biologicky aktivní polypeptid nebo protein.

Termín „gen znamená fragment DNA obsahující oblast DNA („přepisovanou oblast DNA), která se přepisuje na molekulu RNA (např. mRNA) v buňce za řízení vhodných regulačních oblastí. Což je například v rostlině exprimovatelný promotor. Gen tak může obsahovat několik operativně spojených fragmentů DNA, jako je promotor, 5'vedoucí sekvence, kódující oblast a 3'oblast obsahující polyadenylační místo. Endogenní rostlinný gen je gen, který se přirozeně nachází v rostlinných druzích. Chimerový gen je libovolný gen, který se v normálním případě nenachází v rostlinných druzích nebo v jiném případě jde o libovolný gen, kde promotor není spojen s částí nebo s celou přepisovanou oblastí DNA nebo alespoň s jednou regulační oblastí genu.

Vynález se zakládá na neočekávaném zjištění, že chimérové geny obsahující DNA kódující protein řídící dělení buněk vázající se na protein podobný Rb , zvláště rostlinný cyklin typu-D za řízení promotoru exprimovatelného v rostlinách, se mohou stabilně začlenit do genomu rostlinné buňky, aniž se objeví nežádoucí účinky, a dále zesílená exprese takového proteinu řídícího dělení buněk, zvláště cyklinu typu D, v rostlinách vede ke specifickým změnám rychlosti růstu a architektury výsledných transformovaných rostlin.

Vynález popisuje změnu síly exprese nebo aktivity funkčního proteinu řídícího dělení buněk. Upřednostňuje se stabilní změna v buňkách rostliny, přičemž se mění architektura nebo rychlost růstu nebo se mění u transformovaných rostlin a jejich potomstva oba rysy najednou. Je výhodné, aby se množství nebo funkční množství proteinů řídících dělení buněk řídilo geneticky změnou exprese genů ♦ ·· • · 9 · » · 9 9

9999 99 9 ·· 99 « · » I • · · « • · 9 9 9 * · · * · « »· ·<*·» 99 99 kódujících tyto proteiny řídící dělení buněk. Zvýšení množství a funkční množství proteinu řídící dělení buněk se může dosáhnout například manipulací počtu kopií kódujícího genu(ů), změnou promotorové oblasti kódujících genů nebo manipulací genů, které přímo nebo nepřímo regulují sílu exprese proteinu řídícího dělení buněk. V jiném případě množství proteinu řídícího dělení buněk se může zvýšit stabilizací mRNA kódující protein řídicí dělení buněk nebo stabilizací proteinu řídícího dělení buněk, například odstraněním destrukčních motivů nebo tzv. sekvencí PĚST.

Funkční množství a aktivita proteinu řídícího buněčné dělení se může zvýšit snížením množství antagonisty nebo inhibitoru proteinu podporujícího buněčné dělení metodou, jako je například získání buňky s proteinem, jako je neaktivní protein řídící dělení buněk podobný proteinu, jehož funkční množství se zvýší, nebo část takového proteinu řídícího dělení buněk, která je stále schopna vázat inhibitor nebo jiný regulační protein nebo je stále schopna se vázat na kínázy závislé na cyklinu. Funkční množství nebo aktivita proteinu řídícího dělení buněk se může také zvýšit změnou nebo mutací proteinu řídícího dělení buněk, přičemž se redukuje nebo eliminuje navázání antagonisty nebo inhibitoru aktivity proteinu, který se vztahuje k dělení buněk.

Redukce funkčního množství proteinu řídícího dělení buněk se může dosáhnout například snížením množství RNA kódující protein řídící dělení buněk, které je dostupné při translaci, metodou, jako je například antimediátorová RNA, působení ribozymu nebo ko-suprese. V jiném případě funkční množství proteinu řídícího dělení buněk se může snížit zvýšením množství antagonisty nebo inhibitoru proteinu podporujícího dělení buněk.

Termín „protein řídící dělení buněk je polypeptid nebo protein, který je nutný při regulaci postupu buněčným cyklem eukaryontní buňky. Upřednostňuje se rostlinná buňka nebo

			9	* ·* • · · 9 1 9 9 9 9 ·	·· ** 1 9 9
		14	9	···· · · · · « • 9 9 9 • · 99 9191	9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 91
protein, který	může	způsobit vstup	buněk	do buněčného	cyklu
nebo způsobit	postup	buněk buněčným	cyklem	přímou interakcí

s proteinem nutným pro regulaci postupu buněčným cyklem nebo s polypeptidem nebo proteinem, u něhož se předpokládá ekvivalentní funkce, ale není nutný pro regulaci buněčného cyklu.

Vhodné proteiny řídící dělení buněk jsou proteiny schopné samy nebo v kombinaci s jinými proteiny fosforylovat protein podobný Rb. Upřednostňuje se protein schopný fosforylovat protein podobný Rb v rostlinné buňce na přechodu fáze G1 a S nebo protein schopný vázat se na kapsovou doménu proteinů podobných retinoblastomu (Rb-like). Výhodné jsou proteiny vykazující vazebný motiv LxCxE obsažený v aminokyselinové sekvenci nebo příbuzný motiv, jako je LxSxE nebo FxCxE (vazebné motivy jsou reprezentovány jednopísmenným aminokyselinovým kódem, kde x znamená libovolnou aminokyselinu). Zvláště preferované jsou cykliny, které obsahují vazebný motiv LxCxE (a/nebo příbuzný motiv) v Nterminální polovině proteinu. Upřednostňuje se, aby se tento motiv nacházel v prvních zbytcích obsahujících 50 aminokyselin, zvláště pak v prvních zbytcích obsahujících 30 aminokyselin, jako jsou cykliny typu D, zvláště pak rostlinné cykliny typu D. Výhodné jsou cykliny ze skupiny zahrnující Arabidopsis thaliana CYCD1, Arabidopsis thaliana CYCD2, Arabidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD2; Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuberosus CYCD3;1 nebo cykliny s podstatně podobnými proteinovými sekvencemi.

Zmíněné rostlinné cykliny typu D se zcela charakterizovaly aminokyselinovou sekvencí kódovanou sekvencí DNA EMBL č. N°X83369 od pozice nukleotidu 104 k nukleotidu 1108 v případě Arabidopsis thaliana CYCD1, EMBL č. N°X83370 od pozice nukleotidu 195 k nukleotidu 1346 v případě Arabidopsis thaliana CYCD2, EMBL č. N°X83371 od pozice nukleotidu 266 k nukleotidu 1396 v případě Arabidopsis thaliana CYCD3, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 1 od pozice nukleotidu 182 k nukleotidu 1243 v případě Nicotiana tabacum CYCD2/1, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od pozice nukleotidu 181 k nukleotidu 1299 v případě Nicotiana tabacum CYCD3/1, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3 od pozice nukleotidu 198 k nukleotidu 1298 v případě Nicotiana tabacum CYCD3/2, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 4 od pozice nukleotidu 165 k nukleotidu 1109 v případě Helianthus tuberosus CYCD1;1, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 5 od pozice nukleotidu 48 k nukleotidu 1118 v případě Helianthus tuberosus CYCD3/1 nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 21 od pozice nukleotidu 316 k nukleotidu 1389 v případě Zeam mays CYCD2.

Uvažuje se, že zvýšení, respektive snížení, množství nebo funkční množství nebo aktivita těchto proteinů řídící dělení buněk v rostlinných buňkách urychluje, respektive oddaluje, přechod fáze G1 do fáze S nebo zvyšuje, respektive snižuje poměrnou část aktivně se dělících buněk na základě jejich interakce s proteiny podobnými Rb, které ovlivňují schopnost proteinu deaktivovat jisté transkripční faktory. Dále se uvažuje, že exprese těchto proteinů řídících buněčné dělení, které interagují s proteiny podobnými Rb, účinně umožňuje buňkám započít proces dělení, zatímco (nadměrná) exprese G2/mitotických cyklinů (jako jsou cykliny typu B nebo produkt genu ccřc25) naopak vede k rychlejšímu postupu fázemi G2/mitóza buněčného cyklu, který už započal.

Termín „proteiny podobné Rb se definují jako proteiny ze skupiny zahrnující lidský Rb-1 protein (popisuje se v publikaci Lee et al., 1987 Nátuře 329: 642-645; č. P06400), lidský P107 (Ewen et al., 1991 Cell 66: 1155-1164 ; č. L14812) a lidský pl30 (Hannon et al., 1993 Genes Dev. 7: 2378-2391; č. A49370) , RBF Drosiphila (Du et al., 1996 Genes and Development 10: 1206-1218; č. pro vstup DNA kódujícicho genu X96975), myší • ·

RB (Bernards et al., 1989 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 64746478; č. P13405), kuřecí RB (Boehmelt et al., 1994 Cell Growth Differ. 5: 221-230; č. X72218), Xenopus Rb (Destree et al.,

1992 Dev. Biol. 153: 141-149; A44879), ZmRb a Rbl z Zae mays (Xie et al., 1996 EMBO J. 15: 4900-4908; Grafi et al. , 1996 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 8962-8967; číslo pro vstup DNA kódujících genů: X98923; GenBank U52099) stejně jako proteiny, které současně vykazují alespoň 25 až 30 % podobnosti (shody) aminokyselinové sekvence s alespoň se třemi členy shora uvedené skupiny, a obsahují konzervativní cysteinový zbytek umístěný v pozici 706 lidského Rb-1 nebo v ekvivalentních polohách v jiných proteinech podobných Rb (popisuje se v publikaci Xie et la., 1996 EMBO J. 15. 4900-4908) .

Proteiny podobné Rb jsou členy malé rodiny známé jako „kapsové proteiny. Tento termín se odvodil s konzervativní dvoudílné oblasti, která se nazývá „kapsová doména (pocket domain). Funguje jako vazebné místo pro několik proteinů řídících růst, jako je rodina transkripčních faktorů E2F, cykliny typu D a virové onkoproteiny. Subdomény A a B kapsové oblastí jsou více konzervativní ve srovnání se zbytkem proteinu (přibližně 50 až 64 % v případě subdomén A a B) a jsou odděleny nekonzervativním mezerníkem. Kapsové domény se nacházejí mezi aminokyselinami v polohách 451 a 766 u lidského proteinu Rb, v poloze 321 až 811 v případě lidského proteinu pl07, v poloze 438 až 962 v případě lidksého proteinu pl30, v poloze 445 až 758 v případě myšího proteinu Rb, v poloze 441 až 758 v případě kuřecího proteinu Rb, v poloze 440 až 767 v případě proteinu Rb Xenopus, v poloze 11 až 382 v případě ZmRb kukuřice, v poloze 89 až 540 v případě proteinu Rbl kukuřice.

„Navázání na protein podobný Rb nebo navázání na kapsovou oblast proteinu podobného Rb se může analyzovat buď testem in vitro nebo jedním z testů in vivo nebo jejich kombinací.

V testu in vitro se navázání analyzuje mezi proteinem ···· » · • · · · • · · » · • · · · · • · · · · · • · · · · ···· · * · · označeným ³⁵S-methiononem a fúzním proteinem glutathion-Stransferasa (GST)/kapsová doména proteinu podobnému Rb, jako je například lidský Rb. Fúze s GST umožňuje jednoduché čištění a fixaci fúzního proteinu na částice glutathionsefarosy. Interakce mezi testovaným proteinem a proteinem podobným Rb se porovnává s vazbou mezi stejným proteinem a fúzním proteinem GST a proteinem podobným Rb s mutací v konzervativním cysteinu v poloze ekvivalentní systeinu 706 u lidského Rb, jako je lidský Rb C706F. Takový test se popisuje například v publikaci Dowdy et al 1993 Cell 73: 499-511 a Ewen et al. 1993 Cell 73: 487-497. V jiné variantě protein podobný Rb a protein vázající se na Rb se společně exprimovaly v hmyzích buňkách a spojení se detekovalo gelovou filtrací nebo společnou imunoprecipitací (0'Reilly et al. 1992. Baculovirus expression vectors-A laboratory manual. Freeman and Co. New York).

Test in vivo, který se používá pro detekci navázání proteinu na kapsovou doménu proteinu podobného Rb, je kvasinkový dvou hybridní systém (Fields and Song, 1989 Nátuře 340: 245-246). Tato analýza odhaluje schopnost rekonstituovat funkční aktivitu GAL4 ze dvou separovaných fúzních proteinů obsahujících vazebnou doménu DNA (GAL4^BD) a aktivační oblast GAL4^ad) fúzovanou s kapsovou doménou proteinu podobného Rb a testovaného proteinu. Exprese plazmidů obsahující chimerové geny kódující tyto fúzní proteiny se zavedou do kmene kvasinek kódujícího vhodné GAL4 indukovatelné markéry. Je to například kmen HF7c (popisuje se v publikaci Feilloter et al., 1994 Nucl. Acids Res. 22: 1502-1503) obsahující Gal4-indukovatelné markéry HIS3 a LacZ nebo kmen Y190 (popisuje se v publikaci Harper et al., 1993 Cell 75: 805-816) . Proteiny, které se vážou na kapsovou doménu proteinu podobného Rb umožňují růst v nepřítomnosti histidinu. Příklad dvou hybridního testu demonstrující interakci proteinu s proteinem podobným Rb se popisuje v publikaci Durfee et al. 1993 Genes and Development 7: 555-569.

• · · · > · · I

I · · 4 » · · · · ·

Je výhodné, aby se zahrnuly kontrolní experimenty, jako například oddělené zavedení expresivních plazmidů do stejného kmene kvasinek nebo zavedení expresivních plazmidů kódujících fůzní proteiny obsahující DNA vazebnou doménu (GAL4

BDv aktivační oblast (GAL4^ad) fúzovanou s mutovanou kapsovou doménou proteinu podobného Rb. Upřednostňuje se mutace v C706 nebo v ekvivalentní poloze.

V jiném případě test in vitro pro stanovení vazby mezi proteinem a kapsovou doménou proteinu podobného Rb zahrnuje dočasnou expresi obou proteinů v rostlinných buňkách. Upřednostňují se protoplasty rostliny tabáku. Dále se používá ímunoprecípitace za použití protilátek řízených proti jednomu ze dvou proteinů, přičemž se stanovuje společná precipitace druhého proteinu.

„Fosforylující protein podobný Rb se může analyzovat testem in vitro, který spočívá na použití adenosintrifosfátu značeného ³²P, čímž se monitoruje kapacita proteinu (nebo kombinací proteinů, jako jsou cykliny a kinázi závislé na cyklinu) přenášet značené fosfátové skupiny na cílový protein. Termín „cyklin se definuje jako regulační protein obsahující regulační oblast obsahující přibližně 100 aminokyselin, která je známa jako „cyklinový box. Cyklinový box je vazebné místo kináz závislých na cyklinu umožňující uplatnit svůj regulační účinek na kinázovou aktivitu CDK.

Cyklinový box se může stanovit porovnáním aminokyselinové sekvence proteinu se známým aminokyselinová sekvence mezi z Arabidopsis thaliana, mezi z Arabidopsis thaliana, mezi z Arabidopsis thaliana, cyklinové boxy popsané v publikacích Renaudin et al., 1994 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 73757379; Renaudin et al., 1996 Plant Molecular Biology 32: 10031018, Soni et al. 1995 Plant Cell 7: 85-103; Hemerly et al.,

1992 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:

cyklinovým	boxem	, jako je
polohami	81	až	186	CYCD1
polohami	96	až	201	CYCD2
polohami	86	až	191	CYCD3

3295-3299).

Acad.

Nati.

• · • ·

Aminokyselinová sekvence identifikovaná jako cyklinový box na bázi porovnání sekvence by měla obsahovat alespoň pět konzervativních zbytků, které jsou nutné pro aktivitu cyklínu R(97), D(126), L(144), K(155), E(185) (označené polohy jsou ze sekvence CYCD z Arabidopsis thaliana) (popisuje se v publikaci Soni et al., 1995 Plant Cell 7: 85-103; Renaudin et al., 1996 Plant Molecular Biology 32: 1003-1018).

Cykliny typu D (cyklin D nebo CycD) jsou cykliny, které se charakterizují přítomností dalších charakteristických sekvencí, jako je motiv LxCxE nebo příbuzné motivy vhodné pro proteiny podobné Rb, které se nacházejí v N-terminální části proteinu. S výhodou jsou umístěny mezi N-koncem a cyklinovým boxem, zvláště v prvních 50-ti aminokyselinách, preferuje se v prvních 30-ti aminokyselinách iniciačního methioninového zbytku. Upřednsotňuje se, aby leucinu z vazebného motivu předcházela v poloze -1 nebo -2 aminokyselina s kyselým bočním řetězcem (D, E) . Mohou se najít alternativní vazebné motivy, jako je LxSxE nebo FxCxE. V publikaci Phelps et al 1992 J. Virol. 66: 2418-2427 se popisuje, že mutace vazebného motivu LxCxE v lidském papilomaviru E7 až LxSxE neovlivňuje schopnost proteinu vázat se na proteiny podobné Rb. Na základě sekvenční homologie CycDl (obsahující Arabidopsis thaliana CycDl a Helianthus tuberosus CYCD1;1,), CysD2 (obsahující Arabidopsis thaliana CYCD2, Nicotiana tabacum CYCD2;1, Zea mays CYCD2), CycD3 (obsahující Arabidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD3/2, Helianthus tuberosus CYCD3;1) se identifikovaly tři skupiny cyklinů typu D.

Názvosloví a konsensus sekvencí v případě různých typů a skupin rostlinných cyklinů zahrnujících cykliny typu D se popisuje v publikaci Renaudin et al., 1996 Plant Molecular Biology 32: 1003-1018) a může se používat pro klasifikaci nových cyklinů založené na svých aminokyselinových sekvencích.

• · • · • · · · · • · · · ·

Proteiny řídící dělení buněk se mohou poskytovat buňkám přímo například elektroporací protoplastů. v přítomnosti proteinů řídících dělení buněk nebo nepřímo transformací rostlinných buněk v rostlinách exprimovatelnými chimérickými geny, které kódují testovaný protein a jsou začleněny do genomu protoplastů dočasně nebo stabilně.

V jednom provedení vynálezu množství nebo funkční množství proteinu řídícího dělení buněk schopného fosforylovat protein podobný Rb nebo vázat se na kapsovou doménu proteinů podobných Rb se zvýší začleněním chimerového genu do 'genomu buněk rostliny za účelem získání rostliny se změněnou rychlostí růstu nebo se změněnou architekturou. Gen obsahuje následující operativně spojené fragmenty DNA:

a) promotorovou oblast exprimovatelnou v rostlině, zvláště oblast promotoru CaMV35S,

b) přepisovanou oblast DNA kódující protein, který v případě, že se exprimuje zvyšuje množství nebo funkční množství proteinu řídícího dělení buněk a

c) formaci 3'-konce a polyadenylační signál funkční v rostlinných buňkách.

V preferovaném provedení vynálezu síla exprese cyklinu D se zvyšuje začleněním chimerového genu obsahujícího přepisovanou oblast DNA kódující cyklin D do genomu rostlinné buňky. Tento gen řídí v rostlině exprimovatelný promotor. Přepisovaná oblast DNA s výhodou obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující nukleotidovou sekvenci EMBL č. N°X83369 od pozice nukleotidu 104 k nukleotidu 1108, nukleotidovou sekvenci EMBL č. N°X83370 od pozice nukleotidu 195 k nukleotidu 1346, nukleotidovou sekvenci EMBL č. N°X83371 od pozice nukleotidu 266 k nukleotidu 1396, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 1 od pozice nukleotidu 182 k nukleotidu 1243, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od pozice nukleotidu 181 k nukleotidu 1299, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3 od pozice nukleotidu 198 k nukleotidu 1298, nukleotidovou • · ♦ 9

9 sekvencí SEQ ID NO: 4 od pozice nukleotidu 165 k nukleotidu 1109, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 5 od pozice nukleotidu 48 k nukleotidu 1118 nebo nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 21 od pozice nukleotidu 316 k nukleotidu 1389 v případě Zeam mays CYCD2.

Ve zvláště preferovaném provedení vynálezu se síla exprese cyklinu typu CycD2 změnila (to znamená zesílila) začleněním chimerového genu cycD2 do genomu rostlinné buňky. Chimerový gen obsahuje přepisovanou oblast DNA kódující cyklin CysD2 řízenou v rostlině exprimovatelným promotorem. V tomto případě se upřednostňuje konstitutivní promotor, zvláště promotor CaMV35S. Takovým chimerovým genem je gen cycD2 plazmidu pCECl. Touto změnou dojde ke změně morfologie, architektury a růstové charakteristiky transgenní rostliny, zvláště k urychlení vegetativního růstu, zvláště ke změně rychlosti růstu transgenní rostliny.

„Zeslabení nebo „zesílení měřitelného fenotypického rysu se kvantifikuje jako rozdíl mezi průměrem měření související s popisem tohoto rysu u různých rostlin jedné transgenní rostlinné linie a průměru měření uvedeného rysu v rostlinách typu děleno průměrem měření uvedeného rysu divokého typu. Tento rozdíl se vyjadřuje v procentech. Transgenní a kontrolní (rostliny divokého typu) rostliny se kultivují za podmínek dodávky nutrientů, světla, vlhkosti, vhodné teploty a podobně. Upřednostňuje se kultivace za standardizovaných podmínek. Preferované množství zesílení a zeslabení jsou statisticky podstatné, upřednostňuje se míra spolehlivosti 0,05, zvláště pak míra spolehlivosti 0,01. Může se stanovit například jedním ze způsobů analýzy rozptylu (popisuje se například v publikaci Snedecor and Cochran, Statistical Methods The Iowa University Press, Ames, Iowa, U.S.A) .

Zesílení vegetačního růstu transgenní rostliny se s výhodou monitoruje měřením nárůstu suché hmotnosti během divokého v rostlinách růstového období. Průměr nárůstu suché hmotnosti se definuje jako rozdíl průměru suché hmotností transgenních rostlin a rostlin divokého typu, násobeno 100 a děleno průměrem suché hmotnosti rostlin divokého typu. Typické zvýšení suché hmotnosti, zvláště pak v počátečním období růstu, dosaženého začleněním chimerových genů cycD2 podle vynálezu je v rozmezí alespoň přibližně 39 % až 350 %, zvláště výhodné je rozmezí 68 % až 150 %.

Je zřejmé, že zvýšení suché hmotnosti, jako výsledek začlenění chimérových genů může kolísat v závislosti na rostlinných druzích nebo použitých chimérových genech. Vynález zdůrazňuje u transgenních rostlin libovolné podstatné zvýšení suché hmotnosti, zvláště jestliže se suchá hmotnost tvoří alespoň 1,4 až 4,5 násobek suché hmotnosti netransformovaných kontrolních rostlin, zvláště alespoň 1,8 až 2,7 násobek suché hmotnosti netransformovaných kontrolních rostlin. V každém případě průměrná suchá hmotnost transgenních rostlin se statisticky podstatně liší od průměru suché hmotnosti netransformovaných rostlin.

Zesílení vegetačního růstu transgenní rostliny se také může stanovit porovnáním počtu listů viditelných na transgenních rostlinách a kontrolních rostlinách divokého typu v daném čase. Očekává se, že rozdíl počtu listů transgenních rostlin uprostřed období růstu je alespoň 1,1 až 3 násobek, zvláště pak 1,5 až 2 násobek počtu listů u netransformovaných rostlin.

Zesílení vegetačního růstu transgenní rostliny je možné také monitorovat měřením výšky stonku (měří se od úrovně půdy do bodu maximálního vzrůstu) během periody růstu. Průměrná hodnota zvýšení výšky stonku se definuje jako rozdíl průměrné hodnoty výšky stonku transgenních rostlin a rostlin divokého typu, násobeno 100 a děleno průměrnou výškou rostlin divokého typu. Typické zvýšení výšky stonku zavedením chimerových genů cycD2 podle vynálezu je v rozmezí hodnot: přibližně 65 % během

0

období časného růstu, přes 20 až 30 % ve střední periodě růstu až alespoň 10 % v období kvetu, ale může být vyšší, přibližně 40-50 % až 75 % uprostřed období růstu a 15-20 % na konci stádia kvetu.

Je zřejmé, že výška stonku jako výsledek zavedení chimerových genů podle vynálezu může kolísat v závislosti na rostlinných druzích nebo na užívaných chimerových genech. Vynález zdůrazňuje libovolné podstatné zvýšení výšky stonku u transgenních rostlin, zvláště, jestliže výška stonku je alespoň 1,1 až 3 násobek výšky stonku netransformovaných kontrolních rostlin, zvláště alespoň 1,5 až 2 násobek výšky stonku netransformovaných kontrolních rostlin.

Rozdíl ve výšce stonku mezi transgenními a kontrolními rostlinami postupně během růstu klesá, protože rychlost růstu u rostlin během období květu klesá. Konečná výška transgenní rostliny se pak může podobat konečné výšce rostlin, které nejsou transgenní.

Transgenní rostliny, které neobsahují geny cycD2 podle vynálezu vykazují zvýšenou rychlost růstu ve srovnání s netransformovanými rostlinami, což vede ke zkrácení času, který je nutný pro dosažení dané suché hmotnosti nebo výšky stonku. Termín „rychlost růstu znamená zvýšení velikostí rostliny nebo její části za den, zvláště pak nárůst výšky stonku za den, a může se vypočítat jako rozdíl mezi velikostí rostliny nebo části rostliny na počátku a na konci období zahrnující určitý počet dní (zvláště 6 až 8 dní), děleno počtem dní. Zvýšení rychlosti růstu se přednostně vyjadřuje vzhledem k obecné definici zvýšení měřitelného fenotypu, ale může se také vyjádřit jako poměr mezi rychlostí růstu transgenních rostlin versus rychlostí růstu netransformovaných kontrolních rostlin během stejného období za stejných podmínek.

Jak se popisuje shora v textu, zvýšení růstové rychlosti jako výsledek začlenění chimerových genů, zvláště chimerových • · · · · genů cycD2 podle vynálezu může kolísat v závislosti na na rostlinném druhu a použitých zdůrazňuje libovolné podstatné transgenních rostlin, zvláště, v rozmezí od přibližně 4% a 85 % 60 %, speciálně od přibližně 30 % chimerových genech. Vynález zvýšení rychlosti růstu u jestliže rychlost růstu je ,zvláště od přibližně 20 % do do 50 %.

Zrychlení vegetačního růstu transgenní rostliny je také možné monitorovat měřením délky a velikosti největšího listu v různém čase během období růstu, zatímco listy se stále zvětšují. Tento měřitelný fenotyp vyjadřuje míru zvýšené zralosti transgenních rostlin. Průměrná hodnota zvýšení délky největšího listu (definovaná jako rosdil mezi průměrnou délkou největšího listu transgenních rostlin a rostlin divokého typu, násobeno 100 a děleno průměrnou délkou největšího listu u rostlin divokého typu) získaná zavedením chimerových genů podle vynálezu je v časném období růstu v rozmezí od přibližně 7 do 31 % (průměrná hodnota je přibližně 17 %) , ve střední fázi růstu je tato hodnota v rozmezí přibližně 3 až 14 % (průměrná hodnota je 7 %).

Opět platí, že zvýšení velikosti největšího listu jako výsledek zavedení chimerových genů podle vynálezu může klísat v závislosti na rostlinných druzích nebo použitých chimerových genech a vynález zdůrazňuje každé podstatné zvýšení růstu listu nebo velikosti transgenních rostlin.

Vynález dále popisuje chimerový gen řídící dělení buněk. Zvláště chimerové geny cycD2, které se také mohou zavést do rostlin za účelem zvýšení vývoje kořenů, zvláště dojde ke zvýšení průměrné hodnoty délky kořenů. V obecném případě ke zvýšení vývoje kořenů dochází souběžně se zvětšení vegetační části nad zemí (stonku, listů, květů) a může být v rozmezí od přibližně 40 % až 70 %. Toto zvýšení opět kolísá v závislostí na rostlinných druzích a na použitých chimerových genech. Vynález zdůrazňuje každé podstatné zvýšení vývoje kořenů, zvláště statisticky podstatné zvýšení.

·· ····

Dále vynález popisuje chimerový gen řídící dělení buněk, zvláště chimerové geny cycD2, které se také mohou zavést do rostlin za účelem zvýšení veliksoti a také počtu květů, zvláště počet oplodněných květů a počet oplodněných vajíček v každém květu. Jako výsledek zvýšení počtu oplodněných květů a počtu oplodněných vajíček v každém květu (v obecném případě to vede ke zvýšení počtu semen v rostlině) dojde ke zvýšení výtěžku semen s každé rostliny. Je zřejmé, že zvýšený počet květů a vajíček u květu stejně jako zvýšení výtěžku semen kolísá v závislosti na rostlinných druzích transformovaných chimerovými geny řídícími dělení buněk podle vynálezu nebo na použitých chimerových genech. Typická hodnota zvýšení velikosti květů jako výsledek zavedení chimerového genu obsahující oblast DNA kódující CysD2 řízeného protmotorem CaMV35S je v rozmezí alespoň přibližně 4 až 30 %, zvláště alespoň 10 až 20 %. Typická hodnota zvýšení počtu je v rozmezí alespoň přibližně 20 až 50 %, zvláště alespoň 24 až 45 %, zatímco hodnota zvýšení počtu semen v rostlině (vyjádřená na základě hmotnosti) je v rozmezí alespoň přibližně 5 až 55 %, zvláště alespoň 10 až 30 %, výhodné je přibližně 25 %.

V jiném provedení vynálezu chimerový gen řídící dělení buněk, zvláště chimerové geny cycD2, které se také mohou zavést do rostlin nebo jejich semen, urychlují klíčení. Zjistilo se, že transgenní semena obsahující chimerové geny cycD2 podle vynálezu mohou klíčit alespoň o 8 . až 16 hodin rychleji než kontrolu divokého typu.

Shora v textu zmiňované chimerové geny se mohou také zavést do rostlin za účelem zvýšení průměrné hodnoty počtu dní nutných pro dosažení vývoje květenství, čímž se účinně snižuje čas, které rostliny potřebují, aby začaly kvést. Transgenní rostliny obsahující chimerové geny podle vynálezu, tak zralosti, zvláště stádia květenství dřivě, ale normální velikost kvetoucí rostliny. Skutečné dosahuj í vykazuj i zkrácení času, který je nutný pro dosažení stádia květu může

• * · · • · · · ·· záviset na rostlinných druzích nebo na použitých chimerových genech. V typickém případě transgenní rostliny nesoucí chimerový gen obsahující oblast DNA kódující CycD2 řízený promotorem CaMV35S vykazují zkrácení času nutného pro dosažení fáze kvetu alespoň o přibližně 3 % až 11-12 % , zvláště alespoň přibližně 4 % až 7 %.

V jiném zvláště preferovaném provedení vynálezu se do rostliny zavede chimerový gen obsahující oblast přepisované DNA kódující CycD3 za řízení v rostlině exprimovatelného promotoru, upřednostňuje se konstitutivní promotor, zvláště promotor CaMV35S, jako je chimerový gen obsahujícíc nukleotidovou sekvenci chimerového genu cycD3 pCRK9, za účelem získání transgenních rostlin se změněnými morfologickými rysy nebo architekturou, zvláště se změněnou velikostí specifických rostlinných částí nebo orgánů, zvláště se změněnou velikostí a morfologií květů s prodlouženými a/nebo zvětšenými korunními plátky. Transgenní rostliny transformované chimerovým genem, který obsahuje oblast DNA kódující CycD3 řízenou promotorem exprimovatelným v rostlinách (a její potomstvo) vykazují zvýšenou velikost kvetu o přibližně 31 % až 44 %. Tyto rostliny však také kvetou později ve srovnání s rostlinami divokého typu, což odpovídá prodloužení doby dosažení květu o přibližně 5 až 20 %, zvláště o přibližně 8 až 16 %.

V jiném provedení vynálezu roste funkční množství proteinu řídícího dělení buněk schopného fosforylovat protein podobný Rb nebo vázat se na kapsovitou doménu proteinů podobných Rb, zvláště cyklinu typu D, za účelem získání rostliny se změněnou rychlostí růstu a architekturou tím, že se začlení chimerový gen do genomu rostlinných buněk, obsahující následující operativně spojené fragmenty DNA:

a) oblast promotoru exprimovatelného v rostlinách, zvláště oblast promotoru CaMV35S,

b) oblast přepisované DNA kódující protein, který v případě, je-li exprimován zvyšuje funkční množství ···» · · ·· » · · « • « • · · I • · · 1 • · » 4 » · · I ·· ·· proteinu řídícího dělení buněk, upřednostňuje se část DNA kódující mutantní protein řídící dělení buněk nebo část mutantního proteinu řídícího dělení buněk. Více se upřednostňuje část DNA kódující mutantní cyklin typu D, zvláště cyklin typu D, který vykazuje mutaci v cyklinovém boxu (zvláště substituce aminokyseliny 185 nebo aminokyseliny 155 cyklinu typu D, speciálně E185 nebo K155A) nebo cyklinu typu D, kde se odstranily sekvence PĚST, zvláště, kde se odstranil C-konec za účelem odstranění sekvencí PĚST, nebo cyklin typu D, kde se změnil nebo deletoval vazebný motiv LxCxE, zvláštěkde se deletoval C-zbytek z vazebného motivu LxCxE a

c) formace 3'-konce a polyadenylační signál funkční v rostlinných buňkách.

Ačkoli nechceme vynález omezit na mód působení, věří se, že mutantní proteiny řídící dělení buněk projevují své účinky maskováním inhibitorů nebo anatagonistů normálních funkčních proteinů řídících dělení buněk.

Z tohoto popisu vyplývá, že chimerové geny obsahující přepisovanou oblast DNA kódující jiné cykliny typu D, zvláště cykliny skupiny CycD získané z rostlin , se mohou použít za účelem získání podobných účinků. Tyto geny je možné získat z jiných rostlinných druhů nebo odrůd různými způsoby, které zahrnují hybridizaci, kde se jako sondy používají dostupné DNA kódující CycDl, CycD2 nebo CycD3 a přísnost hybridizačních podmínek je snížena. Dále se mohou použít metody založené na polymerázové řetězcové reakci za použití oligonukleotidů založených na dostupných nukleotidových sekvencích cyklinů typu D. Upřednostňují se oligonukleotidy s nukleotidovou sekvencím kódujícím konvenční odpovídaj ící sekvencí aminokyselinové sekvence, zvláště oligonukleotidy, které mají nukleotidovou sekvenci odpovídající sekvencím kódujících konzervativní aminokyselinové sekvence v cyklinovém boxu ···« · ·

99 • 9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9

99 oligonukleotidů cyklinů typu každé skupiny cyklinů. Tyto konzervativní aminokyselinové sekvence se mohou odvodit z dostupné DNA kódující takové aminokyselinové sekvence. Zvláště preferovanou kombinací vhodných pro PCR amplifikaci rostlinných Dl je oligonukleotid vybraný ze skupiny oligonukleotidů, které mají sekvence SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 nebo SEQ ID NO: 9 a oligonukleotid vybraný ze skupiny oligonukleotidů, které vykazují sekvenci DNA uvedenou v SEQ ID NO: 10 nebo SEQ ID NO: 11.

Zvláště preferovanou kombinací oligonukleotidů vhodných pro PCR amplifikaci rostlinných cyklinů typu D2 je oligonukleotid vybraný ze skupiny oligonukleotidů se sekvencí DNA uvedenou v SEQ ID NO: 12 nebo SEQ ID NO: 13 a oligonukleotid vybraný ze skupiny oligonukleotidů zahrnující sekvenci DNA uvedenou v SEQ ID NO: 14 nebo SEQ ID NO: 15. Zvláště preferovanou kombinací nukleotidů vhodnou pro PCR amplifikaci rostlinných cyklinů typu D3 je oligonukleotid vybraný ze skupiny oligonukleotidů zahrnující sekvenci DNA uvedenou v SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 nebo SEQ ID NO: 18 a oligonukleotid vybraný ze skupiny oligonukleotidů vykazující sekvenci DNA uvedenou v SEQ ID NO: 19 nebo SEQ ID NO. 20. Fragment amplifikované DNA se pak používal pro testování knihovny cDNA a genomové knihovny (za přísných podmínek) za účelem izolovat klony v plné délce.

V jiném případě lze získat další geny kódující cykliny odvozené z rostlin způsoby, jako je například funkční komplementace kmenů kvasinek, které jsou podmíněně deficitní na cykliny Gl-S, jak se popisuje v publikacích Soni et al., 1995 Plant Cell 7: 85-103 a Dahl et al., 1995 Plant Cell 7:

1847-1857 nebo použitím kvasinkového dvou hybridního systému (Fields and Song, 1989 Nátuře 340: 245-246) k izolaci sekvencí DNA kódujících cykliny vázající se na kapsovou doménu proteinů podobných Rb, jak se popisuje shora v textu.

>·«· · ·

Dále je známo, že některé rostliny obsahují více jak jeden gen kódující cyklin typu D stejné podskupiny (například rostlina tabáku obsahuje alespoň dva geny podskupiny CycD3) a je zřejmé, že tyto varianty se mohou použít v souladu s vynálezem.

Cykliny typu D, které mají aminokyselinovou sekvenci podstatně podobnou aminokyselinové sekvenci popsané ve vynálezu, jako jsou mutantní cykliny. typu D, se však mohou použít k dosažení stejných účinků. S ohledem na aminokyselinovou sekvenci termín „podstatně podobný znamená, když se seřadí dvě relevantní sekvence, procento shody sekvencí, to znamená počet poloh se stejnými aminokyselinovými zbytky děleno počtem zbytků kratší ze dvou sekvencí, je vyšší než 80 %, upřednostňuje se vyšší než 90 %. Seřazení dvou aminokyselinových sekvencí se uskutečnilo použitím Wilburova a Lipmanova algoritmu (popisuje se v publikaci Wilbur and Lipman, 1983 Proč. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726) za použití 20-ti aminokyselin, délku slova tvoří 2 aminokyseliny a přemostění mezer je 4. Analýza provedená na počítači a interpretace sekvenčních dat, zahrnující seřazení sekvencí, jak se popisuje shora v textu, se může provést za použití programů Intelligenetics™Suite (Intelligenetics lne., CA).

Je zřejmé, že při konstrukci chimerových genů řídících dělení buněk podle vynálezu, se může použít libovolná sekvence DNA kódující protein řídící dělení buněk, zvláště cyklin typu D. Zvláště to pak mohou být sekvence DNA, které jsou zcela nebo částečně syntetizovány uměle.

Je také zřejmé, že další promotory exprimovatelné v rostlinách , zvláště konstitutivní promotory, jako jsou promotory opinové synthasy mikroorganizmu Agrobacterium Ti nebo Ri-plazmidy. Za účelem dosáhnout stejného účinku je možné zvláště použít promotor nopalinové synthasy. V případě existence různých forem promotoru CaMV35S, je odborníkovi jasné, že předmětu vynálezu lze stejně dosáhnout použitím • · • ·

těchto alternativ promotoru CaMV35S, jak se popisuje v publikaci Hulí and Howell, Virology, 86, str. 482 (1978).

Vynález dále popisuje rostliny se změněnou morfologií nebo architekturou omezenou na specifické orgány nebo tkáně za použití tkáňově specifického nebo orgánově specifického promotoru za účelem řízení exprese DNA, která kóduje protein řídící dělení buněk, zvláště cyklinu typu D. Takové tkáňově nebo orgánově specifické promotory jsou známy v oboru a zahrnují, ale nejsou omezeny na promotory - specifické pro semena (např. WO89/03887), promotory specifické pro původní orgány (An et al., 1996 The Plant Cell 8: 15-30), promotory specifické pro stonek ( Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 36253633), promotory specifké pro listy (Hudspeth et al., 1989 Plant Mol. Biol. 12: 579-589), promotory specifické pro mesofyl (jako je světlem indukovatelný promotor Rubisco), promotory specifické pro kořeny (Keller et al., 1989 Genes

Devel. 3: 1643-1646, promotory specifické pro hlízy (Keil et al., 1989 EMBO J. 8: 1323-1330), promotory specifické pro vaskulární tkáň (Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369), promotory specifické pro meristém (jako je promotor genu SHOOTMERISTEMLESS (STM)) (popisuje se v publikaci Long et al., 1996 Nátuře 379: 66-69), promotor specifický pro primordia (jako je promotor genu CycD3a Aníirrhinum, Doonan et al., 1988 in „Plant Cell Division (Francis, Duditz and Inzé, Eds.) Portland Press, London) a podobně.

V jiném provedení vynálezu se exprese chimérového genu, který kóduje protein řídící dělení buněk může řídit aplikací vhodného chemického indukčního činidla, operativním spojením oblasti DNA kódující protein řídící dělení buněk s promotorem, jehož exprese se vyvolá chemickou látkou, jako je promotor genu popsaný v přihlášce evropského patentu „EP 0332104 nebo promotoru genu uvedeného v dokumentu WO 90/08826.

V dalším provedení vynálezu se exprese chimérového genu, který kóduje protein řídící dělení buněk, může řídit použitím

místně specifické rekombinasy a jejích odpovídajících sekvencí působících ve formě cis. exprimovatelný v rostlině a protein řídící dělení buněk

Například mezi promotor přepisovanou oblast kódující se může začlenit nepříbuzná nukleotidová sekvence (s výhodou může obsahovat signál končící transkripci a/nebo translaci) lemovaná cis-působícími sekvencemi, které rozeznává místně specifická rekombinasa (např. místa Iok nebo FRT). Nebo se uvedená exprese může řídit tak, že v rostlinných buňkách obsahujících uvedený chimérový gen s místně specifickou rekombinasou (např. Cre nebo FLP) se začleněná nepříbuzná nukleotidová sekvence eliminuje rekombinací, což umožňuje expresi chimerového genu řídícího dělení buněk.

Uvažuje se, že morfologické změny dosažené na základě zesílené exprese proteinů řídících buněčné dělení, zvláště cyklinů typu D, v rostlinách, způsobené zavedením chimerového genu obsahující oblast DNA kódující protein řídící dělení buněk, zvláště cyklin typu D, exprimovatelným v rostlinách, mohou deaktivaci sekvencí PĚST. Sekvence PĚST jsou aminokyselinové sekvence, které jsou bohaté na prolin , glutamát nebo aspartát a serín nebo threonin, které senacházejí mezi pozitivně nabitými lemujícími sekvencemi, jenž se podílí na přeměně proteinu obsahujícího takové sekvence (Tyers et al., 1992 EMBO

J. 11: 1773-1784; Cross, 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 4675-4684; Wittenberg and Reed, 1988 Cell 54: 1061-1072; Salama et al. ,

Cell. Biol. 14: 7953-7966). Odstraněním těchto PĚST v kvasinkových cyklinech dojde k jejich stabilizaci in vivo (Pines, 1995 Biochem. J. 308: 697-711).

Oblasti PĚST se mohou identifikovat počítačovou analýzou za použití software, jako je PESTFIND (popisuje se v publikaci Rogers et al., 1986 Science 234: 364-368; Rechsteiner,

1990Seminars Cell Biol. 1: 433-440). Mutace DNA kódující protein řídící dělení buněk se změněnými sekvencemi PĚST jsou řízeného promotorem zesílit adaptaci nebo

1994 Mol sekvencí ·

··· · · · · ····

O /-) · ♦ ♦ ·······

JZ · ♦··· ·· · · ·· ·· · • · · · · ···· ··· · ·· ···· 94 ·· v oboru dobře známy. Lze použít metody popsané v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory, Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk.

Dále se předpokládá, že kvantitativní účinky fenotypických změn se mohou změnit, to znamená zesílit nebo zeslabit, expresí endogenních chimerových genů řídících dělení buněk, zvláště endogenních chimerových genů, které kódují CycD, jako alternativa k použití heterogenních genů kódujících podobné proteiny pocházejících z jiných rostlin. Upřednostňuje se, aby se používaly heterogenní geny, zvláště heterogenní geny kódující podobné proteiny, které vykazují méně než přibližně 65 %, přednostně méně než 75 % , s výhodou méně než 65 % shodu aminokyselinové sekvence s endogenním proteinem řídícím dělení buněk.

Vynález dále popisuje, že morfologie rostlin je možné změnit zeslabením exprese funkčního proteinu řídícího dělení buněk, zvláště cyklinu typu D. Toho lze dosáhnout například použitím antimediátorové DNA, ribozymu nebo metod ko-suprese. Do rostlinných buněk se zavede chimerový gen obsahující oblast DNA přepisovanou na RNA, jejíž produkce redukuje, inhibuje nebo předchází expresi proteinu řídícího dělení buněk, zvláště cyklinu typu D. Preferuje stabilní začlenění do genomu rostlinných buněk.

V souladu s vynálezem oblast DNA chimerového genu kóduje antimediátorovou RNA, která je komplementární s alespoň částí sense mRNA kódující protein řídící dělení buněk, zvláště cyklin typu D. Antimediátorová RNA tak obsahuje oblast, která je komplementární s částí sense mRNA. Upřednostňuje se, aby tvořila její pokračování v délce alespoň 50-ti baží. Zvláště se preferuje délka 100 až 1 000 baží. Antimediátorová RNA může být komplementární s libovolnou částí sekvence mRNA: může být komplementární se sekvencí sousedící s 5' koncem nebo s kapovacím místem, s částí nebo s celou vedoucí oblastí, s oblastí intronu nebo exonu (nebo s oblastí, která přemosťuje • ·

intron nebo exon), sense pre-mRNA, s oblastí, která přemosťuje nekódující nebo kódující oblast, se všemi nebo s částí kódující oblasti zahrnující 3'-konec kódující oblasti a/nebo celou nebo část oblasti 3'-konce nebo koncové RNA-sekvence Podobnost sekvencí u antimediátorvé RNA a komplementu sense RNA kódujícímu protein řídící dělení buněk by měla být v rozmezí alespoň přibližně 75 až 100 %.

V jiném provedení vynálezu přepisovaná oblast DNA chimerového genu kóduje specifický enzym RNA nebo tzv. ribozym (popisuje se například v dokumentu WO 89/05852), který je schopný vysoce specifického štěpení sense mRNA, která kóduje protein řídící dělení buněk, zvláště cyklin typu D.

V jiném provedení vynálezu množství funkčního proteinu řídícího dělení buněk, zvláště cyklinu typu D, se může snížit expresí chimerového genu obsahující oblast DNA kódující protein nebo polypeptid, který v případě, že se exprimuje, snižuje množství proteinu řídícího dělení buněk, zvláště cyklin typu D, nebo tento protein inhibuje, aby vykonal v buňkách jeho funkci. Je výhodné, aby chimerový gen kódoval protilátky, které se váží na protein řídící dělení buněk, zvláště cyklin typu D.

Snížení množství nebo funkční množství proteinu řídícího dělení buněk, zvláště cyklinu typu D, v buňkách transgenní rostliny, která obsahuje chimerové geny podle vynálezu, vede ke změně architektury rostliny. U transgenních rostlin ve srovnání s netransformovanými rostlinami, které se pěstují za stejných podmínek, se zvláště mění výška stonku, sníží se rychlost růstu nebo se prodlouží doba nutná k dosažení kvetu Získaný účinek se může měnit v závislosti na rostlinných druzích nebo na používaných chimerových genech. Vynález zdůrazňuje každý účinek na architekturu a/nebo rychlost růstu, zvláště snížení výšky stonku nebo zpomalení růstu rostlin nebo prodloužení doby nutné pro vyvinutí kvetu.

·· 9 9 · 9 · 9 · ······ 9 9 99 99 9

9 9 9 · 9 9 · 9 99 9·9· 99 99

Zpomalení rychlosti růstu způsobené snížením množství proteinu řídícího dělení buněk , upřednostňuje se cyklin typu D, zvláště cyklin typu CYCD2, se pohybuje v rozmezí přibližně 30 % až 60 %, zvláště v rozmezí přibližně 35 % až 50 %.

Zmenšení výšky stonku způsobené snížením množství proteinu řídícího dělení buněk, upřednostňuje se cyklin typu D, zvláště cyklin typu CYCD2 se pohybuje v rozmezí přibližně 10 % až 60 %, zvláště v rozmezí přibližně 30 % až 50 %., zvláště výhodná je přibližná hodnota 10 %.

Prodloužení doby nutné pro dosažení květenství způsobené snížením množství proteinu řídícího dělení buněk , upřednostňuje se cyklin typu D, zvláště cyklin typu D2 se pohybuje v rozmezí přibližně 10 % až 40 %, zvláště v rozmezí přibližně 15 % až 38 %.

Chimerový gen řídící dělení buněk může dále zahrnovat další regulační sekvence nebo sekvence s jinou funkcí, jako jsou například vedoucí sekvence [např. cab22L vedoucí sekvence z Petunia nebo vedoucí sekvence omega pocházející z TMV (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Res. 15: 3257-3273)],

3transkripční terminační signál a polyadenylační signál (např. gen oktopinové synthasy (De Greve et al., 1982 J. Mol. Appl. Genet. 1. 499), 3'transkripční terminační signál a polyadenylační signál genu nopalinové synthasy (Depicker et al. , 1982 J. Mol. Appl. Genet. 1: 561) nebo T-DNA genu 7 (Velten and Schell, 1985 Nucl. Acids Res. 13: 6998) a podobně (Guerineau et al., 1991 Mol. Gen. Genet. 226: 141-144; Proudfoot, 1991 Cell, 64: 671-674; Safacon et al., 1991 Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al., 1990 Plant Cell, 2: 1261-1272; Munroe et al., 1990 Gene 91: 151-158; Ballas et al., 1989 Nucl. Acids Res. 17: 7891-7903; Joshi et al. , 1987 Nucl. Acids Res. 15: 9627-9639), sekvence iniciace translace v rostlinách (Joshi et al., 1987 Nucl. Acids Res. 15: 9627-9639), introny (Luehrsen and Walbot, 1991 Mol. Gen. Genet. 225: 81-93) a • · • 0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ·· · 0 0 0 0 0000*0 · · 0 0 0 » 0 • 0 0 0 >··· 0 0 00 0000 0 0 00 podobně, operativně spojené s nukleotidovou sekvencí chimerového genu řídícího dělení buněk.

Upřednostňuje se, aby rekombinantní DNA obsahující chimerový gen řídící dělení buněk byla doprovázena chimerovým genem markéru. Chimerový gen markéru může obsahovat DNA markéru, která je operativně spojena svým 5-koncem s promotorem exprimovatelným v rostlinách. Upřednostňuje se konstitutivní promotor , jako je promotor CaMV 35S nebo světlem indukovatelný promotor genu kódujícícho malou podjednotku Rubisco. Svým 3'-koncem je markerová DNA spojena s 3'-koncem transkripčního a polyadenylačního signálu. Očekává se, že volba markéru DNA není kritická a může se použít libovolná vhodná markerová DNA. Markerová DNA může například kódovat protein, který transformované rostlinné buňce poskytuje odlišitelnou barvu. Je to například gen Al (Meyer et al., 1987 Nátuře 330: 677), který poskytuje transformovaným rostlinným buňkám rezistenci na herbicid, nebo gen bar kódující rezistenci na fosfinotricin (popisuje se v dokumentu EP 0,242,246) nebo může poskytnout rezistenci na antibiotika. Takovým genem je gen aac(6'), kódující rezistenci na gentamycin (W094/01560) .

Ačkoli je zřejmé, že vynález je možné použít v případě všech rostlinných druhů a odrůd, je zvláště vhodný při změně architektury nebo při zvýšení rychlosti růstu rostlin, které je možno komerčně využít. Očekává se, že Očekává se, že posílení vegetačního růstu bude nejdůraznější u rostlin, které neprochází vzhledem k rychlému vegetačnímu růstu extenzivním šlechtěním a selekcí. Vynález je zvláště relevantní pro rostliny, které se pěstují ve skleníku, zvláště při zkrácení doby nutné pro dosažení požadovaného stádia vývoje, jako je například doba nutná pro dosažení květenství, vytvoření plodů nebo semen. Vynález je dále relevantní při zrychlení růstu stromů, zvláště jehličnatých stromů, jako je borovice, topol, Eucalyptus a podobně. Další důležitou aplikací vynálezu je • · «· · · · · · · • •φ · · · φ · · · » · ···· »· · · · · ·· · • · · * · »··« ·«· · «* ·«·· ·· ·· expanze účinných oblastí, kde se rostliny mohou kultivovat. Zkracuje se doba nutná pro dosažení ekonomicky důležitého vývojového stádia. Zvláště preferovanou rostlinou, kde se může vynález s výhodou aplikovat je kukuřice, řepka olejná, lněné semínko, pšenice, trávy, vojtěška, luštěniny, rajčata, salát, rýže, ječmen, brambory, tabák, cukrová řepa, slunečnice a okrasné rostliny, jako je karafiát, chryzantéma, růže, tulipány a podobně.

Rekombinantní DNA obsahující chimerový gen řídící dělení buněk se může stabilně začlenit do genomu jádra buňky rostliny. Transfer genu se může uskutečnit vektorem, kterým je Ti-plazmid bez ramen obsahující chimerový gen podle vynálezu, a pomocí mikroorganizmu Agrobacterium. Tato transformace se může uskutečnit použitím postupu popsaným například v dokumetu EP 0,116,718. Jestliže se používají další způsoby transformace rostlin, jako je přímý transfer genu (popisuje se v dokumentu EP 0,233,247), transformace zprostředkovaná pylem (popisuje se v dokumentu EP 0,270,356; WO 85/01856 a US 4,684,611), transformace rostlinné RNA zprostředkované virem (popisuje se v dokumentu EP 0,067,553 a US 4,407,956), transformace zprostředkovaná lipozomy (popisuje se například v dokumentu US 4,536,475), mohou se použít jiný typ vektorů.

Dále jsou také vhodné jiné metody, jako je bombardování mikroprojektily, jak se popisuje v publikaci Fromm et al. , 1990 Bio/Technology 8: 833 a Gordon-Kamm et al. 1990 The Plant Cell 2: 603. Buňky jednoděložních rostlin, jako jsou hlavní obilniny, se mohou transformovat použitím poraněné a/nebo enzymaticky degradované kompaktní embryogenní tkáně schopné tvořit kompaktní embryogenní kallus nebo poraněných a/nebo degradovaných nezralých embryí, jak popisuje dokument WO 92/09696. Výsledná transformovaná rostlina se pak může vhodným způsobem použít pro regeneraci transformované rostliny.

Získaná transformovaná rostlina se může použít v běžném schématu šlechtění za vzniku více transformovaných rostlin se ♦ · · ♦ ·· ·· · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 stejnými charakteristikami nebo při začlenění chimerového genu řídícího dělení buněk v jiných odrůdách stejných nebo příbuzných rostlinných druhů. Semena získaná z transformovaných rostlin obsahují chimerový gen řídící dělení buněk podle vynálezu, jako stabilní inzert genomu.

V následujících příkladech se popisuje konstrukce chimerového genu řídícího dělení buněk a použití takového genu při modifikací architektury a rychlosti růstu rostlin. Jestliže není v příkladech uvedeno jinak metody genového inženýrství se provádějí podle standardních protokolů popsaných v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yourk. Standardní materiály a metody molekulárního zpracování rostlin se popisují v publikaci Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy; BIOS Scientific Publications Ltd (UK) a Blackwell Scientific Publications, UK.

Seznam	sekvencí:
SEQ	ID	NO:	1:	cDNA kódující	CYCD2;1	Nicotiana tabacum
SEQ	ID	NO:	2:	cDNA kódující	CYCD3;1	Nicotiana tabacum
SEQ	ID	NO:	3:	cDNA kódující	CYCD3;2	Nicotiana tabacum
SEQ	ID	NO:	4:	cDNA kódující	CYCD1;1	Helianthus tuberosus
SEQ	ID	NO:	5:	cDNA kódující	CYCD3;1	Helianthus tuberosus
SEQ	ID	NO:	6:	T-DNA pGSV5
SEQ	ID	NO:	7 :	PCR primer 1
SEQ	ID	NO:	8 :	PCR primer 2
SEQ	ID	NO:	9:	PCR primer 3
SEQ	ID	NO:	10	: PCR primer 4
SEQ	ID	NO:	11	: PCR primer 5
SEQ	ID	NO:	12	: PCR primer 6
SEQ	ID	NO:	13	: PCR primer 7
SEQ	ID	NO:	14	: PCR primer 8
SEQ	ID	NO:	15	: PCR primer 9
SEQ	ID	NO:	16	: PCR primer 10

• · ·· flfl · · flfl • flfl « · · · · · · · flflfl · · · · · · · • ····«· fl fl flfl flfl fl • · flflfl · · · · flflfl · ·♦···· · * · ·

SEQ	ID	NO:	17 :	PCR primer	11
SEQ	ID	NO:	18:	PCR primer	12
SEQ	ID	NO:	19:	PCR primer	13
SEQ	ID	NO:	20 :	PCR primer	14
SEQ	ID	NO:	21:	cDNA kódující CYCD2 Zea Mays
Plazmidy pCECl	a pCRK9 jsou uloženy v instituci

Belgian Coordinated Collections of Microoragnismus (BCCM) Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie (LMBP)

Universiteite Gent

K.L.Ledeganckstraat 35

B-9000 Gent, Belgium

Uložení se uskutečnilo 11. 3. 1997 a jsou označeny následujícími čísly:

MC(1061)(pCECl):BCCM/LMBP3657 DH5a(pCRK9):BCCM/LMBP3656

Plazmidy pBlueScript-ZMl8 se uložily v instituci

Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) Laboratorium voor Moleculaire Biologie-Plasmidecollectie (LMBP)

Universiteit Gent

K. L. Ledeganckstraat 35

B-9000 Gent, Belgium

Uložení se uskutečnilo 19. 3. 1998 a je označen číslem

BCCM/LMBP 3866.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce chimerových genů

1.1. Konstrukce chimerového genu CaMV35S-AthcycD2 a ínkluze ve vektoru T-DNA

NcoI-SacI fragment o velikosti 1298 bp obsahující DNA kódující CYCD2 z A.thaliana (vykazující nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83370, poloha 194 až 1332) se ošetřil polymerázou Klenow za vzniku tupých konců a ligoval se do plazmidu pART7 linearizovaným restrikčním enzymem Smál (Gleave, 1992 Plant. Mol. Biol. 20: 1203-1207). Vzniká plazmid pCECl. Tímto způsobem se zkonstruoval chimerový gen lemovaný restrikčními místy Notl, kde DNA kódující CYCD2 se operativně spojil s promotorem CaMV35S izolátu CabbB-Jl (Harpster et al., 1988 Mol. Gen. Genet. 212: 182-190) a s oblastí 3'ocs (MacDonald et al. 1991 Nucl. Acids. Res. 19: 5575-5581). Chimerový gen se pak začlenil mezi hranici T-DNA vektoru T-DNA, obsahující selektivní chimerový gen markéru.

Chimerový gen cycE>2 se vystřihl z plazmidu pCECl za použití restrikčního enzymu Notl a ligoval se do plazmidu pART27 (Gleave, 1992 Plant. Mol. Biol. 20: 1203-1207) linearizovaného restrikčním enzymem Notl za vzniku pCEC5. Plazmid pART27 obsahuje chimerový gen selekčního markéru obsahující následující operativně spojené fragmenty: promotor genu nopalinové synthasy, kódující oblast neo a 3'konec genu nopalinové synthasy (An et al., 1988 Bunary vectors In: Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS (eds) Plant Molecular Biology Manual pp A3/1-A3/19. Kluwer Academie Publishers, Dordrecht).

V jiném případě chimerový gen cycD2 se vystřihl z plazmidu pCECl za použití vhodného restrikčního enzymu (např. Notl) a zavedl se do polylinkeru mezi hraniční sekvence T-DNA T-DNA vektoru pGSV5, dohromady s chimerovým genem selekčního markéru (pSSU-bar-3'ocs; De Almeida et al., 1989 Mol. Gen. Genet. 218: 78-86) za vzniku pCEC5b.

Plazmid pGSV5 se odvodil z plazmidu pGSC1700 (Cornelissen and Vandewiele, 1989 Nucl. Acids Res. 17: 833), ale liší se od později vytvořených plazmidů, které neobsahují gen betalaktamázy a tím, že jeho T-DNA se charakterizuje sekvencí SEQ ID NO: 6.

1.2 Konstrukce chimerového genu CaMV35S-AthcycD3 a inkluze ve vektoru T-DNA.

cDNA cycD3 se izolovala jako BslI-Dral fragment o velikosti 1335 bp obsahující tupé konce po ošetření polymerázou Klenow (vykazuje nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83371, poloha nukleotidu 104 až 1439). Tento fragment se začlenil do restrikčního místa Smál plazmidu pUC18 za vzniku pRS14a. Tento klón nese celou kódující sekvenci cycD3 s kodonem inicijujícím translaci, který se nachází bezprostředně vedle restrikčního místa Smál plazmidu pUCl8 v takové orientaci, že restrikční místo Sací plazmidu pUC18 je na 5'-konci cDNA cycD3 a restrikční místo BamHI na 3'-konci. Izoloval se SacI-BamHI fragment o velikosti 1,35 kb plazmidu pRS14a a ligoval se do SacI-BamHI fragmentu o velikosti 26,6 kb pSLJ94 (Jones et al., 1992 Transgen. Research 1: 285-297) za vzniku pCRK9. Tímto způsobem se zkonstruoval chimerový gen, kde DNA oblast kódující cycD3 z A.thaliana se operativně spojila s promotorem CaMV35S a s oblastí 3'ocs. V plazmidu pCRK9 se chimerový gen nachází mezi okraji T-DNA a je doprovázen chimerovým selekčním genem neo (popisuje se v publikaci Jones et al., 1992 Transgen. Research 1: 285-297).

V jiném případě chimerový gen cycD3 se vystřihne z plazmidu pRS14a za použití vhodných restrikčních enzymů a zavede se do polylinkeru mezi hraniční sekvence T-DNA sekvence vektoru pGSV5 spolu s chimerovým genem selekčního markéru (pSSU-har-3'ocs; DeAlmeida et al. , 1989 Mol. Gen. Genet. 218: 78-86) za vzniku plazmidu pCRK9b.

Příklad 2: Transformace rostliny tabáku T-DNA vektory z příkladu 1 zprostředkovaná mikroorganizmem Agrobacterium

T-DNA vektory pCEC5 a pCRK9 se zavedly do mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Klapwijk et al., 1980 J. Bacteriol. 141: 128-136) elektroporací, jak se popisuje • ·» fefe fefe fefe • ««fefe fe··· • fe fe· · fe··· fe····* · · fefe fefe · • fefe fe fefefefe • · fefe fefefefe fefe fefe v publikaci Walkerpeach and Velten (1995) In: Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS (eds.) Plant Molecular Biology Manual pp Bl/l-Bl/19. Kluwer Academie Publishers, Dordrecht). Transformanty se vybraly za použití spéctinmycinu a tetracyklinu.

Vektory T-DNA pCEC5b a pCRK9b se zavedly do A.tumefaciens C58ClRif^R triparentním křížením (Ditta et al., 1980 Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351).

Výsledné kmeny mikroorganizmu Agrobacterium se použily pro transformaci Nicotiana tabacum odrůda Xanthi. V tomto případě se aplikovala disková transformace listů, jak se popisuje v publikaci An et al., 1985 EMBO J. 4: 277-284.

Vytvořilo se osm rostlin tabáku transformovaných plazmidem pCRK9 (označených jako 1K9, 2K9, 3K9, 4K9, 8K9, 10K9, 17K9, 19K9 a 28K9) a 11 rostlin tabáku transformovaných plazmidem pCEC5 (označených C8 linie 1 až 3 a 5 až 12).

U rostlin transformovaných pCRK9 T-DNA se zkoumal počet kopií začleněných transgenů Southernovou hybridizací, kde se jako sonda použil značený inzert cDNA pRS14a. Každá linie 2K9, 3K9 a 4K9 získaly jednu kopii transgenů, zatímco linie 1K9 obsahovala tři kopie transgenů.

U rostlin transformovaných pCEC5 T-DNA se analyzoval počet kopií začleněných transgenů Southernovou hybridizací za použití DNA štěpené restrikčním enzymem BamHI připravené z uvedených rostlin a značeného NcoI-EcoRI fragmentu o velikosti 0,7 kb pocházejícího z J22 cDNA (obsahující část oblasti kódující cycD2; popisuje se v publikaci Soni et al., 1995 Plant Cell 7: 85-103). Linie C8-2, C8-3, C8-5, C8-8, C81, C8-9. C8-10, C8-11, C8-12 vykazovaly všechny kopie transgenů, linie C8-7 měly dvě kopie, linie C8-6 měly tři kopie a linie C8-1 měly čtyři kopie transgenů.

TO (primární transformanty) se samooplodnily a vznikly semena (TI) . Rostliny, které vyrostly ze semen Tl se označily C8-T1-X, kde X značí číslo linie původního transformantu.

• 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 .· 9 9 9 9

9999 9 9 9 9 99 99 9 • 999 9999

999999 99 99

Semena z rostlin TI se označily T2. Rostliny vyrostlé z takových semen se označily C8-T2-X, kde X je opět číslo linie původního transformantů. V případě, že se neuvádí populace, pak rostliny vyrostly ze semen TI.

Northernova analýza potvrdila transkripci transgenů alespoň v liniích C8-1, C8-3, C8-7, 3K9, 4K9 a 8K9.

Příklad 3: Analýza fenotypu transformovaných rostlin tabáku.

3.1. Rostliny tabáku obsahující chimerový gen CaMV35S-AthCycD2

Semena z primárních transformantů (rostliny TO) se povrchově sterilizovaly 10 % bělícím činidlem po dobu 15 minut a pak se promyly ve sterilní vodě. Povrchově sterilizovaná semena se nechala klíčit na médiu GM, které obsahuje kanamycin v konečné koncentraci 100 μ9/πι1. Semena na plotnách se uchovávala po dobu 5-ti dní při teplotě 4 °C (vernalizace) a pak se uchovávala při teplotě 23 ^cC v růstové komoře. Všechny časové údaje se vztahují ke dni umístění do růstové komory. 18 dní po přesunutí do růstové komory (to znamená 23 dní celkem) se semenáče rezistentní na kanamycin přenesly do korýtek na semena obsahující půdu a nechaly se růst v růstové místnosti při fotoperiodě 18 hodin. Po dalších 10 dnech se tyto rostliny přenesly do sedmi centimetrových květníků a po dalších 15 dnech se přenesly do 20-ti centimetrových květníků, kde zůstaly po zbytek doby expreimentu. Rostliny v květnících se inkubovaly ve skleníku. Denní fotoperioda se doplňovala svícením na celkovou dobu 18 hodin. Rostliny se do skleníku umístily v náhodném seskupení.

Měření započalo za další dva dny (to znamená po 45 dnech nebo po 27 dnech v půdě; označuje se jako týden 1) a opakovalo se každý týden po dobu sedmi týdnů. Z každé linie se testoval následující počet rostlin: 22 rostlin z linie C8-1, 7 rostlin z linie C8-2, 22 rostlin z linie C8-3, 8 rostlin z linie C8-5, 6 rostlin Z linie C8-6, 22 rostlin z linie C8-7, 5 rostlin « · ·· ·· ·· • · · • · · ♦ · ·

Z linie C8-8, 6 rostlin z linie C8-9, 4 rostliny z linie C810, 6 rostlin z linie C8-11, 5 rostlin z linie C8-12, 34 rostlin z netransformované kontroly (divoký typ).

Analyzovaly se následující parametry: výška rostliny od povrchu půdy k nejvyššímu bodu (uvádí se v tabulce č. 1, jako průměrná výška +/- standardní odchylka v cm), délka největšího listu v definovaném čase (uvádí se v tabulce č. 2, vyjadřuje se jako průměrná délka +/- standardní odchylka v cm) , čas (uvádí se v tabulce č. 3, jako průměrný čas +/- standardní odchylka ve dnech), kdy je viditelné květenství meristém pouhýma očima (květenství velikosti 0,25 cm a 1 cm), výška, při které je viditelné květenství meristém (uvedeno v tabulce č. 3 jako průměrná délka +/- standardní odchylka v cm), délka okvětních plátků, šířka kořenového krčku okvětních plátků (uvedeno v tabulce č. 3 jako průměrná délka a šířka +/standardní odchylka v mm) , celkový počet tobolek semen na jednu rostlinu a průměrný výtěžek semen na jednu rostlinu (na základě hmotnosti).

Transgenní rostliny vykazovaly zvýšenou rychlost růstu od stádia semenáčů, což vede k vyšší hodnotě průměrné výšky stonku (tabulka č. 1). V časovém bodě týden 3 jsou všechny populace transgenních linií podstatně vyšší než netransformované kontrolní rostliny (t-test, míra pravděpodobností 95 %), zatímco linie C8-1, C8-2, C8-3, C8-5, C8-11 jsou podstatně vyšší než netransformované kontroly při míře pravděpodobnosti 99 %. Zvýšená rychlost růstu vede k větším listům v indikovaném čase, který koresponduje s periodou, kdy pokračuje růst listů (tabulka č. 2) a k větším květům, kdy okvětní lístky jsou průměrně delší než u květů netransformovaných rostlin.

U transgenních rostlin se také zvýšil počet květů, stejně jako počet oplodněných květů, což vede k většímu počtu semenných tobolek a k většímu výtěžku semen (uvádí se v tabulce č. 4). Počet semen v jedné tobolce byl však u

99 99 ·· * 9 · 9 9 9 9 · • · · · 9 · ·

999999 · · · 9 9 9 9

999 9 9 9 9

999 9 99 9999 99 99 transgenních rostlin vyšší ve srovnání s kontrolními rostlinami divokého typu. Výtěžek aberujících semen v linii C8-T1-6 byl způsoben nadměrně vysokým procentem odpadnutím květů.

Může se udělat závěr, že konstitutivní exprese DNA kódující AthCycD2 vede ke zvýšení počtu semenných tobolek a celkového výtěžku semen v jedné rostlině.

U semenáčů divokého typu a transgenních semenáčů se porovnával vývoj kořenů (uvádí se v tabulce č. 4) . Semena se sterilizovala, vysela se na plotny s kultivačním médiem GM, aniž došlo k selekci, proběhla vernalizace a plotny se uchovávaly ve vertikální poloze v růstové místnosti. Délka kořenů se měřila 9 a 13 dní po vernalizaci a zaznamenala se přítomnost laterálních kořenů. Použila se semena z linie C8Tl-7 a C8-T2-2 (homozygotní). Linie C8-T1-7 vykazuje dva inzerty, které segregují přibližně 15:1 na plotnách s kanamycinem. Z této linie vyrostlo 35 semenáčů a z nich tři reprezentují rychlost růstu pozorovanou u semenáčů divokého typu. Data získaná u těchto semenáčů se odděleně zaznamenávaly devět dní po vernalizaci. Za účelem stanovení podstatnosti rozdílů průměrných hodnot se aplikoval t-test a hladina významnosti se udává v tabulce. Symbol ns znamená nepodstatný rozdíl mezi vzorky. Tak se zdá, že zvýšení vegetačního růstu apikálních částí je v rovnováze s vývojem kořenů.

0 • ·

0 0 0 • 0 00 η

• · · »0 00 0

0 • 0 0 0

0

0000

div. typ 1

o 00 •«k 1 NJ

C8-T1-11

C8-T1-10

C8-T1-9

a - OJ 1 -1 t co

o “ta _X 1

C8-T1-6

C8-T1-5

C8-T1-3

| C8-T1-2

C8-T1-1

Linie

rť

Xk

CO

O

CO

OJ

cn

CO

Xk

05

03

03

on

Xk

Xk

nj

ó

ČO

<1

čn

<33

čo

čo

<33

bu

ČD

cn CL

CO

o

o

co

cn

o

Xk

OJ

O

05

(D

1+

14

I4

14

H-

H-

H-

14

B·

14

14

14

CL tí

—k

NJ

N)

-k

-k

OJ

-X

««k

NJ

*x

NJ

3

o>

čn

OJ

ČO

Xk

Xk

Ó

**4

mX

čn

NJ

Xk

H' l·-1

OJ

cn

O

co

Xk

-X

Xk

cn

05

co

OJ

cn

rt

•i

NJ

-A

cn 'C'

o

—0

co

o

-k

CD

o

cn

•*4

03

03

I-1 CL

čn

čn

ó

čn

Oj

ČO

<1

OJ

Xk

NJ

(D

o

ČO

o

00

NJ

NJ

cn

*x

CO

CL 3

1+

14

H-

(4

14

(4

14

14

14

14

14

14

3

OJ

cn

OJ

Xx

OJ

NJ

Xk

NJ

_x

Xk

NJ

OJ

• Hs M

OJ

ČO

ó

OJ

Xk

čn

čn

03

čo

NJ

Xx

OJ

cn

NJ

03

NJ

-*·

05

—*·

CO

Xk

-X

03

rt cn

03

Xk

Xk

Xk

OJ

Xk

OJ

Xk

Xx

Xx

OJ

<£> CL

—k

NJ

cn

cn

A

CD

OJ

Xk

03

<o

CD

(D

03

03

_x

<1

05

OJ

—i.

05

_x

čo

ČO

CL 3

NJ

Η*

*4

cn

*4

NJ

NJ

o

CD

Xk

05

xX

3

H-

14

14

H-

H-

14

H·

14

14

H-

14

H' CO

O

—k

cn

CD

05

NJ

05

05

03

CO

Xk

05

05

Ó

05

Ó

ČO

_x

Xk

05

Č5

<í

05

NJ

—k

OJ

NJ

o

“4

NJ

05

CO

OJ

05

cn

cn

*4

~4

05

05

-4

cn

*4

05

*4

<33

cn cl (D CL 3

Xk

co

NJ

cn

NJ

NJ

Xk

NJ

o

05

*4

03

O

cn

NJ

OJ

X.

05

05

05

čn

Ó

O

H*

cn

03

•*4

O

05

*4

CO

14

Xx

CO

14

I4

14

14

14

14

14

14

(4

14

“4

OJ

cn

-4

CO

OJ

-4

cn

cn

-x

Xk

co

03

OJI

čn.

“4

čo

_x

čo

OJ

O

**4

03

CO

NJ

o

NJ

03

NJ

OJ

o

Xk

OJ

CO

•Jk

— 'f-t

03

O

o

O

_k

_x

o

«X

CO

cn

OJ

OJ

90

CO

_x

CO

O

o

*4

co

cn

Xx

03

OJ

•4

—k

Xk

05

Xk

Lx

Xx

CO cl

05

o

OJ

’*4

~4

k

čn

CD

čn

«X

Xk

NJ

o CL 3 3

14

H-

14

cn

H-

o

o

OJ

o

14

1+

14

—i.

«X

14

1+

1+

H-

H-

-X

_x

o

Xk

-*

CO

NJ

03

03

CD

05

cn

o

o

H' Cn

ČO

K

čn

NJ

NJ

Ó

OJ

O

Xb

čn

NJ

O

NJ

—k

Xk

03

03

CD

NJ

4

—X

cn

ft

.i

_jk

_X

_k

_x

_x

CO H1 CL

NJ

Xk

_X

cn

OJ

_k

Xk

NJ

Xk

OJ

Xk

NJ

—X

o

Xx

NJ

”4

OJ

co

O

OJ

Xk

OJ

ČO

03

Xk

kj

Čo

Xk

čn

cn

čn

čo

OJ

(D

O

čn

cn

OJ

NJ

co

o

03

cn

O

UX >-3

H-

H-

co

H-

H·

O

H·

H-

14

H-

1+

14

3

_k.

14

NJ

H-

_k

—X

NJ

—X

NJ

Η' ΟΊ

00

NJ

cn

—0

O

cn

—k

OJ

ΙΌ

*4

Xx

NJ

—k.

05

čo

OJ

05

Ó

*4

03

_x

'*4

03

00

05

OJ

co

X

OJ

cn

OJ

W

-4

cn

O

cn

«k

—- Ct-

X»

_X

cn

Xk

05

cn

05

Xx

«-k

OJ

CO ^<S

cn

cn —Λ.

NJ CD

čn o

NJ

05 ČO

CO

Xk

cn co

cn *4

05 03

•*4 O

O CL (D

co H·

03 H-

OJ 14

H-

-4 (4

o 14

Xk 14

čo o

čo 00 14

OJ 14

o o H-

CO H-

CL 3 ' 3

>.

-4

«i

NJ

OJ

H' -J

CO

O

co

*4

03

—k

—k

cn

CO

NJ

CO

—*

Xk

’*4

NJ

NJ

05

03

ČO

05

čo

-j.

čo

COJ

Xk

05

CO

*4

05

CO

OJ

03

cn

OJ

o

Tabulka č. 1: Průměrná délka (v cm) transformovaných rostlin tabáku obsahující CaMV35S-AtcycD2 φφ ·· φ φ · φ φ φ φ · φ φ φ · φ φ φ · φφ ·· φ · φφφφ

d H- < rt *<

C8-T1-12

C8-T1-11

C8-T1-10

O 03 1 “4 1 co

C8-T1-8

C8-T1-7

C8-T1-6

C8-T1-5

C8-T1-3

”o CD -H 1 ro

ÍC8-T1-1 .I

I-—1 H- 0 H- (D

—X

_k

_x

_x

_x

_x

X.

__x

(O

k

cn

k

ro

«(«X

cn

k

cn

cn

03

OJ

cn

03

cn

A

k

_X

čn

03

ó

čo

03

cn

rt

~4

O

OJ

cn

_x

03

co

03

03

cn

k

0

cn

O

OJ

o

-4

-«4

03

-'J

ro

cn

OJ

0

d

1+

l+

1+

H-

1+

H-

1+

l+

l+

1+

1+

l+

(1) 2

—k

—k

ro

ro

ro

ro

-X

to

-X

-X

čo

k

_x

03

ó

A

A

k

03

k

A

03

l·-1

k

03

u.

CO

OJ

ro

—X

o

03

o

03

k

03

IO

OJ

OJ

cn

co

co

ro

cn

o

IO

03

ΓΟ

ro

ro

»x

ro

ro

ro

ro

ro

ro

cn

—k

o

co

o

ro

o

—

o

OJ

CO

03

k

00

_X

čo

cn

ó

čo

čn

čo

čn

čo

co

O

OJ

03

—k

o

o

OJ

03

cn

o

0

£L

O

OJ

-^4

o

o

OJ

03

—X

o

CD

(D

1+

l+

H-

1+

1+

l+

1+

l+

l+

1+

1+

l+

ro

-X

-k

ro

ro

_x

_x

—k

-X

OJ

—k

10

A

k

03

co

o

00

k

čo

A

A

ÓJ

ó

03

-o

O

ro

«X

-4

co

o

k

OJ

cn

0

O

cn

ro

cn

o

cn

4

-o

k

k

ÍO

ro

ro

ro

ro

ÍO

ro

ro

ro

ro

ro

ro

03

cn

03

03

-s

CO

co

co

co

~4

oj

Lk

03

čn

OJ

čn

čo

čo

čo

OJ

03

_k

rt

cn

o

OJ

03

OJ

on

o

ro

M

k

k

—X

'C'

N3

o

OJ

OJ

OJ

OJ

co

~4

cn

«•X

OJ

k

d

1+

l+

H-

1+

1+

1+

1+

1+

1+

1+

1+

1+

6

-X

ro

_x

to

ro

-X

—k

ro

OJ

_k

ro

čo

03

A

03

X

čn

čo

A

03

ó

CO

-X

OJ

03

o

ro

OJ

_x

cn

4

o

4

CD

k

co

O

03

ro

cn

03

03

k

ro

cn

ro

ro

Tabulka č. 2: Průměrná délka (v cm) největšího listu transformovaných rostlin tabáku obsahující CaMV35S-AtcycD2 φ« φφ • φ φ φ φ φ φ * φ φ φ φ φ φ φ φ • Φ ·« • · φ

·· φφ φ * φφ φ • · · • ···· • · φφφ * φ

• φ • φ φφ φφφφ

. div.typ

průměr

C8-T1-12

C8-T1-11

G8-T1-10

C8-T1-9

O co A 1 oo

C8-T1-7

C8-T1-6

C8-T1-5

Č8-T1-3

C8-T1-2 ]

C8-T1-1

—t-- linie

<31

co

-x|

-xl

-x|

xl

<30

-~sl

<31

<31

<33

x

O

co

OO

ΓΌ

o

co

o

CO

Ul

-xl

o jv 73

čo

b

b

b

b

Lx

b

b

o

A

A

lx

b

. ” 1-5 ru ů C1

o

—X

o

~xj

α

-xl

co

Ul

o

Ul

•xl

NO

Ul

σι 0 3

ω cd<

h Oj h 3 N< 3

čas kvě (dny

1+

1+

1+

1+

l+

l+

1+

l+

l+

l+

1+

1+

1+

rf ω

oo

NO

x

-X

NO

OO

00

oo

NO

NO

00

NO

X

3 ω rř

A

b

b

b

b

NO

A

b

b

La

lx

b

Ul

<

NO

co

o

oo

_x

Ul

00

oo

NO

-X

oo

-xl

co

NO

~x|

o

00

-xl

Ol

X

co

NO

σι

oo

o

-0

-XJ

~xl

•xJ

~xl

xl

-xl

-xl

•xl

HX,íO K

CD

Ul

<31

OO

-xl

CO

~x|

•s

oo

<31

X

NO

X

b

b

X

_x

A

b

b

—X

oo

b

b

O

A

0 Q. C’ 3 0 3

co

co

O

S

Ul

o

o

Ul

oo

00

NO

o

Ul

ω n><

r. čas až kv (dny)

φ<

tens

1+

1+

1+

1+

l+

l+

1+

l+

l+

1+

1+

1+

1+

Γ+ <

NO

re

ω

NO

NO

NO

NO

NO

NO

NO

OO

oo

X

H“

b

b

Ai

_x

CO

X

A

b

b

b

lx

b

b

X

no

_x

00

CO

NO

co

Ul

X

00

X

X

X

NO

co

CJ1

-xJ

Ol

CO

oo

NO

X

-xJ

X

<35

—k

—X

—X

-X

_x

—X

_X

_X

-X

—X

NO

o

NO

NO

—X

00

—x

NO

o

_X

o

_X

~xl

_X

X

-xl

co

<35

00

χ<4

NO

<31

o

Ul

— Ό Ό

A

b

b

A

A

Lx

lx

b

lx

b

b

b

O K 3 H- d’

o

Ul

3 Žt (Έ><

rná výš větenst

ka ví

H-

1+

1+

H-

l+

l+

1+

l+

1+

1+

1+

1+

1+

i—*

_x

X

NO

NO

0 3

O

o

-xj

X

co

o

ui

X

Ul

<31

X

«X

b

b

b

b

A

b

lx

lx

b

A

—X

lx

b

no

co

co

NO

o

NO

CD

co

Ul

oo

oo

oo

-xJ

o

NO

oo

X

NO

-X

NO

xJ

co

•xl

X

CD

o

Tabulka č. 3A'-Vývoj květů (průměrná výška při vývoji květenství o velikosti 0,25 cm nebo 1 cm (v cm), průměrný čas nutný pro dosažení květenství o výšce 0,25 nebo 1 cm (ve dnech po vernalizaci) u rostlin tabáku transformovaných CaMV35SAthCycD2.

t

CL ρ- < X X)

průměr

C8-T1-12

C8-T1-11

C8-T1-10

o 03 ( -j 1 O

C8-T1-8

o 03 1 H 1

C8-T1-6

C8-T1-5

C8-T1-3 j — ----—i

o 00 1 -1 -X 1 NO

C8-T1-1

linie

Α.

Φα cn

42

φ» fU

44.

! 45.

42.

48

cn o

47

J)A

44

47

-

.22

.093

.57

.40

.60

ru

.90

.04

‘x 03

.30

.30

co

.22

a>< e· rt 3 C Φ< n

1+

1+

1+

l+

l+

1+

l+

1+

l+

l+

1+

1+

!+

délka mm)

—k

tu

o

-A

_k

-A

-A

ru

_A

ru

_A

_A

tu

(

.005

.877

.978

.891

.627

,906

.252

.604

.990

.822

.720

.848

.261

1

*D

-u

n ω

-a

X

3 co

X

X

x

O co

X

X

A

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

< 3

O

O

O

O

O

O

o

O

O

H' N

O o ru

b cn

O

b

b o ~A

b o

.002

O

.001

a namnosti

26

CU

28

29.

ω o

30.

30.

Ca) Ca)

34,

cu cu

cu

CU

33.

.76

.43

.55

o

.93

.56

ω

«X CO

.25

.30

.04

.45

průměr. kvetu (

B w< —·· H-

1+

1+

1+

l+

1+

1+

l+

1+

!+

1+

1+

1+

1+

_α

_A

_A

IU

tU

fU

_A

_A

_A

.099

.886 I

.190

866‘

.002

.333

.270

CU CO *A

.467

.945

.360

.486

b cn 03

v

-D

ns

0

“0

ns

x

x

X

X

-a

x

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

Λ

< 3

a

O

O

O

O

O

O

O

O

O

H' Ν K

o o _a

b cn

O

.002

b o —A

O o

O o wX

.001

.001

001

3 0) 0> 3 3 O (Λ ft H·

• ·	• •		• · • ·	• · fc ·
	fc ·		fc fc	fc
	• fcfcfc ·	• ·	•	•
	•		• ·	•
• ·	• ·		• ·	• · · ·
cn	X	0	<	rt	X
	P	3	><	3	3
CL	3	N	X	σ	σ
p-	<	3'	o	3'	3
<	CL	<	Ω<	X	X
O	3<	P-	P'	3	X
X	X	cn	X		3
J-C'	O	X	3	rt
3	CL	3'	X	P	Ω<
	o		3	3	•
rt	σ	rt		3
	0	P	ω	ω	co
X	o	3	3	Xi	ω
3	ω	3	o
3	rt	cn	X P 3° a	P
ω		X 3 3	3 o <	< Χ)' o

'C cr o

ω

N o

3' x

o

CL

O

X

X

O r+

O tr o

Cl

O

X

O

CL

OJ' <

O)'

P' x

X

P

OJ'

P' ω

PX

PHi

Px o

o

X

P' x

rt p

Φ' <

·<'

M

I—¹

CL

X

X)

P3 ρω ω

ω

X

Ο Η Ο < 3 3 Η· <<

ω

CL ρ<

Ο

X ><' ω

X oj r+ ρω rt

ΡΩ

X p;

X

O

Cl ω

rt

OJ rt

3' <

X ><

X ω

Ν

X

Ο

Ν<

ΡX

Ρ'

X

I

X ω

ω

X ω<

3'

X

Ο

CL

Ο

X

CL

3'

X

X *<

cn<

Ρ'

Ρ<

χ χ

<!

ω<

χ

3°

X

Ν<

CL

3'

X ω

X ω

Ρ' *<'

Ω

X

Ο

S <

ω χ

ω >

χ

X

Q <

Ω σ

[U

Ο ι_ιX <

ω<

χ

3°

X σ

X

X

X

Ν ρ3 ρω χ

ο

CL

Ο

X ω<

3<

ρΡ-¹ ω

ω

CL

3'

X χ

ω<

Ρ'

3<

X

X ω<

χ χ

<

ω<

χ

3°

X

Ν<

CL

3'

Ο

X

3° ω<

3' <

ω χ

ρX ο

ω χ

χ <

<Τ><

X

3’

X

Ο

Ν

3'

CL

3'

X

X ω<

Ρ'

Ρ<

X

cn	3		ω
p	L_l.	3	rt	P
O	3		l·—1	0
<		X	H·	tn
3	3	3	2	X
3'	P'	N<	·<	X
3	P	CL		P-
P'	3	3'		3

co

Tabulka č. 4A: Průměrný počet semenných tobolek na jednu rostlinu, průměrná hmotnost obsahu semen šesti tobolek (g), průměrný výtěžek semen na jednu rostlinu (g) u rostlin tabáku transformovaných CaMV35SAthCycD2.

linie	průměr, počet semen, tobolek	průměr, hmotnost semen 6 tobolek (g)	průměr, výtěžek semen/ 1 rostl, (gi
C8-T1-1	105.15 ± 14.96	1.085 + 0.174	19.015
C8-T1-2	127.29 ±7.82	0.824 ±0.137	17.481
C8-T1-3	110.46 ± 16.30	1.106 ±0.179	20.361
C8-T1-5	97.86 ± 10.81	1.105 ±0.178	18.023
C8-T1-6	78.60+ 12.97	1.078 ±0.150	14.123
C8-T1-7	118.17 ± 15.64	1.131 ±0.253	22.275
C8-T1-8	123.75 ±4.78	1.123 ±0.165	23.162
C8-T1-9	110.83 ±20.91	1.090 ±0.218	20.134
C8-T1-10	104.20 ± 10.99	1.122 ±0.311	19.485
C8-T1-11	138.20 ±8.35	1.116 ±0.222	25.705
C8-T1-12	106.20 ± 12.62	1.134 ±0.056	20.072
div. typ	106.73 ± 16.47	0.938 ±0.118	16.685

Tabulka č. 4B: Porovnání vývoje kořenů u semenáčů divokého typu a transformovaných semenáčů

linie	Počet rostlin	o. Ό laterální ch kořenů	Průměrná délka kořenů (mm)		hladina významnos ti
9 dní po vernalizaci
WT	23	36	15,326	± 1,893
C8-T1-7	25	100	26, 520	± 1.971	0,001
	3	33	14,000	± 3,464	Ns
C8-T2-2	28	100	26,911	± 2,064	0,001
13 dní po vernalizaci
WT	16	100	28,188	± 1,893
C8-T1-7	13	100	53,846	± 1,971	0,001
C8-T2-2	15	100	51,267	± 3,464	0,001

3.2 Rostliny tabáku obsahující chimerový gen CaMV35S-AthCycD3. Ze semen TI se vypěstovaly rostliny obsahující chimerové geny CaMV35S-AthCycD3 a ošetřily se způsobem, jak se popisuje v odstavci 3.1. Z měřením se započalo 49 dní po vyklíčení. Měřilo se v intervalu přibližně 7 dní. V případě každé linie se analyzoval následující počet rostlin: 11 rostlin v případě linie 1K9, 19 rostlin v případě linie 3K9, 20 rostlin v případě linie 4K9 a 18 rostlin v případě netransformovaných kontrol.

t Analyzovaly se následující parametry:délka a řířka okvětní trubice (v cm) a čas (dny) , kdy alespoň 75 % rostlin dosáhlo alespoň stádia, kde se jasně vyvinulo květenství, uvádí se v tabulce č. 5.

Tabulka č. 5: Shrnutí měření u rostlin tabáku obsahující chimerový gen CaMV35S-AthCycD3.

linie	Průměrná délka květní trubice (cm)	Průměrná šířka květní trubice (cm)	Průměrný čas nutný pro dosažení květenství délky 1 cm (dny)
1K9	5,66 ± 0,46	3,44 ± 0,27	100
3K9	5,18 ± 0,37	3,20 + 0,35	100
4K9	5,48 ± 0,38	2,90 ± 0,35	93
wt	3,96 ± 0,12	2,39 + 0,10	84

V případě, že okvětní trubice transgenních rostlin byla v průměru delší, než vykazují netransformované rostliny, pak transgenní rostliny měly větší květy a pro dosažení stádia, kdy je jasně vyvinuté květenství, je nutný delší čas.

Příklad 4: Izolace genů homologů cycD z jiných rostlin

Knihovna cDNA pocházející z exponenciálně rostoucích buněk rostliny tabáku BY-2 se zkonstruovala ve vektoru Lambda Express (Stratagene). Přibližně 7,5 x 10⁵ klonů knihovny se naneslo na plotnu a z každé plotny se vytvořily repliky blotů připravené za použití nylonových membrán Hybond N⁺ (Amersham Int.), které se pak fixovaly pečením při teplotě 80 °C po dobu dvou hodin. Membrány se hybridizovaly s heterogenními sondami cycD2 nebo cycD3 značenými náhodným začleněním oc-³²PdCTP. Sonda cycD3 obsahuje fragment cycD3 z A. thaliana (HincII-KpnI fragment o velikosti 405 bp, vykazuje nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83371 z polohy nukleotidu 557 do polohy nukleotidu 962) . Sonda cycD2 se skládá z NcoI-SacI fragmentu o velikosti 1298 bp, který pochází z A. thaliana (vykazuje nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83370 od polohy nukleotidu 194 do 1332) . Hybridizace cycD3 se provedla při teplotě 55 °C a membrány se • · · · « · ♦ β· promývaly dvakrát po dobu 10 minut v roztoku 2xSSC/0,1% SDS, pak následovalo desetiminutové promytí v roztoku 0,1 SSC/0,1 % SDS. Po té následuje autoradiografie. Hybridizace cycD2 proběhla při teplotě 48 °C. Membrány se promyly třikrát po dobu dešti minut v roztoku 2x SSC/0,1 % SDS. Všechna promytí se provedla při teplotě místnosti. Izolované klony knihovny se vystřihly in vivo (podle protokolu výrobce) za vzniku subklónů ve fágemidu pBK-CMV (Stratagene) a použitím standardních metod se stanovila sekvence DNA. Informace o sekvencích se analyzovaly za použití software GCG (Genetic Computer Group) (1994). Sekvence cDNA cycD2;l, cycD3;1 a cycD3;2 z rostliny tabáku se reprezentovaly v sekvencích SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.

Jiná knihovna cDNA se připravila z polyadenylační RNA izolované z hlíz, kořenů a listů z rostliny Helianthus tuberosus. cDNA se syntetizovala z oligo(dT)primeru a ligovala se do vektoru lambda ZAPII do restrikčního místa EcoRI.

Přibližně l,25xl0⁶ klonů se naneslo na plotnu. Připravily se repliky blotů plaků způsobem, který se popisuje shora v textu a bloty se hybridizovaly za použití značených sond. Bloty se navíc testovaly použitím sondy cycDl, která obsahuje Xbal-Aval fragment o velikosti 401 bp genu cycDl A. thaliana (který má nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83369 od polohy nukleotidu 312 do polohy nukleotidu 713) . Izolované klony se analyzovaly, jak se popisuje shora v textu. Sekvence cycDl;l a geny cycD3;l pocházející z Helianthus tuberosus jsou reprezentovány v SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 5.

Z polyadenylační RNA izolované z kalu Zea mays (Pa91xH99)xH99 se připravila další knihovna cDNA. cDNA se syntetizovala z oligo(dT) primeru a ligovala se do vektoru lambda ZAPII v restrikčním místě EcoRI. Přibližně 1,25x10® klonů se naneslo na plotnu a připravily se repliky blotů plaků, jak se popisuje shora v textu a provedla se hybridizace za použití značených sond, jak se uvádí shora v textu.

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0 • · 000 0000 900 · 00 0000 00 00

Provedla se analýza izolovaných klonů, jak se popisuje shora v textu. Sekvence cDNA cycD2 pocházející z Zea mays se uvádí v SEQ ID NO: 21.

Příklad 5: Konstrukce antimediátorových chimerových genů a transformace rostlin tabáku

NcoI-SacI fragment o velikosti 1298 bp obsahující DNA kódující CYCD2 pocházející z A. thaliana (vykazující nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83370 od polohy nukleotidu 194 do polohy nukleotidu 1332) se ošetřil polymerázou Klenow za vzniku zkrácených tupých konců a ligoval se do vektoru pART7 linearizovaného restrikčním enzymem Smál (Gleave, 1992 Plant.

Mol. Biol. 20: 1203-1207). Vybral se plazmid, kde fragment DNA byl v takové orientaci, že DNA kódující CYCD2 se zavedla reverzním způsobem mezí promotor CaMV35S ízolátu CabbB-Jl (Harpster et al., 1988 Mol. Gen. Genet. 212: 182-190) a oblast 3'ocs (MacDonald et al. 1991 Nucl. Acids. Res. 19: 5575-5581) tak, že při expresi se produkuje antimediátorová RNA.

Chimerový antikódující gen se začlenil mezi hraniční T-DNA sekvenci vektoru T-DNA, který také obsahuje chimerový gen selekčního markéru. Chimerový gen cycD2 se vystřihl z plazmidů pCEC2 za použití restrikčního enzymu Notl a ligoval se do plazmidů linearizovaného restrikčním enzymem Notl (Gleave et al., 1992 Plant. Mol. Biol. 20: 1203-1207) za vzniku pCEC6.

Rostliny tabáku se transformovaly chimerovými geny, jak se popisuje v příkladu 2.

Příklad 6: Analýza transformantů

Rostliny transformované chimerovými geny popisovanými v příkladu 5 se ošetřily způsobem popsaným v příkladu 3.1 a testoval se následující počet rostlin: 7 rostlin linie C9-2 a 6 rostlin linie C9-7.

Analyzovaly se následující parametry: výška rostliny od povrchu půdy k nejvyššímu bodu (tabulka č. 6; uvádí se jako

• · • · průměrná výška ± standardní odchylka (v cm)), délka největšího listu ve definovaném čase (tabulka č. 7, uvádí se jako průměrná délka ± standardní odchylka (v cm)), čas (tabulka č. 8, uvádí se jako průměr času ± standardní odchylka (ve dnech)), při kterém je viditelné pouhýma očima květenství meristém, výška, při které je viditelné květenství meristém (tabulka č. 8, uvádí se jako průměrná délka ± standardní odchylka (v cm)).

Transgenní rostliny vykazují zpomalenou rychlost růstu, která je zjevná od stádia semenáčů. Výsledkem je menší průměrná výška stonku (tabulka č. 6). Zvýšená rychlost růstu vede k vytvoření menších listů v daném čase, který koresponduje s dobou, kdy pokračuje růst rostlin (tabulka č. 7) .

Tabulka č. 6: Průměrná výška (uvádí se v cm) transformovaných rostlin tabáku obsahující CaMV35S-antikódující cycD2.

linie	C9-2	C9-7	Netransformovaná kontrola'
Týden 1	2,64 ± 1,22	2,75 ± 0,89	4,48 ± 1,63
Týden 2	6,64 ± 1,68	6,07 ± 1,43	10,50 ± 3,33
Týden 3	20,00 ± 3,74	17,21 ± 6, 47	31,82 ±7,89
Týden 4	34,07 ± 6,13	28,50 ± 5,83	54,00 ±7,89
Týden 5	54,00 ± 8,87	45,14 ± 8,46	86,56 ± 10,91
Týden 6	74,29 ± 9,97	61,29 ± 5,11	121,80 ± 18,28
Týden 7	85,92 ± 12,03	71,50 ± 23,19	145,18 ± 19,44

Tabulka č. 7: Rozdíl v průměrné hodnotě délce listů transformovaných rostlin tabáku obsahující CaMV35Santikódující cycD2 a průměrné hodnoty délky největších listů netransformovaných rostlin tabáku (v cm).

9 • · · 9 9 9 9 · « · 9

999 99 9 9999

9999999 9 9 99 99 9

9 999 9999 *99 9 99 9999 99 99

linie	C9-2	C9-7	Netransformovaná kontrola
Týden 1	-2,31	-4,30	0
Týden 2	-3,26	-6, 44	0
Týden 3	-4,35	-8,91	0

Tabulka č.

květenství květenství antikóduj ící

8: Průměrná velikost kvetu (mm), průměrná výška (cm), průměrný čas nutný k dosažení vývoje (dny) u rostlin tabáku transformovaných CaMV35ScycD2.

linie	Průměrný čas dosažení květenství (dny)	Průměrná výška při květenství (cm)	Průměrná délka květu (mm)
C9-2	102a	95	NA
C9-7	89 ± 7,95	68,57 ± 9,62	38,31
Netransformovaná kontrola	79 ± 2,39	111 ± 10,02	41,22

Pouze u jedné rostliny se vyvinulo květenství během monitorovaného času

Tabulka č. 8b: Účinek exprese antikódujícího CycD2 na délku květu u transgenních rostlin tabáku se analyzoval v dalších liniích (generace TI) a statisticky se porovnával s rostlinami divokého typu za použití t-testu. Měřila se délka pěti květů z každé rostliny a vypočítala se průměrná hodnota délky květů každé transgenní linie. Hodnoty každé nezávislé transgenní linie se porovnaly s rostlinou divokého typu za použití ttestu. Tabulka vykazuje hladinu významnosti, která udává, zda jsou výsledky srovnání s rostlinou divokého typu statisticky podstatné.

linie

Průměrná délka květu (mm)

Míra významnosti

• · · β

C9-T1-1	41,05 ± 1,558	NS
C9-T1-3	40,68 ± 1,574	NS
C9-T1-7	38, 68 ± 1,991	NS
C9-T1-10	39,78 ± 1,024	P<0,05
C9-T1-12	39,55 ± 1,568	P<0,05
Průměrná hodnota	40 ± 1,301	P<0,05
Divoký typ	41,22 ± 1,005

Příklad 7: Transformace rostliny řepky olejně T-DNA popsanými v příkladu 1 a podobné vektory a analýza transformovaných rostlin

Získaly se hypokotylní explantáty Brassica napus kultivované a transformované v podstatě stejně, jak se popisuje v publikaci De Block et al. 1989 Plant Physiol. 91: 694. Použily se následující modifikace metod:

-hypokotylní explanty se pre-kultivovaly po dobu jednoho dne na kultivačním médiu A2 (MS, 0,5 g/1 Mes (pH5,7), 1,2 % glukózy, 0,5 % agarózy, lmg/1 2,4-D, 0,25 mg/1 kyseliny naftalenoctové (NAA) a 1 mg/1 6-benzylaminopurinu (BAP)).

-infekční	médium A3	je	MS, 0,5 mg/1	Mes	(pH5,7), 1,2 %
glukózy, 0,1	mg/1 NAA, C	i,75	mg/1 BAP a	0,01	mg/1	kyseliny
gibberelínové	(GA3) .
-selekční	médium A5G	je	MS, 0,5 g/1	Mes	(pH5,7)	, 1,2 %

glukózy, 40 mg/1 adenin. SO₄, 0,5 g/1 polyvinylpyrrolidonu (PVP), 0,5 % agaróza, 0,1 mg/1 NAA, 0,75 mg/1 BAP, 0,01 mg/1 GA3, 250 mg/1 karbenicilinu, 250 mg/1 triacilinu, 5 mg/1 AgNO₃ po dobu tří týdnů. Po této době selekce se pokračuje v kultivaci na médiu A5J (podobné jako A5G, ale obsahuje 3 % sacharózu)

-regenerační médium A6 je MS, 0,5 g/1 Mes (pH5,7), 2 % sacharóza, 40 mg/1 adenin. SO_4; 0,5 g/1 PVP, 0,5 % agarózy,

0,0025 mg/1 BAP a 250 mg/1 triacilinu.

-zdravé výhonky se přenesly do média pro zakořenění, kterým bylo A9: MS s poloviční koncentrací, 1,5 % sacharóza (pH5,8), 100 mg/1 tracílínu, 0,6 % agar v nádobě o objemu 1 1. MS je zkratka kultivačního média podle Murashige and Skooga (popisuje se v publikaci Murashige and Skoog, 1962 Physiol. Plant. 15: 473).

Hypokotylní explanty se infikovaly mikroorganizmem Agrobacterium tumefaciens kmen C58ClRif^R nesoucí pomocný Tiplazmid, jako je pGV4000, který se odvodil od plazmidu pMP90 (Koncz and Schell 1986 Science 260: 536-539) získaným začleněním bakteriálního genu nesoucího rezistenci na kanamycin spojeného s fragmentem o velikosti 2,5 kb, který vykazuje homologii s T-DNA vektorem pGSV5, do vektoru pMP90, a T-DNA vektor získaný z vektoru pGSV5 obsahující chimerové geny popsané v příkladu 1 mezi hraničními sekvencemi T-DNA a chimerovým genem markéru (pCEC5b a pCRK9b).

Transgenní rostliny řepky olejně obsahující chimerové geny podle vynálezu vykazují urychlený vegetační program (vyšší rychlost růstu) , zkrácení času nutného pro dosažení stádia květenství, zvýšení počtu květů a zvýšený výtěžek semen u jedné rostliny.

Příklad 8: Transformace rostlin kukuřice vektory popsanými v příkladu 1 a podobné vektory a analýza transformovaných rostlin.

Rostliny kukuřice se transformovaly vektory popsanými v příkladu 1 podle WO 92/09696. Transgenní rostliny kukuřice obsahující chimerové geny podle vynálezu vykazují zrychlený vegetační program (zvýšená rychlost růstu), zkrácení času nutného pro dosažení stádia květenství, zvýšený počet květů a zvýšený výtěžek semen v jedné rostlině.

Příklad 9: Transformace rostlin rajčat vektory podle příkladu 1 a podobné vektory a analýza transformovaných rostlin.

·· · · · · · · · · «·· · · · · · · · * • · · · · · ♦ · 4 · ««····« » « · · · · · • · « · · ···· • ·· · · · ·«·· 4 · 4·

Rostliny rajčat se transformovaly vektory popsanými v příkladu 1 a v publikaci De Block et al. 1987 Embo J. 6: 2513-2518. Transgenní rostliny rajčat obsahující chimerové geny podle vynálezu vykazují zrychlený vegetační program (zvýšená rychlost růstu, zkrácený čas nutný k dosažení stádia květenství, zvýšený počet květů a zvýšený výtěžek plodů na j ednu rostlinu) .

Příklad 10: Transformace rostlin hlávkového salátu vektory popsanými v příkladu 1 a podobnými vektory a analýza transformovaných rostlin.

Rostliny hlávkového salátu se transformovaly vektory podle příkladu 1. Vektory se popisují v publikaci Micheimore et al.,

1987 Plant Cell Rep. 6: 439-442. Transgenní rostliny hlávkového salátu obsahující chimerové geny podle vynálezu vykazují zrychlený vegetační program (zvýšená rychlost růstu), zkrácený čas nutný k dosažení stádia květenství, zvýšený počet květů a zvýšený výtěžek semen na jednu rostlinu.

Příklad 11: Další analýza potomstva linie transgenních rostlin tabáku transfromované konstrukcemi CaMV35SAthCycD2 podle příkladu 3 v segregační a v nesegregační populaci

U populace potomků (segregační nebo nesegregační) rostlin ze dvou linií transgenních rostlin tabáku transformovaných konstrukcemi CaMV35SAthCycD2 (linie 2 a linie5 příkladu 3) se analyzovala délka času květenství a zvýšení vegetačního růstu měřením průměrné výšky stonku nebo průměrné suché hmotnosti rostlin.

Segregace transgenů se monitorovala stanovením jejich rezistence na kanamycin. V případě segregační populace se analyzovalo 32 rostlin, zatímco v případě nesegregačních populací se analyzovalo 12 rostlin. Netransformované populace zahrnovaly také 12 rostlin.

Použily se následující populace:

Β · ·Β ΒΒ ΒΒ ΒΒ • ΒΒ Β Β Β Β · Β Β Β • Β Β β Β Β Β Β Β ♦ ·«««··« · · «Β ΒΒ Β

Β Β β * Β «ΒΒΒ

Β «· Β ΒΒ ···· Β· Β*

Segregační populace:

Linie 2:

C8-T1-2 (semena Tl z primárního transformantu C8-2; segreguje 3:1 v případě T-DNA)

C8-T2-2 (semena T2 ze samooplodněných rostlin C8-T1-2 #3, které jsou homozygotní, semeno segreguje 3:1 pro T-DNA)

C8-T2-2 (semena T2 z křížení rostliny C8-T1-2 #3 s rostlinou divokého typu za použití pylu rostliny divokého typu jako rodičovského pylu. Toto semeno segreguje 1:1 pro T-DNA a všechny rostliny obsahující T-DNA jsou hemizygotní)

Linie5

C8-T1-5 (semena Tl z primárního transformantu C8-5; segreguje

3:1 v případě T-DNA)
C8-T2-5 (semena T2 ze	samooplodněných	rostlin	C8-T1-5	#304,
které jsou hemizygotní, Nesegregační populace	semeno segreguje	3:1 pro	T-DNA)
Linie 2
C8-T2-2 (semena T2 ze	samooplodněných	rostlin	C8-T1-2	#302,

které jsou homozygotní pro T-DNA)

Linie 5

I

C8-T2-2 (semena T2 z rostliny C8-T1-5 #121 křížené s rostlinou divokého typu za použití pylu rostliny divokého typu jako rodičovského pylu. Všechny rostliny #121 obsahující T-DNA jsou hemizygotní a všechny semena T2 jsou hemizygotní pro T-DNA) « · 99 99 9999

9 9 9999 9999

99999·9 9 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 ·· 9

C8-T2-2 (semena Τ2 ze samooplodněných rostlin C8-T1-5 #121 Všechny rostliny #121 jsou hemizygotní a pro T-DNA a všechny semena T2 jsou hemizygotní pro T-DNA)

Měřil se účinek nadměrné exprese CycD2 na délku času, která je nutná k iniciaci vývoje květenství u transgenních rostlin tabáku a hodnoty se statisticky porovnávaly s hodnotami stejných parametrů měřených u kontrolní populace divokého typu za použití neparametrického t-testu, kde směrodatná odchylka populací divokého typu a transgenních populací není stejná. Zaznamenával se čas, který potřebuje každá rostlina pro vývoj květenství o velikosti 0,5 cm a vypočítal se průměrný počet dní po vernalizaci. Hodnoty pro každou transgenní populaci se porovnaly s hodnotou pro populaci divokého typu za použití t-testu. Data získaná v případě segregačních linií se oddělila od dat získaných u populace rezistentní na kanamycin a populace citlivé na kanamycin. Data získaná u populace rezistentní na kanamycin se také označila odděleně v případě homozygotní sub-populace rezistentní na kanamycin (není dále segregační) a v případě hemizygotní sub-populace rezistentní na kanamycin (dále segregační 3:1). Tato data jsou uvedena v tabulce č.9. V tabulce č. 10 se uvádí průměrné hodnoty výšky stonku u transgenních nesegregačních liniích v odlišném čase po vernilizaci ve srovnání s populací divokého typu (statisticky hodnoceno). Hodnota míry významnosti menší než 0,05 se považuje za vysoce významný rozdíl mezí průměrnou výškou každé transgenní linie a průměrnou výškou kontrol. NS znamená nepodstatný rozdíl mezi populacemi. Navíc biomasa semenáčů z uvedených nesegregačních populací se porovnávala se semenáči divokého typu během časného vegetačního růstu. Semenáče se sklízely v označené dny po vernalizaci a určila se jejich hmotnost vážením dříve než se sušily při teplotě 70 °C po dobu dvou dnů. Vypočítala se průměrná hodnota suché hmotnosti • · · · · · · 9 · • · · · · · ♦ · * • · · · · ·>«« ······ · · · » · · · • · · · · · · · 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 semenáčů a standardní odchylka a výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 11.

Tabulka č. 9: Účinek nadměrné exprese CycD2 na délku času nutnou pro iniciaci vývoje květenství u transgenních rostlin tabáku

Populace	Průměrný čas květenství 0,5 cm (dny)	Standardní odchylka	Míra významnosti
Nesegregační linie
WT	72,125	2,258	-
C8-T2-2 (302	63,62	3,863	0,001
s.opi.) C8-T1-5(121	67,78	2,438	0, 02
samopl.) C8-T1-5(121xWT)	64,18	1,991	0,001
Průměr	65,19	2,258	0,001
Segregační linie
C8-T1-2 s.opl., KanR	59, 04	2,973	0,001
Hemizyg.	59, 32	3,110	0,001
Homozyg.	58,50	2,507	0,001
Citl. na kanamycin	73,00	5,994	NS
C8-T2-2 pl 3xWT Kan R	59,44	2,756	0,001
Citl. na kanamycin	69,10	2,846	NS
C8-T2-2 pl 3	59,20	2,141	0, 001
s.opi., KanR Hemizyg.	59,25	1,653	0,001
Homozyg.	59,38	3,021	0,001
Citl. na kanamycin	73,50	5,431	NS
C8-T1-5 KanR	62,67	3,367	0,001
Citl.na kanamyc.	71,50	5,782	NS
C8-T2-5 pl 304 s.opi. Hemizygot.	64,50	3,030	0,001
Homozygot.	65,83	2,483	0,002
Citl. na kanamycin	74,50	7,764	NS

fe · • · • · • ·

míra významnosti 3_	C8-T2-5 (121 x WT)	míra významnosti	— o f-> co ω i *-* H ω cn i • cn 0 TJ H	míra významnosti	C8-T2-2 (302 s.opi.)	div. typ	populace
0.001 !	4.37 + 0.378	o b o	4.25 ± 0.507	0.002	3.55 + 0.451	1.48 + 0.238	ω CL P H'
0.001	8.14 + 1.914	0.001	6.02 i 1.662	0.001	6.02 + 1.662	3.50 + 0.831	37 dní i_I
0.001	14.76 + 2.550	0.001	11.11 ± 3.823	1ΌΌ	11.11 ± 3.823	7.59 + 1.932	4 Í dní !I
0.001	25.18 + 3.314	0.001	19.35 + ,6.528	0.05	19.35 ± 6.528	14.59 + 3.816	cn CL P
0.001	39.91 ± 4.898	o b o	32.81 + 9.181	0.05	32.81 ± 9.181	25.81 ± 6.030	4 9 dní
o ó o	75.04 ± 6.258 !	0.001	71.82 + 7.604	0.05	67.50 + 12.281	58.24 + 8.423	Cn Ol CL P H'
0.01	117.83 + | 9.808	0.01	119.86 + 10.675	0.01	120.12 + 12.829	107.06 + 8.306	63 dní I
0.05	146.54 ± 13.422	o b o	152.82 + 11.297	0.01	151.46 + 15.253	136.75 ± 7.105	O CL P H'
ns	160.71 ± 15.183	0.001	170.73 ± 11.130	0.05	165.23 + 14.696	153.94 + 7.430	77 dní
ns	174.1 + 14.963	o b	192.18 ± 7.846	ns	177.23 ± 13.935	177.71 ± 13.129	konečná výška

Tabulka č. 10: Statistické porovnání výšky stonku transgenních rostlin tabáku obsahující CaMV35SAthCycD2 s kontrolami divokého typu.

cn

div. typ	C8-T2-5 (121 x WT)	C8-T2-5 (121 s.opi.)	C8-T2-2 (302 s.opl.)	populace
1.2 ±0.510	5.48 ±1.130	4.30 ± 1.623	3.75 ± 1.462	17 dní
13.16 ±3.09	39.51 ± 10.13	29.05 + 10.50	22.11 + 6.59	23 dní
29.88 ± 14.89	79.81 ± 20.36	49.14 ± 8.51	53.19 + 9.97	28 dní
135 ±60.72	476 ± 120.2	351 ±67.6	337 + 58.3	34 dní
382 ± 90.3	946 ±154	547 + 24.9	530 ± 60.0	38 dní

• · ·* 9 9 · · · · 9 9 9 9 9 9

4 9 9 4 4 4 9 9 4

9999994 9 9 99 99 9

9 9 4 9 9 4 4 9

999 9 99 9999 9» 99 η

h st° ω<

κ o

o c

tr o

α t?

o ct o

St σ

ΗΟ flj ω

·<

x ω

N<

q, α>'

Γ+

Hi

SH ts ω

Ό ω

ti ts

I—¹

Ηts

H<D

Φ

Ό

Hi

St° (D<

Hi ts tr o

g.

ts o

r+ fu

Hσ

HÍU ω

X x

o ts

X

Hi

O

H-¹

Tabulka č. 11: Hodnoty suché hmotnosti (mg) získané z nesegregačních populací transgenních semenáčů, které nadměrně exprimují CycD2 a semenáčů divokého typu (WT) v různém čase po vernalizaci. Ve všech případech t-test označuje, že existuje velmi podstatný rozdíl mezi t »9 · · »9 9« 99 99 • 9 9 9 9 *9 ·

9 9 9 9 · ·

9· · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 99

Sekvenční protokol (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1284 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA na mRNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Nicotiana tabacum (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: (B) Pozice: 182 ..1243 (D) Jiné informace:

/poznámka= „cDNA kódující cyklin CYCD2;1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

CAAATTTTTC	TCCCTTCTAT	AGTCTCTTTC	CTGTTCTCTT	AAAAATCCTT	AAAAATTTAT	60
TTTTTTTAAC	AATCTCATGT	AAATGGGATT	AAATTTTGTA	AAAATATAAG	A.TTTTGATAA	120
AGGGGGTTTA	ATTATAACAT	AGTAAATTAA	GATTTTTTTT	TTGCTTTGCT	AGTTTGCTTT	180
AATGGCAGCT	GATAACATTT	ATGATTTTGT	AGCCTCAAAT	CTTTTATGTA	CAGAAACAAA	240
AAGTCTTTGT	TTTGATGATG	TTGATTCTTT	GACTATAAGT	CAACAGAACA	TTGAAACTAA	300

··

GAGTAAAGAC	TTGAGCTTTA	ACAATGGTAT	TAGATCAGAG	CCATTGATTG	ATTTGCCAAG	360
TTTAAGTGAA	GAATGCTTGA	GTTTTATGGT	GCAAAGGGAA	ATGGAGTTTT	TGCCTAAAGA	420
TGATTATGTC	GAGAGATTGA	GAAGTGGAGA	TTTGGATTTG	AGTGTGAGAA	AAGAGGGTCT	480
TGATTGGATT	TTGAAGGCTC	ATATGCACTA	TGGATTTGGA	GAGCTGAGTT	TTTGTTTGTC	540
GATAAATTAC	TTGGATCGAT	TTCTATCTCT	GTATGAATTG	CCAAGAAGTA	AAACTTGGAC	600
AGTGCAATTG	TTAGCTGTGG	CCTGTCTATC	ACTTGCAGCC	AAAATGGAAG	AAATTAATGT	660
TCCTTTGACT	GTTGATTTAC	AGGTAGGGGA	TCCCAAATTT	GTATTTGAAG	GCAAAACTAT	720
ACAAAGAATG	GAACTTTTGG	TATTAAGCAC	ATTGAAGTGG	AGAATGCAAG	CTTATACACC	780
TTACACATTC	ATAGATTATT	TTATGAGAAA	GATGAATGGT	GATCAAATCC	CATCTCGGCC	840
GTTGATTTCT	GGATCAATGC	AACTGATATT	AAGCATAATA	AGAAGTATTG	ATTTCTTGGA	900
ATTCAGGTCT	TCTGAAATTG	CAGCATCAGT	GGCAATGTCT	GTTTCAGGGG	AAATACAAGC	960
AAAAGACATT	GATAAGGCAA	TGCCTTGCTT	CTTCATACAC	TTAGACAAGG	GTAGAGTGCA	1020
GAAGTGTGTT	GAACTGATTC	AAGATTTGAC	AACTGCTACT	ATTACTACTG	CTGCTGCTGC	1080
CTCATTAGTA	CCTCAAAGTC	CTATTGGAGT	GTTGGAAGCA	GGAGCATGCT	TGAGCTACAA	1140
AAGTGGTGAT	GAoAGAACAG	TTGGATCATG	TACAACTTCT	TCACATACTA	AAAGGAGAAA	1200
ACTTGACACA'	TCATCTTTAG	AGCATGGGAC	TTCAGAAAAG	TTGTGAATCT	GAATTTTCCC	1260
TTTTTAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAA				1284

(2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 1679 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetě
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA na mRNA
(iii)	HYPOTETICKÁ: ne

(iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Nicotiana tabacum (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: (B) Pozice: 181 ..1299 ·· ·· ·· • * • · ·· ···· (D) Jiné informace:

/poznámka=cDNA kódující cyklin CYCD3;1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

AAACGAGTCT CTGTGTACTC CTCCTCCTAT AGCTTTTCTC TCTTCTTCTC TTCACACCTC 60

CCACAACACA CAATCAGACA AAATAGAGAG GAAAATGAGT ATGGTGAAAA AGCTTTGTTT 120

TGTATAATGA GAAAAAGAGA TTTATATACA TCTCTTCTTC TACTTCCTTC TTACTAGAAG 180

ATGGCAATAG AACACAATGA GCAACAAGAA CTATCTCAAT CTTTTCTTTT AGATGCTCTT 240

TACTGTGAAG AAGAAGAAGA AAAATGGGGA GATTTAGTAG ATGATGAGAC TATTATTACA 300

CCACTCTCTT CAGAAGTAAC AACAACAACA ACAACAACAA CAAAGCCTAA TTCTTTATTA 360

CCTTTGCTTT TGTTGGAACA AGATTTATTT TGGGAAGATG AAGAGCTTCT TTCACTTTTC 420

TCTAAAGAAA AAGAAACCCA TTGTTGGTTT AACAGTTTTC AAGATGACTC TTTACTCTGT 480

TCTGCCCGTG TTGATTCTGT GGAATGGATT TTAAAAGTGA ATGGTTATTA TGGTTTCTCT 540

GCTTTGACTG CCGTTTTAGC CATAAATTAC TTTGACAGGT TTCTGACTAG TCTTCATTAT 600

CAGAAAGATA AACCTTGGAT GATTCAACTT GCTGCTGTTA CTTGTCTTTC TT7AGCTGCT 660

AAAGTTGAAG AAACTCAAGT TCCTCTTCTT TTAGATTTTC AAGTGGAGGA TGCTAAATAT 720

GTGTTTGAGG CAAAAACTAT TCAAAGAATG GAGCTTTTAG TGTTGTCTTC ACTAAAATGG 780

AGGATGAATC CAGTGACCCC ACTTTCATTT CTTGATCATA TTATAAGGAG GCTTGGGCTA 840

AGAAATAATA TT.CACTGGGA ATTTCTTAGA AGATGTGAAA ATCTCCTCCT CTCTATTATG 900

GCTGATTGTA GATTCGTACG TTATATGCCG TCTGTATTGG CCACTGCAAT TATGCTTCAC 960

GTTATTCATC AAGTTGAGCC TTGTAATTCT GTTGACTACC AAAATCAACT TCTTGGGGTT 1020

CTCAAAATTA ACAAGGAGAA AGTGAATAAT TGCTTTGAAC TCATATCAGA AGTGTGTTCT 1080

AAGCCCATTT CACACAAACG CAAATATGAG AATCCTAGTC ATAGCCCAAG TGGTGTAATT 1140

GATCCAATTT ACAGTTCAGA AAGTTCAAAT GATTCATGGG ATTTGGAGTC AACATCTTCA 1200

TATTTTCCTG TTTTCAAGAA AAGCAGAGTA CAAGAACAGC AAATGAAATT GGCATCTTCA 1260

ATTAGCAGAG TTTTTGTGGA AGCTGTTGGT AGTCCTCATT AAAATCAATC ACCTGATTTA 1320

TCTCTTTTCT TTCTTATTAC CAACTATGGT GGTAATAATA TTTATTGATA TTCAGAAGTA 1380

TTTACCTTTA ATGTCATTTT CAAAAATTAC ATGAAAATGG AAAAAAAGAA AAGAAGAGCT 1440

TAGCTGGTGG TTGCAGTTGG CAGAGAAGAG GACTGGCTTT TTTTTGCAGG AGTGTAGTCT 1500

ACTACTACTG GAAAGCAGAG ATAGAGAGAG GAGAAAAGAC AGAAAATCTG CACTATTTGT 1560

TTTTTCTCTA TTCATATCAA TTCTCTCTTA GGTCCTTTTC ATGCATGCAT ACTTTTGATG 1620

GACATATTTT ATATATTTAC TATAATCATA AATTCTTGAA TAAAAAAAAA AAAAAAAAA 1679 (2) • ·

9 9 to'

Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1431 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Nicotiana tabacum (ix) ZNAKY:

(A) Název/klíč: (B) Pozice: 1981..1298 (D) Jiné informace:

/poznámka=cDNA kódující cyklin CYCD3;2 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

CACCTTTACT	CTCTTCTCCT	TTTTGGCTCT	TCCCATTCTC	TCCTTCTCTT	TCTTTATTTT	60
CTGTCCTGTA	GAGAGAGAGA	GAAAGTATAA	GCAAAGCAGC	AGATATGTTA	CTGGGTCCAA	120
GATTGAGTTT	TGGCTTACCT	TGAAGATAAT	GAGTAGAGCC	TGCATTGTCT	TCTTCCGTCA	180
AGAAGAAGAA	GAAGAAGATG	GTTTTCCCTT	TAGATACTCA	GCTCCTAAAT	CCAATCTTTG	240
ATGTCCTTTA	CTGTGAGGAA	GATCGATTCT	TGGACGATGA	TGA7TTAGGA	GAATGGTCTA	300
GTACTTTAGA	ACAAGTAGGA	AATAATGTGA	AAAAGACTCT	ACCTTTATTA	GAATGTGACA	360
TGTTTTGGGA	AGATGACCAG	CTTGTCACTC	TTTTAACTAA	GGAAAAAGAG	TCTCATTTGG	420
GTTTTGATTG	TTTAATCTCA	GATGGAGATG	GGTTTTTAGT	GGAGGTTAGA	AAAGAGGCAT	480
TGGATTGGAT	GTTGAGAGTC	ATTGCTCACT	ATGGTTTCAC	TGCTATGACT	GCTGTTTTAG	540
CTGTGAATTA	TTTTGATAGG	TTTGTATCTG	GACTCTGCTT	TCAGAAAGAT	AAGCCTTGGA	600
TGAGTCAACT	TGCTGCTGTG	GCTTGTCTTT	CTATTGCTGC	TAAAGTGGAA	GAGACCCAAG	660
TCCCCCTTCT	CTTAGACCTC	CAAGTGGCTG	ATTCAAGATT	TGTGTTTGAG	GCAAAGACTA	720
TTCAGAGAAT	GGAACTCTTG	GTGCTCTCCA	CTCTTAAGTG	GAAAATGAAT	CCAGTGACAC	780
CACTATCTTT	CATTGATCAT	ATCATGAGGA	GATTTGGATT	CATGACCAAT	CTACATTTGG	840
ATTTTCTTAG	GAGATGTGAA	CGCCTCATTC	TTGGTATTAT	CACTGATTCT	AGGCTCTTGC	900
ATTATCCTCC	atctgttatt	GCAACTGCAG	TAGTGTATTT	CGTGATCAAT	GAGATTGAGC	960

• · »»t· ·« 0· ·· ·· • · · · · « · » • · · · · · · • · · · · · · · · « · »»· ···· ··· · «0 ···· ·· ··

CTTGCAATGC	AATGGAATAC	CAGAATCAGC	TCATGACTGT	TCTTAAAGTC	AAACAGGATA	1020
, GTTTTGAAGA	ATGCCATGAT	CTTATTCTAG	AGCTAATGGG	CACTTCTGGC	TACAATATCT	1080
GCCAAAGCCT	CAAGCGCAAA	CATCAATCTG	TACCTGGCAG	TCCAAGTGGA	GTTATCGATG	1140
CATATTTTAG	TTGCGACAGC	TCTAATGATT	CGTGGTCGGT	AGCATCTTCA	ATTTCATCGT	1200
CACCAGAACC	TCAGTATAAG	AGGATCAAAA	CTCAGGATCA	GACAATGACA	CTGGCTCCAC	1260
TGAGTTCTGT	TTCTGTCGTT	GTGGGCAGTA	GTCCTCGTTG	ATCAGTATCT	CATTCTCTAG	1320
ATTATCTAGT	ATTACGGCTA	TGGTTACTAT	ATGATCTCTC	TTTTTTGGTA	TGTTCTCTTA	1380
AACTGCAGTT	GCACAATGCT	CTGATGTTCC	ATTAAAAAAA	AAAAAAAAAA	A	1431

(2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1788 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA na mRNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Helianthus tuberosus (ix) ZNAKY:

-	(A)	Název/klíč: -
	(B)	Pozice: 165 ..1109
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=cDNA kódující cyklin CysDl;l Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

(xi)

ΦΦ • Φ φ φ φ

φ φ

φφφφ φ

φ φ

φ φ

• φ ·· · • · · φ ΦΦΦ· • · φφφ · ·« • φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦ ·· φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦ

ΦΦ

GACAACAATG ACTTCTACTC	ACTATTCACT ACTTACTAAT CACTGCAACT TCTCCGGCCA	60
CTTTTCACCT CAAACCGCCG	GAACTCCGCC GCTCCGGTCG ACGGTGAATC ACTGAATCTT	120
AGCAATTATG TTCACAACAG	TATGAACAAT CAACACCGGT CATCATGTCA ATCTCGTGCT	180
CTGACTGCTT CTCCGACTTA	. CTCTGCTGCG AGGACTCCGG CATATTATCC GGCGACGACC	240
GGCCGGAGTG CTCCTATGAT	TTCGAATATT CCGGCGACTT TGATGATTCG ATCGCGGAGT	300
TTATAGAACA GGAGAGAAAG	TTCGTTCCAG GAATCGATTA CGTCGAGCGA TTTCAATCGC	360
AAGTTCTCGA TGCTTCTGCT	AGAGAAGAAT CGGTTGCCTG GATCCTTAAG GTGCAACGGT	420
TTTACGGATT TCAGCCGTTG	ACGGCGTACC TCTCCGTTAA CTATCTGGAT CGTTTCATCT	480
ATTGCCGTGG CTTCCCGGTG	GCAAATGGGT GGCCCTTGCA ACTCTTATCT GTAGCATGCT	540
TGTCTTTAGC TGCTAAAATG	GAGGAAACCC TTATTCCTTC TATTCTTGAT CTCCAGGTTG	600
AAGGTGCAAA ATATATTTTC	GAGCCGAAAA CAA.TCCGAAG AATGGAGTTT CTTGTGCTTA	660
GTGTTTTGGA TTGGAGACTA	AGATCCGTTA CACCGTTTAG CTTTATCGGC TTCTTTTCGC	720
ACAAAATCGA TCCATCTGGA	ATG7ATACGG GTTTCCTTAT CTCAAGGGCA ACACAAATTA	780
TCCTCTCAAA TATTCAAGAA	GCTAGTTTAC TTGAGTATTG GCCATCATGT ATTGCTGCTG	840
CAACAATACT TTGTGCAGCA	AGTGATCTTT CTAAATTCTC ACTTATCAAT GCTGATCATG	900
CTGAATCATG GTGTGATGGC	CTTAGCAAAG AGAAGATCAC AAAATGTTAC AGACTTGTAC	960
AATCTCCAAA GATATTGCCG	GTACATGTTC GAGTCATGAC GGCTCGAGTG AGTACTGAGT	1020
CAGGTGACTC ATCGTCGTCG	TCTTCTTCGC CATCGCCTTA CAAAAAGAGG AAACTAAATA	1080
ACTACTCATG GATAGAGGAG	GACAAAAGAT GAAAATAAGG AGACAAAATA ΑΑΤΑΑΑΤΑΑΑ	1140
TCCGGATTCC TCTCTATATT	TTTTAAAGGA ATCAACAAAT ΑΤΑΤΑΤΑΑΑΑ AAAAAAAATG	1200
GAGTCAGGAA AAGCAACGAA	AGCCGCCGGA GGAAGAAAAG GCGCCGGAGC GAGGAAGAAG	1260
TCCGTCACAA AGTCCGTCAA	AGCCGGTCTC CAGTTCCCCG TCGGAAGAAT CGCTAGGTTT	1320
CTAAAAAAAG GCCGATACGC	TCAACGTACC GGATCCGGAG CTCCGATCTA CCTTGCTGCT	1380
GTTCTAGAAT ACCTTGCTGC	TGAGGTTTTG GAGTTGGCGG GAAATGCAGC GAGAGATAAC	1440
AAGAAGACAA GGATAAACCC	TAGGCACTTG CTATTGGCTG TTAGGAACGA TGAGGAATTG	1500
GGGAAATTGC TTGCTGGTGT	TACTATTGCT AGTGGAGGTG TGTTGCCCAA TATCAATCCG	1560
GTTCTTTTGC CCAAGAAGTC	TTCTTCTTCT TCTGCTGCTG AGAAGACCCC CAAATCTAAA	1620
AAGTCGCCTA AAAAGGCTGC	TTAGATAGAT GTTTCTGGTT ATAGTTGGTT AGATTAAGTT	1680
GAAGCAAAAC AGTCTCTTTT	GTTCAATTAG TCGTCTGGCA ATGTAACTAT TTTGGTCGTC	1740

TTCAAAATGT TAATTGGATA CTATCTTCTT ΤΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ΑΑΑΑΑΑΑΑ

1788 ϊ

(2) Informace o SEQ ID NO: 5:

* ···· · « · · • · ·· · ···· ···· · · · ······

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 1414 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA na mRNA

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Helainthus tuberosus (ix) ZNAKY:

(A)	Název/klíč: -
(B)	Pozice: 48 ..1118
(D)	Jiné informace:
/poznámka=cDNA kódující cyklin CYCD3;1

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

TTGAACCTTC ATTTCTTTTC TTTTCTTCTT TCTAATCACC AACCCCAATG GCCATTTTAT 60

CACCATATTC ATCTTCTTTC TTAGACACAC TCTTTTGCAA TGAACAACAA GATCATGAAT 120

ATCATGAATA TGAGTATGAA GATGAATTTA CACAAACCAC CCTCACAGAT TCATCTGATC ISO

TCCATCTTCC CCCCCTGGAC CAACTAGATT TGTCATGGGA ACATGAAGAG CTTGTGTCCT 240

TGTTCACAAA AGAACAAGAG CAGCAAAAAC AAACCCCTTG TACTCTCTCT TTTGGCAAAA 300

CTAGTCCCTC AGTTTTTGCT GCTCGTAAAG AGGCTGTAGA TTGGATCCTT AAGGTCAAAA 360

GTTGTTATGG ATTCACACCT CTTACAGCCA TTTTAGCCAT CAATTATCTT GATAGGTTTC 420

TTTCTAGCCT CCATTTTCAA GAAGATAAAC CTTGGATGAT TCAACTTGTT GCTGTTAGTT 480

GTCTCTCTTT AGCTGCTAAA GTTGAAGAAA CTCAAGTGCC ACTCTTACTA GATCTTCAAG 540

TAGAGGACAC TAAGTACTTG TTTGAGGGTA AAAACATACA AAAAATGGAG CTTTTGGTGA 600

TGTCAACTTT GAAATGGAGG ATGAACCCAG TGACACCAAT CTCATTTCTT GATCACATTG 660

TAAGAAGGCT TGGATTAACT GATCATGTTC ATTGGGATTT TTTCAAGAAA TGTGAAGCTA 720

TGATCCTTTG TTTAGTTTCA GATTCAAGAT TCGTGTGTTA TAAACCATCC GTGTTGGCCA 780

CAGCTACAAT GCTTCACGTT GTAGATGAAA TTGATCCTCC CAATTGTATT GACTACAAAA 840

GTCAACTTCT GGATCTTCTC AAAACCACTA AGGACGACAT AAACGAGTGT TACGAGCTCA 900

TTGTCGAGCT AGCT7ACGAT CATCACAACA AACGAAAACA TGATGCAAAC GAGACAACAA 960

CCAATCCGGT TAGTCCAGCT GGCGTGATCG ATTTCACTTG TGATGAAAGT TCAAATGAGT 1020 • 9 • · · · ·

	71	• · · • · · 9 9999 9 9 99 9 9	• · · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
CATGGGAACT	TAATGCTCAT	CATTTCCGCG	AGCCTTCATT	CAAGAAAACA	AGAATGGATT	1080
CAACAATTCG	GGTTCGGGTT	TGGTTCACTT	ATAAGCTTTA	ATCGAGGGTA	GTTGTAAACA	1140
TGTAATCCGC	ATGCACGCTA	TTAATCCTAC	GGTCCACTAC	TACATATAAT	CGGCCTATAA	1200
AATTATAGGT	TAAGATGACC	AGTCGTAGGC	GTCGAGATGT	CCTTATGGTT	GGTCAATTTC	1260
TCTATGGTTT	TAGGTCGTTT	TTAATGTGAG	ataaattaaa	TTCGGTATGT	TAAGTCTTTA	1320
TCAAGGAATG	GACGTTATAT	TTATTGTTTG	ATATTGAGAA	TTAAATTCCA	TGGGAAAAAA	1380
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAA			1414

(2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 17 párů baží
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
(D)	TOPOLOGIE: lineární
DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotíodvý
PCR

pro (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

A

GCMTGGATYC

TYAAGGT (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina

(A) POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý primer 2 pro PCR (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

TGCTTGTCWT TAGCTGC 17 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý primer 3 pro PCR (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

AAGAATGGAR YTTCTTGT 18 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 19 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A) PCR	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý primer

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ARAGNATYCY KGCWGCAGC (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• · « · • · · · • · · · • · · · · • flfl ·

	flfl flflfl ·	• flfl • · flfl
	(A)	DÉLKA: 19 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý	primer
	PCR
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
CCRTCACACC	AWGNYTCAG
(2) Informace o	SEQ ID NO: 12:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 16 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý	primer
	PCR

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

pro pro

TGGWGATTTG GATTTG (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý primer
	PCR
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

pro

ATNAANTACT TGGATCG • · (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i)

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 19 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý
	PCR
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
AGCTTGCANT	CTCCANTTC
(2) Informace o	SEQ ID NO: 15:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý
	PCR

(xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

pro

TAGAAGNCC TGAANTC

Informace o SEQ ID NO: 16 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina • · · · · · · • 4 · · · 4 ♦

4 · · * · ·

4444·· · · · · · • 4 · 4 9 4

4 4 44 9 4 4 9 (A) POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý primer 10 pro PCR (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

GANTGGATNY TNAARGT 17 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové
	(D).	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
	(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý
	pro	PCR

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

AAGABAARCC WTGGATG 17 (2) Informace o SEQ ID NO: 18 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý primer 12 pro PCR (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

GTKGAAGARA

CTCAAGTBCC (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• · • ·

	76 : ··:* · • · · ·	• · · · • · · • · · · · ·	• · · • · · • ·
		(A)	DÉLKA: 24 párů baží
		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
		(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová'kyselina
		(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý	primer 13
		pro	PCR
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
TGGNGTNACW	GGNTKCATYY		24
(2)	Informace o	SEQ ID NO: 20:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA: 20 párů baží
		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová
		(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	DRUH	MOLEKULY: jiná nukleová kyselina
		(A)	POPIS: /desc.= „oligonukleotiodvý	primer	PR14
		pro	PCR
	(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
GCWGNNGCNA	NNNCAGANGG		20
(1)	Informace o	SEQ ID NO: 21:
	(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
		(A)	DÉLKA: 1846 párů baží
		(B)	TYP: nukleová kyselina
		(C)	DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová
		(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii)	DRUH	MOLEKULY: cDNA na mRNA

(iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) POZITIVNÍ: ne (v) PŮVODNÍ ZDROJ:

77	• · · * · • · · · · · BBB · · • ······ · • · · · · «·· · ·· ··	• ·· • · · « B · · « • · · * « Β B « Β Β B ·
(A) ORGANIZMUS: Zea mays ix) ZNAKY: (A) Název/klíč: - (B) Pozice: 316 ..1389 (D) Jiné informace: /poznámka=	„cDNA kódující	cyklin

CYCD2 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

L 1 λ	CTAGCCGGCG	TCGTCCTCCC	CCTCTCHCGC	TCCTCTGTCC	TCCCCTCTCC	60
ACTTGAGAAG	AACACAATTA	GGAAAAAAAG	GCAAAAAACA	TTTACCTTTT	TTCTATCTGT	120
ATATTATCTG	aataaatcaa	GAGGAGGAAG	AGGGGAGGGA	GCGAGGGAGG	GGGAGGAGTA	180
GCAAATCCAG	ACTCCATAGC	AACCAGCTCG	CGAGAAGGGG	AAAAGGGGGA	GGAAGAGCTT	240
CGCTTGTGTA	TTGATTGCTC	GCTGCTCCAG	TCCCTGCATT	CGTGCCGTTT	TTGGCAAGTA	300
GGTGGCGTGG	CAAGCATGGT	GCCGGGCTAT	GACTGCGCCG	CCTCCGTGCT	GCTGTGCGCG	360
GAGGAGAACG	CTGCTATTCT	CGGCCTGGAC	GACGATGGGG	AGGAGTCCTC	CTGGGCGGGC	420
GCCGC7ACGC	CGCCACGTGA	CACCGTCGCC	GCCGCCGCCG	CCACCGGGGT	CGCCGTCGAT	480
GGGATTTTGA	CGGAGTTCCC	CTTGCTCTCG	GATGACTGCG	TTGCGACGCT	CGTGGAGAAG	540
GAGGTGGAGC	ACATGCCCGC	GGAGGGGTAC	CTCCAGAAGC	TGCAGCGACG	GCATGGGGAC	600
CTGGATTTGG	CCGCCGTCAG	GAAGGACGCC	ATCGATTGGA	TTTGGAAGGT	CATTGAGCAT	660
TACAATTTCG	CACCGTTGAC	TGCCGTTTTG	TCTGTGAACT	ACCTCGATAG	ATTCCTCTCC	720
ACGTATGAGT	TCCCTGAAGG	CAGAGCTTGG	ATGACTCAGC	TCTTGGCAGT	GGCTTGCTTG	780
TCTTTGGCTT	CGAAAATCGA	AGAGACTTTT	GTGCCACTCC	CCTTGGATTT	GCAGGTAGCG	840
GAGGCAAAGT	TTGTTTTTGA	GGGAAGGACC	ATAAAAAGGA	TGGAGCTTCT	GGTGCTAAGC	900
ACCTTAAAGT	GGAGGATGCA	TGCTGTTACT	GCTTGCTCAT	TTGTTGAATA	CTTTCTTCAT	960
AAATTGAGTG	ATCATGGTGC	ACCCTCCTTG	CTTGCACGCT	CTCGCTCTTC	GGACCTTGTC	1020
TTGAGGACCG	CTAAAGGTGC	TGAATTCGTG	GTATTCAGAC	CCTCCGAGAT	TGCTGCCAGT	1080
GTTGCACTTG	CTGCTATCGG	CGAATGCAGG	AGTTCTGTAA	TTGAGAGAGC	TGCTAGTAGC	1140

9

			78		• · · · · • ···· · · · • · · · ·· · · ··	9 9 · 9 9 9 9 9
TGCAAATATT	TGGACAAGGA	GAGGGTTTTA	AGATGCCATG	AAATGATTCA	AGAGAAGATT	1200
ACTGCGGGAA	GCATTGTCCT	AAAGTCTGCT	GGATCATCAA	TCTCCTCTGT	GCCACAAAGC	1260
CCAATAGGTG	TCCTGGACGC	TGCAGCCTGT	CTGAGTCAAC	AAAGCGATGA	CGCTACTGTC	1320
gggtctcCtg	CAGTATGTTA	CCATAGTTCT	TCCACAAGCA	A GAG GAGAA G	GATCACTAGA	1380
CGTCTACTCT	AATTGTGGTA	CGCTTCAGGT	GTGCTCCTCA	CCGCTCTAGG	AGTTTTTGAT	1440
TGGTTCAAAC	ATCTTAAATT	TAGTTTGGCC	GCTGGAGGAT	TATGGTTTAG	TCAAGTAGTT	1500
GCTGAATGGA	CAACAAAACA	CGCACACTAC	TTGGTCCATA	AAGACAAGAA	AATAACTGGC	1560
AGCGTCCCGC	GAGCCAGCGC	TGCAATCCAG	TTCATGCAAG	ACCCTAGAGT	CCAGGGGGGG	1620
TGCTGGTGTA	GGTAGAGAGG	GAACAAGGCA	TTCACATACG	CCGTAGAGAT	GAGAGAGCCT	1680
CTCGTATGTT	TTGTACTTTT	GCTCCTTCAG	TTTGCAATGA	ACTATATAAA	CAAGGATTGC	1740
CTTGGGGCAG	TGAACATTTG	TCGGATGAAA	AGAATCAAAA	AGGATGGGGG	TGGGCAGAGG	1800
AATAGAACAA	TTTGATATAT	TTCCATAAAC	TAAAAAAAAA	AAAAAA		1846

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY
2. 2.
3. 3.
4. 4 .
5. 5.

   a)

   b)

   c)
6. 6.

   2.

   3.

   4 .

   5.

   a)

   b)

   c)

   6.

   Způsob získání rostliny vykazující změněné růstové charakteristiky nebo změněnou architekturu, vyznačující se tím, že zahrnuje krok upravující množství a funkční množství proteinu řídícího dělení rostlinných buněk, přičemž protein řídící dělení buněk je schopen vázat nebo fosforylovat protein podobný Rb.

   Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e uvedený protein řídící dělení buněk obsahuje ve své Nterminální části vazebný motiv proteinu podobného Rb.

   Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, ž e uvedený vazebný motiv proteinu podobného Rb je LxCxE. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e uvedený protein řídící dělení buněk je cyklin typu D. Postup podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že uvedené množství nebo funkční množství uvedeného proteinu řídícího dělení buněk se upravilo tak, že v uvedených buňkách uvedené rostliny se exprimuje chimerový gen obsahující následné operativně spojené fragmenty DNA:

   oblast promotoru exprimovatelnou v rostlině, přepisovanou oblast DNA kódující RNA nebo protein, který v případě, že se exprimuje buď zvyšuje nebo snižuje uvedené množství nebo funkční množství uvedeného proteinu řídícího dělení buněk a formaci 3'-konce a polyadenylační signál funkční v rostlinných buňkách.

   Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená přepisovaná oblast DNA kóduje antimediátorovou RNA, ribozym nebo pozitivní (sense) řetězec RNA, která v případě, že se exprimuje snižuje, inhibuje nebo předchází expresi proteinu řídícího dělení buněk.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e uvedené přepisovaná oblast DNA kóduje antimediátorovou RNA, která v případě, že se exprimuje, snižuje, inhibuje nebo předchází expresi endogenního cyklinu typu D.
8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že uvedená přepisovaná oblast DNA kóduje protein řídící dělení buněk schopný vázat nebo fosforylovat protein podobný Rb.
9. 9. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e uvedená přepisovaná oblast DNA kóduje protein řídící dělení buněk obsahující vazebný motiv proteinu podobného Rb.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, ž e uvedený vazebný motiv je LxCxE.
11. 11. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e uvedená přepisovaná oblast DNA kóduje cyklin typu D.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e uvedený cyklin typu D pochází z rostlin.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e uvedený cyklin typu D se vybral ze skupiny zahrnující Arabidopsis thaliana CYCD1, Arabidopsis thalina CYCD2, Arabidopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotíana tabacum CYCD2;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuberosus CYCD3.
14. 14. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, ž e uvedená přepisovaná oblast DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83369 z polohy nukleotidu 104 do polohy nukleotidu 1108, nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83370 z polohy nukleotidu 195 do polohy nukleotidu 1346, nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83371 z polohy nukleotidu ·· *·

    266 do polohy nukleotidu 1396, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 z polohy nukleotidu 182 do polohy nukleotidu 1243, nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 2 z polohy nukleotidu 181 do polohy nukleotidu 1299, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 z polohy nukleotidu 198 do polohy nukleotidu 1298, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 4 z polohy nukleotidu 165 do polohy nukleotidu 1109, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 5 z polohy nukleotidu 48 do polohy nukleotidu 1118 nebo nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 21 z polohy nukleotidu 316 do polohy nukleotidu 1389.
15. 15. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e uvedená přepisovaná oblast DNA kóduje protein nebo peptid, který v případě, že se exprimuje zvyšuje uvedené funkční množství uvedeného proteinu řídící dělení buněk.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e uvedená přepisovaná oblast DNA kóduje protein nebo peptid vybraný ze skupiny zahrnující mutantní cyklin typu D, část cyklinů typu D, cyklin typu D, který vykazuje mutaci v cyklinovém boxu, cyklin typu D2, který vykazuje substituci aminokyseliny 185 nebo aminokyseliny 155, cyklin typu D2, který vykazuje mutaci E185A nebo K155A, cyklin typu D, kde se odstranila sekvence PĚST, cyklin typu D, kde se zaměnil nebo odstranil vazebný motiv LxCxE nebo cyklin typu D, kde se odstranil C-zbytek vazebného motivu LxCxE.
17. 17. Způsob podle libovolného z nároků 5 až 16, vyznačující se tím, že uvedená oblast promotoru exprimovatelná v rostlině je oblast promotoru CaMV35S.
18. 18. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že uvedenou upravenou charakteristikou růstu je snížená rychlost růstu.
19. 19. Způsob podle nároku 8 až 17, vyznačující se tím, že uvedenou upravenou charakteristikou růstu je zvýšená rychlost růstu.

    * ·

    Způsob podle nároku 8 až 17, vyznačující se tím, že uvedenou upravenou charakteristikou růstu je rychlejší klíčení.

    Způsob podle nároku 8 až 17, vyznačující se tím, že uvedenou upravenou charakteristikou růstu je snížení času nutného k vykvetení.

    Způsob podle nároku 8 až 17, vyznačující se tím, že uvedená upravená stavba zahrnuje zvýšený počet květů na jedné rostlině nebo zvýšený počet semen u jedné rostliny nebo zvýšený počet plodů u jedné rosltiny. Chimerový gen podle popisu v libovolném z nároků 5 až 17. Rostlinná buňka, vyznačující se tím, že obsahuje chimerové geny podle nároku 23.

    Rostlina, vyznačující se tím, že v podstatě zahrnuje rosltinné buňky podle nároku 24. Rostlina podle nároku 25, která roste ve skleníku.

    Rostlina podle nároku 23, která se vybrala ze skupiny zahrnující borovici, topol, strom Eucalyptus, vojtěška, luštěniny, traviny, kukuřici, řepku olejnou, semena lnu, pšenice, zelenina rodu brassica, rajčata, salát, rýže, ječmen, brambory, tabák, cukrová řepa, slunečnice, karafiát, chryzantéma, růže nebo tulipán.

    Semeno rostliny podle libovolného z nároků 25 až 27, vyznačující se tím, že obsahuje chimerové geny podle nároku 23.

    Izolovaný fragment DNA, vyznač u j ící s e tím, ž e obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 od polohy nukleotidu 182 až 1243. Izolovaný fragment DNA, vyznač u j ící s e tím, ž e obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od polohy nukleotidu 181 až 1299. Izolovaný fragment DNA, vyznač u j ící s e tím, ž e obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 od polohy

    nukleotidu 198 až 1298.

    —f »»»»»»--· 2 Λ. Λ. Λ « · ♦·· ·♦♦· » ·· ·♦♦· ·· ··

    32.Izolovaný fragment DNA, vyznačující se tím, ž e obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 4 od polohy nukleotidu 165 až 1109.

    33.Izolovaný fragment DNA, vyznačující se tím, ž e obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 5 od polohy nukleotidu 48 až 1118.

    34.Izolovaný fragment DNA, vyznačující se tím, ž e obsahuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 21 od polohy nukleotidu 316 až 1389.

    35. Použití proteinu řídícího dělení buněk, který je schopný vázat kapsovou doménu proteinu podobného Rb nebo je schopný fosforylovat protein Rb, přičemž dochází ke změně růstových charakteristik nebo stavby rostliny.

    36. Použití podle nároku 35, kde protein řídící dělení buněk obsahuje ve své N-terminální části vazebný motiv LxCxE.

    37. Použití podle nároku 36, kde protein řídící dělení buněk je cyklin typu D.

    38. Použití podle nároku 37, kde proteinem řídícím dělení buněk je cyklin typu D vybraný ze skupiny zahrnující Arabidopsis thaliana CYCD1, Arabidopsis thalina CYCD2, Arabisopsis thaliana CYCD3, Nicotiana tabacum CYCD3;1, Nicotiana tabacum CYCD2;1, Nicotiana tabacum CYCD3;2, Helianthus tuberosus CYCD1;1, Zea mays CYCD2 a Helianthus tuberosus CYCD3.

    39. Použití podle libovolného z nároků 34 až 37, kde protein řídící dělení buněk je kódován chimerovým genem začleněným v genomu rostlinných buněk.

    40. Použití DNA, která kóduje protein řídící dělení buněk schopný vázat se nebo fosforylovat protein podobný Rb, přičemž se mění růstové charakteristiky nebo stavba rostliny.

    41. Použití podle nároku 40, kde protein řídící dělení buněk je cyklin typu D.

    »· ··

    0 0 0 · • · · *

    0 · · ·

    0 0 0 ·

    00 ·· ··

    42.Použití podle nároku 41, kde uvedená DNA obsahuje nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83369 z polohy nukleotidu 104 do polohy nukleotidu 1108, nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83370 z polohy nukleotidu 195 do polohy nukleotidu 1346, nukleotidovou sekvenci EMBL č. X83371 z polohy nukleotidu 266 do polohy nukleotidu 1396, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 z polohy nukleotidu 182 do polohy nukleotidu 1243, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 2 z polohy nukleotidu 181 do polohy nukleotidu 1299, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 z polohy nukleotidu 198 do polohy nukleotidu 1298, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 4 z polohy nukleotidu 165 do polohy nukleotidu 1109, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 5 z polohy nukleotidu 48 do polohy nukleotidu 1118 nebo nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 21 z polohy nukleotidu 316 do polohy nukleotidu

    1389.