KR101028113B1

KR101028113B1 - 생장 증진, 내염성 및 노화 조절에 관여하는 고추의 ＣａＨＢ1 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101028113B1
Application number: KR1020090009443A
Authority: KR
Inventors: 최도일; 윤준선; 오상근
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-02-05
Filing date: 2009-02-05
Publication date: 2011-04-08
Also published as: KR20100090135A

Abstract

본 발명은 고추 유래의 호메오박스 1(Capsicum annuum homeobox 1; CaHB1) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 벡터를 이용한 식물의 생장 및 내염성을 증가시키는 방법 및 노화를 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, CaHB1 유전자를 통하여 생장 및 내염성이 증가된 식물체의 개발 및 노화 기작을 밝힐 수 있을 것으로 기대된다.

고추, CaHB1, 생장증진, 내염성, 노화조절

Description

생장 증진, 내염성 및 노화 조절에 관여하는 고추의 ＣａＨＢ1 유전자 및 그의 용도{CaHB1 gene involved in growth enhancement, salt tolerance and senescence regulation of Capsicum annuum and uses thereof}

본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래의 호메오박스 1 유전자(CaHB1) 및 그 특성에 관한 것이다.

식물은 농작물로서 재배되어 왔다. 환경 조건은 지속적으로 변화하며, 생물체에 영향을 미치므로, 육종가는 수확량 증가를 위하여 생물체가 스트레스에 대항하여 생존하는 능력을 향상시키기에 집중하여 왔다. 환경 요인들 중에, 염분 스트레스, 가뭄, 냉해, 및 병원균 공격은 식물 생존 및 작물 생산성에 불리하게 작용한다. 이런 문제들을 극복하기 위하여, 스트레스 내성에 영향을 미치는 유전형질을 밝혀내어 스트레스 내성 식물의 개발을 위한 육종에 사용되어 왔다. 지난 수십 년 동안에, 식물이 스트레스에 적응하는 분자적 기작이 밝혀져, 스트레스에 대한 내성이 향상된 형질전환 식물의 개발에 사용되어 왔다.

한국특허공개 제2003-0010744호에는 식물 리파제 인코딩 디엔에이, 형질전환 식물 및 식물내의 노화 조절방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0499272호에 는 식물의 노화 활성을 갖는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0877730호에는 단자엽 식물의 노화 및 세포사멸에 관여하는 PBZ1 단백질이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0871591호에는 생장이 촉진된 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1) 형질전환 식물체 및 고추 씨에이피엘에이원 (CaPLA1)유전자가 개시되어 있으나, 본 발명의 유전자와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 고추 식물체의 발달과정 및 여러 스트레스 조건 하에서 CaHB1 유전자의 발현양상을 관찰하며, 이 유전자를 클로닝하고 형질전환 벡터를 제작하여, 과발현체에서 이 유전자의 발현양상을 분석하여 유전자의 역할을 알아보고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물체의 발달 중에 및 스트레스 하에서 차별적으로 발현되는 고추 유래의 CaHB1 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, CaHB1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, CaHB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터를 이용한 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터를 이용한 식물의 생장 및 내염성을 증가시키는 방법 및 노화를 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 고추 유래 CaHB1 단백질 및 유전자는 가뭄 및 염에 의해 발현이 강하게 증가되고, 건조 스트레스에 관련되는 에테폰, 살리실산 등의 식물 호르몬에 의해 발현이 강하게 유도되는 것을 확인하였다. 또한, CaHB1의 과발현체는 생장이 증진되고 노화가 촉진되며, 강한 내염성이 있는 것을 확인하였다.

따라서, CaHB1 유전자를 통하여 생장이 증진된 식물체뿐만 아니라 가뭄 및 염 스트레스에 내성이 강한 식물체를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

또한 본 발명에 따른 단백질은 식물의 노화 활성을 가지므로, 상기 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 식물의 노화 조절 물질을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 식물의 노화 조절 유전자 또는 단백질을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추(Capsicum annuum) 유래의 CaHB1(Capsicum annuum homeobox 1) 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 CaHB1 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명은 상기 CaHB1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 CaHB1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하 게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, CaHB1 유전자는 multigene 패밀리로서 고추 내에 상동성(homologous) 유전자들이 많이 존재하는데, 본 발명의 CaHB1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 CaHB1 유전자뿐만 아니라, CaHB1 유전자의 multigene 패밀리도 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 CaHB1 cDNA 유전자의 전체 길이는 819 bp의 cDNA가 272 아미노산을 코딩하고 있다. 유전자를 데이터베이스에서 블라스트한 결과, HD-Zip class II 유전자들과 유사성을 가지며 다른 HD-Zip class II 단백질에서 잘 보존되어있는 HD-Zip 도메인과 CPSCE 모티프를 가지고 있다.

본 발명의 CaHB1 유전자는 식물체의 줄기 및 잎에서 강하게 발현되는 양상을 보였다 (도 2 참고). 상기 유전자는 가뭄, 염분, 만니톨, 에테폰, 또는 살리실산에 의해 발현이 증가하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 CaHB1 유전자는 에테폰 또는 살리실산 등의 식물 호르몬에 의해 발현이 강하게 유도될 수 있다. 본 발명의 CaHB1 유전자는 에테폰을 처리했을 때 1시간 후에 발현이 유도되어 3시간 후까지 지속되다가 6시간 후에 약해지는 것을 보여주었다. 살리실산을 처리한 경우에는 6시간 후에 발현이 유도되어 9시간 후까지 지속되다가 24시간 후에 약해지는 것을 보여주었다 (도 4 참고).

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CaHB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있 는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 CaHB1을 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전 사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 식물 발현 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 본 발명에 따른 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 토마토이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및/또는 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al.(1982) Nature 296:72-74; Negrutiu et al.(1987) Pl Mol Biol 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al.(1985) Bio/Technol 3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.(1986) Mol Gen Genet 202:179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.(1987) Nature 327:70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 유전자가 도입된 재조합 벡터로 식물 세포 를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물체를 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 CaHB1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 생장을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 CaHB1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 내염성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 CaHB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물 노화를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, CaHB1 유전자의 발현을 억제하여 식물 노화를 지연시킬 수 있다.

상기 방법에 이용되는 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 토마토이다.

CaHB1이 과발현된 토마토 재배품종 '마이크로톰'(Solanum lycopersicon cv. 'MicroTom') 형질전환체는 염분 스트레스에 대한 내성이 증가하였으며 노화가 촉진되었다. CaHB1이 일시적으로 과발현된 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물체는 병원균-유도된 세포사멸이 촉진되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

토마토(Solanum lycopersicon cv. MicroTom) 종자는 1%(v/v) NaOCl로 25 ℃에서 10　분간 표면 살균되어, 멸균된 증류수로 5　분간 3 회 수세되었다. 종자를 MS 아가 배지 상에서 발아시켜, 형질전환에 사용하기 전에 식물 배양실에서 16 시간 광주기로 25 ℃에서 2 주간 키웠다.

고추 식물체(재배품종 부강) 및 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물체는 각각 화분 및 배양실에서 16 시간 광주기로 25 ℃에서 5-7 주간 키웠다.

2. 일시적인 과발현(TOE)

TOE를 위하여, 5 내지 7 주된 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물체가 사용되었다. 아그로박테리움 투머파시엔스 균주 GV2260(Agrobacterium tumefaciens strain GV2260)이 동결형질전환방법(Freeze thaw method)으로 형질전환되었다. pMBP-1 또는 pMBP-1:CaHB1를 포함하는 아그로박테리움 투머파시엔스가 카나마이신 50 ㎍/ml 및 리팜피신 50 ㎍/ml을 함유하는 YEP 배지 5 ml를 포함하는 시험관에서 30℃에서, 200 rpm으로 밤새 배양되었다. 배양 후 수확된 세포는 10 mM MgCl₂에 재현탁되어, 20℃에서 3-5 시간 동안 진탕하면서 200 μM 아세토시링곤에 노출되었다. 유도된 아그로박테리움 현탁액이 바늘 없는 주사기로 니코티아나 벤타미아나 식물체의 잎에 접종되었다.

3. 현미경 분석

한 달된 대조구 또는 CaHB1-형질전환 식물체의 잎이 광학현미경 및 투과전자현미경(TEM)으로 관찰되었다.

4. 화학적 처리 및 병원균 접종

5 mM 살리실산(SA), 5 mM 에테폰, 100 μM 메틸 자스모네이트(MJ), 또는 100 μM 앱시스산(ABA) 각각의 처리 후 CaHB1 전사체의 발현양상을 보기 위하여, 고추 식물체의 잎에 해당 물질을 분무하였다.

고추 및 니코티아나 벤타미아나에 병원균 접종을 위하여, 잔토모나스 악소노포디스 pv. 글라이신즈(Xanthomonas axonopodis pv. Glycines: Xag) 8ra 또는 8-13 의 배양액이 바늘 없는 주사기로 식물체의 잎에 접종되었다.

5. CaHB1 단백질의 세포 내 위치

아라비돕시스(Arabidopsis) 원형질체에서 CaHB1의 발현을 보기 위하여 콜리플라워 모자익 바이러스(CaMV) 35S 프로모터 통제 하의 CaHB1-mGFP 구축물이 제조되었다. 융합 구축물이 폴리에틸렌 글리콜-매개된 형질전환 방법으로 아라비돕시스 어린 잎의 원형질체로 도입되었다. 융합 구축물의 발현은 형질전환 40 시간 후에 Zeiss Axioplan 형광현미경(Jena, Germany)으로 관찰되어, 이미지는 냉각장치가 부착된 CCD 카메라로 포착되었다.

6. 겔 블럿 분석

총 RNA는 제조사의 설명서에 따라 TRIzol

시약(Gibco-BRL, http://www. invitrogen.com/)을 사용하여 추출되었다. 고추 식물체의 총 RNA 20　㎍이 1% 포름알데하이드 아가로즈 겔 상에서 분리되었다. 겔은 나일론 멤브레인으로 블럿되어 ³²P로 표지된 cDNA 프로브와 혼성화되었다. RNA 로딩의 양은 겔 상의 rRNA를 에티듐 브로마이드로 염색하여 증명하였다.

7. 역전사 - 중합효소연쇄반응 ( RT - PCR ) 분석

총 RNA 1 ㎍을 MMLV 역전사효소, dNTPs, 반응 완충액, 및 올리고(dT) 프라이 머를 함유하는 RT master premix(ELPIS, Korea)와 혼합하였다. 제1가닥 cDNA가 제조사의 프로토콜에 따라 합성되었다. RT-PCR은 유전자 특이적 프라이머로 수행되었다.

실시예 1.

고추에서 병저항성 반응 동안 발현이 조절되는 유전자를 microarray 실험을 통해 발굴하였다 (Lee et al.(2004) Functional & Integrative Genomics 4:196-205). 발굴된 유전자들 중 전사조절 인자만을 선택하여 기능이 밝혀지지 않은 유전자를 선별하였다. 그 중 homeodomain-leucinezipper (CaHB1) 유전자의 기능을 밝히고자 하였으며, 전장 유전자를 EST로부터 얻을 수 있었다.

CaHB1 및 아라비돕시스(Arabidopsis), 벼, 및 크라테로스티그마 플란타지네움(Craterostigma plantagineum)으로부터 분리된 CaHB1의 오소로그 간 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, CaHB1는 HD-Zip 도메인과 CPSCE 모티프 부위에서 다른 HD-Zip class II 유전자들과 유사성을 가지며, 애기장대의 HAT22, HAT9, 크라테로스티그마 플란타지네움의 유전자(CAA06728)와 유사성이 있다는 것을 알 수 있다(도 1).

실시예 2.

다양한 조직 및 노화과정 중의 유전자 발현을 확인하여 CaHB1이 어떤 조직 또는 발달과정에서 작용하는지를 확인한 결과, CaHB1은 줄기와 꽃에서 상대적으로 많이 발현되고(도 2의 (a)), 특이적으로 노화가 진행됨에 따라 발현이 많이 증가되 는 것이 확인되었다(도 2의 (b)).

실시예 3.

고추 식물체가 병원균 및 다양한 스트레스를 받았을 때 CaHB1의 발현을 확인하여, 유전자의 기능을 유추하였다. Xag 8ra 및 Xag 8-13을 접종하였을 때 발현이 감소하는 것을 볼 수 있었고(도 3의 (a)), 상처, 추위, 열에는 발현이 증감하지 않았지만, 가뭄과 염 스트레스에 의해서는 발현이 증가하였다(도 3의 (b)). 만니톨 및 NaCl을 처리하여 시간대 별로 확인하였을 때 발현이 확연히 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 3의 (c)).

실시예 4.

CaHB1의 발현은 스트레스에 의해 조절되고, 이런 스트레스에 의한 발현은 호르몬과 직접적으로 연관되어 있다는 것이 보편적으로 알려진 사실이므로, 식물체에 여러 스트레스 관련 호르몬을 처리하여 CaHB1의 발현 정도를 확인하였다. SA 및 에테폰에 의해 발현이 증가하였고, MJ 및 ABA에 의해서는 발현이 조절되지 않음을 확인하였다(도 4).

실시예 5.

CaHB1이 HD-Zip 패밀리에 속하는 전사인자임이 공지서열 간의 유사성 분석으로 확인되었으므로, CaHB1의 C-말단 쪽에 GFP를 태깅하여(도 5의 (a)) CaHB1 단백 질의 세포 내 위치를 확인한 결과 세포의 핵인 것을 볼 수 있었다. 대조구의 GFP는 세포질에 고르게 분포하였다(도 5의 (b)).

실시예 6.

CaHB1의 기능을 알기 위하여 형질전환이 가능한 토마토 재배품종 마이크로톰 식물체에 CaHB1을 과발현시켰다. 성체로 자랐을 때, CaHB1 과발현 식물체가 대조구 보다 생장이 증진된 것을 확인할 수 있었다. 이 같은 생장의 증진이 세포의 크기나 개수에 의한 것인지 확인하기 위하여, 잎의 절단면을 관찰하였을 때 책상조직이나 해면조직 세포가 대조구 보다 더 커져 있는 것을 확인하였다. 또한 세포벽도 상대적으로 두꺼워진 것을 볼 수 있었다(도 6).

실시예 7.

CaHB1의 전사가 가뭄이나 염 스트레스에 의하여 증가하였으므로, 식물체가 이러한 스트레스를 받았을 때 CaHB1가 어떠한 기능을 할 것으로 예측되었다. CaHB1이 과발현된 토마토 재배품종 '마이크로톰' 식물체를 이용하여 실제로 CaHB1이 그러한 기능을 하는지 확인하고자 실험을 수행하였다. 0.5 M 또는 1M NaCl 용액에 띄운 잎디스크에서 대조구에서는 3일 후 엽록소가 거의 빠져나갔지만, CaHB1의 과발현체에서는 상대적으로 적은 양의 엽록소가 빠져나간 것을 확인할 수 있었다. 이는 CaHB1 과발현 식물체의 세포가 염에 대한 내성을 가지는 것을 의미한다(도 7).

실시예 8.

CaHB1이 노화과정 중에 발현이 급격히 증가하였으므로, 노화에 관련하여 어떤 기능할 것이라 추정하였다. 실제로 CaHB1이 과발현된 토마토 재배품종 '마이크로톰' 식물체는 대조구 식물체와 비교하여 노화가 상대적으로 빨리 진행되는 것을 확인할 수 있었다(도 8). 이로 볼 때, CaHB1은 노화를 촉진시키는 방향으로 작용하는 것을 알 수 있다.

실시예 9.

CaHB1의 발현이 Xag 8ra와 같은 병원균의 침입에 의해 감소(실시예 3)하는 것으로 보아, CaHB1이 병원균의 침입에 반응할 것으로 생각되었다. CaHB1을 니코티아나 벤타미아나의 잎에 일시적으로 과발현시킨 후 Xag 8ra를 접종한 결과 CaHB1이 과발현된 부분에서는 세포사멸이 빠르게 진행되는 반면, 대조구에서는 이러한 반응이 나타나지 않았다(도 9의 (a)). 이러한 세포 사멸과정은 활성산소종(reactive oxygen species)과 밀접하게 연관되어 있으므로 DAB 염색으로 과산화수소의 축적을 확인한 결과 CaHB1을 과발현시켜 Xag 8ra를 접종한 곳에서는 상당량의 과산화수소가 축적된 반면, 대조구에서는 그렇치 않았다(도 9의 (b)). 이로써, 식물체가 병원균의 침입을 받았을 때 CaHB1이 세포의 사멸 과정 조절에 관여한다는 것을 알 수 있다.

도 1은 CaHB1 단백질의 아미노산 서열의 정렬 및 계통수이다. (a)는 CaHB1 및 아라비돕시스(Arabidopsis), 벼, 및 크라테로스티그마 플란타지네움(Craterostigma plantagineum)으로부터 분리된 CaHB1의 오소로그 간 아미노산 서열을 비교한 것으로, 서열 위의 막대는 HD 및 Zip 도메인을 나타낸다. 보존된 CPSCE 모티프는 적색 박스로 표시되었다. (b)는 CaHB1 및 아라비돕시스 및 크라테로스티그마 플란타지네움의 서브패밀리 II HD-Zip 패밀리 유전자의 계통수이다. HAT1, HAT2, HAT3, HAT9, HAT14, HAT22, ATHB2, ATHB4, 및 ATHB17는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터, CAA06728는 크라테로스티그마 플란타지네움으로부터 분리된 것이다.

도 2는 여러 조직 및 노화 중에 CaHB1 전사체의 발현을 보여주는 것이다. (a)는 잎, 줄기, 뿌리, 및 꽃에서 CaHB1의 발현패턴을 보여주는 것이다. (b)는 노화 중에 CaHB1의 발현을 보여주는 것이다. 고추 식물체(재배품종 부강)의 잎에서 CaHB1의 전사물 양이 RT-PCR로 결정되었다. YL는 어린 잎, NS는 완전히 펼쳐진 노화되지 않은 잎, ES는 노화 초기의 잎, LS는 노화 후기의 잎이다.

도 3은 병원균 및 비생물적 스트레스에 반응한 CaHB1의 발현패턴을 보여주는 것이다. (a)의 고추 잎은 Xag 8ra 또는 Xag 8-13로 접종되었다. (b)의 고추 잎은 상해, 냉해, 가뭄, 열, 또는 염으로 처리되었다. (c)의 고추 잎은 400 mM 만니톨 또는 NaCl로 처리되었다.

도 4는 식물 호르몬에 반응한 CaHB1 mRNA의 발현패턴을 보여주는 것이다. 고 추 잎에 SA, 에테폰, MJ, 및 ABA를 포함한 식물 호르몬의 처리 후 CaHB1의 발현이 모니터되었다. CaPR1a, CaACO, CaPinII, 또는 CaDhn 유전자가 각각 양성 유전자 마커로 사용되었다. 대조 용액으로서, 물 또는 0.1% 에탄올이 처리되었다.

도 5는 핵 내 CaHB1의 위치를 보여준다. (a)는 mGFP-융합된 CaHB1 단백질의 발현을 위해 구축된 벡터이다. mGFP가 CaHB1의 C-말단 구간에 융합되어, CaMV 35S 프로모터에 의해 구성적으로 발현된다. (b)는 핵 내 CaHB1-mGFP 단백질의 위치를 나타내는 것으로, 녹색 형광은 mGFP가 축적되었음을 나타낸다. 핵은 DAPI로 염색되었다.

도 6은 CaHB1이 과발현된 토마토 재배품종 '마이크로톰' 식물을 보여준다. 대조구 식물과 비교된 형질전환 라인의 증진된 생장(첫 번째 및 두 번째 라인), 소엽(세 번째 라인)의 횡단면, 및 세포벽의 TEM 이미지(네 번째 라인)를 보여준다.

도 7은 염분 스트레스에 대한 CaHB1 과발현체의 증가된 내성을 보여준다. 잎 디스크를 0.5 M 또는 1 M NaCl 용액에 띄워, 3 일 후 촬영되었다. #13, #14, 및 #18은 형질전환된 토마토 재배품종 '마이크로톰' 식물체의 라인을 나타낸다.

도 8은 CaHB1의 과발현이 가속화된 노화를 촉진함을 보여준다. 대조구 식물체에 비하여 CaHB1을 과발현하는 형질전환된 토마토 재배품종 '마이크로톰' 식물체는 가속화된 노화를 보여준다.

도 9는 CaHB1의 일시적인 과발현에 의한 병원균-유도된 세포사멸의 증진을 보여준다. (a)는 CaHB1의 TOE에 의한 병원균-유도된 세포사멸이 촉진됨을 보여준다. 니코티아나 벤타미아나의 잎에 Xag 8ra의 접종으로 세포사멸이 유도되었다. 흰 점선의 원은 DAB 염색에 사용된 잎 디스크를 나타낸다. 사진은 병원균 접종 후 3 일 후 촬영되었다. (b) 과산화수소가 축적되었음이 DAB 염색으로 보여진다. 병원균-접종된 또는 비처리된 구역의 잎 디스크를 조사하였다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> CaHB1 gene involved in growth enhancement, salt tolerance and senescence regulation of Capsicum annuum and uses thereof <130> PN08266 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 819 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 atgggttttg atgatatttg caacactggc ctggttctag gattaggctt ttcctcaaca 60 accgatcaaa aatcaacaaa aataacacca ctagcaagca aaggaccagc atctcttacg 120 tttgaacctt cactaactct aagcctaatt tctggtgatc gtacctatga gcaacaagct 180 acaaagaagg ttaacgttac gaagccatcg aacgatcatc aatcggctga tttgtacaga 240 caagatagtg ctgcttcttc ctattcaaat gctagtgtga aaagggagag agatgttggt 300 agtgaagaga caactacaga ggtagaaaga gtttcctcca gagttattag cgatgaagat 360 gatgatggct ctaacgctag gaagaaactt aggctcacta aagcacaatc cgccctttta 420 gaggaaagct tcaagctaca cagcactctc aatcctaagc aaaaacagga tttagccatg 480 gaacttagtc taaggcctcg ccaagttgaa gtttggttcc agaacagaag agccagaaca 540 aagctgaagc aaacagaggt agactgtgaa ttcctgaaaa aatgctgtga gacactgaca 600 gaagaaaaca ggaggcttca caaagagcta caagaactaa aggcactaaa aatagcacaa 660 cctttgtaca tgcaattgcc ggcggcaacc ttaactatgt gtccttcatg cgaaaggatc 720 ggcggcggtg tcggagaaaa tccatcgaaa aatcctttta ctattgctca gaagcctcac 780 ttctacagtc catttaataa tccatcagca gcttgttaa 819 <210> 2 <211> 272 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 2 Met Gly Phe Asp Asp Ile Cys Asn Thr Gly Leu Val Leu Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Ser Ser Thr Thr Asp Gln Lys Ser Thr Lys Ile Thr Pro Leu Ala 20 25 30 Ser Lys Gly Pro Ala Ser Leu Thr Phe Glu Pro Ser Leu Thr Leu Ser 35 40 45 Leu Ile Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Glu Gln Gln Ala Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Val Thr Lys Pro Ser Asn Asp His Gln Ser Ala Asp Leu Tyr Arg 65 70 75 80 Gln Asp Ser Ala Ala Ser Ser Tyr Ser Asn Ala Ser Val Lys Arg Glu 85 90 95 Arg Asp Val Gly Ser Glu Glu Thr Thr Thr Glu Val Glu Arg Val Ser 100 105 110 Ser Arg Val Ile Ser Asp Glu Asp Asp Asp Gly Ser Asn Ala Arg Lys 115 120 125 Lys Leu Arg Leu Thr Lys Ala Gln Ser Ala Leu Leu Glu Glu Ser Phe 130 135 140 Lys Leu His Ser Thr Leu Asn Pro Lys Gln Lys Gln Asp Leu Ala Met 145 150 155 160 Glu Leu Ser Leu Arg Pro Arg Gln Val Glu Val Trp Phe Gln Asn Arg 165 170 175 Arg Ala Arg Thr Lys Leu Lys Gln Thr Glu Val Asp Cys Glu Phe Leu 180 185 190 Lys Lys Cys Cys Glu Thr Leu Thr Glu Glu Asn Arg Arg Leu His Lys 195 200 205 Glu Leu Gln Glu Leu Lys Ala Leu Lys Ile Ala Gln Pro Leu Tyr Met 210 215 220 Gln Leu Pro Ala Ala Thr Leu Thr Met Cys Pro Ser Cys Glu Arg Ile 225 230 235 240 Gly Gly Gly Val Gly Glu Asn Pro Ser Lys Asn Pro Phe Thr Ile Ala 245 250 255 Gln Lys Pro His Phe Tyr Ser Pro Phe Asn Asn Pro Ser Ala Ala Cys 260 265 270

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 고추(Capsicum annuum) 유래의 CaHB1 단백질.
제1항의 CaHB1 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 가뭄, 염분, 만니톨, 에테폰, 또는 살리실산에 의해 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터.
제5항에 따른 벡터로 형질전환된 식물체.
제5항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조 방법.
제5항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 CaHB1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 생장을 증가시키는 방법.
제5항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 CaHB1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물 내염성을 증가시키는 방법.
제5항에 따른 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 CaHB1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물 노화를 조절하는 방법.
제10항에 있어서, CaHB1 유전자의 발현을 억제하여 식물 노화를 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.