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KR20080052570A - 야생형 ｋｒｐ에 의한 활성 사이클린-ｃｄｋ 복합체 억제의우성 음성 돌연변이 ｋｒｐ 단백질 보호 - Google Patents

야생형 ｋｒｐ에 의한 활성 사이클린-ｃｄｋ 복합체 억제의우성 음성 돌연변이 ｋｒｐ 단백질 보호 Download PDF

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KR20080052570A
KR20080052570A KR1020087005208A KR20087005208A KR20080052570A KR 20080052570 A KR20080052570 A KR 20080052570A KR 1020087005208 A KR1020087005208 A KR 1020087005208A KR 20087005208 A KR20087005208 A KR 20087005208A KR 20080052570 A KR20080052570 A KR 20080052570A
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KR
South Korea
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amino acid
polypeptide
mutant
plant
cki
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KR1020087005208A
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Inventor
폴 올리비어
제이 디로처
Original Assignee
타게티드 그로스 인코퍼레이티드
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Abstract

야생형 CKI 단백질에 대해 우성 음성 길항제 활성을 갖는 돌연변이 CDK 억제제(CKI) 폴리펩티드 뿐만 아니라, 관련된 조성물, 예를 들면 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및 벡터, 및 이러한 핵산 및 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포 및 유전자전이 식물이 공개된다. 또한, 돌연변이 단백질을 사용하여 세포, 특히 식물 세포에서 세포 분열을 조절하는 관련된 방법이 공개된다.
CDK, CKI, KRP, BnKRP1

Description

야생형 ＫＲＰ에 의한 활성 사이클린-ＣＤＫ 복합체 억제의 우성 음성 돌연변이 ＫＲＰ 단백질 보호{Dominant negative mutant KRP protein protection of active cyclin-CDK complex inhibition by wild-type KRP}
관련 출원
본 출원은 전문이 본원에 참조로서 인용된 2005년 7월 29일자 미국 특허원 제60/703,999호에 대해 우선권을 주장한다.
식물은 진핵생물과 동일한 기본적인 세포 주기를 갖는다. 놀랍지 않게도, 식물은 또한 세포 주기의 상이한 단계 간의 이행을 조절하는 사이클린 의존성 키나제(CDK)라고 하는 진핵생물 키나제를 공통적으로 갖고 있다. 세포 주기를 연구하는데 사용되는 모델 식물 시스템인 아라비돕시스(Arabidopsis)는 다수의 CDK 하위 그룹을 갖고 있다. CDKA는 포유동물의 cdc2(CDK1)와 가장 유사하고, 이의 사이클린 파트너와의 상호작용을 매개하는 영역 내에 고도로 보존된 Pro Ser Thr Ala Ile Arg Glu(PSTAIRE) 아미노산 서열(서열번호 1)을 함유한다. 아라비돕시스는 또한 고등 동물에서는 보존되어 있지 않은 CDKB라고 하는 식물-특이적인 CDK 그룹을 갖고 있다. 하지만, 식물은 G1 CDK(CDK4 및 CDK6)에 대한 포유동물 대응물이 없다. CDKA는 G1 CDK(식물 D형 사이클린에 의해 활성화됨)인 것으로 제안되었고, 반면에 CDKB는 S-단계 및 이후에 우세하게 발현되는 것으로 증명되어 이로 인해 G2/M 특이적 CDK인 것으로 확인되었다.
이러한 CDK의 활성화/비활성화는 세포에서 세포 주기를 진행시키고, 또한 세포가 언제 세포 주기를 빠져나와야 하는지 지시한다. 아라비돕시스는 10개의 하위계열로 분류되는 최대 49개의 사이클린을 함유한다[참조: Wang et al., Plant Physiol. 135:1084-1099, 2004]. 오직 A, B 및 D 계열만이 세포 주기에서 일정한 역할을 하고 CDK를 활성화시키는 것으로 보인다[참조: Wang et al., Plant Physiol. 135:1084-1099, 2004]. CDKA는 D형 사이클린에 의해 활성화되며, CDKB는 A 및 B형 사이클린에 의해 활성화된다.
동물에서 CDK는 2개의 CDK 억제제(CKI) 계열에 의해 음성적으로 조절된다. CDK4의 억제제(INK4; inhibitor of CDK4)라고 하는 한가지 계열에는 4개의 일원(p15, p16, p18 및 p19)이 포함되고, 이들은 G1 CDK(즉, CDK4 및 CDK6)에 결합하여 이들이 사이클린과 결합하는 것을 억제한다. 다른 억제제 그룹은 키나제 억제제 단백질(KIP; Kinase Inhibitor Protein) 또는 CIP(CDK 상호작용 단백질; CDK Interacting Protein) 단백질이라고 하며, 이들은 모든 동물에서 고도로 보존되어 있다. CIP/KIP 계열은 사이클린 A- 및 E-CDK2 키나제 활성을 주로 억제한다. 식물에서, 추정되는 CKI가 확인되었고[참조: Wang et al., Nature 386:451-452, 1997; Wang et al., Plant J. 15:501-510, 1998; De Veylder et al., Plant Cell 13:1653-1667, 2001; Jasinski et al., Plant Physiol. 130:1871-1882, 2002], 시험관내에서, 정제된 사이클린/CDK 키나제 활성을 억제시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Wang et al., 1997, supra; Wang et al., Plant J. 24:613-623, 2000; Lui et al., Plant J. 21 :379-385, 2000]. 식물 CKI가 발현되면 성장이 감소되며 크기가 큰 세포를 함유하는 기관이 작아지는 것으로 밝혀졌다[참조: Wang et al., 2000, supra; Jasinski et al., J. Cell Sci. 115:973-982, 2001; De Veylder et al., supra; Zhou et al., Plant Cell Rep. 20:967-975, 2002; Zhou et al., Plant J. 35:476-489, 2003; Schnittger et al., Plant Cell 15:303-315, 2003]. 아라비돕시스에서, 이러한 CKI를 CDK의 억제제(ICK; Inhibitor of CDK) 또는 KIP 관련 단백질(KRP; KIP Related Protein)이라고 한다. CKI의 CIP/KIP 계열과 가장 유사한 7개의 ICK 계열 일원이 확인되었다. 각각의 이러한 ICK/KRP 계열 일원은 p27KIP1에 대해 높은 아미노산 동일성을 갖지만, 동일성은 가장 C-말단의 30개의 아미노산에 한정된다. 현재까지, 어느 식물에서도 INK 관련 CKI가 확인되지 않았다.
사이클린의 과발현 또는 CKI의 녹아웃(knockout)은, 균형이 잘 잡혀있는 세포 주기 엔진이 포유동물에서 쉽게 교란될 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 불균형은 결국 가속화된 세포 주기, 증가된 동물 크기 및/또는 종양 발생을 유도할 수 있다. CKI "활성"을 감소시키거나 완전히 제거하면 사이클린/CDK 키나제 활성이 증가된다. 이러한 증가된 활성은 세포 주기 진행에 필요한 하류 표적을 인산화시켜, 결국 동물에서 세포 과증식이 일어난다[참조: Coats et al., Science 272:877- 880, 1996]. 마우스에서 p27KIP1 유전자를 결실시키면, 과도한 사이클린/cdk 활성으로 인해 과도한 세포 증식이 유도되어 마우스의 크기가 커지게 된다[참조: Fero et al., Cell 85:733-744, 1996; Kiyokawa et al., Cell 85:721-732, 1996; Nakayama et al., Cell 85:707-720, 1996].
KRP 계열의 다양한 일원의 발현을 억제시키는 메커니즘이 존재한다. 식물에서의 전사후 유전자 사일런싱(PTGS; Post-Transcriptional Gene Silencing)은 동물에서의 RNA 간섭(RNAi; RNA interference)과 유사한 RNA 분해 메커니즘이다. RNAi는 이본쇄 RNA(dsRNA)를 짧은 21 내지 23bp의 dsRNA 단편으로 특이적으로 분해시켜, 결국 상동 RNA 집단의 분해에서 일정한 역할을 한다. 식물에서, PTGS는 역위 반복(IR; Inverted Repeat) 전략을 사용하여, 예를 들면 옥수수, 콩 및 캐놀라와 같은 작물을 포함하는 많은 식물 종에서 유전자 발현을 억제시킨다. 하지만, IR 기술은 IR 서열의 효율성, 표적외(off target) 유전자 조절[참조: Jackson et al., Nature Biotech. 21:635-637, 2003], 일시적 사일런싱, 전체적인 IR 안정성 등과 같은 다수의 단점을 갖고 있다. 이러한 단점은 한번에 하나 이상의 유전자를 사일런싱시켜야 할 필요가 있는 경우에 복잡해진다.
통상적인 식물 육종은 지난 75년 동안 작물 수확량 증대를 위한 주요 원동력이었다[참조: J. Fernandez-Cornejo, Agriculture Information Bulletin No . (AIB786) 81 pp, February 2004]. 보다 최근에는, 예를 들면 해충 및 제초제에 대한 내성을 갖는 유전자전이(transgenic) 작물이 가능해졌다. 하지만, 이러한 유전자전이 작물은 수확량 감소를 수반한다[참조: Elmore et al., Agron . J. 93:408- 412, 2001; Elmore et al., Agron . J. 93:404-407, 2001]. 현재까지, 종자 크기가 증가되거나 작물 수확량이 증가된 공지된 유전자전이 작물은 시판되고 있지 않다.
예를 들면, 작물 수확량 증가, 종자 크기 증가, 발아율 증가, 뿌리 질량 증가 등을 포함하는 비제한적인, 상업적 가치가 있는 특정 작물의 특성을 변형시키는 개선된 방법을 당업계에서 필요로 하고 있다. 본원에서 기술되는 본 발명은 이들 및 기타 필요성을 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은, 야생형 사이클린 의존성 키나제 억제제(CKI) 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 변이 식물 CKI 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양태에서, 변형(들)은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 야생형 CKI 단백질과 비교하여, CDK 단백질에 대한 변형된 결합 친화도를 부여하면서, 사이클린 단백질에 대한 결합 친화도는 실질적으로 유지된다. 본 발명의 변이 CKI 폴리펩티드는 야생형 CKI 기능에 대해 우성 음성 길항제 활성을 갖는다. 변이체가, 상응하는 야생형 CKI 단백질을 발현하는 세포, 또는 상응하는 야생형 단백질에 대해 이종성(heterologous)이지만, 특히, 사이클린 및 CDK 결합에 관하여 실질적으로 동등한 야생형 기능을 갖는 야생형 CKI를 발현하는 세포 내에서 발현되는 경우, 야생형 CKI의 생물학적 활성이 억제되어, 세포 주기 진행이 가속화되고 세포 증식이 증가하게 된다.
다른 양상에서, 본 발명은 변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산, 또는 재조합 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 변이 CKI-암호화 핵산 또는 벡터 를 숙주 세포 속에 도입시켜 핵산을 증폭시키거나 발현시킬 수 있다. 숙주 세포는, 예를 들면, 변이 CKI 폴리펩티드 생산을 위한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 세포에서의 변이 CKI 폴리펩티드 발현은 세포 분열 조절을 위한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포에서의 변이 CKI 폴리펩티드 발현은 세포 주기 진행을 가속화시키고 세포 증식을 증가시킬 수 있다.
다른 양상에서, 변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 전이유전자를 포함하는 유전자전이 식물이 제공된다. 유전자전이 식물에서의 변이 CKI 폴리펩티드의 발현은, 예를 들면, 식물 활력(vigor) 증가, 뿌리 질량 증가, 식물 크기 증가 또는 초기 발아 증가 등을 위한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
정의
달리 정의하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 것과 유사한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 검사에서 사용할 수 있지만, 단지 대표적인 방법 및 물질만이 기술된다. 본 발명의 목적상, 다음의 용어를 아래에 정의한다.
본원에서 사용되는 "하나의" 및 "상기"라는 용어는, 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 "사이클린 의존성 키나제 억제제" (본원에서 "CDK 억제제" 또는 "CKI"라고도 함)라는 용어는 사이클린 의존성 키나제(CDK)를 음성적으로 조절하는 단백질 계열을 말한다. 본 발명에서 사용가능한 CKI에는 독립적으로 사이클린 및 CDK에 결합할 수 있는 별도의 폴리펩티드 영역을 갖는 것이 있다. 이러한 CKI에는, 예를 들면, KIP 관련 단백질(KRP)("CDK"의 억제제 또는 "ICK"로도 공지됨)이라고 하는 동물의 키나제 억제제 단백질(KIP)에 대해 상동성을 갖는, 확인된 식물 CKI 계열(7개의 확인된 아라비돕시스 CKI)이 포함된다.
"폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
"핵산"이라는 용어는 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 및 이의 중합체를 말한다. 구체적으로 한정하지 않으면, 당해 용어에는 참조 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지된 천연 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산이 포함된다. 달리 명시하지 않으면, 특정 핵산 서열에는 이의 보존적으로 변형 (예: 축퇴(degenerate) 코돈 치환)된 변이체도 사실상 포함된다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 세번째 위치를 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환시킨 서열을 생성시켜 달성할 수 있다[참조: Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260:2605-2608, 1985; Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8:91-98, 1994]. 핵산이라는 용어는 유전자, cDNA 및 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다.
CKI 폴리펩티드 및 핵산과 관련하여 "천연"이라는 용어는, 자연에서 발견되는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 (즉, 천연 공급원(유기체)으로부터 분리될 수 있고 사람의 개입에 의해 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열)을 갖는 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 통상적인 유전학에 따라 선택적으로 육종되었을 수 있는 실험실 식물 주(strain)는 천연 식물이라고 간주한다.
본원에서 사용되는 "야생형 CKI 유전자" 또는 "야생형 CKI 핵산"은, 유기체의 게놈 내의 CKI 유전자 좌(genetic locus)에 상응하는 핵산 서열을 말하고, 이는 상기 유전자 좌에 상응하는 천연 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 CKI 단백질의 정상적인 기능을 수행하는 유전자 산물을 암호화한다. 유전자 좌는 개체의 집단에서 하나 이상의 서열 또는 대립유전자(allele)를 가질 수 있고, "야생형"이라는 용어에는 정상적인 기능을 수행하는 유전자 산물을 암호화하는 모든 이러한 천연 대립유전자가 포함된다. "야생형"에는 또한 반드시 천연은 아니지만 여전히 정상적인 기능을 갖는 유전자 산물을 암호화하는 유전자 서열 (예: 사일런트(silent) 돌연변이를 갖거나 보존적 치환을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자)이 포함된다.
"야생형 CKI 폴리펩티드" 또는 "야생형 CKI 단백질"이라는 용어는 야생형 유전자에 의해 암호화된 CKI 폴리펩티드를 말한다. 유전자 좌는 개체의 집단에서 하나 이상의 서열 또는 대립유전자를 가질 수 있고, "야생형"이라는 용어에는 정상적인 기능을 수행하는 유전자 산물을 암호화하는 모든 이러한 천연 대립유전자가 포함된다.
본 발명의 CKI 폴리펩티드 및 핵산과 관련하여 "돌연변이체" 또는 "변이체"라는 용어는 상응하는 야생형 폴리펩티드 또는 핵산과 비교하여 변형된 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다.
"참조 CKI 폴리펩티드"라는 용어는 돌연변이 또는 변이 CKI 폴리펩티드를 정의하기 위한 목적으로 본원에서 사용되는 용어이다: 당해 용어는 아미노산 서열의 변형을 정의하기 위한 목적으로 돌연변이 CKI 폴리펩티드와 비교되는 CKI 폴리펩티드를 말한다. 따라서, "참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 변형을 갖는 CKI 아미노산 서열을 포함하는" 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, 하나 이상의 아미노산 변형(들)을 제외하고는, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 그 외에는 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 기술되는 본 발명을 수행하는데 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드는 미리 결정된다. 참조 CKI 폴리펩티드는, 예를 들면, 야생형 및/또는 천연 CKI 폴리펩티드, 또는 의도적으로 변형된 CKI 폴리펩티드일 수 있다.
"변형된 결합" 또는 "변화된 결합"이라는 용어는, 참조 CKI 폴리펩티드가 사이클린/CDK 복합체에 결합하는 야생형 유전자에 의해 암호화된 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 말한다. 본원의 "변형된 결합" 또는 "변화된 결합"이라는 용어는 사이클린/CDK 키나제 복합체에 대한 돌연변이 CKI의 결합을 말한다. "변형된 결합" 또는 "변화된 결합"이라는 용어는 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여 돌연변이 CKI 폴리펩티드의 상대적인 결합을 말한다. "변형된 결합" 또는 "변화된 결합"은 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여 사이클린/CDK 복합체에 대한 동일한 결합, 감소된 결합 또는 동등한 결합을 갖는 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 말할 수 있다.
본원에서 사용되는 "재조합체"는 재조합 방법으로 의도적으로 변형된 아미노 산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 본원의 "재조합 핵산"이라는 용어는, 일반적으로, 엔도뉴클레아제에 의한 핵산의 조작에 의해, 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 형태로, 시험관내에서 최초로 형성된 핵산을 의미한다. 따라서 선형으로 분리된 돌연변이 또는 변이 CKI 핵산, 또는 일반적으로 연결되어 있지 않은 DNA 분자를 연결시켜 시험관내에서 형성된 발현 벡터는 둘다, 본 발명의 목적상 재조합체라고 간주한다. 일단 재조합 핵산을 생성하여 숙주 세포 또는 유기체 속에 재도입시키면, 비-재조합적으로, 즉 시험관내 조작이 아닌 숙주 세포의 생체내 세포 기구를 사용하여 복제될 것이라는 것을 이해하여야 한다: 하지만, 이러한 핵산은, 일단 재조합적으로 생산되면, 이후에 비-재조합적으로 복제되더라도, 본 발명의 목적상 여전히 재조합체라고 간주한다. "재조합 단백질"은 재조합 기술을 사용하여, 즉 위에 서술한 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질은 하나 이상의 특징에 의해 천연 단백질로부터 구별된다.
아미노산과 관련하여, "비-보존적" 변형은 야생형 잔기와 돌연변이 잔기가 소수성, 전하, 크기 및 형태를 포함하는 하나 이상의 물리적 성질에 있어서 상당히 상이한 변형을 의미한다. 예를 들면, 극성 잔기에서 비극성 잔기로의 변형 또는 그 반대의 변형, 양전하를 띤 잔기에서 음전하를 띤 잔기로의 변형 또는 그 반대의 변형, 및 큰 잔기에서 작은 잔기로의 변형 또는 그 반대의 변형은 비보존적 변형이다. 예를 들면, 보다 상당한 영향을 주는 치환이 일어날 수 있다: 변화 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 알파-나선 또는 베타-쉬트 구조; 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성; 또는 측쇄의 크기. 일반적으로 폴리펩티드의 성질 을 가장 크게 변화시킬 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기(예: 세릴 또는 트레오닐)가 소수성 잔기(예: 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐)로 (또는 이에 의해) 치환되는 경우; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로 (또는 이에 의해) 치환되는 경우; (c) 양전성(electropositive) 측쇄를 갖는 잔기(예: 리실, 아르기닐 또는 히스티딜)가 음전성(electronegative) 잔기(예: 글루타밀 또는 아스파르틸)로 (또는 이에 의해) 치환되는 경우; 또는 (d) 크기가 큰 측쇄를 갖는 잔기(예: 페닐알라닌)가 측쇄를 갖지 않는 잔기(예: 글리신)로 (또는 이에 의해) 치환되는 경우이다.
보존적 변형은 일반적으로 아래에 제시된 것이지만, 당업계에 공지된 바와 같이, 다른 치환도 보존적이라고 간주될 수 있다.
Ala: Ser
Arg: Lys
Asn: Gln, His
Asp: Glu
Cys: Ser
Gln: Asn
Glu: Asp
Gly: Pro
His: Asn, Gln
Ile: Leu, Val
Leu: Ile, Val
Lys: Arg, Gln, Glu
Met: Leu, Ile
Phe: Met, Leu, Tyr
Ser: Thr
Thr: Ser
Trp: Tyr
Tyr: Trp, Phe
Val: Ile, Leu
단백질 작용 메커니즘 또는 유전자 표현형과 관련하여 "우성 음성"이라는 용어는, 돌연변이 또는 변이 단백질, 또는 돌연변이 또는 변이 단백질을 암호화하는 유전자가, 야생형 기능을 갖는 상응하는 단백질이 야생형 기능을 수행하는 것을 실질적으로 방해하는 것을 말한다.
본원에서 사용되는 "야생형 CKI의 길항제"라는 어구는 돌연변이 CKI 폴리펩티드가, 길항제의 부재 하에서의 야생형 CKI 폴리펩티드에 의한 키나제 활성 억제와 비교하여, CDK/사이클린 복합체의 키나제 활성을 억제하는 야생형 CKI 폴리펩티드의 능력을 상당히 감소(억제)시키는 것을 의미한다.
핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓인 경우, 이는 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들면, 프로모터 또는 인핸서가 암호화 서열의 전사에 영향을 주는 경우, 이는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 것이다; 또는 리보좀 결합 부 위가 해독을 촉진시키도록 위치한 경우, 이는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 것이다.
"식물"이라는 용어에는 전체 식물, 식물 기관(예: 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 등), 종자 및 식물 세포(예: 조직 배양 세포) 및 이의 자손이 포함된다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 식물 계열은, 형질전환 기술에서 사용가능한 고등 식물 계열, 예를 들면 겉씨식물 및 속씨식물, 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라, 조류(algae)와 같은 특정 하등 식물처럼 일반적으로 광범위하다. 여기에는 다배체(polyploid), 이배체(diploid) 및 반수체(haploid)를 포함하는 다양한 배수성(ploidy) 수준의 식물이 포함된다. 외떡잎 속씨식물의 예에는, 예를 들면, 아스파라거스, 야생 사탕옥수수, 보리, 밀, 벼, 수수, 사탕수수, 양파, 기장, 호밀 및 귀리 및 다른 곡물이 포함된다. 쌍떡잎 속씨식물의 예에는 토마토, 담배, 목화, 유채씨(캐놀라), 동백, 야생 콩, 대두, 후추, 상추 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 목본종의 예에는 포플러나무, 소나무, 삼나무, 떡갈나무, 전나무 등이 포함된다.
"이종성 서열"은 상이한 종으로부터 유래된 것이거나, 동일한 종으로부터 유래된 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 것이다. 예를 들면, 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터는 구조 유전자가 유래된 종과 상이한 종으로부터의 것이거나, 동일한 종으로부터 유래된 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 것이다.
"벡터"라는 용어는 외래 DNA의 일부분 속에 삽입될 수 있는 DNA, 통상적으로 이본쇄 DNA의 일부분을 말한다. 벡터 또는 레플리콘(replicon)은, 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 기원일 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 자가 복제를 용이하게 하는 "레플리콘" 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 본 발명과 관련하여 "레플리콘"이라는 용어에는 또한 숙주 염색체 속으로 벡터 서열의 재조합을 표적화하거나 또는 용이하게 하는 폴리뉴클레오타이드 서열 영역이 포함된다. 또한, 외래 DNA를 처음에, 예를 들면, DNA 바이러스 벡터 속에 삽입시킬 수 있지만, 바이러스 벡터 DNA를 숙주 세포 속으로 형질전환시키면 바이러스 DNA가 바이러스 RNA 벡터 분자로 전환될 수 있다. 외래 DNA는 이종성 DNA로 정의되며, 이는 예를 들면 벡터 분자가 복제되는 숙주 세포에서 자연적으로 발견되지 않는 DNA이며, 선별가능하거나 스크리닝가능한 마커 또는 전이유전자를 암호화한다. 벡터를 사용하여 외래 또는 이종성 DNA를 적당한 숙주 세포 속으로 전달한다. 일단 숙주 세포 내에 들어가면, 벡터는 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 또는 공동으로 복제할 수 있고, 다수의 벡터 카피 및 이의 삽입된 DNA가 생성될 수 있다. 대안으로, 벡터는 숙주 염색체 속으로 외래 또는 이종성 DNA의 삽입을 표적화할 수 있다. 또한, 벡터는 삽입된 DNA가 mRNA 분자로 전사되게 하거나 또는 삽입된 DNA가 다수의 RNA 카피로 복제되게 하는 필수적인 요소를 함유할 수도 있다. 일부 발현 벡터는 삽입된 DNA 근처에 mRNA가 단백질 분자로 해독되게 하는 서열 요소를 추가적으로 함유한다. 따라서 삽입된 DNA에 의해 암호화된 많은 mRNA 및 폴리펩티드 분자가 신속하게 합성될 수 있다.
"전이유전자 벡터"라는 용어는 삽입된 DNA 단편, 즉 "전이유전 자(transgene)"를 함유하는 벡터를 말하며, 이는 숙주 세포 내에서 mRNA로 전사되거나 RNA로서 복제된다. "전이유전자"라는 용어는 RNA로 전환되는 삽입된 DNA의 일부분 뿐만 아니라, RNA의 전사 또는 복제에 필요한 벡터의 일부분도 말한다. 또한, 전이유전자는 단백질을 생산할 수 있는 개방 판독 프레임(open reading frame)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 반드시 포함할 필요는 없다.
"형질전환된 숙주 세포", "형질전환된" 및 "형질전환"이라는 용어는 DNA를 세포 속에 도입시키는 것을 말한다. 상기 세포를 "숙주 세포"라고 하며, 이는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 통상적인 원핵생물 숙주 세포에는 다양한 이.콜라이(E. coli) 균주가 포함된다. 통상적인 진핵생물 숙주 세포로는 식물 세포(예: 캐놀라, 콩, 벼 또는 옥수수 세포 등), 효모 세포, 곤충 세포 또는 동물 세포가 있다. 도입되는 DNA는 일반적으로 삽입된 일부분의 DNA를 함유하는 벡터의 형태이다. 도입되는 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종 또는 숙주 세포와 상이한 종으로부터의 것이거나, 일부 외래 DNA 및 숙주 종으로부터 유래된 일부 DNA를 함유하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다.
CKI 폴리펩티드 및 핵산과 관련하여, 다른 서열 (예: 영역, 단편, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치 등)에 대한 "상응성"은, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치 번호에 따라 넘버링(numbering)하고 나서, 각 위치에서 매치되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수를 최대화하는 방식으로, 즉 서열 동일성 %를 최대화하는 방식으로 서열을 정렬하는 통상적인 방법을 토대로 한다. 주어진 "상응하는 영역"을 갖는 모든 위치가 동일할 필요는 없으므로, 상응하는 영역 내의 비-매칭 위치는 "상응하는 위치"라고 간주될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 명시된 CKI 폴리펩티드의 "아미노산 위치 X에 상응하는 아미노산 위치"에 대한 언급은, 다른 인식된 CKI 폴리펩티드 및 구조적 동족체 및 계열 내의 동등한 위치의 집합에 대한 언급을 의미한다.
CKI 폴리펩티드 및 핵산의 KRP 상위계열에 관한 본 발명의 통상적인 양태에서, 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치의 "상응성"은 통상적으로 CDK 결합 영역 내의 아미노산 또는 CDK 결합 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드에 대하여 결정된다. 일반적으로, KRP 폴리펩티드의 다른 영역과 비교하여, KRP CKI의 CDK 결합 영역은 실질적인 서열 동일성 또는 유사성을 공유한다. 따라서, KRP CKI 폴리펩티드의 CDK 결합 영역을 결정하는데 적당한 한가지 기술은, 제2의 KRP CKI의 공지된 CDK 결합 영역에 대하여 (예를 들면, 브라시카 나푸스(Brassica napus) Krp1(Bn Krp1)의 대략적인 아미노산 위치 145번 내지 168번으로부터) 실질적인 서열 동일성 또는 유사성을 공유하는 아미노산 영역을 확인하는 것이다 (다수의 CKI 계열 일원과 BnKrp1과의 아미노산 서열 정렬이 제시된 도 1을 참조한다). 일단 CDK 결합 영역에 상응하는 서열이 서열 정렬에 의해 결정되면, 이에 따라서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치를 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 "서열 동일성 %"는 비교 윈도우(comparison window)를 통해 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정되고, 이때 비교 윈도우 내의 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. %는 동일한 핵 산 염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열에 모두 존재하는 위치의 수를 세어 매치된 위치의 수를 계산하고, 매치된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 %를 얻는 방법으로 계산한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "동일성" %라는 용어는, 다음의 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정된, 비교 윈도우 또는 명시된 영역에 걸쳐 최대로 상응하도록 비교 및 정렬한 경우, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열(subsequence), 또는 특정 % (예: 특정 영역에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성)의 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 서열이 약 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상 또는 55% 이상 동일한 경우, 이들은 서로 "실질적으로 동일하다". 이러한 정의는 또한 검사 서열의 보완을 말한다. 임의로, 동일성은 길이가 약 6개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 15개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 25개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 35개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 50개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 100개 또는 그 이상의 아미노산인 폴리펩티드 영역에 걸쳐, 또는 이러한 폴리펩티드 영역을 암호화하는 핵산 영역에 걸쳐 존재한다. 본 발명의 특정한 바람직한 양상에서, 비교를 위한 명시된 영역은 CKI 폴리펩티드의 CDK 결합 영역, 이러한 CDK 결합 영역의 일부를 포함하는 폴리펩티드 영역, 또는 이러한 CDK 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 영역이다.
2개 이상의 폴리펩티드 서열과 관련하여 "유사성" 또는 "유사성 %"라는 용어는, 다음의 서열 비교 알고리듬 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정된, 비교 윈도우 또는 명시된 영역에 걸쳐 최대로 상응하도록 비교 및 정렬한 경우, 보존적 아미노산 치환으로 정의되는 바와 같이 동일하거나 유사한 특정 % (예: 특정 영역에 걸쳐 60% 유사성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 유사성)의 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 서열이 서로 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상 또는 55% 이상 유사한 경우, 이들은 서로 "실질적으로 유사하다". 임의로, 이러한 동일성은 길이가 약 6개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 15개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 25개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 35개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 50개 이상의 아미노산 잔기이거나, 길이가 약 100개 또는 그 이상의 아미노산인 영역에 걸쳐 존재한다.
본 발명의 특정 양상에서, 서열 동일성 또는 유사성 결정의 경우, 비교를 위한 명시된 영역은 CKI 폴리펩티드의 CDK 결합 영역, 이러한 CDK 결합 영역의 일부를 포함하는 폴리펩티드 영역, 또는 이러한 CDK 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드 영역이다.
서열 비교의 경우, 통상적으로 하나의 서열이 참조 서열로서 역할을 하고, 이에 대해 검사 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리듬을 사용하는 경우, 검사 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리듬 프로그램 변수를 지정한다. 디폴트(default) 프로그램 변수를 사용하거나, 대안적인 변수를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리듬은 프로그램 변수에 따라 참조 서열에 대해 검사 서열의 서열 동일성 또는 유사성 %를 계산한다.
본원에서 사용되는 "비교 윈도우"에는, 서열을 연속적인 위치의 수가 동일한 참조 서열과 최적으로 정렬시킨 후 비교할 수 있는, 연속적인 아미노산 또는 뉴클레오타이드 위치의 단편에 대한 참조가 포함된다. 본 발명에 따른 CKI 폴리펩티드의 비교에 관하여, 비교 윈도우는 통상적으로 약 6 내지 약 200개 또는 그 이상의 연속적인 아미노산, 통상적으로 약 6 내지 약 50개, 약 6 내지 약 25개, 약 15 내지 약 100개, 약 15 내지 약 50개, 약 15 내지 약 30개, 약 20 내지 약 50개, 또는 약 25 내지 약 50개의 연속적인 아미노산이다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들면, 문헌[참조: Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1970]의 국지적 상동성 알고리듬, 문헌[참조: Needleman and Wunsch, J. Mol . Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리듬, 문헌[참조: Pearson and Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 검색 방법, 이러한 알고리듬의 컴퓨터화된 실행 (예: Wisconsin Genetics 소프트웨어 패키지(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 포함된 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 조사[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)]에 의해 수행할 수 있다.
유용한 알고리듬의 한가지 예로는 PILEUP이 있다. PILEUP은 관련된 서열의 그룹으로부터 단계적인 짝 정렬(pairwise alignment)을 사용하여 다중 서열 정렬을 생성하여 관련성 및 서열 동일성 %를 제시한다. 이는 또한 정렬을 생성하는데 사용된 클러스터링(clustering) 관계를 보여주는 수형도(tree diagram) 또는 수목도(dendogram)를 작성한다. PILEUP은 문헌[참조: Feng and Doolittle, J. Mol . Evol. 35:351-360, 1987]의 단계적 정렬 방법의 단순화를 사용한다. 사용된 방법은 문헌[참조: Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989]에 기술된 방법과 유사하다. 상기 프로그램은 각각 최대 길이가 5,000 뉴클레오타이드 또는 아미노산인 최대 300개의 서열을 정렬할 수 있다. 다중 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열의 짝 정렬로 시작하여, 2개의 정렬된 서열의 클러스터(cluster)를 생성한다. 이어서, 이 클러스터를 그 다음으로 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터에 대해 정렬한다. 2개의 서열 클러스터를, 2개의 개개의 서열의 짝 정렬을 단순 반복하여 정렬한다. 최종 정렬은 일련의 단계적인 짝 정렬로 달성된다. 상기 프로그램은 서열 비교 영역에 대한 특정 서열 및 이의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 좌표를 지정하고 프로그램 변수를 지정하여 실행시킨다. PILEUP을 사용하여, 참조 서열을 다른 검사 서열과 비교하고 다음의 변수를 사용하여 서열 동일성 관계 %를 결정한다: 디폴트 갭 가중치(3.00), 디폴트 갭 길이 가중치 (0.10) 및 가중 말단 갭. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지 [예: 버전 7.0 (참조: Devereaux et al., Nucl . Acids Res. 12:387-395, 1984)]로부터 입수할 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 %를 결정하는데 적당한 알고리듬의 다른 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이 있고, 이들은 각각 문헌[참조: Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402, 1977 및 Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410, 1990]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information을 통해 공개적으로 사용가능하다. 이 알고리듬은, 데이터베이스 서열 중의 동일한 길이의 단어와 정렬시킨 경우, 양의(positive-valued) 역치 점수(threshold score) T에 어느 정도 부합하거나 충족하는, 조회(query) 서열 중의 길이 W의 짧은 단어를 확인하여 먼저 고 득점 서열 쌍(HSP)을 확인함을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 역치라고 한다[참조: Altschul et al., supra]. 이러한 초기 이웃 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 개시하기 위한 기반으로서 역할을 한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가할 수 있는 만큼 멀리 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는, 뉴클레오타이드 서열의 경우, 변수 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 벌점; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 다음의 경우에 정지된다: 누적 정렬 점수가 최대 도달 값으로부터 X의 양만큼 하락한 경우; 하나 이상의 실점(negative-scoring) 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 점수가 0 이하가 된 경우; 또는 서열의 어느 한쪽 말단에 도달한 경우. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 디폴트로서 단어길이 (W) = 11, 기대값 (E) = 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이 = 3 및 기대값 (E) = 10, 및 BLOSUM62 득점 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci , USA 89:10915-10919, 1992] 정렬 (B) = 50, 기대값 (E) = 10, M = 5, N = -4 및 두 가닥 비교를 사용한다.
BLAST 알고리듬은 또한 2개의 서열 간의 유사성 통계 분석을 수행한다[참조: Karlin and Altschul, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5887, 1993]. BLAST 알고리듬에 의해 제공되는 유사성의 한가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))이고, 이는 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 일어날 확률을 나타낸다. 예를 들면, 참조 핵산에 대한 검사 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 통상적으로 약 0.01 미만, 그리고 보다 통상적으로 약 0.001 미만인 경우, 핵산이 참조 서열과 유사하다고 간주한다.
유전자 상동체(homolog) 및 오르토로그(ortholog)는 또한 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 HomoloGene 리소스(resource)를 사용하여 확인할 수 있다. 제1의 유전자의 상동체 또는 오르토로그는 제1의 유전자에 의해 암호화된 유전자 산물과 동일하거나 유사한 기능을 갖는 유전자 산물을 암호화할 수 있다. 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 오르토로그라는 것을 나타내는 또다른 것은, 이종성 유전자가 진핵생물 세포 발현 시스템에서 내생적(endogenous) 유전자의 무효 대립유전자(null allele)를 보완(예: 구호(rescue))할 수 있는 것이다.
도 1은 아라비돕시스 KRP 계열 일원과 브라시카 Krp 계열 일원과의 아미노산 서열 정렬을 보여준다. 아라비돕시스 KRP의 서열은 공개 데이터베이스로부터 입수하였다: AtKrp1 (Genbank 번호 U94772)(서열번호 2); AtKrp2 (Genbank 번호 CAB76424)(서열번호 3); AtKrp3 (Genbank 번호 CAC41617)(서열번호 4); AtKrp4 (Genbank 번호 CAC41618)(서열번호 5); AtKrp5 (Genbank 번호 CAC41619)(서열번호 6); AtKrp6 (Genbank 번호 CAC41620)(서열번호 7); 및 AtKrp7 (Genbank 번호 CAC41621)(서열번호 8). 브라시카 KRP (BnKrpl (서열번호 68), BnKrp3 (서열번호 69), BnKrp4 (서열번호 70), BnKrp5 (서열번호 71), 및 BnKrp6 (서열번호 72))에 대한 서열은 아래 실시예 1에 기술된 바와 같이 입수하였다. p27에 대한 아미노산 서열(서열번호 73)도 제시한다.
도 2는 옥수수 (서열번호 9), 캐놀라, 콩 (서열번호 11), 포플러나무 (서열번호 12), 담배 (서열번호 13), 밀, 벼 (서열번호 15) 및 감자 (서열번호 16) 사이클린 및 CDK 결합 도메인의 아미노산 서열 정렬을 보여주며, CDK 결합 도메인 내의 높은 서열 동일성 정도를 보여준다.
도 3은 BnKrp1 F151A;153A (서열번호 74) 또는 BnKrp1 Y149A;F151A;F153A (서열번호 75)를 암호화하는, 옥수수에서의 발현을 위하여 코돈 최적화된 돌연변이 BnKrp1 핵산 서열을 보여준다.
본 발명에는 식물 세포 분열의 조절을 위한 조성물 및 방법이 포함된다. 특히, 우성 음성 메커니즘을 통해 야생형 CKI 단백질 기능에 대해 길항작용하는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 관련된 폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포, 유전자전이 식물 및 이의 사용 방법이 제공된다. 변이, 우성 음성 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 광범위한 다양한 유전자전이 벡터를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 본 발명의 CKI 전이유전자가 식물 속에 도입되어 발현되면, 식물 세포 분열이 조절된다. 세포 분열의 조절은, 변이 CKI 전이유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열의 종류에 따라 식물 전체에서 일어나거나 조직 또는 기관 특이적 방식으로 일어날 수 있다. 특히, 본원에서 제공된 조성물 및 방법을 사용하여 식물 세포의 세포 주기 진행을 가속화시킬 수 있고, 이에 수반하여 세포 증식이 증가된다. 이러한 방식으로 상기 조성물 및 방법을 사용하여, 예를 들면 임의의 광범위한 다양한 식물에서 작물 수확량 및/또는 종자 크기를 증가시킬 수 있다. 작물 수확량의 증가에는, 예를 들면 잎 조직 증가, 과일 증가, 꽃 생산 증가, 뿌리 질량 증가 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 변이 CKI 폴리펩티드는 KRP 계열 일원이다. 본 발명의 당해 양상은 적어도 부분적으로, KRP 계열 일원의 CDK 결합 영역이 사이클린-CDK 복합체의 억제를 주로 담당한다는 발견을 토대로 한다. 따라서, KRP 계열 일원의 (사이클린 결합 영역에 대립하여) CDK 결합 영역을 표적화하면, 야생형 CKI 기능의 특히 효능있는 우성 음성 길항제인 돌연변이 단백질이 생성될 수 있다.
돌연변이 CKI 폴리펩티드, 핵산 및 벡터
본 발명의 CKI 폴리펩티드는 천연 또는 야생형 CKI로부터 구별가능한 돌연변이 또는 변이 단백질이다. 변이 CKI 폴리펩티드는 참조 CKI 폴리펩티드(예: 야생형 CKI 단백질)와 비교하여 단백질의 CDK 또는 사이클린 결합 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함한다. 통상적인 변형에는 상응하는 야생형 서열과 비교하여 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 포함된다. 특히 적당한 변형으로는 아미노산 치환이 있다. 특정 양태에서, 변이 CKI 폴리펩티드는 하나 이상의 비-보존적 변형(예: 치환)을 포함한다.
본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 우성 음성 단백질이다. 우성 음성 접근법은 특히, CDK 및 사이클린 결합에 개별적으로 관련된 2개의 폴리펩티드 영역을 갖는 CKI 폴리펩티드에 대해 사용가능하다. 본 발명의 우성 음성 돌연변이체를 생성시키기 위한 일반적인 접근법에는, 개개의 CDK 및 사이클린 결합 영역 중의 하나를 변형시켜 "야생형" CDK 또는 사이클린 결합을 변형시키는 것이 포함된다. 이러한 변형된 CDK 또는 사이클린 결합 영역은, 야생형 폴리펩티드와 비교하여 사이클린 또는 CDK에 대한 동등한, 또는 감소되거나 제거된 결합을 일으킬 수 있다. 두 경우에, 돌연변이는 CKI 키나제 억제 활성을 감소시키거나 제거시킬 것이다. 야생형 기능을 방해할 수 있는 우성 음성 CKI 폴리펩티드를 설계하기 위해서는, 돌연변이 폴리펩티드는 (1) 사이클린/CDK 복합체에 실질적으로 결합해야 하고; (2) 고농도에서도 사이클린 CDK 복합체를 실질적으로 억제하지 않아야 하며; (3) 사이클린/CDK 복합체에의 결합에 대해 야생형 CKI 폴리펩티드와 경쟁해야 한다. 생체내에서, 이러한 모든 요건을 충족하는 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 세포에서 사이클린/CDK 키나제 활성을 상승시키고, 이는 세포 증식을 증가시키며 유사분열 지수(mitotic index)를 높여, 결국 식물의 수확량 및/또는 종자 크기를 증가시키고/시키거나 식물의 하나 이상의 영역에서 상승된 사이클린/CDK 키나제 활성과 관련된 일부 다른 특징을 유도한다.
특정 KRP 폴리펩티드의 경우에, 이러한 CKI 폴리펩티드 계열에서 사이클린/CDK 키나제 억제를 주로 담당하는 CDK 결합 영역을 변형 목적으로 표적화한다.
특히 적당한 변형에는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 포함된다. 예를 들면, 아미노산 치환은 결합을 감소시키거나 제거시키는 CDK 또는 사이클린-결합 영역에서의 변형으로서 생성될 수 있다. 유사하게, 아미노산 치환은 CKI 억제 활성을 감소시키거나 제거시키는 CDK 또는 사이클린-결합 영역에서의 변형으로서 생성될 수 있다. 통상적인 양태에서, CDK 또는 사이클린 결합 영역에서 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 일으켜 CDK 또는 사이클린 단백질에 대한 CKI 폴리펩티드의 결합을 붕괴시키거나 변형시킨다.
치환 CKI 폴리펩티드 돌연변이체는, 참조 CKI 단백질 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에 상이한 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 분자 내에서 하나의 아미노산만 치환된 단일 치환이거나, 동일한 분자 내에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수 있다. 본 발명의 CKI 단백질 분자 활성의 실질적인 변화는, 측쇄가 전하 및/또는 구조에 있어서 천연 아미노산과 상당히 상이한 다른 아미노산, 천연 아미노산과 전하가 반대인 아미노산, 또는 천연 아미노산과 친수성이 반대인 아미노산 등으로 아미노산을 치환시켜 달성할 수 있다. 이러한 종류의 치환은 치환된 부분에서 폴리펩티드 골격의 구조 및/또는 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 줄 것으로 예상된다. 본 발명의 특정한 대표적인 양태에서, 치환 CKI 돌연변이체는 알라닌에 의한 비-알라닌 잔기의 치환을 포함한다. 다른 변이에서, 치환 CKI는 예를 들면, 반대 전하를 띤 아미노산, 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기, 친수성이 반대인 아미노산, 작은 비-극성 아미노산 (예: Cys, Thr, Ser, Ala 또는 Gly) 또는 극성 아미노산 (예: Pro, Glu, Asp, Asn 또는 Gln)에 의한 아미노산 잔기의 치환을 포함한다.
삽입 CKI 폴리펩티드 돌연변이체는 참조 CKI 단백질 분자 내의 특정 위치에서 아미노산의 바로 근처에 하나 이상의 아미노산이 삽입된 것이다. "아미노산의 바로 근처"는 아미노산의 α-카복시 또는 α-아미노 관능 그룹에 연결된 것을 의미한다. 삽입은 하나 이상의 아미노산일 수 있다. 삽입은, 예를 들면, 1개 또는 2개의 보존적 아미노산으로 이루어질 수 있다. 삽입 부위 근처의 아미노산과 전하 및/또는 구조가 유사한 아미노산을 보존적이라고 정의한다. 대안으로, 돌연변이 CKI는 삽입 부위 근처의 아미노산과 실질적으로 상이한 전하 및/또는 구조를 갖는 아미노산의 삽입을 포함한다.
결실 CKI 폴리펩티드 돌연변이체는 참조 CKI 단백질 분자 내의 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 일부 양태에서, 결실 돌연변이체는 CKI 단백질 분자의 특정 영역에서 결실된 1개, 2개 또는 그 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 결실 돌연변이체에는, 예를 들면, 아미노- 또는 카복시-말단의 절두(truncation)를 갖는 돌연변이체가 포함될 수 있다.
본 발명의 방법은, 개개의 영역이 CDK 및 사이클린 단백질의 결합에 관련되어 있어 CDK 기능을 억제하는, CKI 계열 단백질의 임의의 인식된 일원에 적용될 수 있다. 한가지 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질은 CKI의 KRP 계열에 속하는 단백질의 돌연변이체 또는 변이체이다. 위에 언급한 바와 같이, KRP 계열 일원의 CDK 결합 영역은 키나제 억제를 주로 담당한다. 따라서, CDK 결합 영역은 바람직하게는, 변이 KRP CKI 폴리펩티드의 설계에서 변형을 위하여 표적화된다. KRP 단백질의 CDK 결합 영역은 일반적으로 브라시카 나푸스 Krp1 (BnKrp1)(서열번호 17)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응한다. 특정 양태에서, KRP 계열 일원의 CDK 결합 영역의 변형은, BnKrp1의 145번 내지 168번 위치에 상응하는 영역 내에서 하나 이상의 아미노산 위치, 2개의 아미노산 위치 또는 그 이상의 변형을 포함한다 (아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) Krp1 내의 상응하는 영역은 아미노산 167번 내지 190번을 포함한다). 변형을 위한 특히 적당한 아미노산 위치에는 브라시카 나푸스 Krp1 (BnKrp1)의 아미노산 145, 148, 149, 151, 153, 155, 163, 164, 165 및/또는 167번에 상응하는 위치가 포함된다. 다른 CKI 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산 잔기는 공지된 방법을 사용하여 서열 정렬에 의해 쉽게 결정되며 본원에서 추가로 기술되는 바와 같다.
각각의 경우에, 위에서 언급된 아미노산은 포유동물 p27에서 보존되어 있고, 모두 사이클린 A 및 CDK2와 복합체를 형성한 p27의 결정 구조에서 CDK와 접촉한다. 한가지 양태에서, KRP CDK 결합 영역의 변형은 BnKrp1의 아미노산 151번 및 153번 위치에 상응하는 아미노산의 변형 (예: 각각의 이러한 부위에서의 알라닌 또는 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환)을 포함한다. 다른 대표적인 변이에서, BnKrp1의 151번 및 153번 위치에 상응하는 아미노산의 변형 이외에도, KRP CDK 결합 영역의 변형에는 BnKrp1의 아미노산(들) 149번, 164번 및/또는 165번에 상응하는 위치(들)에서의 변형(들) (예: BnKrp1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 추가적인 아미노산 치환; 또는 BnKrp1의 아미노산 164번 및 아미노산 165번 둘다에 상응하는 위치에서의 2개의 추가적인 아미노산 치환)이 추가로 포함된다. KRP CKI 폴리펩티드에 대한 이러한 변형(들)은 CDK 단백질에 대한 결합 친화도를 변형시키지만, 사이클린 단백질에 결합하는 변이 단백질의 능력은 실질적으로 보존된다.
특정 관심대상의 Krp CDK 결합 영역의 변형에는 임의의 다음의 아미노산 치환에 상응하는 변형이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다:
BnKrp1 F145A;Y149A
BnKrp1 F145A;Y149A;F151A
BnKrp1 F145A;Y149A;F151A;F153A
BnKrp1 Y149A;F151A
BnKrp1 Y149A;F153A
BnKrp1 F151A;F153A
BnKrp1 F151A;F153A;Y149A
BnKrp1 F151A;F153A;E164A
BnKrp1 F151A;F153A;W165A
BnKrp1 F151A;F153A;E164A;W165A
BnKrp1 F151A;F153A;Y149A;E164A
BnKrp1 F151A;F153A;Y149A;W165A
BnKrp1 F151A;F153A;Y149A;E164A;W165A
BnKrp1 E164A;W165A
특정 양태에서, 위와 같이 변형된 CKI 폴리펩티드는 BnKrp1이다. 다른 변이에서, 위와 같이 변형된 CKI는 BnKrp1이 아니며 (예: 아라비돕시스 탈리아나), 치환된 아미노산은 위에서 제시된 것에 상응한다.
KRP 계열 일원의 추가적인 변형을 포함하는, CDK 또는 사이클린 결합에 영향을 주는 다른 변형(에: 치환, 삽입, 결실)은 구조적 정렬 방법, 서열 정렬 방법 등을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 돌연변이 또는 변이 단백질은, 예를 들면, 이전에 미국 특허 제6,188,965호; 제6,296,312호 및 제6,403,312호에 기술된 PDA™ 시스템; 알라닌 스캐닝(미국 특허 제5,506,107호 참조), 유전자 셔플링(shuffling) (국제공개공보 제WO 01/25277호), 부위 포화 돌연변이유발, 평균 필드(mean field), 서열 상동성, 또는 본원에서 이후에 추가로 기술되는 포인트 돌연변이 부위 및 종류의 선별을 유도하는 당업자에게 공지된 다른 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다.
본 발명의 CKI 폴리펩티드 변이체는, 예를 들면 통상적으로 부위-지시된(site-directed) 돌연변이유발이라고 하는 기술을 사용하여, 상응하는 야생형 CKI, 또는 변이체가 유래된 다른 상응하는 CKI를 암호화하는 DNA 서열을 돌연변이시켜 작제할 수 있다. CKI 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 당업자에게 익히 공지된 다양한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술로 돌연변이시킬 수 있다[참조: PCR Strategies, M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA, Chapter 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990]. 또한, 당업계에서 익히 공지된 화학 및/또는 방사선조사 돌연변이유발 방법을 사용하여 KRP 계열 일원 단백질의 암호화 영역 내에 돌연변이를 유도할 수 있다. 스크리닝을 수행하여 본 발명의 돌연변이 또는 변이 Krp를 암호화하는 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있는 식물을 찾아낼 수 있다. 식물을 CKI의 아미노산 서열의 변화, 키나제 활성의 변화 또는 표현형의 예상된 변화에 대해 스크리닝한 후, 서열 분석할 수 있다.
비제한적 예로서, Transformer Site-Directed Mutagenesis 키트[판매원: Clontech]에서 사용되는 2개의 프라이머 시스템을 사용하여, 부위-지시된 돌연변이체를 CKI 단백질을 암호화하는 유전자 속에 도입시킬 수 있다. 이 시스템에서 표적 플라스미드를 변성시킨 후, 2개의 프라이머를 동시에 플라스미드에 어닐링(annealing)시킨다; 이러한 프라이머 중 하나는 목적하는 부위-지시된 돌연변이를 함유하며, 또다른 하나는 플라스미드 내의 또다른 지점에 돌연변이를 함유하여 제한 부위가 제거된다. 이어서, 두번째 가닥 합성을 수행하여, 이러한 2개의 돌연변이를 긴밀하게 연결시키고, 생성된 플라스미드를 이.콜라이 mutS 균주 속으로 형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 세균으로부터 분리하여, 관련된 제한 효소로 처리하고 나서 (비돌연변이된 플라스미드가 선형화됨), 이.콜라이 속으로 재형질전환시킨다. 이 시스템은, 일본쇄 파지미드(phagemid)를 서브클로닝하거나 생성시킬 필요없이, 발현 플라스미드에서 직접 돌연변이를 생성할 수 있게 한다. 2개의 돌연변이를 긴밀하게 연결시키고 나서 비돌연변이된 플라스미드를 선형화시키면, 돌연변이 효율이 높아지고 최소한의 스크리닝이 가능하게 된다. 최초 제한 부위 프라이머의 합성 후, 이 방법은 돌연변이 부위 마다 오직 하나의 새로운 프라이머 종류의 사용을 요구한다. 각각의 위치적 돌연변이체를 개별적으로 제조하기 보다는, 일련의 "설계된 축퇴" 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하여 모든 목적하는 돌연변이를 주어진 부위에 동시에 도입시킬 수 있다. 돌연변이유발된 영역에 걸쳐 플라스미드 DNA를 서열분석해서 형질전환체를 스크리닝하여, 돌연변이 클론을 확인하고 분류할 수 있다. 이어서, 각각의 돌연변이 DNA를 제한효소처리하고, 예를 들면 Mutation Detection Enhancement 겔 (J. T. Baker) 상에서 전기영동으로 분석하여, (비돌연변이유발된 대조군에 대한 밴드 이동 비교에 의해) 서열 내에 다른 변화가 일어나지 않았다는 것을 확인할 수 있다. 대안으로, 전체 DNA 영역을 서열분석하여, 표적화된 영역 외에서는 추가적인 돌연변이가 일어나지 않았다는 것을 확인할 수 있다.
pET (또는 기타) 과발현 벡터 내의 확인된 돌연변이 듀플렉스(duplex)를 사용하여 이.콜라이 균주 BL21 (DE3) pLysS와 같은 이.콜라이를 형질전환시켜, 돌연변이 단백질을 높은 수준으로 생산하고 표준 프로토콜에 의해 정제할 수 있다. FAB-MS 매핑(mapping) 방법을 사용하여 돌연변이체 발현의 충실도(fidelity)를 신속하게 확인할 수 있다. 이 기술은 전체 단백질에 걸친 단편의 서열분석을 제공하고 서열 할당에 필요한 확실성을 제공한다. 이러한 종류의 매핑 실험에서, 단백질을 프로테아제로 분해시킨다 (이 단편이 주요 관심대상이며 나머지 맵은 비돌연변이유발된 단백질의 맵과 동일할 것이므로, 선택은 변형될 특정 영역에 따라 달라질 것이다). 절단 단편의 집합을, 예를 들면, 소구경(microbore) HPLC (역상 또는 이온 교환; 마찬가지로 변형될 특정 영역에 따라 달라짐)로 분획하여 각각의 분획 중에 다수의 펩티드를 제공하고, 펩티드의 분자량을 FAB-MS와 같은 표준 방법으로 측정한다. 이어서, 측정된 각각의 단편의 질량을 예측된 서열의 분해로부터 예상된 펩티드의 분자량과 비교하고, 서열의 정확성을 신속히 확인한다. 단백질 변형을 위한 이러한 돌연변이유발 방법은 특정적이므로, 변형된 펩티드의 서열분석은 MS 데이터가 예측과 일치하면 필수적이지 않다. 변화된 잔기를 확인할 필요가 있는 경우, CAD-직렬(tandem) MS/MS를 사용하여 본 혼합물의 펩티드를 서열분석하거나, 표적 펩티드를 정제하여 변형의 위치에 따라 제거 에드만 분해(subtractive Edman degradation) 또는 카복시펩티다제 Y 분해를 할 수 있다.
특정 부위 지시된 돌연변이유발의 설계에 있어서, 우선 비-보존적 치환을 하고 (a) 표적화된 CDK- 또는 사이클린-결합 활성이 감소되는지의 여부 및 (b) 임의의 비-표적화된 활성 (예: CDK-결합 영역이 표적화된 경우 사이클린 결합)이 결과적으로 크게 감소되는지의 여부를 결정하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이 방법으로 잔기가 비-표적화된 생물학적 활성에 중요한 것으로 증명되는 경우, 보존적 치환을 할 수 있다.
다른 부위 지시된 돌연변이유발 기술을 CKI 뉴클레오타이드 서열과 함께 사용할 수도 있다. 예를 들어, DNA의 제한 엔도뉴클레아제 분해 후 연결을 사용하여, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual (2nd Ed., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY]의 제15.3장에 일반적으로 기술된 바와 같이 CKI의 결실 변이체를 생성시킬 수 있다. 유사한 전략을 사용하여, 문헌[참조: Sambrook et al., supra]의 제15.3장에 기술된 바와 같이 삽입 변이체를 작제할 수 있다. 보다 최근에 문헌[참조: Zhu et al. (Proc . Natl . Acad. Sci . USA 96:8768-8773, 1999]에는 키메릭(chimeric) RNA/DNA 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생체내에서 돌연변이를 식물 유전자에 표적화시키는 방법이 고안되었다.
하나 이상의 아미노산이 치환된 돌연변이 폴리펩티드는 다수의 방법 중 하나로 생성될 수 있다. 아미노산이 폴리펩티드 쇄에서 서로 가까이 위치하는 경우, 모든 목적하는 아미노산 치환을 암호화하는 하나의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 이들을 동시에 돌연변이시킬 수 있다. 하지만, 아미노산이 서로 다소 멀리 위치하는 경우 (예를 들면, 10개 이상의 아미노산으로 분리된 경우), 모든 목적하는 변화를 암호화하는 단일 뉴클레오타이드를 생성시키는 것은 보다 어렵다. 대신, 2개의 대안적인 방법 중 하나를 사용할 수 있다. 첫번째 방법에서, 별도의 올리고뉴클레오타이드를 치환될 각각의 아미노산에 대해 생성시킨다. 이어서, 올리고뉴클레오타이드를 일본쇄 주형 DNA에 동시에 어닐링시키면, 주형으로부터 합성된 두번째 DNA 가닥은 모든 목적하는 아미노산 치환을 암호화할 것이다. 대안적인 방법은 2회 이상의 돌연변이유발을 포함하여 목적하는 돌연변이체를 생산한다. 제1회는 단일 돌연변이체에 대해 기술된 바와 같다: 야생형 CKI DNA를 주형으로서 사용하고, 첫번째 목적하는 아미노산 치환(들)을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 이 주형에 어닐링시키면, 헤테로듀플렉스(heteroduplex) DNA 분자가 생성된다. 돌연변이유발의 제2회는 돌연변이유발의 제1회에서 생산된 돌연변이된 DNA를 주형으로서 사용한다. 따라서, 이 주형은 이미 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 이어서, 추가적인 목적하는 아미노산 치환(들)을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 이 주형에 어닐링시키면, 생성된 DNA 가닥은 돌연변이유발의 제1 및 제2회로부터의 돌연변이를 암호화한다. 이 생성된 DNA를 돌연변이유발의 제3회 등에서 주형으로서 사용할 수 있다.
적당한 변형의 확인을 지시하는데 특히 적당한 한가지 기술은 CKI 단백질을 서열 정렬로 정렬시킴을 포함한다. 위에 논의된 많은 서열 정렬 방법론이 사용될 수 있다. 서열-기반 정렬 프로그램에는, 예를 들면, Smith-Waterman 검색, Needleman-Wunsch, Double Affine Smith-Waterman, 프레임 검색, Gribskov/GCG 프로파일 검색, Gribskov/GCG 프로파일 스캔, 프로파일 프레임 검색, Bucher 일반화된 프로파일, Hidden Markov 모델, Hframe, Double Frame, Blast, Psi-Blast, Clustal 및 GeneWise가 포함된다[참조: 참조로서 인용된, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997].
관련된 CKI 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 예를 들면, 다중 서열 정렬(MSA)로 정렬될 수 있다 (도 1 참조). 또한 MSA를 사용하여 하나 이상의 CKI 폴리펩티드에 관해 공지된 구조 정보를 아직 확인되어 있지 않을 수 있는 추가적인 CKI 폴리펩티드에 대해 (통상적으로 실질적인 서열 동일성을 공유하는 CKI 폴리펩티드에 대해) 확장시킬 수 있다. 상이한 CKI 폴리펩티드 간의 높은 정도의 구조적 상동성으로 인하여, MSA는 정렬 내의 다양한 위치에서 변형 효과의 신뢰할 수 있는 예측자(predictor)로서 사용될 수 있다. 따라서, KRP 계열 일원의 경우에, 예를 들면, 도 1에 제시된 CKI 서열 및 넘버링은 임의의 다른 KRP 계열 일원 단백질 서열에 대한 MSA 참조 지점으로서 사용될 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 변형을 위한 특히 적당한 아미노산 위치에는 브라시카 나푸스 KRP1 (BnKrp1)의 아미노산 위치 145, 148, 149, 151, 153, 155, 163, 164, 165 및/또는 167번에 상응하는 위치가 포함된다. 도 1에 제시된 정렬을 사용하고/하거나 본원에서 기술된 것과 같이 당업계에서 공지된 정렬 프로그램을 사용하여, 정렬 프로그램의 넘버링 시스템을 참조 지점으로서 사용할 수 있고, CKI 폴리펩티드의 관련된 위치를 CKI의 다른 인식된 일원 또는 구조적 상동체 및 계열 내의 동등한 위치와 서로 연관시킬 수 있다. 유사한 방법을 사용하여 서열분석되어야 하는 CKI 폴리펩티드의 아미노산 서열(들)을 정렬시킬 수 있다.
특정 경우에, CDK 또는 사이클린 단백질과 상호작용하는 CKI 폴리펩티드 내의 아미노산은 CKI/CDK 또는 CKI/사이클린 복합체의 3차원 구조로부터 직접 확인할 수 있다. 관련된 CKI 폴리펩티드의 CKI/CDK 또는 CKI/사이클린 복합체를 분석하여 동등한 정보를 도출할 수 있다. 따라서, 구조적 정렬을 사용하여 본 발명의 변이 CKI 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 광범위한 다양한 구조 정렬 프로그램이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 모두 참조로서 인용된, NCBI 웹사이트로부터의 VAST; SSAP[참조: Orengo and Taylor, Methods Enzymol. 266:617-635, 1996]; SARF2[참조: Alexandrov, Protein Eng. 9:727-732, 1996], CE[참조: Shinydyalov and Bourne, Protein Eng. 11:739-747, 1998; Orengo et al., Structure 5:1093-108, 1997]; Dali[참조: Holm et al., Nucl . Acid Res. 26:316-9, 1998]를 참고한다.
따라서, CKI/CDK 또는 CKI/사이클린 경계면에서 유용한 변형은 PDA™ 기술[참조: 본원에 참조로서 인용된, 미국 특허 제6,188,965호; 제6,269,312호 및 제6,403,312호]과 같은 단백질 설계 또는 모델링 알고리듬을 사용하여 선별할 수 있다. 이러한 계열의 알고리듬은 일반적으로 원자 수준 또는 아미노산 수준의 득점 기능을 사용하여 아미노산 서열과 단백질의 전체적인 3차 및 4차 구조와의 적합성을 평가한다. 따라서, 이러한 계열의 알고리듬을 사용하여, 정확히 폴딩되어 단백질의 비-변형된 영역에 상응하는 천연 표적과 상호작용하는 변이 CKI 단백질의 능력을 실질적으로 교란시키지 않는 CDK- 또는 사이클린-결합 변형 및/또는 붕괴를 선별할 수 있다. 이러한 기술은 통상적으로 표적 단백질의 고 해상도 구조 정보를 입력정보로서 사용한다. 한가지 양태에서, 적당한 CKI 단백질의 실험적으로 결정된 구조를 입력정보로서 사용한다. 대안적인 양태에서, MSA를 사용하여, 3차원 구조가 결정학적 또는 관련된 방법을 사용하여 결정된 계열의 부분집합을 토대로 하여 CKI 일원에 대한 원자 수준의 상동성 모델의 작제를 유도할 수 있다. 또다른 양태에서, 포유동물 p27/사이클린 경계면의 구조적 모델을 사용하여 식물 CKI에 대한 접촉 아미노산 잔기를 예측할 수 있다.
CDK 또는 사이클린 단백질에 대한 변형된, 예를 들면, 감소된 결합을 갖는 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, 예를 들면, 지시된 진화(directed evolution)(예: 오류 빈발(error prone) PCR, DNA 셔플링 등), 단일 부위 포화 돌연변이유발 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 포함하는 다양한 다른 방법으로 확인할 수도 있다. KRP CKI의 경우에, 예를 들면, 이들 및/또는 기타 방법의 사용은, CDK 결합 활성을 감소시키며 본원에서 기술된 CDK 결합 영역의 외부에 존재하는, 추가적인 변형의 확인을 가능하게 할 수 있다.
또한, 분자 동력학 계산을 사용하여, 돌연변이 서열 점수를 개별적으로 계산하고 목록을 수집하여 서열을 계산적으로 스크리닝할 수 있다. 또한, 잔기 쌍 포텐셜(residue pair potential)을 사용하여 계산적 스크리닝 동안에 서열 점수를 계산할 수 있다[참조: 본원에서 참조로서 인용된, Miyazawa et al., Macromolecules 18: 534-552, 1985].
대안으로, 변이 CKI 단백질의 라이브러리를 제조하여 검사할 수 있다. 예를 들면, 변이 CKI 아미노산 서열의 라이브러리를 사용하여 변이 CKI 서열을 암호화하는 핵산을 설계하고 나서, 이를 숙주 세포 속에 클로닝하여 발현시키고 검정할 수 있다. 코돈, 적당한 발현 벡터, 및 적당한 숙주 세포의 선택은 통상적으로 많은 요인에 따라 달라질 것이고, 필요에 따라 쉽게 최적화될 수 있다.
우성 음성 길항제 활성 및/또는 본원에서 개관된 다른 목적하는 활성에 대해 검사하는 돌연변이체의 라이브러리를 스크리닝하는데 특히 적당한 한가지 방법에서, 혼합된 뉴클레오타이드를 사용한 다중 PCR 반응을 수행한다. 전체 길이 유전자에 상응하는 중첩되는 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 각각의 변이 위치 또는 부분집단에 있는 모든 상이한 아미노산을 나타낼 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드를 동일한 비율로 혼합하고 다중 PCR 반응을 수행하여, 라이브러리에 의해 정의된 돌연변이의 조합을 함유하는 전체 길이 서열을 생성할 수 있다. 또한, 이는 오류 빈발 PCR 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
통상적으로, 각각의 중첩되는 올리고뉴클레오타이드는 변화될 오직 하나의 위치만을 포함한다. 대안으로, 변이 위치가 서로 가까이 있어 이를 수행할 수 없고, 올리고뉴클레오타이드 당 다수의 변이체를 사용하여 모든 가능성의 완전한 재조합을 가능하게 한다 (즉, 각각의 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이되는 단일 위치에 대한, 또는 돌연변이되는 하나 이상의 위치에 대한 코돈을 함유할 수 있다). 돌연변이되는 다수의 위치는 바람직하게는 서열 내에 가까이에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 길이가 비현실적이 되지 않게 한다. 올리고뉴클레오타이드 상의 다수의 위치를 돌연변이시키기 위하여, 돌연변이의 특정 조합을, 상기 조합을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함시키거나 제외시켜 라이브러리에 포함시키거나 제외시킬 수 있다. 예를 들면, 본원에서 논의된 바와 같이, 가변 영역 간에 상관관계가 있을 수 있다: 즉, 위치 X가 특정 잔기인 경우, 위치 Y는 특정 잔기이어야 한다 (또는 특정 잔기이어서는 안된다). 이러한 가변 위치의 집합을 종종 본원에서 "클러스터"라고 한다. 클러스터가 서로 가까이 있는 잔기를 포함하여, 하나의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 상에 존재할 수 있는 경우, 클러스터를 "우수한" 상관관계로 위치시켜, 라이브러리의 유효성을 감소시킬 수 있는 부적당한 조합을 제거할 수 있다. 하지만, 클러스터의 잔기가 서열 내에 멀리 떨어져 있어, 합성을 위한 상이한 올리고뉴클레오타이드 상에 존재할 경우, 잔기를 "우수한" 상관관계로 위치시키거나, 이들을 가변 잔기로서 완전히 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 라이브러리를 다수의 단계에서 생성시켜, 클러스터 돌연변이가 오직 함께 나타나게 할 수 있다. 이러한 과정, 즉 돌연변이 클러스터를 확인하여 이들을 동일한 올리고뉴클레오타이드 상에 위치시키거나 클러스터를 보존하는 다수의 단계에서 이들을 라이브러리 또는 라이브러리 생성으로부터 제거하는 과정은, 라이브러리를 적당하게 폴딩된 단백질로 상당히 풍부하게 할 수 있다. 클러스터의 확인은 많은 방법으로, 예를 들면, 공지된 패턴 인식 방법, 돌연변이 발생 빈도 비교를 사용하거나 실험적으로 생성될 서열의 에너지 분석을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들면, 상호작용 에너지가 높은 경우, 위치가 상호관련되어 있다). 이러한 상관관계는 위치적 상관관계 (예: 가변 위치 1번과 2번은 항상 함께 변화하거나 절대 함께 변화하지 않는다) 또는 서열 상관관계 (예: 1번 위치에 잔기 A가 있는 경우, 2번 위치에 항상 잔기 B가 있다)일 수 있다[참조: 참조로서 명백히 인용된, Pattern Discovery in Biomolecular Data : Tools , Techniques , and Applications; (Jason T. L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha eds., New York, Oxford University, 1999); Andrews, Introduction to Mathematical Techniques in Pattern Recognition (New York, Wiley-Interscience, 1972); Applications of Pattern Recognition (K. S. Fu ed., Boca Raton, FL, CRC Press, 1982); Genetic Algorithms for Pattern Recognition (Sankar K. Pal and Paul P. Wang eds., Boca Raton, FL, CRC Press, 1996); Pandya, Pattern Recognition with Neural Networks in C++ (Boca Raton, FL, CRC Press, 1996); Handbook of Pattern Recognition & Computer Vision (C. H. Chen, L. F. Pau, and P. S. P. Wang, eds., 2nd ed. Singapore; River Edge, N.J., World Scientific, cl999); Friedman, Introduction to Pattern Recognition : Statistical , Structural , Neural , and Fuzzy Logic Approaches (River Edge, N.J., World Scientific, 1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32)]. 또한, 컨센서스 모티프(consensus motif)를 검색하는데 사용되는 프로그램을 사용할 수도 있다.
코돈이 삽입 또는 결실된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 상이한 길이의 단백질을 발현하는 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 특히, 삽입 또는 결실에 대한 계산적 서열 스크리닝으로 상이한 길이의 단백질을 한정하는 2차 라이브러리를 생성할 수 있고, 이는 상이한 길이의 혼합된 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리에 의해 발현될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 계열(예: 돌연변이체의 집합)을 셔플링하여 생성시킨다: 즉, 최상위 서열(순위 목록을 사용하는 경우)의 일부 집합을 오류 빈발 PCR의 존재 또는 부재 하에서 셔플링할 수 있다. 이와 관련하여 "셔플링"은, 일반적으로 임의의 방식으로, 관련된 서열을 재조합하는 것을 의미한다. 여기에는 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제5,830,721호; 제5,811,238호; 제5,605,793호; 제5,837,458호 및 PCT US/19256에서 정의되고 예시된 "셔플링"이 포함될 수 있다. 이러한 서열 집합은, 예를 들면, 확률 표 (예: SCMF를 사용하여 생성된 것) 또는 몬테 카를로(Monte Carlo) 집합으로부터의 인위적인 집합일 수도 있다. 유사하게, "계열"은 최상위 10개 및 최하위 10개의 서열, 최상위 100개의 서열 등일 수 있다. 이는 오류 빈발 PCR을 사용하여 수행할 수도 있다.
따라서, 인-실리코(in silico) 셔플링은 본원에서 기술된 계산적 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예: 2개의 라이브러리 또는 2개의 서열로 시작하여, 서열의 임의의 재조합을 생성시키고 평가할 수 있다).
오류 빈발 PCR을 수행하여 변이 CKI 폴리펩티드의 라이브러리를 생성시킬 수 있다[참조: 본원에 참조로서 인용된, 미국 특허 제5,605,793호, 제5,811,238호 및 제5,830,721호]. 이는 최적 서열에 대해, 또는 라이브러리 또는 일부 다른 인위적인 집합 또는 계열의 최상위 일원에 대해 수행할 수 있다. 이 방법에서, 1차 라이브러리의 계산적 스크리닝에서 발견된 최적 서열에 대한 유전자를 합성할 수 있다. 이어서, 오류 빈발 PCR을, 라이브러리의 변이 위치에 있는 돌연변이를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드(바이어스(bias) 올리고뉴클레오타이드)의 존재 하에서 최적 서열 유전자에 대해 수행한다. 올리고뉴클레오타이드의 첨가는 라이브러리에서 돌연변이의 혼입을 유리하게 하는 바이어스를 생성시킬 것이다. 대안으로, 오직 특정 돌연변이에 대한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 라이브러리를 바이어스시킬 수 있다.
유전자 셔플링을, 바이어스 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서, 최적 서열에 대한 유전자에 대해 오류 빈발 PCR로 수행하여, CKI 라이브러리에서 발견되는 돌연변이의 비율을 반영하는 DNA 서열 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 바이어스 올리고뉴클레오타이드의 선택은 다양한 방법으로 수행할 수 있다; 이들은 이들의 빈도에 따라 선택될 수 있다, 예를 들면, 돌연변이 빈도가 높은 위치를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다; 대안으로, 가장 가변적인 위치를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 다양성이 증가되게 할 수 있다; 2차 라이브러리를 정렬시킨 경우, 다수의 최상위 득점 위치를 사용하여 바이어스 올리고뉴클레오타이드를 생성시킬 수 있다; 임의의 위치를 선택할 수 있다; 소수의 상위 득점 위치 및 소수의 하위 득점 위치를 선택할 수 있는 방법 등이 있다. 중요한 것은 바람직한 가변 위치 및 서열에 따라 새로운 서열을 생성시키는 것이다.
다른 변이에서, 야생형 유전자 또는 다른 유전자를 사용하는 PCR을 사용할 수 있다. 이 양태에서, 시작 유전자 (예: 야생형 유전자, 전반적으로 최적화된 서열을 암호화하는 유전자, 또는 예를 들면 상이한 유기체로부터의 상동 서열을 정렬하여 얻은 컨센서스 서열)를 사용한다. 이 양태에서, 변이 위치에 상응하고 라이브러리의 상이한 아미노산을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 말단에서 PCR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다. 이는 두가지 이점을 제공한다. 첫번째로, 이는 일반적으로 보다 적은 올리고뉴클레오타이드를 요구하고 오류가 보다 적게 일어날 수 있다. 두번째로, 야생형 유전자를 사용하는 경우, 합성할 필요가 없다는 점에서 실험적인 장점을 갖는다.
돌연변이 CKI 폴리펩티드는 임의의 수의 유기체로부터의 것일 수 있으며, 식물로부터의 CKI 폴리펩티드가 특히 바람직하다. 적당한 식물에는, 예를 들면, 형질전환 기술에서 사용가능한 고등 식물 계열, 예를 들면 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물 뿐만 아니라, 조류와 같은 특정 하등 식물이 포함된다. 여기에는 다배체, 이배체 및 반수체를 포함하는 다양한 배수성 수준의 식물이 포함된다. 특정 양태에서, 식물은 브라시카 나푸스, 아라비돕시스 탈리아나, 글리신 막스(Glycine max), 옥수수, 벼, 밀, 알팔파(alfalfa), 목화, 포플러나무 등이다.
위에 기술한 바와 같이, 본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 야생형 CKI 폴리펩티드의 우성 음성 길항제이다. 특정 양태에서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 이와 상응하는 사이클린 또는 CDK 단백질 (즉, CKI 돌연변이체가 유래된 종으로부터의 내생적인 천연 CDK 또는 사이클린 단백질) 중 하나 또는 둘다와 물리적으로 상호작용하여, 돌연변이 CKI를 포함하는 CDK/사이클린 복합체를, 야생형 CKI 단백질에 의한 CDK/사이클린 키나제 억제에 대해 보호한다.
대안적인 비-상호배타적인 양태에서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 이종성 CDK 또는 사이클린 단백질 (즉, CKI 돌연변이체가 유래된 종과 상이한 종으로부터의 천연 CDK 또는 사이클린 단백질) 중 하나 또는 둘다와 물리적으로 상호작용하여, 돌연변이 CKI를 포함하는 이종성 CDK/사이클린 복합체를, 복합체 내의 CDK 및 사이클린 단백질에 상응하는 야생형 CKI 단백질에 의한 (즉, CDK 및 사이클린 단백질에 대해 내생적인 야생형 CKI 단백질에 의한) CDK/사이클린 키나제 억제로부터 보호한다.
일부 양태에서, 본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 상응하는 야생형 CKI 단백질에 대해 매우 특이적인 길항제이다. 대안적인 양태에서, 본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 하나 이상의 야생형 CKI 폴리펩티드에 대한 특이적인 길항제이다. 예를 들면, 돌연변이 아라비돕시스 CKI 폴리펩티드는 오직 야생형 아라비돕시스 CKI 폴리펩티드의 특이적인 길항제이거나, 야생형 아라비돕시스, 브라시카 나푸스, 글리신 막스, 옥수수, 벼, 목화 및/또는 포플러나무 CKI 폴리펩티드에 대해 특이적일 수 있다. 또한, 돌연변이 브라시카 CKI 폴리펩티드는 오직 야생형 브라시카 CKI 폴리펩티드의 특이적인 길항제일 수 있거나, 야생형 아라비돕시스, 브라시카 나푸스, 글리신 막스, 옥수수, 벼, 밀, 알팔파, 목화 및/또는 포플러나무에 대한 특이적인 길항제이다.
돌연변이 CKI 폴리펩티드는 야생형 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 예를 들면, CDK 또는 사이클린 단백질 중 하나에 대한 변형된 결합 및 CDK/사이클린 키나제 복합체의 감소된 억제를 포함하는, 실질적으로 감소된 생물학적 활성을 나타낸다. 이러한 감소된 생물학적 활성은 생체내 및/또는 시험관내 검정을 사용하여 검사하고 확인할 수 있다. 적당한 검정에는 CDK/사이클린 키나제 활성 검정; CDK 또는 사이클린 결합 검정; 및 세포 증식 검정이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 야생형 CKI 폴리펩티드와 비교하여 생물학적 활성의 실질적인 감소는, 변이 CKI 폴리펩티드의 생물학적 활성이, 상응하는 야생형 CKI 폴리펩티드의 활성의 80% 미만 또는 70% 미만, 통상적으로 60% 미만 또는 50% 미만, 보다 통상적으로 40% 미만 또는 30% 미만, 그리고 바람직하게는 20% 미만 또는 10% 미만이라는 것을 의미한다.
일부 양태에서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, 본원에서 개관된 것에 추가적으로, 야생형 CKI 폴리펩티드와 비교하여 변형을 포함한다 (즉, 돌연변이 CKI 단백질은 상응하는 야생형 CKI 단백질과 비교하여 우성 음성 단백질을 생성시키는데 사용된 것 이외의 추가적인 변형을 함유할 수 있다). 예에는 이.콜라이에서의 가용성 발현을 가능하게 하기 위하여 도입된 아미노산 치환 및 용액 작용(solution behavior)을 최적화시키기 위하여 도입된 아미노산 치환이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본원에서 개관된 바와 같이, 본원에서 기술된 임의의 돌연변이를 임의의 방법으로 조합시켜 추가적인 변이 CKI 폴리펩티드를 형성시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 에피토프(epitope) 또는 정제 태그의 부가, 다른 융합 서열의 부가 등에 의해, 상응하는 야생형 단백질보다 긴 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 생성되거나, 보다 짧을 수 있다.
돌연변이 CKI 폴리펩티드는 돌연변이 CKI 핵산에 의해 암호화되는 것으로서 확인할 수도 있다. 핵산의 경우에, 핵산 서열의 전체 서열 동일성은 아미노산 서열 동일성과 부합하지만, 유전자 암호의 축퇴 및 상이한 유기체의 코돈 바이어스가 고려된다. 따라서, 핵산 서열 동일성은 단백질 서열의 동일성보다 낮거나 높을 수 있고, 서열 동일성이 낮은 것이 통상적이다.
당업자가 인식하는 바와 같이, 유전자 암호의 축퇴로 인하여, 본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 매우 많은 수의 핵산이 생성될 수 있다. 따라서, 특정 아미노산 서열이 확인되면, 돌연변이 CKI 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방법으로 하나 이상의 코돈의 서열을 단순히 변형시켜, 돌연변이 단백질을 암호화하는 임의의 수의 상이한 핵산을 생성시킬 수 있다.
본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드 및 핵산은 (합성적으로 제조하지 않은 경우) 바람직하게는 재조합체이다. 위에 언급한 바와 같이, 돌연변이체는 통상적으로, 카세트(cassette) 또는 PCR 돌연변이유발 또는 당업계에 익히 공지된 다른 기술을 사용하여, 상응하는 CKI 단백질을 암호화하는 DNA 내의 뉴클레오타이드의 부위-특이적 돌연변이유발에 의해, 돌연변이체를 암호화하는 DNA를 생성시킨 후, DNA를 재조합 세포 배양물 중에서 발현시켜 제조한다. 아미노산 서열 돌연변이체는 돌연변이의 미리결정된 성질, 돌연변이 CKI 단백질 아미노산 서열의 천연 대립유전자 또는 종간 변이로부터 구별되는 특징에 의해 특성이 규명된다. 위에 개관된 바와 같이, 변이체는 통상적으로 CDK 또는 사이클린 단백질의 유사한 결합을 나타낸다 (따라서, 상응하는 야생형 CKI 단백질과 비교하여, 돌연변이체는 억제 활성에 있어서 실질적인 감소를 나타낸다); 하지만 추가적인 변이체 특징을 갖는 변이체가 선별될 수도 있다.
아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 부위 또는 영역은 미리결정되지만, 돌연변이 그 자체는 미리결정되지 않는다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 능력을 최적화시키기 위하여, 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고, 발현된 변이 CKI 단백질을 목적하는 활성의 최적 조합에 대해 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 미리결정된 부위에서 치환 돌연변이를 만드는 기술은 익히 공지되어 있다 (예: M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발). 돌연변이체의 스크리닝은 최적 특성에 대한 돌연변이 CKI 단백질 활성의 검정을 사용하여 수행한다.
일부 양태에서, 아미노산 치환은 단일 잔기 치환이다. 다른 양태에서, 다수의 아미노산 잔기를 치환시킨다 (예: 2, 3, 4개 또는 그 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있다). 삽입은 통상적으로 약 1 내지 약 20개의 아미노산의 범위이지만, 상당히 큰 삽입도 허용될 수 있다. 결실은 약 1 내지 약 20개의 잔기 또는 약 1 내지 약 30개의 잔기의 범위이지만, 일부 경우에 결실은 매우 클 수 있다. 특정 양태에서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 2개 이상의 야생형 CKI 단백질로부터 유래된 키메라(chimera)이고, 본원에서 개관된 CDK 또는 사이클린 결합 영역 내에 하나 이상의 변형을 갖는다.
치환, 결실, 삽입 또는 이의 임의의 조합을 사용하여 최종 돌연변이체에 도달한다. 일반적으로, 변형(들)은 상대적으로 적은 아미노산에 대해 수행하여 분자의 변화를 최소화시킨다. 하지만, 특정 환경에서 큰 변화가 허용될 수 있다.
돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산을 사용하여, 다양한 벡터를 제조할 수 있다. 숙주 세포에 적합한 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유하는 임의의 벡터를 본 발명의 실시에서 사용할 수 있다. 벡터는 자가 복제성 염색체외 벡터 또는 숙주 게놈 속에 통합되는 벡터일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 전사 및 해독 조절 핵산 영역을 포함한다. "제어 서열"이라는 용어는 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 말한다. 원핵생물에 대해 적당한 제어 서열은, 예를 들면, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 전사 및 해독 조절 핵산 영역은 일반적으로 폴리펩티드를 발현시키는데 사용되는 숙주 세포에 적당할 것이다.
특정 양태에서, CKI 핵산을 숙주 세포에서 유전자 발현을 향상시키기 위하여 코돈 최적화를 사용하여 변형시키고, 여기에는 코돈 서열을 DNA 분자가 발현될 세포의 종에서 많이 사용되는 해독 코돈(동일한 아미노산에 상응함)으로 치환시킴이 포함된다. 옥수수에서의 발현을 위하여 최적화된 BnKrp1 돌연변이체 암호화 서열의 예 (BnKrp1 F151A;F153A 및 Y149A;F151A;F153A)는 도 3에 제시되어 있다. 코돈 최적화 과정은 일반적으로 당업계에 익히 공지되어 있고, 당업자는 이를 사용하여 본 발명에 따른 다른 코돈 최적화된 돌연변이체 Krp1 서열을 수득할 수 있다.
많은 종류의 적당한 발현 벡터 및 적당한 조절 서열은 다양한 숙주 세포에 대해 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 전사 및 해독 조절 서열은, 예를 들면, 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 해독 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 엑티베이터 서열을 포함할 수 있다. 통상적인 양태에서, 조절 서열은 프로모터 및 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 벡터는 또한 통상적으로 외래 DNA의 삽입을 위한 다수의 제한 부위를 함유하는 폴리링커(polylinker) 영역을 포함한다. 복제 서열, 조절 서열, 표현형 선별 유전자를 암호화하는 DNA, 및 관심대상의 변이 CKI DNA를 함유하는 적당한 벡터의 작제는 표준 재조합 DNA 과정을 사용하여 실시한다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 분리된 플라스미드, 바이러스 벡터 및 DNA 단편을 절단하고 테일러링(tailoring)하여 특정한 순서로 함께 연결시켜 목적하는 벡터를 생성시킨다[참조: Maniatis, supra 및 Sambrook et al., supra].
프로모터 서열은 구성적(constitutive) 또는 유도성 프로모터를 암호화한다. 프로모터는 천연 프로모터 또는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 하나 이상의 프로모터의 요소가 결합된 하이브리드 프로모터는 또한 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에서 유용하다. 통상적인 양태에서, 프로모터는 강력한 프로모터로서, 세포, 특히 식물 세포에서 높은 발현을 가능하게 한다. 본 발명에 따라 사용하는데 특히 적당한 프로모터는 아래에 추가로 기술된다.
또한, 발현 벡터는 추가적인 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가지고 있어서, 이로 인해 2개의 유기체에서, 예를 들면, 발현의 경우 식물 또는 곤충 세포에서 유지되고 클로닝 및 증폭의 경우 원핵생물 숙주에서 유지되게 할 수 있다. 또한, 발현 벡터의 통합을 위하여, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈에 대한 하나 이상의 서열 상동체, 그리고 바람직하게는 발현 작제물의 측면에 위치하는 2개의 상동 서열을 함유한다. 통합되는 벡터는, 벡터 내에 포함되는데 적당한 상동 서열을 선별하여 숙주 세포 내의 특정한 좌(locus)로 지시될 수 있다. 통합 벡터를 위한 작제물은 당업계에 익히 공지되어 있다.
특정 양태에서, 발현 벡터는 선별가능 마커 유전자를 함유하여 형질전환된 숙주 세포의 선별을 가능하게 한다. 선별 유전자는 당업계에 익히 공지되어 있고 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 적당한 선별 유전자에는, 예를 들면, 앰피실린 및/또는 테트라사이클린 내성을 암호화하는 유전자가 포함될 수 있고, 이들은 이러한 벡터로 형질전환된 세포가 이러한 항생제의 존재 하에서 성장할 수 있게 한다.
본 발명의 한가지 양상에서, 돌연변이 CKI 핵산을 단독으로 또는 벡터와 함께 세포 속에 도입시킨다. "~ 속에 도입시킨다" 또는 본원의 문법적 동의어는, 핵산이 핵산의 후속적인 통합, 증폭 및/또는 발현에 적당한 방식으로 세포 속에 들어가는 것을 의미한다. 도입 방법은 표적화된 세포의 종류에 따라 주로 결정된다. 대표적인 방법에는 CaPO4 침전, 리포좀 융합, 리포펙틴(lipofectin)®, 전기천공(electroporation), 바이러스 감염 등이 포함된다. 식물 속으로의 도입에 특히 적당한 방법은 당업계에 공지되어 있고 또한 아래에 기술되어 있다 (제2장 "유전자전이 식물"을 참조한다). 이러한 방법에는, 예를 들면, DNA 적재된 미세발사체(DNA laden microprojectile)를 사용한 세포 포격(bombardment)이 포함된다. 돌연변이 CKI 핵산은 숙주 세포의 게놈 속에 안정하게 통합되거나, 세포질에 일시적으로 또는 안정하게 존재할 수 있다 (예: 표준 조절 서열, 선별 마커 등을 사용하는 통상적인 플라스미드의 사용을 통해).
원핵생물은 본 발명의 초기 클로닝 단계를 위하여 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 이들은 대량의 DNA의 신속한 생산, 부위-지시된 돌연변이유발에 사용되는 일본쇄 DNA 주형의 생산, 많은 돌연변이체의 동시적인 스크리닝, 및 생성된 돌연변이체의 DNA 서열분석에 특히 유용하다. 적당한 원핵생물 숙주 세포에는 이.콜라이 K12 균주 94 (ATCC 수탁번호 31,446), 이.콜라이 균주 W3110 (ATCC 수탁번호 27,325), 이.콜라이 X1776 (ATCC 수탁번호 31,537) 및 이.콜라이 B가 포함된다; 하지만 많은 다른 이.콜라이 균주 (예: HB101, JM101, NM522, NM538, NM539) 및 많은 다른 원핵생물 종 및 속, 예를 들면 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 간균, 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세산스(Serratia marcesans)와 같은 엔테로박테리아과(enterobacteriaceae), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종은 모두 숙주로서 사용될 수 있다. 견고한 세포벽을 갖는 원핵생물 숙주 세포 또는 다른 숙주 세포는 통상적으로 문헌[참조: Sambrook et al., supra]의 제1.82장에 기술된 염화칼슘 방법을 사용하여 형질전환시킨다. 대안으로, 전기천공을 사용하여 이러한 세포를 형질전환시킬 수 있다. 원핵생물 형질전환 기술은, 예를 들면 문헌[참조: Dower, in Genetic Engineering , Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth . Enymol., 204:63, 1991]에 제시되어 있다. 이.콜라이의 형질전환에 통상적으로 사용되는 플라스미드에는 pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCI18, pUCI19 및 Bluescript M13이 포함되고, 이들은 모두 문헌[참조: Sambrook et al., supra]의 제1.12장 내지 제1.20장에 기술되어 있다. 하지만, 많은 다른 적당한 벡터 역시 사용가능하다.
본 발명의 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 통상적으로, 돌연변이 CKI 폴리펩티드의 발현을 유도하거나 초래하는데 적당한 조건 하에서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 생산된다. 세포 분열의 조절을 위하여, CKI 단백질을 정상적인 세포내 형태로 발현시킨다. 돌연변이 CKI 폴리펩티드의 회수 또는 분리를 포함하는 본 발명의 적용을 위하여, CKI 돌연변이체를 세포내 단백질로서 또는, 대안으로, 숙주 세포로부터 분비되는 형태로 발현시킬 수 있다. 일반적으로 세포로부터 분비되는 많은 진핵생물 단백질은 내생적 분비 시그날 서열을 아미노산 서열의 일부분으로서 함유한다. 따라서, 일반적으로 세포질에서 발견되는 단백질은, 시그날 서열을 단백질에 연결시켜 분비되게 표적화시킬 수 있다. 이는 시그날 서열을 암호화하는 DNA를 단백질을 암호화하는 DNA의 5' 말단에 연결시키고 나서, 이 융합 단백질을 적당한 숙주 세포에서 발현시키는 방법으로 쉽게 달성된다. 시그날 서열을 암호화하는 DNA는, 시그날 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 임의의 유전자로부터 제한 단편으로서 수득할 수 있다. 따라서, 원핵생물, 효모 및 진핵생물 시그날 서열은 본 발명을 실시하는데 사용되는 숙주 세포의 종류에 따라 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 사람 성장 호르몬, 프로인슐린 및 프로알부민을 포함하는 다수의 진핵생물 유전자의 시그날 서열 부분을 암호화하는 DNA 및 아미노산 서열은 공지되어 있고[참조: Stryer, Biochemistry (W.H. Freeman and Company, New York, NY, 1988, p.769], 적당한 진핵생물 숙주 세포에서 시그날 서열로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 산 포스파타제[참조: Arima et al., Nuc . Acids Res. 11:1657, 1983], α-인자, 알칼리성 포스파타제 및 인버타제와 같은 효모 시그날 서열을 사용하여 효모 숙주 세포로부터의 분비를 지시할 수 있다. 예를 들면, LamB 또는 OmpF[참조: Wong et al., Gene 68:193, 1988], MalE, PhoA 또는 베타-락타마제를 암호화하는 유전자 뿐만 아니라, 다른 유전자로부터의 원핵생물 시그날 서열을 사용하여 원핵생물 세포에서 발현되는 단백질을 배양 배지 속으로 표적화시킬 수 있다.
돌연변이 CKI 폴리펩티드 발현에 적당한 조건은 발현 벡터 및 숙주 세포의 선택에 따라 달라질 것이고, 당업자가 일상적인 실험을 통해 쉽게 결정할 것이다. 예를 들면, 발현 벡터에서 구성적 프로모터의 사용은 숙주 세포의 성장 및 증식을 최적화시킴을 요구할 것이지만, 유도성 프로모터의 사용은 유도에 적당한 성장 조건을 요구한다. 또한, 일부 양태에서, 회수 시기가 중요하다. 예를 들면, 곤충 세포 발현에서 사용되는 배큘로바이러스(baculovirus) 시스템은 용해성(lytic) 바이러스이므로, 회수 시기 선택이 산물 회수율에 중요할 수 있다.
원핵생물 벡터에서 가장 통상적으로 사용되는 프로모터에는 p-락타마제(페니실리나제) 및 락토스 프로모터 시스템[참조: Chang et al., Nature 375:615, 1978; Itakura et al., Science 198:1056, 1977; Goeddel et al., Nature 281:544, 1979] 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템[참조: Goeddel et al., Nucl . Acids Res. 8:4057, 1980; EPO 공개 공보 제36,776호] 및 알칼리성 포스파타제 시스템이 포함된다. 이들이 가장 통상적으로 사용되지만, 다른 미생물 프로모터도 사용되며, 이들의 뉴클레오타이드 서열에 관한 상세한 설명이 공개되어, 당업자는 이들을 플라스미드 벡터에 기능적으로 연결시킬 수 있다[참조: Siebenlist et al., Cell 20:269, 1980].
본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 반응성 프로모터 시스템의 설명적 예로는 옥수수의 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 시스템이 있다. GST는 종종 출아 전(pre-emergent) 제초제로서 사용되는 많은 소수성 친전자성 화합물을 해독시킬 수 있는 효소의 계열이다[참조: Weigand et al., Plant Molecular Biology 7:235-243, 1986]. 연구를 통해 GST가 이러한 향상된 제초제 내성을 일으키는데 직접적으로 관련되어 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 작용은 특정한 1.1kb mRNA 전사 산물을 통해 주로 매개된다. 간단하게, 옥수수는 외부 자극에 대해 반응할 수 있고 유전자 산물을 생산하도록 유도될 수 있는 이미 존재하는 천연 휴지(quiescent) 유전자를 갖고 있다. 이 유전자는 이전에 확인되고 클로닝되었다. 따라서, 본 발명의 한가지 양태에서, 프로모터를 GST 반응성 유전자로부터 제거하여 돌연변이 CKI 암호화 서열에 부착시킨다. 돌연변이 CKI 유전자가 게놈 DNA 공급원으로부터 유래한 경우, 키메릭 유전자를 작제하는 동안 천연 프로모터를 제거하는 것이 필요하다. 이러한 조작된 유전자는, 외부의 화학적 자극에 대해 반응하는 프로모터와 돌연변이 CKI 단백질의 성공적인 생산을 담당하는 유전자의 조합이다.
유도성 프로모터는 유도인자에 대해 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접적 또는 간접적으로 활성화시킬 수 있는 프로모터이다. 유도인자의 부재 하에서, DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 통상적으로 유도성 프로모터에 특이적으로 결합하여 전사를 활성화시키는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하며, 이후에 유도인자에 의해 직접적 또는 간접적으로 활성 형태로 전환된다. 유도인자는 화학 물질, 예를 들면 단백질, 대사산물, 성장 조절인자, 제초제 또는 페놀계 화합물, 또는 열, 냉, 염 또는 독성 요소에 의해 직접적으로 또는 바이러스와 같은 병원균 또는 병원체의 작용을 통해 간접적으로 부여되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 유도성 프로모터를 함유하는 식물 세포는, 예를 들면 분사, 급수, 가열 또는 유사한 방법으로, 세포 또는 식물에 유도인자를 외부적으로 가하여 유도인자에 노출시킬 수 있다. 식물 성장 동안 특정 시기에 표적 유전자의 발현을 활성화시키는 것이 바람직한 경우, 그 시기에 유도인자를 가할 수 있다.
이러한 유도성 프로모터의 예에는 열 충격 프로모터, 예를 들면 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)의 유도성 70KD 열 충격 프로모터[참조: Freeling et al., Ann . Rev . of Genetics 19:297-323]; 냉 유도성 프로모터, 예를 들면, 비.나푸스(B. napus)로부터의 냉 유도성 프로모터[참조: White et al., Plant Physiol. 106, 1994]; 및 에탄올에 의해 유도되는 알콜 데하이드로게나제 프로모터[참조: Nagao et al., Surveys of Plant Molecular and Cell Biology Vol. 3, p 384-438 (B.J. Miflin ed., Oxford University Press, Oxford, 1986)]가 포함된다.
구성적 프로모터는 유전자전이 식물의 모든 조직에서 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접적 또는 간접적으로 활성화시킬 수 있는 프로모터이다. 통상적으로, CaMC의 35S 프로모터[참조: Odell, Nature 313:810-812, 1985]와 같은 구성적 프로모터를 사용한다. 식물에서 유용한 구성적 프로모터의 다른 예에는 벼 액틴 프로모터[참조: Elroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990], 옥수수 HE 히스톤[참조: Lepetit et al., Mol . Gen . Genet. 231:276-285, 1992] 등이 포함된다.
본 발명의 CKI 전이유전자는, 초기 종자 발생에서 높은 수준의 발현을 지시하는 것으로 밝혀진 (즉, 나핀(napin) 프로모터 전에 전사되는) BCEA (비.캄페스트리스 (B. campestris) 배아) 프로모터와 같은 프로모터를 사용하여 발현시킬 수 있다. 이는 브라시카 종자에서 저장 산물이 축적되기 전이지만 색소가 빠르게 생합성되는 기간이다[참조: Johnson-Flanagan et al., J. Plant Physiol. 136:180, 1989; Johnson-Flanagan et al., Physiol . Plant 81:301, 1991]. 종자 저장 단백질 프로모터는 또한 종자-특이적 방식으로 높은 수준의 발현을 지시하는 것으로 밝혀졌다[참조: Voelker et al., Plant Cell 1:95, 1989; Altenbach et al., Plant Mol. Biol. 13:513, 1989; Lee et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:6181, 1991; Russell et al., Transgenic Res. 6:157-68, 1997]. 나핀 프로모터는 유전자전이 브라시카에서 올레오신(oleosin) 유전자 발현을 지시하여, 올레오신이 총 종자 단백질의 대략 1%로 축적되게 하는 것으로 밝혀졌다[참조: Lee et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 99:6181, 1991]. 프로모터를 선택함에 있어서, 다른 조직에서의 발현에 영향을 주지 않으면서 특정 조직에서 억제 또는 과발현을 가능하게 하는 조직-특이적 또는 발생적으로 조절되는 프로모터를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "조직 특이적 프로모터"는, 예를 들면, 뿌리, 잎, 줄기, 암술, 꽃밥, 꽃잎, 종자 껍질, 종자 주심(nucellus) 또는 상피 층과 같은 특정 조직에서 주로 유전자 발현을 지시하는 암호화 영역을 말한다. 전사 자극인자, 인핸서 또는 활성인자를 조직 특이적 프로모터 속에 통합시켜 조직 특이성을 유지하면서 높은 수준의 활성을 갖는 프로모터를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 과발현에서 사용되는 프로모터는 바람직하게는 조직-특이적일 것이다. 종자 저장 부분에서 과발현을 시도하는 경우, 잎과 같은 부적당한 조직에서의 과발현은 해로울 수 있다. 특히 적당한 프로모터는, 예를 들면, 종자 특이적, 뿌리 특이적, 잎 특이적, 과실 특이적 발현 등을 가능하게 하는 것이다. 이는 종자, 뿌리, 잎 및 과실이 특정 관심대상이므로 특히 유용할 수 있다. 상이한 조직 종류에 특이적인 일부 프로모터는 이미 사용가능하거나 익히 확립된 기술[참조: 미국 특허 제5,792,925호; 제5,783,393호; 제5,859,336호; 제5,866,793호; 제5,898,096호 및 제5,929,302호]에 의해 그리고 아래에 추가로 기술된 바와 같이 분리할 수 있다. 표 1에는 본 발명을 실시하는데 사용할 수 있는 다른 배아 특이적 프로모터를 열거한다.
배아 특이적 프로모터
프로모터 배아 배젖 시기 참고문헌
아라비돕시스의 올레오신 강력함, 일정함 없음 중심부에서는 낮고, 초기 내지 후기 떡잎 단계에 높음 Al et al., Plant Mol. Biol. 25:193-205, 1994
비시아 파바(Vicia faba)의 USP 강력함, 일정함 없음 초기에는 알려져 있지 않고, 후기 떡잎 단계에 강력함 Baumlein et al., Mol . Gen . Genet. 225:459-467, 1991
비시아 파바의 레구민(legumin) 강력함, 떡잎에서 우선적임 호분(aleurone) 층 (후기) 초기에는 알려져 있지 않고, 후기 떡잎 단계에 강력함 Baumlein et al., supra, 1991
브라시카의 나핀 ? 후기 Kohno-Murase, Plant Mol . Biol. 26:1115-1124, 1994
아라비돕시스의 알부민 S1 오직 축(axis)에서 없음 초기 내지 후기 떡잎 단계 Guerche et al., Plant Cell 2:469-478, 1990
알부민 S2 축 및 떡잎에서 없음 초기 내지 후기 떡잎 단계 Guerche et al., supra, 1990
본 발명의 특정 양태에서, 미성숙 종자의 배아기 식물의 발생 동안에 특히 활성인 종자 특이적 프로모터가 관심대상이다. 종자 발생 초기에 본 발명의 우성 음성 돌연변이체의 발현은 종자 발생 초기에 세포 분열을 증가시키는데 바람직할 수 있다. 이 시기에 세포 분열이 많아지면 배아의 크기가 커질 수 있다. 배아의 조성에서 대략 33%가 오일이므로 크기가 큰 배아는 오일 함량이 증가할 것이다. 배아에서는 본 발명을 발현시키고 다른 식물 조직에서는 낮게 발현시키거나 발현시키지 않는데 적당한 프로모터는 종자 오일 함량을 증가시키는데 있어서 관심대상이다. 초기 단계-특이적 배아 발생에서 발현을 개시시키는 프로모터 서열이 특히 관심대상이다. 초기 단계-특이적 프로모터는 아라비돕시스에서 수분(pollination) (대벌레(walking stick)) 후 7일 전에 또는 다른 식물 종에서 동등한 시기에 단백질의 발현을 개시시키는 프로모터이다. 특히 관심대상인 프로모터 서열의 예에는 아미노산 퍼미아제(amino acid permease) 유전자(AAP1)에 대한 프로모터 (예: 아라비돕시스 탈리아나의 AAP1 프로모터), 올레에이트 12-하이드록실라제:데세츄라제(oleate 12-hydroxylase:desaturase) 유전자에 대한 프로모터 (예: 레스퀘렐라 펜들레리(Lesquerella fendleri)의 LFAH12로 명명된 프로모터), 2S2 알부민 유전자에 대한 프로모터 (예: 아라비돕시스 탈리아나의 2S2 프로모터), 지방산 일롱가제(fatty acid elongase) 유전자 프로모터 (FAE1) (예: 아라비돕시스 탈리아나의 FAE1 프로모터), 및 잎 떡잎(leafy cotyledon) 유전자 프로모터 (LEC2) (예: 아라비돕시스 탈리아나의 LEC2 프로모터)가 포함된다. AAP1, LFAH12, 2S2 및 FAE1 프로모터는 배아 발생의 초기 단계에서 불활성이다. 이들은 발생 후기 단계에 점차 전사적으로 활성이 되는데, AAP1 이후에 LFAH12, 2S2가 활성화되고 나서 FAE가 활성화된다. 이어서, 모든 4개의 프로모터는 후기 배아 발생 단계 동안 활성으로 유지된다. LEC2 프로모터는 역 발현 프로파일을 갖는다. 이는 초기 배아 단계에서 활성이고, 그 후 후기 단계 동안 점차 활성이 감소한다. 관심대상인 다른 배아-특이적 프로모터에는 다음의 유전자의 프로모터가 포함된다: 시드스틱(Seedstick)[참조: Pinvopich et al., Nature 424:85-88, 2003], Fbp7 및 Fbp11 (페튜니아 시드스틱(Petunia Seedstick))[참조: Colombo et al., Plant Cell. 9:703-715, 1997], 바니얼스(Banyuls)[참조: Devic, Plant J., 19:387-398, 1999], ABI3[참조: Ng et al., Plant . Mol . Biol. 54:25-38, 2004], agl-15, Agl18[참조: Lehti-Shiu et al., Plant Mol . Biol. 58:89-107, 2005], Phe1[참조: Kohler, Genes Develop. 17:1540-1553, 2003], emb175[참조: Cushing et al., Planta. 221:424-436, 2005], L11[참조: Kwong et al., Plant Cell 15:5-18, 2003], Lec1[참조: Lotan, Cell 93:1195-1205, 1998], Fusca3[참조: Kroj et al., Development 130:6065-6073, 2003], TT12[참조: Debeaujon et al., Plant Cell 13:853-871, 2001], TT16[참조: Nesi et al., Plant Cell 14:2463-2479, 2002], A-RZf[참조: Zou and Taylor, Gene 196:291-295, 1997], TTG1[참조: Walker et al., Plant Cell 11:1337-1350, 1999], TT1[참조: Sagasser et al., Genes Dev. 16:138-149, 2002], TT8[참조: Nesi et al., Plant Cell 12:1863-1878, 2000) 및 Gea-8 (당근)[참조: Lin et al., J. Exp . Botany 50:1139-1147, 1999] 프로모터. 외떡잎 식물로부터의 배아 특이적 프로모터에는 보리로부터의 글로불린(Globulin), 녹스(Knox) (벼) [참조: Postma-Haarsma, Plant Mol . Biol. 39:257-271, 1999], 올레오신(Oleosin)[참조: Plant, Plant Mol . Biol. 25:193-205, 1994; Keddie, Plant Mol . Biol. 24:327-340, 1994], 퍼옥시레독신(Peroxiredoxin)(Per1)[참조: Haslekas et al., Plant Mol . Biol. 36:833-845, 1998; Haslekas et al., Plant Mol . Biol. 53:313-326, 2003], HvGAMYB[참조: Diaz et al., Plant J. 29:453-464, 2002] 및 SAD1[참조: Isabel-LaMoneda et al., Plant J. 33:329-340, 1999], 및 옥수수(Zea Maize) 하이브리드 프롤린 풍부 단백질 프로모터[참조: Jose-Estanyol et al., Plant Cell 4:413-423, 1992; Jose-Estanyol et al., Gene 356:146-152, 2005]가 포함된다.
종자 저장 단백질은 많은 식물에서 총 종자 단백질의 최대 90%를 차지할 수 있기 때문에 종자 저장 단백질의 프로모터도 특히 관심대상이다. 종자 저장 단백질은 엄격하게 조절되어, 매우 조직-특이적이고 단계-특이적인 방식으로 거의 종자에서만 발현된다[참조: Higgins et al., Ann . Rev . Plant Physiol. 35:191-221, 1984; Goldberg et al., Cell 56:149-160, 1989]. 또한, 상이한 종자 저장 단백질은 종자 발생의 상이한 단계에서 발현될 수 있다. 종자-특이적 유전자의 발현은 매우 상세히 연구되었다[참조: Goldberg et al., supra, 및 Higgins et al., supra]. 종자-특이적 프로모터의 예에는 아라비돕시스 및 다른 식물의 LFAH12, 및 토마스(Thomas) 등의 미국 특허 제5,977,436호(전문이 참조로서 인용됨)에 기술된 아라비돕시스 올레오신 유전자의 5' 조절 영역이 포함되고, 이는 이종성 유전자의 암호화 서열 또는 천연 식물 유전자에 대해 상보적인 서열에 작동가능하게 연결된 경우, 식물 종자에서 이종성 유전자 또는 상보적인 서열의 발현을 지시한다.
쌍떡잎 식물에 적당한 종자 저장 단백질 프로모터에는, 예를 들면, 콩 β-파세올린(phaseolin), 렉틴 및 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) 프로모터[참조: Sengupta-Gopalan, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 82:3320-3324, 1985; Hoffinan et al., Plant Mol . Biol. 11:171-129, 1988; Voelker et al., EMBO J. 6:3571-3577, 1987]; 유채씨(캐놀라) 나핀 프로모터[참조: Radke et al., Theor. Appl . Genet. 75:685-694, 1988]; 대두 글리시닌 및 콘글리시닌(conglycinin) 프로모터[참조: Chen et al., EMBO J. 7:297-302, 1988; Nielson et al., Plant Cell 1:313-328, 1989, Harada et al., Plant Cell 1:415-425, 1989; Beachy et al., EMBO J. 4:3047-3053, 1985]; 대두 렉틴 프로모터[참조: Okamuro et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83:8240-8244, 1986]; 대두 쿠니츠(Kunitz) 트립신 억제제 프로모터[참조: Perez-Grau et al., Plant Cell 1:1095-1109, 1989; Jofuku et al., Plant Cell 1:1079-1093, 1989]; 감자 파타틴(patatin) 프로모터[참조: Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8:23-29, 1989]; 완두 콘비실린(convicilin), 비실린(vicilin) 및 레구민(legumin) 프로모터[참조: Rerie et al., Mol . Gen . Genet. 259:148-157, 1991; Newbigin et al., Planta 180:461-470, 1990; Higgins et al., Plant Mol . Biol. 11:683-695, 1988; Shirsat et al., Mol. Gen . Genetics 215:326-331, 1989]; 및 고구마 스포라민(sporamin) 프로모터[참조: Hattori et al., Plant Mol . Biol. 14:595-604, 1990]가 포함된다.
외떡잎 식물의 경우, 본 발명의 실시에 유용한 종자 저장 단백질 프로모터에는, 예를 들면, 옥수수 제인(zein) 프로모터[참조: Schernthaner et al., EMBO J. 7:1249-1255, 1988; Hoffman et al., EMBO J. 6:3213-3221, 1987 (옥수수 15 kD 제인)]; 옥수수 18 kD 올레오신 프로모터[참조: Lee et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 888:6181-6185, 1991]; 왁시(waxy) 프로모터; 슈런켄(shrunken)-1 프로모터; 글로불린 1 프로모터; 슈런켄-2 프로모터; 벼 글루텔린(glutelin) 프로모터; 보리 홀데인(hordein) 프로모터[참조: Marris et al., Plant Mol . Biol. 10:359-366, 1988]; RP5[참조: Su et al., J. Plant Physiol. 158:247-254, 2001]; EBE1 및 2 옥수수 프로모터[참조: Magnard et al., Plant Mol . Biol. 53:821-836, 2003] 및 밀 글루테닌(glutenin) 및 글리아딘(gliadin) 프로모터[참조: 미국 특허 제5,650,558호; Colot et al., EMBO J. 6:3559-3564, 1987]가 포함된다.
비.나푸스 이소시트레이트리아제 및 말레이트 신타제[참조: Comai et al., Plant Cell 1:293-300, 1989]; 홍화(safflower)의 델타-9 데세츄라제[참조: Thompson et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:2578-2582, 1991] 및 피마자(castor)의 델타-9 데세츄라제[참조: Shanklin et al., Proc . Natl Acad . Sci . USA 88:2510-2514, 1991]; 아라비돕시스의 아실 운반체 단백질(ACP)[참조: Post-Beittenmiller et al., Nucl . Acids Res. 17:1777, 1989], 비.나푸스의 ACP[참조: Safford et al., Eur . J. Biochem. 174:287-295, 1988] 및 비.캄페스트리스의 ACP[참조: Rose et al., Nucl . Acids Res. 15:7197, 1987]; 보리의 β-케토아실-ACP 신테타제[참조: Siggaard-Andersen et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:4114-4118, 1991]; 및 옥수수의 올레오신[참조: Lee et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 88:6181-6185, 1991], 대두의 올레오신(Genbank 번호 X60773) 및 비.나푸스의 올레오신[참조: Lee et al., Plant Physiol. 96:1395-1397, 1991]에 대한 유전자의 프로모터도 본 발명의 실시에 적당하다.
본 발명의 실시에 유용한 다른 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 공지된 방법을 사용하여 본 발명에 따라 사용하는데 적당한 추가적인 프로모터를 분리할 수 있다. 예를 들면, 시차 스크리닝(differential screening) 기술을 사용하여 특정 (발생) 시기 (예: 과실 발생 동안)에 발현되는 프로모터를 분리할 수 있다.
키메릭 유전자 작제물에서 이종성 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 종자 특이적 유전자의 프로모터는 또한 유전자전이 식물에서 시간적 및 공간적 발현 패턴을 유지한다. 이러한 예에는 아라비돕시스 탈리아나 2S 종자 저장 단백질 유전자 프로모터를 사용하여 아라비돕시스 및 비.나푸스 종자에서 엔케팔린(enkephalin) 펩티드를 발현시키는 것[참조: Vandekerckhove et al., Bio/Technology 7:929-932, 1989], 콩 렉틴 및 콩 β-파세올린 프로모터를 사용하여 루시퍼라제를 발현시키는 것[참조: Riggs et al., Plant Sci. 63:47-57, 1989], 그리고 밀 글루테닌 프로모터를 사용하여 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제를 발현시키는 것[참조: Colot et al., supra]이 포함된다.
본 발명의 핵산 단편의 적절한 발현 수준을 달성하는 것은 상이한 프로모터를 사용하는 상이한 키메릭 유전자의 사용을 요구할 수 있다. 이러한 키메릭 유전자를, 단일 발현 벡터 내에 함께 또는 하나 이상의 벡터를 사용하여 순차적으로 숙주 식물 속에 전달할 수 있다.
또한, 인핸서는 종종 본 발명의 유전자의 발현을 증가시키는데 필요하거나 유용하다. 이러한 요소는 목적하는 단백질을 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결되어 있어야 하고, 조절 요소는 작동가능해야 한다는 것이 필요하다. 인핸서 또는 인핸서 유사 요소는 천연 또는 키메릭 핵산 단편일 수 있다. 여기에는 35S 프로모터에서 발견되는 것과 같은 바이러스 인핸서[참조: Odell et al., Plant Mol . Biol. 10:263-272, 1988], 오파인(opine) 유전자의 인핸서[참조: Fromm et al., Plant Cell 1:977-984, 1989], 또는 본 발명의 핵산 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터 속에 위치하는 경우에 전사를 증가시키는 임의의 다른 공급원으로부터의 인핸서가 포함될 것이다. 예를 들면, 작제물은 담배 식각 바이러스(TEV; Tobacco Etch Virus) 5' 비해독 리더(leader)에 연결된 이중 전사 인핸서를 갖는 CaMV 35S 프로모터를 포함할 수 있다. TEV 리더는 해독 인핸서로서 작용하여 생성되는 단백질의 양을 증가시킨다.
본원에서 기술된 것과 같은 적당한 프로모터 요소를, 익히 확립된 방법에 따라 돌연변이 CKI 핵산 서열 및 적당한 터미네이터(폴리아데닐화 영역)에 융합시킬 수 있다.
유전자전이 식물
본 발명의 또다른 양상에서, 돌연변이 CKI 전이유전자를 포함하는 유전자전이 식물이 제공된다. 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 발현하는 유전자전이 식물은, 예를 들면, 돌연변이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자전이 벡터(예: 플라스미드 또는 바이러스 벡터)를 식물 속으로 전달하여 수득할 수 있다. 통상적으로, 벡터가 플라스미드인 경우, 벡터는 또한, 예를 들면 카나마이신에 대한 내성을 암호화하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptII) 유전자와 같은 선별가능 마커 유전자를 포함한다. 가장 통상적인 식물 형질전환 방법은, 문헌[참조: Hoeckema et al. (Nature 303:179-181, 1983)]에 기술된 바와 같이, 표적 전이유전자를 식물 형질전환 벡터 속에 클로닝하고 나서, 이를 헬퍼 Ti-플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 투미파시엔스(Agrobacterium tumifaciens) 속에 형질전환시키는 방법으로 수행한다. 전이유전자 벡터를 함유하는 아그로박테리움 세포를, 문헌[참조: An et al. (Plant Physiology 81:301-305, 1986)]에 기술된 바와 같이, 형질전환될 식물의 잎 조각과 함께 배양한다[참조: Hooykaas, Plant Mol . Biol. 13:327-336, 1989]. 배양된 식물 숙주 세포의 형질전환은 일반적으로 위에 기술한 바와 같이 아그로박테리움 투미파시엔스를 통해 수행한다. 견고한 세포막 장벽을 갖지 않는 숙주 세포의 배양물을 통상적으로, 본래 문헌[참조: Graham et al. (Virology 52:546, 1978)]에 기술된 인산칼슘 방법을 사용하여 형질전환시키고, 문헌[참조: Sambrook et al., supra]의 제16.32장 내지 제16.37장에 기술된 바와 같이 변형시킨다. 하지만, DNA를 세포 속에 도입시키는 다른 방법, 예를 들면 폴리브렌(Polybrene)[참조: Kawai et al., Mol . Cell . Biol 4:1172, 1984], 원형질체(protoplast) 융합[참조: Schaffner, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:2163, 1980], 전기천공[참조: Neumann et al., 1982 EMBO J. 1 :841, 1982], 및 핵속으로의 직접적 미세주입[참조: Capecchi, Cell 22:479, 1980]을 사용할 수도 있다. 형질전환된 식물 캘러스(callus)는, 예를 들면, 카나마이신 및 적당량의 식물호르몬, 예를 들면 캘러스 및 신초(shoot) 유도를 위한 나프탈렌 아세트산 및 벤질아데닌을 함유하는 배지에서 세포를 성장시켜 선별가능 마커를 통해 선별할 수 있다. 이어서, 식물 세포를 재분화(regeneration)시키고, 생성된 식물을 당업자에게 익히 공지된 기술을 사용하여 토양으로 이동시킬 수 있다.
위에 기술된 방법 외에, 클로닝된 DNA를 광범위한 다양한 식물 종 (예: 겉씨식물, 속씨식물, 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물) 속으로 전달시키는 수많은 방법이 당업계에 공지되어 있다[참조: Methods in Plant Molecular Biology (Glick and Thompson eds., CRC Press, Boca Raton, FL, 1993); Vasil, Plant Mol . Biol. 25:925-937, 1994; 및 Komari et al., Current Opinions Plant Biol. 1:161-165, 1998 (전반적인 고찰); Loopstra et al., Plant Mol . Biol. 15:1-9, 1990; 및 Brasileiro et al., Plant Mol . Biol. 17:441-452, 1991 (나무의 형질전환); Eimert et al., Plant Mol . Biol. 19:485-490, 1992 (브라시카의 형질전환); Hiei et al., Plant J. 6:271-282, 1994; Hiei et al., Plant Mol . Biol. 35:205-218, 1997; Chan et al., Plant Mol . Biol . 22:491-506, 1993; 미국 특허 제5,516,668호 및 제5,824,857호 (벼 형질전환); 및 미국 특허 제5,955,362호 (밀 형질전환); 제5,969,213호 (외떡잎식물 형질전환); 제5,780,798호 (옥수수 형질전환); 제5,959,179호 및 제5,914,451호 (대두 형질전환)]. 대표적인 예에는 원형질체에 의한 전기천공-촉진된 DNA 도입[참조: Rhodes et al., Science 240:204-207, l988; Bates, Methods Mol . Biol. 111:359-366, 1999; D'Halluin et al., Methods Mol . Biol. 111:367-373, 1999; 미국 특허 제5,914,451호]; 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 원형질체 처리[참조: Lyznik et al., Plant Molecular Biology 13:151-161, 1989; Datta et al., Methods Mol . Biol., 111:335-334, 1999]; DNA 적재된 미세발사체를 사용한 세포 포격[참조: Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444, 1989; Boynton et al., Science 240:1534-1538, 1988; Register et al., Plant Mol . Biol. 25:951-961, 1994; Barcelo et al., Plant J. 5:583-592, 1994; Vasil et al., Methods Mol . Biol. 111:349-358, 1999; Christou, Plant Mol . Biol . 35:197-203, 1997; Finer et al., Curr . Top . Microbiol . Immunol. 240:59-80, 1999]이 포함된다. 또한, 식물 형질전환 전략 및 기술은 문헌[참조: Birch, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol . 48:297, 1997; Forester et al., Exp . Agric. 33:15-33, 1997]에 고찰되어 있다. 이러한 기술은 변이가 적기 때문에 광범위한 식물 종에 적용가능하다.
외떡잎식물 형질전환의 경우에, 입자 포격(particle bombardment)은 통상적으로 선택되는 방법이다. 하지만, 옥수수와 같은 외떡잎식물은 히에이(Hiei) 등의 미국특허 제5,591,616호에 기술된 아그로박테리움 형질전환 방법을 사용하여 형질전환시킬 수도 있다. 외떡잎식물(예: 옥수수) 형질전환을 달성하는 또다른 방법은, 배발생(embryogenic) 현탁 배양물로부터의 세포를 섬유의 현탁액 (5% w/v, Silar SC-9 수염결정(whisker)) 및 플라스미드 DNA (1㎍/㎕)와 혼합시키고 나서, 이를 Vortex Genie II 와동 혼합기[판매원: Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, USA] 상의 다중 샘플 헤드에 수직으로 위치시키거나, Mixomat 치과용 아말감 혼합기[판매원: Degussa Canada Ltd., Burlington, Ontario, Canada]의 받침대에 수평으로 위치시킨다. 이어서, 최고 속도로 60초 동안 혼합시키거나(예: Vortex Genie II를 사용), 고정된 속도로 1초 동안 진탕시켜(Mixomat를 사용) 형질전환을 수행한다. 이 과정으로 세포 집단이 생산되고, 이로부터 안정한 형질전환체를 선별할 수 있다. 식물을 안정하게 형질전환된 캘러스로부터 재분화시키고, 서던 하이브리드화 분석으로 이러한 식물 및 이들의 자손이 유전자전이 식물임을 밝힐 수 있다. 상기 접근법의 주요 장점은 간단함과 저비용이다. 입자 포격과 달리, 고가의 장비 및 물품을 필요로 하지 않는다. 식물 세포, 특히 옥수수의 형질전환을 위한 수염결정의 사용은, 예를 들면, 커피(Coffee) 등의 미국 특허 제5,464,765호에 기술되어 있다.
댄(Dan) 등의 미국 특허 제5,968,830호에는 대두의 형질전환 및 재분화 방법이 기술되어 있다. 홀(Hall) 등의 미국 특허 제5,969,215호에는 형질전환된 베타 불가리스(Beta vulgaris) 식물(예:사탕무)을 생산하는 형질전환 기술이 기술되어 있다.
각각의 상기 형질전환 기술은 장점과 단점을 갖고 있다. 각각의 기술에서, 플라스미드로부터의 DNA를 유전적으로 조작하여, 관심대상의 유전자 뿐만 아니라, 선별가능하고 스크리닝가능한 마커 유전자도 함유하게 한다. 선별가능 마커 유전자를 사용하여 통합된 플라스미드 카피를 갖는 세포만을 선별한다 (작제하여, 관심대상의 유전자 및 선별가능하고 스크리닝가능한 유전자가 하나의 단위로서 전달되게 한다). 스크리닝가능한 유전자는 관심대상의 유전자를 보유하는 세포만의 성공적인 배양을 위한 또다른 점검을 제공한다.
항생제 내성 선별가능 마커를 사용한 통상적인 아그로박테리움 형질전환은, 이러한 식물이 동물 및 사람으로의 항생제 내성 전파의 과도한 위험성을 지닌다는 일반 대중의 반대로 인하여 문제가 있다. 이러한 항생제 마커는 코마리(Komari) 등의 미국 특허 제5,731,179호에 기술된 것과 유사한 아그로박테리움 기술을 사용하여 식물을 형질전환시켜 식물로부터 제거시킬 수 있다. 항생제 내성 문제는, 미국 특허 제5,712,135호에 기술된 바와 같이, bar 또는 pat 암호화 서열을 사용하여 효과적으로 예방할 수도 있다. 이러한 바람직한 마커 DNA는, 글루타민 신테타제 억제제 제초제 포스피노트리신 (글루포시네이트) 및 글루포시네이트 암모늄 염(Basta, Ignite)의 작용을 억제시키거나 중화시키는 제2의 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화한다.
하나 이상의 이러한 유전자를 함유하는 플라스미드를, 임의의 이전에 언급한 기술로 식물 원형질체 또는 캘러스 세포 속에 도입시킨다. 마커 유전자가 선별가능 유전자인 경우, 오직 DNA 패키지(package)가 통합된 세포만이 적당한 식물독성제를 사용한 선별 하에서 살아남는다. 일단 적당한 세포가 확인되고 증식되면, 식물을 재분화시킨다. 형질전환된 식물로부터의 자손을 검사하여, DNA 패키지가 식물 게놈 속에 성공적으로 통합되었다는 것을 확인해야 한다.
형질전환의 성공에 영향을 주는 많은 요인이 있다. 외인성 유전자 작제물 및 이의 조절 요소의 설계 및 작제는, 식물 핵의 염색체 DNA 속으로의 외인성 서열의 통합 및 세포에 의해 발현될 전이유전자의 능력에 영향을 준다. 외인성 유전자 작제물을 비-치명적 방식으로 식물 세포 핵 속에 도입시키는 적당한 방법이 필수적이다. 중요하게는, 작제물이 도입되는 세포의 종류는, 전체 식물을 재생시킬 경우, 적당한 재분화 프로토콜 하에서, 재분화되는 종류이어야 한다.
사용 방법
본 발명의 또다른 양상에 따라, 식물 세포에서 세포 분열을 조절, 예를 들면, 증가시킨다. 본원에서 기술된 방법을 사용한 세포 분열의 증가와 같이, 조절될 수 있는 식물 세포는, 분리된 사이클린 및 CDK 결합 영역을 갖는 야생형 CKI 폴리펩티드를 발현하는 식물 세포이다. 일반적으로, 상기 방법은 식물 세포 내에서 본원에서 기술된 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 발현시키고, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 식물 세포 내에서 야생형 CKI의 생물학적 활성을 억제하게 함을 포함한다. 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 돌연변이 단백질을 암호화하는 재조합 핵산으로부터 발현된다. 또한, 특정 양태에서, 상기 방법은 식물 세포 속에 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산을 도입시킴을 추가로 포함한다. 이러한 재조합 분자의 작제 및 식물 세포 속으로의 도입을 포함하여, 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산은 위에 일반적으로 기술되어 있고, 아래의 실시예에 추가로 예시되어 있다. 세포 분열의 조절은, 유전자전이 식물에 대해 본원에서 앞서 기술된 바와 같이 생체내의 식물 세포에서 수행할 수 있다. 대안으로, 상기 방법은 시험관내의 식물 세포에서 수행할 수 있다.
본원에서 앞서 기술된 바와 같이, 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 변형을 갖는 CKI 아미노산 서열을 포함한다. 세포 분열 조절 방법과 관련하여, 참조 CKI 폴리펩티드는 세포 분열 조절을 수행할 식물 세포 내에서 발현되는 야생형 식물 CKI (통상적으로 내생적 야생형 CKI) 폴리펩티드일 수 있다. 대안으로, 본원에서 기술된 돌연변이 CKI 단백질의 사용은 돌연변이체가 유래된 야생형 CKI의 구조적 상동체 또는 계열 일원에 대해 우성 음성 길항제 활성을 가능하게 하므로, 참조 CKI 폴리펩티드는 식물 세포에서 발현되는 야생형 CKI 폴리펩티드에 대해 이종성이고 실질적으로 동등한 야생형 기능을 제공할 수 있는 야생형 CKI 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 내생적 CKI 단백질로부터 유래되지 않은 돌연변이 CKI 단백질을 식물 세포 내에서 발현시켜 내생적 야생형 CKI 기능을 억제시킨다 (예: 아라비돕시스 탈리아나 야생형 KRP 단백질로부터 유래된 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 사용하여, 예를 들면, 브라시카 나푸스, 글리신 막스, 옥수수 세포 등과 같은 비-이종성 식물 세포에서 야생형 KRP 기능을 억제시킬 수 있다). 브라시카 나푸스 등과 같은 다른 식물로부터 유래된 다른 이종성 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 사용할 수도 있다.
또한, 상기 방법의 특정 양태에서, 대다수의 관련된 CKI를 본 발명의 돌연변이 CKI를 사용하여 식물 세포 내에서 동시에 억제시킨다. 예를 들면, 일부 양태에서, 계열 내의 모든 내생적 CKI(예: KRP 계열 일원)를 동시에 억제시킨다. 위에 언급한 바와 같이, 본원에서 기술된 돌연변이 CKI 단백질은 변이체가 유래된 야생형 CKI의 구조적 상동체 또는 계열 일원 내에서 우성 음성 길항제 활성을 가능하게 하여, 이러한 다수의 상동체 또는 계열 일원의 동시적인 억제를 가능하게 한다. 따라서, 통상적인 양태에서, 표적화된 CDK 또는 사이클린 결합 영역 내에서 실질적인 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 다수의 (및 바람직하게는 모든) CKI를 식물 세포 내에서 억제시킨다. 예를 들면, 특정 양태에서, KRP 계열 일원은 주로 사이클린-CDK 키나제 활성의 억제를 담당하는 CDK 결합 영역 내에서 실질적인 서열 동일성을 공유하므로, 식물 세포 내의 다수의, 및 바람직하게는 모든, 내생적 KRP 계열 일원이 돌연변이 KRP CKI의 발현을 통해 억제되어 세포 분열이 조절된다.
위에 기술한 바와 같이, 내생적 CKI 단백질에 의한 사이클린/CDK 활성 억제를 효과적으로 차단하여, 식물 세포 내에서 세포 분열을 조절한다. 이러한 조절에는 세포 주기 진행의 가속화가 포함되고, 결국 세포 증식이 증가한다. 따라서, 생체내에서 (예: 유전자전이 식물, 상기 참조) 본원에서 제시된 방법을 사용하여, 작물 수확량 및/또는 종자 크기의 증가, 식물 활력 증가, 뿌리 질량 증가, 과일 크기 증가 등을 달성할 수 있다.
작물 수확량 증가는, 내생적 CKI 단백질에 의한 사이클린/CDK 활성 억제를 차단하여 식물 세포 주기가 조절된 특정 식물 조직 및 식물 종에 따라 다양한 형태로 나타날 수 있다.
옥수수, 벼, 밀, 보리, 대두, 캐놀라와 같은 종자 작물에서, 수확량 증가는 총 종자 수 증가, 종자 크기 증가, 또는 종자 수와 종자 크기 둘다의 증가의 형태를 취할 수 있다. 한가지 양태에서, 수확량 증가는 세포 분열을 증가시켜, 총 종자 수를 증가시키거나, 종자 크기를 증가시키거나, 종자 수와 종자 크기를 둘다 증가시키는, 돌연변이 CKI 단백질을 암호화하는 전이유전자를 발현시키는 방법으로, 임의의 종자 작물의 유전자전이 변종에서 달성된다. 한가지 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현을 구성적 프로모터로 조절한다. 또다른 대표적인 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 돌연변이 CKI 단백질의 효과를 농업경영학적으로 중요한 종자 작물의 구성요소인 종자로 표적화하는 종자-특이적 프로모터로 조절한다.
목적하는 산물이 오일인, 대두, 캐놀라, 동백, 아마, 옥수수, 홍화 또는 해바라기 등과 같은 유량종자(oilseed) 작물의 경우, 수확량 증가는 식물 당 오일 생산량의 증가의 형태를 취한다. 오일은 종자 내의 배아로부터 유래된다. 한가지 양태에서, 오일 생산량 증가는 세포 분열을 증가시켜, 총 종자 수를 증가시키거나, 배아 크기를 증가시키거나, 종자 수와 배아 크기 둘다 증가시키는, 돌연변이 CKI 단백질을 암호화하는 전이유전자를 발현시키는 방법으로, 임의의 유량종자 작물의 유전자전이 변종에서 달성된다. 식물 당 총 종자 수의 증가는 식물 당 총 오일 생산량을 증가시킨다. 배아 크기 증가는 종자 당 오일 함량을 증가시키고 식물 당 총 오일 생산량을 증가시킨다. 바람직한 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 초기 배아 발생에서 세포 분열을 증가시키는 배아-특이적 프로모터로 조절하여, 배아 크기가 증가하고, 종자 당 오일 양이 증가하고, 이에 상응하여 식물 당 총 오일 생산량이 증가한다.
비-종자 바이오매스(biomass) 생산은 알팔파, 상추, 담배, 유칼립투스(eucalyptus), 포플러나무와 같은 작물의 주요 수확량 구성요소이다. 이러한 작물에서 수확량의 증가는, 식물의 전반적인 성장 증가로 인한 바이오매스 축적의 향상으로 나타날 것이다. 한가지 양태에서, 바이오매스 증가는, 세포 분열을 증가시켜 성장 및 바이오매스를 증가시키는, 돌연변이 CKI 단백질을 암호화하는 전이유전자를 발현시키는 방법으로, 임의의 바이오매스 작물의 유전자전이 변종에서 달성된다. 한가지 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 식물의 대부분 또는 모든 조직에서 돌연변이 CKI 단백질 암호화 전이유전자를 구성적으로 발현시키는 프로모터로 조절한다. 바람직한 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 전이유전자의 발현을 농업경영학적으로 중요한 식물의 구성요소 (예: 상추 또는 담배의 잎, 또는 유칼립투스 또는 포플러나무의 줄기)로 표적화하는 조직-특이적 프로모터로 조절하여, 표적 조직에서 바이오매스 축적을 증가시킨다.
당 또는 셀룰로스는, 에탄올 생산 목적으로 재배하는 작물 (예: 사탕수수, 사탕무, 옥수수 및 스위치그래스(switchgrass))의 주요 수확량 구성요소이다. 한가지 양태에서, 당 증가는, 세포 분열을 증가시키고 식물의 당 축적 조직의 성장을 증가시키며 식물 당 총 당 함량을 증가시키는, 돌연변이 CKI 단백질을 암호화하는 전이유전자를 발현시키는 방법으로, 사탕수수 또는 사탕무와 같은 임의의 당 생산 작물의 유전자전이 변종에서 달성된다. 한가지 양태에서, 당 생산 작물에서 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 식물의 대부분 또는 모든 조직에서 돌연변이 CKI 단백질 암호화 전이유전자를 구성적으로 발현시키는 프로모터로 조절한다. 바람직한 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 전이유전자의 발현을 식물의 당 축적 조직(예: 사탕수수의 줄기 또는 사탕무의 뿌리)으로 표적화하는 조직-특이적 프로모터로 조절하여, 식물의 당을 저장하고 축적하는 조직의 세포 증식 및 성장을 증가시켜, 총 당 함량을 증가시킨다. 또다른 양태에서, 셀룰로스 증가는, 세포 분열 및 세포벽 합성을 증가시켜 세포벽의 구성요소인 셀룰로스의 함량을 증가시키는, 돌연변이 CKI 단백질을 암호화하는 전이유전자를 발현시키는 방법으로, 옥수수 또는 스위치그래스와 같은 임의의 셀룰로스 생산 작물의 유전자전이 변종에서 달성된다. 한가지 양태에서, 돌연변이 CKI 단백질 전이유전자의 발현은, 식물의 대부분 또는 모든 조직에서 돌연변이 CKI 단백질 암호화 전이유전자를 구성적으로 발현시키는 프로모터로 조절한다. 결과적인 세포 증식의 전반적인 증가는 세포벽 축적을 증가시켜 식물의 총 셀룰로스 함량을 증가시킨다.
다음의 실시예는 청구된 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 제공되며, 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예 1. 활성 사이클린 : CDK 복합체의 생산/정제 및 Krp 분자의 생산/정제
곤충 세포 및 배지
배큘로바이러스 발현 시스템은 이종성 유전자 발현을 위한 다목적 진핵생물 시스템이다. 이 시스템은 정확한 단백질 폴딩, 디설파이드 결합 형성 및 다른 중요한 해독후 변형을 제공한다. 모든 방법은 문헌[참조: Baculovirus expression vector system: Procedures and methods manual. (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA. 6th ed.)]로부터 입수하였다. Sf9 곤충 세포를 본 연구의 경우 27℃에서 TNM-FH 곤충 세포 배지[판매원: BD Bioscience] 중에서 성장시켰다. 대안적인 배지가 당업자에게 익히 공지되어 있으며 또한 유용하다는 것을 유의하여야 한다. 유사하게, Sf21 및 High Five TM 세포와 같은 대안적인 곤충 세포주 역시 바이러스 생산 및 단백질 생산에 작용할 것이다.
웨스턴 블롯 및 면역침전
곤충 세포에서 발현된 재조합 단백질을 웨스턴 블롯으로 모니터하였다. 단백질 추출물(35㎍)을 Laemmli 완충액의 존재 하에서 비등시켜, 10% 또는 12% SDS-PAGE 겔 상에서 전개시키고, 침지형(submerged) 이동 장치[판매원: BioRad]를 사용하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 이동 후, 막을 5% 탈지분유를 함유하는 TBS-T (25mM Tris pH 7.5; 75mM NaCl; 0.05% Tween) 중에서 차단시켰다. 1차 항체를 TBS-T 차단 완충액 중의 1:1000 희석에서 하룻밤 동안 사용하였다. 블롯을 15분 동안 실온에서 3회 세척하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP; Horse Radish Peroxidase)에 접합된 적당한 2차 항체를 TBS-T 차단 완충액 중의 1:10,000 희석에서 사용하였다. 블롯을 2차 항체 중에서 1시간 동안 항온처리하고 나서, TBS-T 중에서 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 이어서, 블롯을 ECL 시스템 프로토콜[판매원: Amersham Biosciences]에 기술된 바와 같이 처리하였다. 통상적으로 사용된 항체는 항-flag M2 모노클로날 항체[판매원: Sigma], 항-HA 모노클로날 또는 폴리클로날 항체[판매원: Babco], 항-PSTAIR 항체[판매원: Sigma-Aldrich], 항-myc 모노클로날 또는 폴리클로날(A-14)[판매원: Santa Cruz Biotechnology]이었다. 사용된 2차 항체는 항-마우스 IG-HRP 및 항-래빗 IG-HRP[판매원: GE Healthcare]였다.
면역침전을 통상적으로 수행하여 AtCyclinD2;1, AtCDKA와 Krp 분자 간의 복합체 형성을 모니터하였다. 단백질 추출물(14㎍)을 0.5ml의 결합 완충액 (100mM 인산나트륨 완충액 pH 7.0, 150mM NaCl, 1% Triton 100 및 프로테아제 억제제) 중 에 희석시켰다. 단백질/항체 혼합물을 4℃에서 약 2시간 동안 서서히 진동시키고 나서, 적당한 항체를 첨가하였다 (2㎍의 항-flag M2 항체; 5㎕의 항-HA 항체; 5㎕의 항-myc 폴리클로날). 단백질 A 세파로즈(sepharose)를 첨가하여 10㎕의 베드 용적(bed volume)이 되게 하였다. 면역침전물을 1시간 동안 4℃에서 서서히 혼합하고 나서, 1ml의 결합 완충액으로 3회 세척하였다. 이어서, 단백질-A 세파로즈 비드(bead)에 결합한 단백질 복합체를 Laemmli 완충액의 존재 하에서 비등시켰다. 단백질 복합체를 10% 또는 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하여 PVDF 막으로 이동시켰다. 막을 위에 기술한 바와 같이 블롯팅하였다.
배큘로바이러스 벡터 작제
아라비돕시스 사이클린 D2;1 (AtcyclinD2;1) 및 아라비돕시스 CDKA (AtCDKA) cDNA 서열을 에피토프 태그화하여 배큘로바이러스 전달 벡터[판매원: BD Biosciences] 속에 클로닝하였다. 당업자에게 공지된 다른 전달 벡터 시스템을 사용할 수도 있다. AtCyclinD2;1을, PCR로 Met Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Asn Leu (MDYKAFDNL) 아미노산 서열 (서열번호 18)을 첨가하여 N-말단에 FLAG 에피토프[판매원: Sigma-Aldrich]로 태그화하고 나서, pAcHLT 전달 벡터[판매원: BD Biosciences] 속에 클로닝하였다. Baculodirect[판매원: Invitrogen]와 같은 다른 배큘로바이러스 전달 벡터 시스템도 본 목적상 사용할 수 있다. 헤마글루티닌(HA) 에피토프 아미노산 서열 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala (YPYDVPDYA; 서열번호 19)을 PCR로 AtCDKA의 5' 말단과 프레임(frame)을 유지하며 위치시키고 나서, pVL1393 전달 벡터[판매원: AB Vector, CA] 속에 클로닝하였다. 사이클린 및 CDK를 에피토프 태그화하여 웨스턴 블롯 및 면역침전 실험을 가능하게 하였다. 태그가 없는 사이클린 및/또는 CDK를 사용할 수도 있다. 다른 적합한 전달 벡터 시스템을 사용할 수도 있다.
재조합 바이러스 생산
사용된 배큘로바이러스 게놈은 Baculogold Bright 배큘로바이러스[판매원: BD Bioscience]이다. 대안적인 배큘로바이러스 게놈을 사용할 수도 있다. AtcyclinD2;1의 Flag 태그화된 버전을, 상동 재조합을 사용하여 배큘로바이러스 바이러스 게놈의 비필수 영역 속에 도입시켰다. 상동 재조합은, 사이클린 D2;1을 함유하는 전달 벡터를 선형화된 BD Baculogold Bright 배큘로바이러스 DNA와 함께 Sf9 곤충 세포 속에 공동-형질감염시킨 경우 달성되었다. Sf9 세포를 60mm 디쉬 상에 2 x 106 세포로 접종시키고, Fugene 6 형질감염 시약을 제조업자(Roche Diagnostics)의 프로토콜에 따라 사용하여 2㎍의 사이클린 D2;1 전달 벡터(pAcHLT-cyclinD2;1) 및 0.5㎍의 선형화된 BD Baculogold Bright 배큘로바이러스 DNA로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 4시간의 형질감염 후, Fugene/DNA 용액을 제거하고 3ml의 TNM-FH 배지로 교체하였다. 4일 후, 상청액을 수거한 후 이를 사용하여 보다 많은 세포를 감염시켜 바이러스를 증폭시켰다. 이러한 증폭을 바이러스 역가가 109 바이러스 입자/ml가 될 때까지 반복하였다. 바이러스를, 1 미만의 감염 다 중도 (moi; Multiplicity Of Infection)로 Sf9 세포를 감염시켜 증폭시켰다. 바이러스 역가를 광학 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 모니터하였다.
AtCDKA 1의 HA 태그화된 버전을, 상동 재조합을 사용하여 배큘로바이러스 바이러스 게놈의 비필수 영역 속에 도입시켰다. 상동 재조합은, 사이클린 D2;1을 함유하는 전달 벡터를 선형화된 BD Baculogold Bright 배큘로바이러스 DNA와 함께 Sf9 곤충 세포 속에 공동형질감염시킨 경우 달성되었다. Sf9 세포를 60mm 디쉬 상에 2 x 106 세포로 접종시키고, Fugene 6 형질감염 시약을 제조업자(Roche Diagnostics)의 프로토콜에 따라 사용하여 2㎍의 AtCDKA 전달 벡터(pVL1393-AtCDKA) 및 0.5㎍의 선형화된 BD Baculogold Bright 배큘로바이러스 DNA로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 4시간의 형질감염 후, Fugene/DNA 용액을 제거하고 3ml의 TNM-FH 배지로 교체하였다. 4일 후, 상청액을 수거한 후 이를 사용하여 보다 많은 세포를 감염시켜 바이러스를 증폭시켰다. 이러한 증폭을 바이러스 역가가 109 바이러스 입자/ml가 될 때까지 반복하였다. 바이러스를, 1 미만의 감염 다중도(MOI)로 Sf9 세포를 감염시켜 증폭시켰다. 바이러스 역가를 광학 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 모니터하였다.
곤충 세포에서의 재조합 단백질 생산
Flag 태그화된 AtcyclinD2;1 단백질의 생산: 태그화된 AtcyclinD2;1은 에스.프루기페르다(S. frugiperda) Sf9 세포를 AtcyclinD2;1 배큘로바이러스로 감염 시켜 수득하였다. 본 목적상, 현탁액 중에서 2 x 106/ml로 성장시킨 Sf9 세포를 5를 초과하는 MOI로 약 4 내지 5일 동안 재조합 배큘로바이러스로 감염시키고 나서 회수하였다. 세포를 수거하여 3000rpm으로 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 새로운 배지로 세척하고 나서 3000rpm으로 4℃에서 원심분리하였다. 펠릿을 -80℃에서 냉동시키거나 즉시 용해시켰다. 용해 완충액은 20mM Hepes(pH 7.5), 20mM NaCl, 1mM EDTA, 20% 글리세롤, 20mM MgCl2 및 프로테아제 억제제 (Complete Mini, EDTA 무함유, 판매원: Boehringer Mannhein) (10ml의 용해 완충액 당 1개의 정제)로 이루어졌다. 세포 용해물을 얼음 상에서 15초 동안의 음파처리(sonication)를 2회 실시하였다. 이어서, 단백질 용해물을 40,000rpm으로 Beckman TLA 100.2 로터(rotor)에서 2시간 동안 원심분리하였다. 태그화된 AtCyclin D2;1을 함유하는 상청액을 분취하여 -20℃에서 냉동시켰다. 항-Flag M2 모노클로날 항체[판매원: Sigma-Aldrich]를 사용하여 웨스턴 블롯으로 발현을 모니터하였다.
태그화된 AtCDKA의 생산을, 에스.프루기페르다 Sf9 세포를 AtCDKA 배큘로바이러스로 감염시켜 달성하여 위에 기술된 것과 동일한 방식으로 처리하였다. 항-HA 모노클로날 또는 폴리클로날 항체[판매원: Babco]를 사용하여 웨스턴 블롯으로 발현을 모니터하였다. 항-PSTAIR 항체[판매원: Sigma-Aldrich]를 사용하여 웨스턴 블롯으로 발현을 모니터할 수도 있다.
AtcyclinD2;1/AtCDKA의 활성 키나제 복합체는, 에스.프루기페르다 Sf9 세포를 AtcyclinD2;1 (MOI > 5) 및 AtCDKA (MOI > 5) 배큘로바이러스로 공동감염시켜 제조하였다. 활성 복합체를 위에 기술된 바와 같이 정제하였다. 항-Flag M2 모노클로날 또는 항-HA 항체를 사용하여 곤충 세포 추출물의 웨스턴 블롯으로 단백질 발현을 모니터하였다. AtcyclinD2;1과 AtCDKA의 상호작용을 아래에 기술되는 공동-면역침전으로 모니터하였다.
키나제 검정
시험관내 검정을 개발하여 다양한 KRP/ICK 분자의 사이클린/CDK 복합체 억제 능력을 검사하였다.
개개의 배큘로바이러스로 감염되거나 2개의 배큘로바이러스로 공동-감염된 곤충 세포로부터의 단백질 추출물 중의 키나제 활성을 표준 키나제 검정으로 모니터하였다. 히스톤 HI(HHI)를 주요 기질로서 사용하였지만, 재조합 담배 망막아세포종(retinoblastoma) 단백질 (Nt Rb)을 기질로서 사용할 수도 있다[참조: Koroleva et al., Plant Cell 16, 2346-79, 2004]. 키나제 검정을 다음과 같이 수행하였다: 7㎍의 곤충 세포 단백질 추출물을 키나제 완충액 칵테일 (KAB: 50mM Tris pH 8.0, 10mM MgCl2, 10μM ATP 및 0.5μCi/ml 32PγATP 및 2㎍의 HHI)에 첨가하여 최종 용적이 30㎕가 되게 하였다. 반응물을 27℃에서 30분 동안 항온처리하였다. 키나제 반응을 동일한 용적(30㎕)의 2X Laemmli 완충액으로 중지시켰다. 12% 겔 상에서 SDS-PAGE를 수행한 후, [32P]포스페이트 혼입을, 자가방사법(autoradiography) 및/또는 Molecular Dynamics PhosphorImager로 모니터하였다. CDK 키나제 검정을 수행하기 위한 대안적인 완충액 조건을 사용할 수도 있다[참조: Wang and Fowke, Nature 386:451-452, 1997; Azzi et al., Eur . J. Biochem. 203:353-360, 1992; Firpo et al., Mol . Cell . Biol. 14:4889-4901, 1994].
결과: AtcyclinD2;1 단독 또는 AtCDKA 단독으로 감염된 곤충 세포로부터의 단백질 추출물은 기질로서 HHI를 사용하여 키나제 활성을 보이지 않았다. AtcyclinD2;1 바이러스 및 AtCDKA 바이러스로 공동-감염된 곤충 세포는 강한 키나제 활성을 함유하였다. 활성 CDK-유사 (cdc2-유사) 키나제를 또한 p13suc1 아가로스 비드를 사용하여 식물 단백질 조직 추출물 또는 식물 조직 배양 세포 추출물로부터 정제하여[참조: Wang and Fowke, Nature 386:451-452, 1997; Azzi et al., Eur. J. Biochem. 203:353-360, 1992], 위에 기술된 유사한 검정 및 아래 실시예 2 내지 8에 기술된 경쟁 실험에서 사용할 수 있다.
세균 발현 벡터 속으로의 Krp cDNA 의 클로닝
AtKrp1 클로닝
AtKrp1 cDNA를 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 PCR로 아라비돕시스 cDNA로부터 클로닝하였다:
Figure 112008015367329-PCT00001
생성된 PCR 단편을 pCRII-TOPO 벡터[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하였다. 생성된 벡터 AtKrp1 #359를 서열분석하여 GenBank #U94772에 대해 정확한 서열을 확인하였다.
브라시카 나푸스 Krp1 클로닝의 5' RACE
National Center for Biotechnology Information 웹사이트에서 BLASTN을 사용하여 AtKRP1 cds에 대해 상동인 브라시카 서열을 검색하였다. 검색한 결과, 2개의 EST 후보(CD820320 및 CD829052)를 얻었고, 이들은 동일한 서열인 것으로 밝혀졌다. CD820320을 조르자(Jorja)의 BLASTX를 통해 사용하여, EST의 해독된 뉴클레오타이드 서열이 At KRP1 단백질 서열과 상당히 매치한다는 것을 확인하였다.
CD829052는 646bp이고, 브라시카 올레라세아(Brassica oleracea) KRP1 서열의 마지막 106개 아미노산 및 3' UTR의 321bp를 포함한다. 5' RACE 프라이머 (GSP1brasskrp1_5'RACE: 5'-CTCTGATAATTTAACCCACTCGTAGCGTCCTTCTAATGGCTTCTC-3'; 서열번호 22)를 설계하여 전체 길이 Bn KRP1을 수득하였다. RACE 프라이머는 CD820320의 암호화 서열의 마지막 45개 뉴클레오타이드를 함유하였다.
5' RACE-ready cDNA를 브라시카 나푸스 DH12075 잎으로부터 SMART RACE cDNA 증폭 키트[판매원: Clontech]를 사용하여 제조하였다. 5' RACE를, pfu 효소 및 완충액[판매원: Stratagene]을 Klentaq 대신에 사용한 것을 제외하고는, 키트 설명서에 따라 이 cDNA 상에서 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 5분 동안 초기 변성시킨 후, 94℃에서 5초, 68℃에서 10초, 72℃에서 3분의 35회 사이클. 생성된 PCR 산물은 대략 600bp의 매우 희미한 밴드였다. 이어서, 2.5㎕의 이 PCR 산물을 위의 PCR 조건을 사용하여 재증폭시켰다. 생성된 PCR 산물을 TOPO Blunt 벡터[판매원: Invitrogen] 속에 클로닝하여, 알파 골드 세포[판매원: Bioline] 속으로 형질전환시켰다. 2개의 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 회수하고, 삽입체를 M13 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 서열분석하였다. 하나의 후보 삽입체의 서열이 CD820320과 동일하였고, 이를 Bn KRP1-II라고 명명하였다 (RACE로부터 새로운 서열이 추가되지 않았다). Bn KRP1-I이라고 명명한 다른 후보 삽입체의 서열은, 뉴클레오타이드 수준에서 암호화 영역이 Bn KRP1-II와 94% 동일하였고, 아미노산 수준에서는 마지막 106개의 잔기가 86% 동일하였다. RACE를 통해, TOPO Blunt 벡터(pTG313)에서 5' UTR의 추가적인 108bp를 갖는 Bn KRP1-I의 전체 암호화 서열을 수득하였다. BnKrp1 암호화 서열(서열번호 23)을 아래에 제시한다:
Figure 112008015367329-PCT00002
pET16b 세균 발현 벡터는 연속적인 6개의 히스티딘(6XHis, 또는 (His)6 또는 hexaHis)을 암호화하는 서열을 함유하여, 고정된 금속 친화도 크로마토그래피[판매원: Novagen]에 의한 단백질 정제를 가능하게 한다. 이 벡터를 변형시켜, 또한 폴리-Myc 에피토프를 6XHis 암호화 서열의 바로 하류에 이와 프레임을 유지하며 포함 되게 하였다 (pET16b-5MYC). 전체 길이 AtKrp1 cDNA를, 전체 암호화 서열의 측면에 위치하는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 pTG #359 TopoIIAtKrp1 cds로부터 증폭시켰다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 pET16B-5MYC 벡터 속으로의 클로닝을 용이하게 하는 제한 효소 부위를 함유하였다 (5'AtKrp1 BamHI/NdeI: ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATATAG (서열번호 24) 및 3'AtKrp1XhoI: ATCGCTCGAGTCACTCTAACTTTAC (서열번호 25)). 생성된 PCR 단편을 pET16b-5myc의 BamHI 및 XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다. 생성된 벡터 AtKrp #385는 AtKrp1 야생형 cDNA를 6XHis 및 myc 태그와 프레임을 유지하며 함유하였다.
다음의 2개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, BnKrp1의 3' 말단에 5' BamHI/NdeI 부위 및 XhoI 제한 부위를 부가시키는 BnKrp1 cDNA를 증폭시켰다 (5'BnKrp1 BamHI/NdeI: ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC (서열번호 26) 및 3'BnKrp1 XhoI: ATCGCTCGAGTCACTCTGATAATTTAAC (서열번호 27)). PCR 단편을 pTG #313(TopoII BnKrp1)으로부터 증폭시켜, pET16b-5myc의 BamHI 및 XhoI 부위 속에 서브클로닝하고 서열분석하였다. 생성된 벡터 BnKrp #461은 BnKrp1 야생형 cDNA를 6XHis 및 myc 태그와 프레임을 유지하며 함유하였다.
세균에서의 재조합 Krp 단백질 발현 및 정제
삽입체를 보유하는 모든 세균 발현 플라스미드 pET16b 및 pET16b-5MYC를 BL21 Star(DE3)[판매원: Invitrogen] 속에 형질전환시켰다. 상기 새로운 형질전환으로부터의 세균 콜로니를 사용하여, 100㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 400ml의 LB 에 접종하고 37℃에서 성장시켰다. 배양물의 OD600이 0.6 내지 0.8에 도달했을 때, 재조합 단백질 발현을 0.5mM 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도하였다. 이어서, 세포를 30℃에서 3시간 동안 성장시켰다. 세포를 JLA 10.500 Beckman 로터에서 원심분리로 수거하였다. 세균 세포 펠릿을 -80℃에서 보관하거나 즉시 용해시켰다. 세균을 프로테아제 억제제를 함유하고 EDTA가 없는 10ml 인산염 용해 완충액 (100mM 인산염 완충액 pH 7.0, 150mM NaCl, 1% Triton X100) 중에서 용해시켰다. 재현탁된 세균 배양물을, 젖은 얼음 상에서 40% 전력으로 20초 동안의 음파처리를 4회 실시하였다. 용해된 세포를 4℃에서 15분 동안 Beckman JA20.1 로터에서 14,000rpm으로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 10ml의 인산염 용해 완충액으로 세척하고, 세포 펠릿을 원심분리로 다시 수거하였다. 태그화된 KRP 분자는 주로 불용성이었다. 불용성인 태그화된 KRP를 요소(urea) 완충액 (8M 요소, 100mM Tris pH 7.5) 중에서 가용화시켰다. 재현탁된 세포 펠릿을 잠시, 젖은 얼음 상에서 40% 전력으로 15초 동안의 음파처리를 3회 실시하였다. 요소-불용성 단백질을 4℃에서 15분 동안 Beckman JA20.1 로터에서 14,000rpm으로 원심분리하여 제거하였다. 태그화된 KRP를, 요소 완충액 중에서 평형화시킨 BD Talon Co2 + 금속 친화도 수지를 사용하여 배치(batch)에서 정제하였다. 배치 정제물을 4℃에서 3시간 내지 하룻밤 동안 서서히 회전시키면서 항온처리하였다. 슬러리(slurry)를 컬럼 상에 로딩하고, 수지를 요소 완충액의 36 베드 용적으로 세척한 후, 5mM 이미다졸(pH 7.5)을 함유하는 요소 완충액의 12 베드 용적으로 세척하였다. 결합된 태그 화된 KRP 단백질을, 300mM 이미다졸(pH 7.5)을 함유하는 요소 완충액을 사용하여 용출시켰다. 분획을 태그화된 KRP에 대해 SDS-Page 및/또는 브래드포드(Bradford) 단백질 검정[판매원: BioRad]으로 모니터하였다. 변성된 태그화된 KRP1의 재폴딩을 순차적 희석 투석을 사용하여 수행하였다. 태그화된 KRP 단백질의 대다수를 함유하는 분획을 배합하여, 1M 요소, 100mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl 및 5mM β-머캅토에탄올 및 5mM 벤즈아미딘 중에서 20시간 동안 4℃에서 투석하였다. 이어서, 투석 완충액을 0.5M 요소, 100mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl 및 5mM β-머캅토에탄올 및 5mM 벤즈아미딘으로 교체하고, 추가로 12시간 동안 계속하였다. 재조합 단백질을 수거하여, 브래드포드 검정으로 정량하고 4℃에 보관하였다.
Krp 의 돌연변이유발
AtKRP 계열 일원 및 BnKRP 계열 일원의 야생형 버전을, 서열분석 및 돌연변이유발 목적으로 기본 pCRII-TOPO 벡터[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하였다.
조작된 5' BamHI 부위 및 3' XhoI 부위를 함유하는 동일한 AtKRP1 야생형 cDNA PCR 단편[참조: "Cloning of Krp cDNAs into bacterial expression vector," supra]을, 돌연변이유발을 위하여 pCRII-TOPO 벡터[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하였다. 생성된 벡터 Topo-AtKrp #385B는 AtKRP1 야생형 cDNA를 함유하였고, 표준 자동화된 서열분석을 사용하여 정확한 서열에 대해 확인하였다. 상기로부터의 동일한 BnKRP1 야생형 cDNA 단편을, 돌연변이유발을 위하여 pCRII-TOPO 벡 터[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하였다. 생성된 벡터 Topo-BnKrp #539는 BnKRP1 야생형 cDNA를 함유하였고, 표준 자동화된 서열 분석을 사용하여 정확한 서열에 대해 확인하였다
부위 지시된 돌연변이유발을, Stratagene의 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발 키트에 대한 프로토콜에 따라 수행하였다.
추정되는 사이클린 결합 영역 내에 다수의 아미노산 치환(E129A, E130A, I131A, D132A)을 갖는 BnKrp1 #462를 작제하기 위하여, 센스(sense) BnKrp1DbleMut#1 (GGAGCAACCACCAACGGCAGTGGCTGCTGCTGCTTTTTTCGTG; 서열번호 28) 및 안티센스(anti-sense) BnKrp1DbleMut#1b (CACGAAAAAAGCAGCAGCAGCCACTGCCGTTGGTGGTTGCTCC; 서열번호 29)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하였다. 이어서, 돌연변이 산물을 pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하여, 결국 BnKrp1#462를 수득하였다.
CDK 결합 영역의 고도로 보존된 잔기 내에 2개의 아미노산 치환(F151A, F153A)을 갖는 BnKrp1#512를 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1DbleMut#2 올리고뉴클레오타이드 (CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA; 서열번호 30) 및 안티센스 BnKrp1DbleMut#2b 올리고뉴클레오타이드 (TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG; 서열번호 31)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수 행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다. 동일한 아미노산 치환을 또한, 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하고 주형으로서 AtKrp1-Topo # 385B를 사용하여 AtKRP1 속에 도입시켰다: "QC ICK1 cds F173A, F175A-coding" 5'-TTCAAGAAGAAGTACAATGCCGATGCCGAGAAGGAGAAGCCATTA-3' (서열번호 32) 및 "QC ICK1 cds F173A, F175A-noncod" 5'-TTATGGCTTCTCCTTCTGGGCATCGGCATTGTACTTCTTCTTGAA-3' (서열번호 33).
추정되는 사이클린 결합 영역 및 CDK 결합 영역 내의 고도로 보존된 잔기에 아미노산 치환(E129A, E130A, I131A, D132A, +F151A, F153A)을 갖는 BnKrp1#463의 경우, 센스 BnKrp1DbleMut#2 올리고뉴클레오타이드 (CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA; 서열번호 30) 및 안티센스 BnKrp1DbleMut#2b 올리고뉴클레오타이드 (TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG; 서열번호 32)를 사용하고, 주형으로서 BnKrp#462를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 단일 아미노산 치환(K148A)을 갖는 BnKrp1#586을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1K148A 올리고뉴클레오타이드 (GATAATTTCAAGAAGGCGTATAACTTTGATTTC; 서열번호 34) 및 안티센스 BnKrp1K148A 올리고뉴클레오타이드 (GAAATCAAAGTTATACGCCTTCTTGAAATTATC; 서열번호 35)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 단일 아미노산 치환(Y149A)을 갖는 BnKrp1#587을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1Y149A 올리고뉴클레오타이드 (AATTTCAAGAAGAAGGCTAACTTTGATTTCGAA; 서열번호 36) 및 안티센스 BnKrp1Y149A 올리고뉴클레오타이드 (TTCGAAATCAAAGTTAGCCTTCTTCTTGAAATT; 서열번호 37)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 단일 아미노산 치환(N150A)을 갖는 BnKrp1#588을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1N150A 올리고뉴클레오타이드 (TTCAAGAAGAAGTATGCCTTTGATTTCGAAAAG; 서열번호 38) 및 안티센스 BnKrp1N150A 올리고뉴클레오타이드 (CTTTTCGAAATCAAAGGCATACTTCTTCTTGAA; 서열번호 39)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 단일 아미노산 치환(F151A)을 갖는 BnKrp1#572를 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1F151A 올리고뉴클레오타이드 (AGAAGAAGTATAACGCTGATTTCGGAAAGGA; 서열번호 40) 및 안티센스 BnKrp1F151A 올리고 뉴클레오타이드 (TCCTTTTCGAAATCAGCGTTATACTTCTTCT; 서열번호 41)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 단일 아미노산 치환(F153A)을 갖는 BnKrp1#573을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1F153A 올리고뉴클레오타이드 (AGTATAACTTTGATGCCGAAAAGGAGAAGCC; 서열번호 42) 및 안티센스 BnKrp1F153A 올리고뉴클레오타이드 (GGCTTCTCCTTTTCGGCATCAAAGTTATACT; 서열번호 43)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 2개의 아미노산 치환(K157A; P158A)을 갖는 BnKrp1#553을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1KP→AA 올리고뉴클레오타이드 (GATTTCGAAAAGGAGGCGGCATTAGAAGGACGCT; 서열번호 44) 및 안티센스 BnKrp1KP→AA 올리고뉴클레오타이드 (AGCGTCCTTCTAATGCCGCCTCCTTTTCGAAATC; 서열번호 45)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 2개의 아미노산 치환(R162A; Y163A)을 갖는 BnKrp1#554를 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1RY→AA 올리고뉴클레오타이드 (GCCATTAGAAGGAGCCGCCGAGTGGGTTAAATT; 서열번호 46) 및 안티센스 BnKrp1RY→AA 올리고뉴클레오타이드 (AATTTAACCCACTCGGCGGCTCCTTCTAATGGC; 서열번호 47)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 2개의 아미노산 치환(E164A; W165A)을 갖는 BnKrp1#555를 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1EW→AA 올리고뉴클레오타이드 (AGAAGGACGCTACGCGGCGGTTAAATTATCAGA; 서열번호 48) 및 안티센스 BnKrp1EW→AA 올리고뉴클레오타이드 (TCTGATAATTTAACCGCCGCGTAGCGTCCTTCT; 서열번호 49)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 2개의 아미노산 치환(K167A; L168A)을 갖는 BnKrp1#556을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1KL→AA 올리고뉴클레오타이드 (CGCTACGAGTGGGTTGCAGCATCAGAGTGAGAGC; 서열번호 50) 및 안티센스 BnKrp1KL→AA 올리고뉴클레오타이드 (GCTCTCACTCTGATGCTGCAACCCACTCGTAGCG; 서열번호 51)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#539를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 다수의 아미노산 치환(F151A; F153A; E164A; W165A)을 갖는 BnKrp1#574를 작제하기 위하여, BnKrp1F151A,F153A 올리고뉴클레오타이드 (CCTTCTAATGGCTTCTCCTTTTCAGCATCAGCGTTATACTTCTTCTTGAA; 서열번호 52) 및 안티센스 F151A,F153A 올리고뉴클레오타이드 (TTCAAGAAGAAGTATAACGCTGATGCTGAAAAGGAGAAGCCATTAGAAGG; 서열번호 53)를 사용하고, 주형으로서 BnKrp1#555를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
CDK 결합 영역 내에 다수의 아미노산 치환(Y149A;F151A;F153A)을 갖는 BnKrp1#598을 작제하기 위하여, 센스 BnKrp1Y149A 올리고뉴클레오타이드 (AATTTCAAGAAGAAGGCTAACGCTGATGCTGAA; 서열번호 54) 및 안티센스 BnKrp1Y149A 올리고뉴클레오타이드 (TTCAGCATCAGCGTTAGCCTTCTTCTTGAAATT; 서열번호 55)를 사용하고, 주형으로서 TopoBnKrp#512를 사용하여 QuikChange 부위-지시된 돌연변이유발을 수행하였다. 돌연변이유발 산물을 서열분석하여 목적하는 돌연변이의 존재를 확인하고 나서, pET16b-5MYC의 BamHI/XhoI 부위 속에 서브클로닝하였다.
BnKrp1#547을 작제하기 위하여, 다음의 2개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, BnKrp1의 3' 말단에 5' BamHI/NdeI 부위 및 XhoI 제한 부위를 부가시키는, 가장 C-말단의 2개의 아미노산(즉, Ser 및 Glu)이 없는 BnKrp1 cDNA를 증폭시켰다 (5' BnKrp1 BamHI/NdeI: ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC (서열번호 26) 및 3' BnKrp1SE>stop XhoI: CTCGAGTCAAGCAGCTAATTTAACCCACTCGTA (서열번호 56)). PCR 단편을 pTG#313(TopoII BnKrp1)으로부터 증폭시켜, pET16b-5myc의 BamHI 및 XhoI 부 위 속에 서브클로닝하고 서열분석하였다. 생성된 벡터 BnKrp#547은 BnKrp1 cDNA를 6XHis 및 myc 태그와 프레임을 유지하며 함유하였다.
BnKrp1#614를 작제하기 위하여, 다음의 2개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 전체 CDK 결합 도메인이 없는 BnKrp1 cDNA를 증폭시켰다: XhoI 부위를 함유하는 5' BnKrp1 BamHI/NdeI: ACGGATCCCATATGGTGAGAAAATGC (서열번호 26) 및 3' BnKrp1△cdk: CTCGAGTCACTTCTTGAAATTATC (서열번호 57). PCR 단편을 pTG#420(TopoII BnKrp1)으로부터 증폭시켜, TopoII[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하고 서열분석하였다. 이어서, BamHI/XhoI 단편을 pET16b-5myc 속에 서브클로닝하였다. 생성된 벡터 BnKrp#614는 CDK 결합 영역에 대한 암호화 서열이 없는 BnKrp1 cDNA를 6XHis 및 myc 태그와 프레임을 유지하며 함유하였다.
실시예 2. 포유동물 p27 KIP1 과 식물 KRP 간의 아미노산 상동성
CIP1/KIP1 계열의 CKI는 2개의 접촉 영역을 사용하여 키나제 복합체에 결합하고 이를 억제시킨다. 이러한 결합 및 억제 방식에 따라, 이들 2개의 영역 중 하나의 결합 능력을 변화시키면, 복합체와 (접촉 도메인을 통해) 여전히 상호작용하고, 키나제 활성을 더 이상 억제하지 않으며, 야생형 CKI가 활성 사이클린/CDK 복합체를 억제하는 것을 방해할 수 있는, 우성 음성 단백질을 잠재적으로 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 사이클린 결합 영역을 비-기능성으로 만들면, 돌연변이 단백질은 CDK 결합 영역을 통해 키나제 복합체와 접촉 도메인을 통해 여전히 상호작용할 것이다. 유사하게, CDK 결합 영역을 비-기능성으로 만들면, 돌연변이 단백질은 사이클린 결합 영역을 통해 키나제 복합체와 여전히 상호작용할 것이다.
AkKrp 계열의 CKI는 전체 단백질에 걸쳐 상동성을 공유하며, 가장 C-말단의 40 내지 45개 아미노산의 상동성이 가장 높다[참조: Wang et al., Nature 386:451-452, 1997; Wang et al., Plant J. 15:501-510, 1998; Lui et al., Plant J. 21:379-385, 2000; De Veylder et al., Plant Cell 13:1653-1667, 2001; Jasinski et al., Plant Physiol. 130:1871-1882, 2002; Zhou et al., Plant Cell Rep. 20:967-975, 2002; Zhou et al., Plant J. 35:476-489, 2003]. 하지만, Krp 계열의 마지막 대략 23개의 아미노산만이 포유동물 p27Kip1에 대해 상동성을 보인다 (도 1 참조).
시험관내 결합 실험을 수행하여, 대표적인 KRP, 즉 BnKRP1과 AtcyclinD2;1 및 AtCDKA 간의 결합 상호작용을 밝혀내는데 기여하였다. 다른 KRP 계열 일원의 결합 상호작용은 또한, 아래에 기술된 동일한 시험관내 결합 실험을 사용하여 밝혀낼 수 있다. CDK 결합 영역 내의 고도로 보존된 아미노산의 아미노산 치환을 함유하는 BnKrp1의 돌연변이 버전을 사용한 시험관내 결합 실험을 통해, 단독으로 이 영역은 CDK에 결합하는데 필요하며 Atcyclin에 대한 결합은 여전히 온전하다는 것을 밝혀내었다. 보다 중요하게, 온전한 CDK 결합 도메인은 AtCyclinD2/CDKA 복합체의 억제를 위하여 절대적으로 요구되었다. CDK 결합 영역의 바로 상류 (본 발명자들이 사이클린 결합 영역이라고 제안하는 영역)에 있는 아미노산은 KRP 계열 일원 간에는 보존되어 있지만(도 1 참조) p27KIP1에서는 보존되어 있지 않다. 상기 제 안된 사이클린 결합 도메인 내의 다수의 보존된 잔기의 돌연변이는 AtcyclinD2;1과의 상호작용을 불가능하게 하지만, AtCDKA와의 상호작용은 온전하게 유지된다. 흥미롭게도, 상기 추정되는 사이클린 결합 영역 돌연변이체는, 야생형 KRP1 만큼 효과적이지는 않지만, AtcyclinD2/CDKA 키나제 복합제를 여전히 억제한다. 키나제 활성을 50% 감소시키는 억제 농도(IC50)는 야생형 KRP1(BnKrp#461)의 경우 0.035㎍이었지만, 사이클린 결합 돌연변이체(BnKrp#462)의 경우 IC50은 1.25㎍이었다.
포유동물 p27KIP1 대응물의 경우에도 유사하게 관찰되었다[참조: Vlach et al., EMBO J. 16:5334-44, 1997]. p27KIP1 사이클린 결합 돌연변이체의 IC50은 야생형 p27KIP1과 비교하여 증가하였다. 하지만, 대조적으로, 고농도의 p27KIP1 CDK 결합 돌연변이체는 키나제 복합체를 여전히 억제할 수 있었다. 이는 식물 Krp에는 부재하는 포유동물 p27KIP1 내의 310 나선의 존재에 의해 설명되는 것 같다 (설명에 관해서는 실시예 3을 참조한다).
이러한 데이터는, 활성 키나제 복합체와의 상호작용을 담당하는 포유동물 p27KIP1 대응물과 유사한 2개의 영역이 KRP 내에 존재한다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 사이클린 도메인 돌연변이체는 여전히 키나제 복합체를 억제할 수 있었고, 이는 CDK 결합 영역이 주로 사이클린/CDK 키나제 억제를 담당한다는 것을 시사한다. 유사하게, p27KIP1의 사이클린 결합 영역은 활성 CDK 복합체의 억제에서 부가적 인 역할을 하였다. 하지만 이러한 결과는, p27KIP1과는 대조적으로, KRP1의 CDK 결합 영역이 키나제 억제에서 보다 중요한 역할을 한다는 것을 설명한다.
그러므로 CDK 결합 영역에서 KRP 계열과 p27KIP1 간의 높은 상동성에 집중하여, 잔기를 변화시키면 결국, 여전히 복합체에 결합할 수 있고, 야생형 BnKRP1가 키나제 복합체를 억제하는 것을 방해할 수 있지만, 복합체 자체를 억제하지는 않는, 우성 음성 BnKrp1 분자가 생성될 것이다.
실시예 3. 식물 KRP 에서 보존되어 있는 CDK 와 접촉하는 중요한 아미노산을 확인하는데 사용되는 사이클린 / CDK 와의 복합체에서의 포유동물 p27 KIP1 의 단백질 구조
궁극적으로 야생형 KRP 기능을 방해할 우성 음성 Krp 분자의 설계를 용이하게 하기 위하여, 사이클린 A-CDK2 키나제 복합체와의 복합체에서의 이전에 공개된 포유동물 p27KIP1의 구조를 사용하였다[참조: Russo et al., Nature 382:325-331, 1996]. 구조적 정보를 정렬 정보와 조합시켜, 알라닌 또는 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우 우성 음성 특징을 갖는 단백질이 생성되는 중요한 아미노산을 확인하였다. 이러한 우성 특징은 다음과 같다: 1) 돌연변이 Krp는 사이클린/CDK 복합체에 결합한다, 2) 돌연변이 단백질은 고농도에서도 사이클린/CDK 복합체의 형성을 실질적으로 억제하지 않는다, 그리고 3) 돌연변이 단백질은 사이클린/CDK 복합체에 결합하기 위하여 야생형 KRP 분자와 실질적으로 경쟁해야 한다. 생체내에서, 이러 한 특징을 만족시키는 돌연변이 Krp는, 세포에서 사이클린/CDK 키나제 활성을 상승시켜, 결국 세포 증식을 증가시키고 유사분열 지수를 높일 것이다.
포유동물 사이클린 A/CDK2 키나제 활성은 p27KIP1의 결합에 의해 완전히 억제될 수 있다. p27KIP1이 사이클린 A/CDK2 키나제 복합체를 억제하는 메커니즘은 복잡한 과정인 것으로 밝혀졌다[참조: Russo et al., supra]. p27KIP1은 두가지 수단을 사용하여 활성 키나제 복합체를 억제한다. 억제에 대한 첫번째 구성요소에는, 모든 식물 KRP 계열의 CKI에서 명백하게 보존되어 있지 않은 p27KIP1의 310 나선이 포함된다. 310 나선은 자신을 키나제의 촉매 틈(catalytic cleft) 속에 삽입시켜 ATP 기질을 모방한다. 310 나선이 상기 틈 영역을 차지하면 ATP 결합 및 키나제 활성이 효과적으로 차단된다. 하지만, 310 나선의 부재 하에서도 p27KIP1은 키나제 복합체를 여전히 억제시킬 수 있었다[참조: Polyak et al., Cell 78:59-66, 1994].
사이클린 A/CDK2에 결합한 p27KIP1 및 키나제 복합체 단독의 결정 구조의 비교는, p27KIP1의 결합시 CDK2의 N-말단 로브(lobe)에서 상당한 형태 변화가 일어난다는 것을 설명하였다[참조: Russo et al., supra]. 사실, 일반적으로 활성 부위에서 ATP의 배위를 돕는 키나제의 N-말단 로브 내의 특정 β-쉬트(sheet)가 p27KIP1의 결합시 없어진다. p27KIP1의 결합은 p27KIP1의 β-헤어핀(hairpin), β-가닥 잔기 및 310 나선, 및 CDK2의 N-말단 로브의 β-쉬트 아미노산을 포함하는 재폴딩을 유도하고, 이는 재폴딩되어 분자간 β-샌드위치(sandwich)를 형성한다 (상기 문헌 참조). 이러한 형태 변화는 단독으로 사이클린 A/CDK2의 키나제 활성을 상당히 억제할 수 있다. 이 β-샌드위치를 형성하는 p27KIP1 내의 잔기는 모든 포유동물 p27KIP1 계열 일원에서 고도로 보존되어 있고, 모든 KRP 계열 일원에서도 고도로 보존되어 있다. 실시예 1에 제시된 결과 및 보존된 310 나선의 부재에 따라, KRP 계열 일원 내의 보존된 CDK 결합 영역은, 활성 키나제 복합체에 결합하여 AtCDKA 키나제의 N-말단 로브에서 형태 변화를 유도하여 키나제 활성을 억제시키는 것 같다. 하지만, KRP의 다른 영역도, 포유동물 p27Kip1에서의 310 나선과 같이, 실제로 촉매 틈 속에 삽입되어 ATP 결합을 모방하므로 배제될 수 없다.
KRP 계열의 가장 카복시-말단의 23개 아미노산은 포유동물 p27Kip1에 대한 가장 높은 아미노산 동일성을 보인다 (도 1 참조). CKI와 키나제 복합체 간의 β-샌드위치 형성에서 일정한 역할을 하는, BnKRP1 내의 다수의 보존된 잔기를 포유동물 p27KIP1에 대한 서열 동일성에 따라 체계적으로 변화시켰다. 각각의 돌연변이체를 키나제 복합체를 억제하는 능력에 대해 야생형 BnKRP1(BnKrp#461)과 비교하였다. 일부 경우에, 돌연변이체 BnKrp1을 AtcyclinD2;1 또는 AtCDKA에 대한 결합에 대해 또한 모니터하였다. 이러한 실험의 결과를 아래의 표 2에 요약한다.
실시예 4 "돌연변이 KRP CKI 폴리펩티드"에 상세히 기술한 바와 같이 돌연변 이를 도입시켰다.
CDK 결합 영역의 가장 N-말단에는 잔기 Lys Tyr Asn Phe Asp Phe (KYNFDF) 모티프(서열번호 58)가 존재한다. 이 모티프는 아라비돕시스 및 브라시카 나푸스 종으로부터의 KRP 계열 일원에서 고도로 보존되어 있다. 이러한 잔기는 대부분 p27KIP1에서 보존되어 있다. p27KIP1에서, 이들은 β-헤어핀 턴(hairpin turn)의 일부를 형성하여, 결국 사이클린 A-CDK2 복합체에서 CDK2와 β-샌드위치를 형성한다. 각각의 이러한 보존된 잔기를 알라닌으로 치환시켜 키나제 복합체를 억제하는 능력에 대해 검사하였다 (표 2 참조). 많은 단일 아미노산 치환 돌연변이는 시험관내에서 키나제 복합체 억제 능력에 영향을 주지 않았다. 하지만, BnKrp1 #587 및 BnKrp1 #572는 흥미있는 결과를 보였다. 각각의 경우에, 키나제 억제가 야생형 단백질과 비교하여 감소되어, KRP1의 이 영역이 키나제 억제에 일정한 역할을 한다는 것을 시사하였다.
p27KIP1 내의 페닐알라닌 62번 및 64번의 측쇄는 CDK2와 접촉하고, β-샌드위치를 형성하는데 필수적인 역할을 하며, KRP1에서 보존되어 있다 (도 1 참조). Krp1 F151A(BnKrp1 #572)의 억제 활성은 부분적으로 저하되어 있었으므로, 페닐알라닌 151번 및 153번을 알라닌으로 치환시켰다. 이 이중 돌연변이체 BnKrp1 #512는, 여전히 사이클린D2;1을 통해 키나제 복합체에 결합하는 능력이 있음에도 불구하고, 더이상 키나제 복합체를 억제하지 않았다. 복합체의 CDK 부분에 대한 이 돌연변이체의 일부 잔여 결합이 여전히 있을 수 있다.
KRP1의 티로신 149번은 p27KIP1에서 보존되어 있지 않다; 하지만, 이는 CDK2와 접촉하여 β-샌드위치의 일부를 형성하는 β-헤어핀의 N-말단 위치에 존재한다. 티로신 149번은 아라비돕시스 및 브라시카의 KRP 계열 일원에서 고도로 보존되어 있다. 티로신 149번을 알라닌으로 치환시키면(BnKrp1 #587), 억제 활성이 부분적으로 저하되어, 이는 CDKA의 결합 및/또는 억제에서 일정한 역할을 한다는 것을 시사하였다. 그러므로, 이 위치의 돌연변이(Y149A)는 이중 돌연변이체 Krp1 F151A;F153A와 조합될 수 있다. 이 삼중 돌연변이체는 키나제 활성을 억제시키는 능력을 잃지만 키나제 복합체에 대한 결합을 유지할 것으로 예상되었다.
KRP1 내의 KYNFDF 모티프(서열번호 58)에 대한 C-말단 영역은 또한 p27KIP1에서 보존되어 있는 다수의 아미노산을 함유한다 (도 1 참조). 이러한 잔기 중 다수는 β-샌드위치의 일부분을 형성하는 p27KIP1의 β-가닥에서 보존되어 있다. 이러한 보존된 아미노산 중 다수를 알라닌으로 치환시켰다 (요약에 관해서는 표 2를 참조한다). 한가지 경우를 제외한 모든 경우에서, 억제 기능이 상당히 손상되지는 않았다. 예외는, 야생형 KRP1 보다 훨씬 약한 억제제인 Krp1 #545(E164A;W165A) 돌연변이체였다. 트립토판 165번의 측쇄는 β-샌드위치 내에서 연장된다. 페닐알라닌 151번, 153번 및 E164 및 W165를 모두 알라닌으로 치환시켰다 (Krp1 #574). 이 복합 돌연변이체 BnKrp1은 또한 고농도로 사용한 경우에도 키나제 복합체를 억제하는데 실패하였다.
KRP1의 완전한 CDK 결합 영역의 절두물은 또한 키나제 복합체를 억제시킬 수 없었다. CDK와의 결합을 담당하는 전체 영역을 결실시켰으므로 이는 놀랍지 않았다. 하지만, 본 발명자들은 이러한 절두를 통해 불안정한 단백질이 생성될 것이라고 생각한다.
실시예 4. 돌연변이 KRP CKI 폴리펩티드
전사후 RNA 수준에서 유전자 발현을 사일런싱시키는데 사용된 기존의 기술 이상의 향상으로서, 식물에서 KRP 계열 일원의 억제를 우성-음성 전략을 사용하여 단백질 수준에서 달성하였다. 우성 음성 전략의 기본 원리는, 유전자를 조작해서 돌연변이 단백질을 생산하여 동일한 단백질의 정상적인 카피가 기능을 수행하는 것을 방해하는 것이다. 이 경우에, 정상적인 KRP 단백질은 사이클린/CDK 복합체와 다중-서브유닛 복합체를 형성하여 키나제 활성을 불활성화시킨다. 그러므로, 야생형 KRP1의 돌연변이 버전을 발현시키면, KRP1의 정상적인 카피가 사이클린/CDK 키나제 활성을 억제하는 것이 방해받을 것이다. 그러므로, 브라시카의 7개의 KRP 계열 일원 간의 높은 수준의 상동성이 주어진 경우, 돌연변이 Krp1은 다른 계열 일원에 대해 또는 아마도 모든 계열 일원에 대해 우성 음성으로서 작용할 것이다. 마지막으로, KRP의 사이클린 및 CDK 결합 영역은 다른 식물 종에서 고도로 보존되어 있다. 그러므로, 이 우성 음성 Krp1은, 예를 들면, 옥수수, 밀, 캐놀라, 콩, 벼, 목화, 포플러나무 등과 같은 다른 식물에서 내생적 KRP에 의한 억제로부터 사이클린/CDK 키나제 복합체를 보호할 것이다.
예전에는, 우성 음성 돌연변이체를 사용하여 다양한 시그날 전달 경로를 밝 혀내는데 기여하였다. 특히, 우성 음성 Ras(GTPase)는 현재까지 가장 통상적으로 사용되는 우성 음성 단백질이고, 다른 GTPase를 연구하는데 사용되는 전략에서 중요한 역할을 하였다[참조: Feig and Cooper, Mol . Cell . Biol. 8:3235-3243, 1988]. 유사하게, CDK의 우성 음성 버전을 사용하여 세포 주기 조절에서 CDK의 역할을 확인하였다[참조: van den Heuvel and Harlow, Science 262:2050-2054, 1993].
KIP/CIP 계열의 CKI는 키나제 복합체를 억제하는데 사용하는 메커니즘에 있어서 INK 계열의 억제제와 상이하다. INK 계열은 CDK에만 결합하지만, CIP/KIP 계열은 사이클린 및 CDK에 독립적으로 결합하는 2개의 보존된 영역을 갖고 있다. CIP1/KIP1 계열의 CKI 및 KRP 계열의 CKI는 2개의 접촉 영역을 사용하여 복합체에 결합한다는 사실로 인해, 이들은 우성 음성 전략을 위한 이상적인 후보가 된다. 이는 CDK 결합 영역은, 사이클린에 결합하는 KRP1의 영역을 온전하게 유지하면서 CDK와 상호작용하지 못하는 돌연변이체를 위하여 표적화될 수 있기 때문이다.
본 발명에서, 캐놀라, 브라시카 나푸스(Bn) KRP 및 애기장대(mouse ear cress) 아라비돕시스 탈리아나(At) KRP 분자를 클로닝하여 사이클린/CDK 활성을 억제시키는 능력을 확인하였다. 본 목적상, 시험관내 검정을 개발하여 사이클린/CDK 복합체를 억제하는 KRP의 능력을 검사하였다. 아라비돕시스 사이클린 D2;1 (AtcyclinD2;1) 및 아라비돕시스 CDKA (AtCDKA)를 에피토프 태그화하여 배큘로바이러스 발현 벡터 시스템[판매원: BD Bioscience] 속에 클로닝하였다. AtCyclinD2;1을 N-말단에 FLAG 에피토프[판매원: Sigma-Aldrich]로 태그화하였다. 헤마글루티 닌 (HA) 에피토프를 AtCDKA의 5' 말단과 프레임을 유지하며 위치시켰다. AtcyclinD2;1 단백질의 생산을, 에스.프루기페르다 Sf9 세포를 AtcyclinD2;1 배큘로바이러스로 감염시켜 달성하였다. AtCDKA의 생산은, 에스.프루기페르다 Sf9 세포를 CDKA 배큘로바이러스로 감염시켜 달성하였다. 사이클린D2;1/CDKA의 활성 복합체는, AtcyclinD2;1 및 AtCDKA 배큘로바이러스로 에스.프루기페르다 Sf9를 공동감염시켜 달성하였다. 사이클린, CDK 및 활성 복합체를 정제하여 키나제 활성에 대해 검정하였다. 키나제 활성을, 히스톤 HI(HHI)를 기질로서 사용하는 표준 키나제 검정을 사용하거나 재조합 NtRb를 사용하여 모니터하였다[참조: Nakagami et al., Plant Cell 14:1847-1857, 2002]. 사이클린 D2;1 감염된 곤충 세포에서는 활성 복합체가 생산되지 않았다. 유사하게, CDKA 감염된 세포에서는 활성 키나제가 생산되지 않았다. 세포를 Atcyclin D2;1 및 AtCDKA로 감염시킨 경우, 키나제 활성이 쉽게 검출되었다. 활성 사이클린 CDK 복합체는 또한, p13suc1 아가로스 비드를 사용하여 식물 단백질 조직 추출물로부터 또는 식물 조직 배양 세포 추출물로부터 정제할 수 있었다[참조: Wang et al., Plant J. 15:501-510, 1998].
pET16b 벡터[판매원: Novagen]에서 HIS 태그에 대한 암호화 서열과 프레임을 유지하며 Krp cDNA를 서브클로닝하여, Krp가 N-말단 폴리-히스티딘 에피토프 태그(HIS 태그)를 함유하도록 설계하였다. 세균에서 야생형 및 돌연변이 Krp 단백질 발현을 유도하고 나서, Ni-아가로스를 사용하여 HIS 태그 융합 단백질로서 정제하였다.
검사한 모든 야생형 브라시카 나푸스 (Bn) Krp (BnKRP1, BnKRP4, BnKRP5)는 사이클린 D2;1/CDKA 복합체를 억제시키는데 매우 효과적이었다. 모든 경우에, 억제는 또한 용량 반응성(dose responsive)이었다. 다수의 다른 아라비돕시스 AtKrp (AtKRP1, AtKRP2)는 또한 효과적인 억제제였다.
CIP1/KIP1 계열의 CKI는 2개의 접촉 영역을 사용하여 키나제 복합체에 결합하고 이를 억제시킨다. 이러한 결합 및 억제 방식에 따라, 이들 2개의 영역 중 하나의 결합 능력을 변화시키면, 우성 음성 특징을 갖는 돌연변이 단백질이 잠재적으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 사이클린 결합 영역을 비-기능성으로 만들면, 돌연변이 단백질은 CDK 결합 영역을 통해 키나제 복합체와 접촉 도메인을 통해 여전히 상호작용할 것이다. 유사하게, CDK 결합 영역을 비-기능성으로 만들면, 돌연변이 단백질은 사이클린 결합 영역을 통해 키나제 복합체와 여전히 상호작용할 것이다.
ICK/KRP 계열 일원은 포유동물 p27KIP1 계열에 대해 한정된 아미노산 동일성을 갖는다. 이 동일성은 가장 C-말단의 24 내지 30개 아미노산에 한정된다. 사실, 포유동물 p27KIP1의 사이클린/CDK 결합 도메인은 단백질의 N-말단에 위치하지만, 식물 Krp 내의 상동 영역은 단백질의 가장 C-말단 부분에서 발견된다 (p27KIP1 및 다양한 Krp 계열 일원의 정렬을 보여주는 도 1을 참조한다). 포유동물 p27KIP1 내의 사이클린 결합 영역은 식물 KRP에서 보존되어 있지 않다. 하지만 추정되는 CDK 결합 영역의 바로 상류 영역은 모든 식물 KRP에서 보존되어 있다. 이 보존된 영역 은, p27KIP1 에 대해 상동성이 아니지만, 사이클린과의 상호작용을 담당할 수 있다. BnKRP1의 상기 제안된 사이클린 결합 영역 내의 다수의 잔기의 아미노산 치환 (아미노산 125번 내지 138번)은 사이클린에 결합하지 못하게 하지만, CDK에 대한 결합에는 영향을 주지 않는다. 이러한 데이터는, 활성 키나제 복합체와의 상호작용을 매개하는 포유동물 p27KIP1 대응물과 유사한 2개의 영역이 KRP 내에 존재한다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 사이클린 결합 영역을 돌연변이시켜도 키나제 복합체의 억제가 완전히 없어지지 않아, CDK 결합 영역이 사이클린/CDK 키나제 억제를 주로 담당한다는 것을 시사한다.
식물 및 포유동물 CKI의 CDK 결합 영역 간의 높은 수준의 상동성이 주어진 경우, 사이클린 A/CDK2 복합체에 결합한 p27KIP1의 결정 구조를 사용하여, 사이클린 및 CDK에 결합하는 p27KIP1의 접촉 잔기를 확인하는데 기여하였다[참조: Russo et al., Nature 382:325-331, 1996]. 접촉 잔기를 다양한 KRP 서열과 비교하여, 이들이 p27KIP1에 대한 상동성이 가장 높은 영역에서 보존되어 있는지의 여부를 결정하였다. CDK 결합 영역의 가장 N-말단에는 LysTyrAsnPheAspPhe (KYNFDF) (서열번호 588) 모티브가 존재한다. 이러한 잔기는 대부분 p27에서 보존되어 있다. 이들은 사이클린 A-CDK2 복합체의 CDK2와 접촉하는 β-쉬트를 형성한다.
각각의 이러한 보존된 잔기를 알라닌으로 치환시켜 키나제 복합체를 억제하는 능력에 대해 검사하였다. 흥미롭게도, 이러한 단일 아미노산 치환 돌연변이 중 다수는 시험관내에서 키나제 복합체 억제 능력에 영향을 주지 않았다. 하지만, Krp1 F151A 및 Krp1 Y149A 돌연변이체는 키나제 복합체에 대한 결합에 영향을 주지 않으면서 CKI 활성을 감소시켰다.
페닐알라닌 151번 및 153번의 측쇄는 CDK와 접촉하고 Krp1 F151A 억제 활성은 부분적으로 저하되어 있었으므로, 페닐알라닌 151번 및 153번을 알라닌으로 치환시켰다. 이 이중 돌연변이체 BnKrp1 (BnKrp1 F151A;F153A)은, 사이클린D2;1을 통해 키나제 복합체에 결합하는 능력이 있음에도 불구하고, 더이상 키나제 복합체를 억제하지 않았다. 복합체의 CDK 부분에 대한 이 돌연변이체의 일부 잔여 결합이 여전히 있을 수 있다는 것을 배제할 수 없다.
Krp1의 티로신 149번은 p27KIP1에서 보존되어 있지 않지만, 포유동물 p27의 구조 모델에서 유사한 아미노산 잔기가 CDK2와 접촉하는 β-쉬트의 위치에 존재한다. 알라닌으로 치환시킨 경우(Krp1Y149A), 억제 활성이 부분적으로 저하되어, 이 아미노산 잔기가 CDKA의 결합 및/또는 억제에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사하였다. 그러므로, 이중 돌연변이 Krp1 F151A;F153A와 조합된 이 위치의 돌연변이(Y149A)는, 키나제 복합체를 더이상 억제시키지 않는 변이 단백질을 생산하였다. 이 삼중 돌연변이체(BnKrp1 Y149A;F151A;F153A)는 키나제 활성을 억제시킬 수 없지만 키나제 복합체에 대한 결합을 여전히 유지한다고 예상된다.
위와 같이, Y149A 및 F151A의 단일 아미노산 치환은 둘다 개별적으로, 돌연변이 BnKrp1 폴리펩티드의 키나제 복합체 억제 능력을 감소시켰다. BnKrp1 Y149A;F151A의 이중 돌연변이체는 키나제 복합체를 더이상 억제시키지 않는 돌연변 이 단백질을 생산할 것으로 예상된다.
KRP1 내의 KYNFDF 모티프 (서열번호 58)에 대한 C-말단 영역은 또한 p27KIP1에서 보존되어 있는 다수의 아미노산을 함유한다. 이러한 보존된 아미노산을 알라닌으로 치환시켰다. 한가지 경우를 제외한 모든 경우에서, 억제 기능이 상당히 손상되지는 않았다. 예외는, 야생형 KRP1 보다 훨씬 약한 억제제인 Krp1 E164A;W165A 돌연변이체였다. 별개의 유도체 단백질에서, 페닐알라닌 151번, 153번 및 E164 및 W165를 모두 알라닌으로 치환시켰다. BnKrp1의 상기 다중 돌연변이체는 또한 키나제 복합체를 억제하는데 실패하였다.
KRP1의 완전한 CDK 결합 영역의 절두물은 또한 키나제 복합체를 억제시킬 수 없었다. CDK와의 결합을 담당하는 전체 영역을 결실시켰으므로 이는 놀랍지 않았다.
생물학적 활성에 대한 다양한 BnKrp1 돌연변이체의 평가 결과를 표 2에 요약한다.
Figure 112008015367329-PCT00003
앞서 언급한 바와 같이, 사이클린 결합 도메인을 붕괴시키면 일부 억제 활성을 여전히 유지하는 돌연변이 Krp1 단백질이 생성된다. 그렇지만, 추정되는 사이클린 결합 영역 (아미노산 125번 내지 138번) 내에 다른 아미노산이 존재하는 것 같고, 이를 치환시켜 임의의 우성 음성 특징을 만족시키는 돌연변이 단백질을 생성시킬 수 있을 것이다. 또한, 알라닌을 상기 특정 연구의 모든 치환에서 사용하였지만, 확인된 아미노산 잔기를 하나 이상의 물리적인 성질이 상당히 상이한 다른 비-알라닌 아미노산 잔기로 치환(다른 비-보존적 치환)시켜도, 우성 음성 단백질이 수득될 것이라고 예상된다. 특히, 특정 아미노산 잔기를 반대 전하를 띤 아미노산으로 또는 실질적으로 상이한 일정한 특징을 갖는 아미노산 잔기로 치환시키면, 예를 들어, 친수성 잔기를 소수성 잔기로 치환시키거나 그 반대로 치환시키면, 보다 우수한 우성 음성 후보물이 수득될 것이라고 예상된다.
이상적인 우성 음성 후보물은, 키나제 활성을 없애는데 필요한 야생형 억제제의 최소량의 10배까지 사용되는 경우에도 키나제 활성을 억제하지 않을 것이다. 다수의 돌연변이체는 이 요건을 만족시켰다 (표 2 참조). 이러한 특징의 중요성은, 생체내에서 발현되는 경우 돌연변이 단백질의 수준이 야생형 단백질과 비교하여 과도하게 높은 수준에 있을 수 있다는 사실에 있다.
본 연구에서 확인된 우성 음성 BnKrp1 분자는 사이클린D2;1/CDKA 복합체를 야생형 BnKRP1 억제로부터 효과적으로 보호한다. 동일한 우성 음성 유도체 Krp1 분자는 또한, 옥수수, 콩, 벼, 목화, 포플러나무 및 알팔파와 같은 다른 종으로부터의 KRP 분자에 의한 억제로부터 키나제 복합체를 보호한다 (실시예 7 참조).
실시예 5. 야생형 CKI 단백질의 키나제 복합체 억제를 경쟁적으로 차단하는 돌연변이 BnKrp1 단백질
특히 유용한 우성 음성 후보는, 키나제 활성을 없애는데 필요한 야생형 억제제의 최소량의 10배까지 사용되는 경우에도 키나제 활성을 억제하지 않을 것이다. 다수의 돌연변이체는 이 요건을 만족시켰다 (표 2, 도 1 및 실시예 2 참조). 이러한 특징의 중요성은, 생체내에서 발현되는 경우 돌연변이 단백질의 수준이 야생형 단백질과 비교하여 과도하게 높은 수준에 있을 수 있다는 사실에 있으며, 돌연변이 단백질은 키나제 복합체를 사실상 임의의 농도에서 실질적으로 억제하지 않는다는 것이 중요하다.
다수의 우성 음성 후보를, 야생형 BnKRP1으로부터 사이클린D2;1/CDKA 복합체를 보호하는 능력에 대해 검사하였다. 경쟁 실험을 다음과 같이 수행하였다. 활성 사이클린D2;1/CDKA 키나제 복합체(7㎍)를 후보 우성 음성 BnKrp1 돌연변이체(5㎍ 또는 10㎍)와 함께 20분 동안 1X 키나제 완충액 중에서 예비항온처리하였다. 이어서, 복합체를, HHI를 기질로서 사용하여 야생형 BnKrp1 (0.5㎍, 1.0㎍ 또는 2㎍)의 부재 하에서 또는 이를 첨가한 후 키나제 활성에 대해 검사하였다. 이어서, 키나제 반응물을 실시예 1의 "키나제 검정"에 기술된 바와 같이 SDS PAGE로 분리하였다. 결과를 phosphorImager[판매원: Molecular Dynamics]로 정량하였다.
BnKrp1 F151A;F153A(BnKrp1 #512)는 야생형 BnKRP1에 의한 억제로부터 키나제 복합체를 보호할 수 있었다. 5㎍의 BnKrp1 F151A;F153A는 0.6㎍의 야생형 KRP1의 존재 하에서 키나제 활성의 최대 40%를 회복시켰다. 이 우성 음성 효과는 용량 의존적이었고, 10㎍의 BnKrp1 F151A;F153A를 사용한 경우 키나제 활성의 최대 60%가 회복되었다.
돌연변이체 BnKrp1 #555(E164A;W165A)는, 또한 반응물 당 10㎍으로 사용한 경우에도 키나제 활성을 억제하는데 실패하였기 때문에, 유망한 우성 음성 후보이다. 경쟁 실험에서, 이 돌연변이체는 야생형 KRP1에 의한 억제로부터 활성 키나제 복합체를 보호하였지만, 5㎍을 사용한 경우에는 14% 그리고 10㎍을 사용한 경우에는 15%의 활성만을 회복시켰다. BnKrp1 #512 및 BnKrp1 #555로부터의 돌연변이를 BnKrp1 #574(F151A,F153A,E164A,W165A)라고 하는 하나의 돌연변이 단백질 속에 조합시켰다. 이 복합 돌연변이체는 5㎍ 및 10㎍의 양에서 스스로 키나제 활성을 억제하는데 실패하였다. 이 복합 돌연변이체는 야생형 BnKRP1에 의한 억제로부터 키나제 복합체를 보호할 수 있었지만, 활성을 35% 만큼만 회복시킬 수 있었다. 돌연변이체 BnKrp1 #598(Y149A;F151A;F153A)은 야생형 BnKRP1에 의한 억제로부터 키나제 복합체를 보호할 수 있었다. 5㎍의 BnKrp1 F151A;F153A는 0.6㎍의 야생형 KRP1의 존재 하에서 최대 55%의 키나제 활성을 회복시켰다. 이 우성 음성 효과는 용량 의존적이었고, 10㎍의 BnKrp1 Y149A;F151A;F153A를 사용한 경우 최대 80%의 키나제 활성을 회복시켰다.
이러한 데이터는, 우성 음성을 위한 표적화를 위한 최적 영역은 β-헤어핀 영역이라는 것을 시사한다. 하지만, 임의의 잔기를 치환시킬 수는 없다. 다수의 단일 아미노산 치환은 우성 음성 Krp를 생성하는데 실패하였지만(실시예 3 참조), 사실상, 보존된 잔기를 너무 많이 치환시켜도, 결국 우성 음성으로서 작용하는데 실패한다는 것을 제외하고는, 우성 음성의 대부분의 요건을 만족시키는 돌연변이체가 생성된다. AtKrp2는 BnKrp1 및 AtKrp1과 가장 밀접하게 관련되어 있다. KYNFDF 모티프 (서열번호 58)가 KAAAAA (서열번호 59)로 치환된 돌연변이체 AtKrp2는 우성 음성 Krp 분자의 유망한 특징을 가졌다. 고농도에서, 이 BnKrp2 돌연변이체는 예상한 바와 같이 키나제 복합체를 억제하는데 실패하였다. 흥미롭게도, 이 돌연변이체는 야생형 BnKRP1에 의한 억제로부터 키나제를 보호하는데 실패하였다.
요약: BnKrp1 F151A;F153A는 야생형 KRP의 키나제 억제를 차단시켰다. Krp1 E164A;W165A는 야생형 KRP를 잘 차단하지 못했지만, BnKrp1 (Y149A;F151A;F153A)는 시험관내 경쟁 검정에서 가장 우수한 우성 음성 후보였다. 이중 돌연변이체 BnKrp1(Y149A;F151A)는 또한 키나제 복합체를 억제로부터 보호할 수 있는 것 같다.
앞서 언급한 바와 같이, 사이클린 결합 도메인을 붕괴시키면 일부 억제 활성을 유지하는 돌연변이 Krp1 단백질이 생성된다. 그렇지만, 치환되어 모든 우성 음성 특징을 만족시키는 돌연변이 단백질을 생성시킬 수 있는 다른 아미노산이 존재하는 것 같다. 또한, 알라닌은 모든 치환의 경우 선택된 아미노산이었다. 다수의 제시된 돌연변이체에서, 잔기를 비-보존적 아미노산으로 치환시켜, 보다 우수한 우성 음성 후보가 수득될 수 있다.
실시예 6. 다른 브라시카 나푸스 KRP 계열 일원에 대해 우성 음성으로서 작용하는 BnKrp1 F151A;F153A 및 BnKrp1 Y149A ;F151A;F153A
우성 음성 전략의 전체 목적 중 하나는, 야생형 대응물에 대해서 뿐만 아니라 모든 계열 일원에 대해서도 우성 음성으로서 작용하는 돌연변이를 KRP 계열의 하나의 일원 속에 도입시키는 것이었다. 브라시카 나푸스 및 아라비돕시스의 KRP 계열의 CKI의 정렬은, 단백질의 가장 C-말단에 높은 서열 동일성이 존재한다는 것을 설명한다. CDK 결합 도메인의 바로 N-말단에 있는 보존된 영역이 사이클린과의 결합을 담당한다는 것을 증명하는 데이터가 위에 제시되었다. 또한, 다수의 그룹이, 다수의 KRP 분자가 사이클린 결합에 대해 중첩되는 특이성을 갖는다는 것을 설명하는, 2-하이브리드 스크리닝 데이터를 제시하였다.
BnKRP4는 β-헤어핀에서 BnKRP1과 상이하다. Phe 151번은 BnKRP1과 BnKRP4 간에 보존되어 있지만, BnKRP1 F153은 BnKRP4에서 프롤린이다. 이는 반드시 보존적 아미노산 치환은 아니며, BnKRP4는 BnKRP1과 상이하게 사이클린/CDKA 복합체와 상호작용할 수 있다는 것을 시시한다. 하지만, CDK 결합 도메인 내의 이 위치는 사이클린/CDKA 억제에서 중요한 역할을 하는 것 같지 않다는 것이 이미 밝혀졌다 (돌연변이체 BnKrp1 #573, 실시예 1 참조).
BnKRP4를 다음의 2개의 올리고뉴클레오타이드를 사용해서 클로닝하여, BnKrp4-1의 3' 말단에 5' BamHI/NdeI 부위 및 XhoI 제한 부위를 부가시키는 BnKrp4 cDNA를 증폭시켰다 (5'BnKrp4-1 BamHI/NdeI: GGATCCCATATGGGAAAATACATAAAG (서열번호 60) 및 3'BnKrp4-1 XhoI: CTCGAGCTAATCATCTACCTTCTT (서열번호 61)). PCR 단편을 pTG #315(TopoII BnKrp4-1)로부터 증폭시켜, pET16b-5myc의 BamHI 및 XhoI 부위 속에 서브클로닝하고 서열분석하였다. 생성된 벡터 BnKrp #605는 6XHis 및 myc 태그와 프레임을 유지하며 BnKRP4 야생형 cDNA를 함유하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 단백질을 발현시키고 정제하였다.
BnKrp4는 IC50이 야생형 BnKRP1의 IC50과 매우 유사한 AtcyclinD2;1/CDKA 키나제 복합체의 강력한 억제제이다. 경쟁 실험을 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이 경우에, BnKrp1 #512 (F151A; F153A) 및 BnKrp1 #598 (Y149A; F151A; F153A)는 야생형 BnKRP4에 의한 억제로부터 키나제 복합체를 보호할 수 있었다. 이러한 관찰에 따라, BnKrp1 #512 및 BnKrp1 #598은, 전부는 아니지만 대부분의 BnKRP 계열 일원에 대해 우성 음성으로서 작용할 것이라고 예상된다.
실시예 7. 다른 식물 종의 Krp 에 대해 우성 음성으로서 작용하는 BnKrp1 F151A;F153A 및 BnKrp1 Y149A ;F151A;F153A
우성 음성 전략의 전체 목적 중 하나는, 야생형 계열 일원에 대해서 뿐만 아니라 상이한 식물 종의 KRP 계열 일원에 대해서도 우성 음성으로서 작용하는 하나 이상의 돌연변이를 KRP 계열의 하나의 일원 속에 도입시키는 것이었다. 본 발명에서 관심대상인 작물 식물에는 대두, 캐놀라, 옥수수, 밀, 알팔파, 벼, 채소 작물 (예: 토마토), 및 나무 (예: 포플러나무)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
AtKRP1의 뉴클레오타이드 서열(GenBank#U94772)을 사용하여 옥수수, 콩, 포플러나무, 담배 및 벼의 KRP 서열에 대해 tBLASTn 검색을 수행하였다. 다수의 짧은 EST는 사이클린/CDK 결합 도메인에 한정되어 높은 상동성을 보였다. 이러한 짧은 서열 중 다수를 정렬시켰고, 이들은 다양한 식물 종 간에 이 영역의 보존을 설명한다 (도 2 참조).
옥수수에서, 한가지 특정 엔트리(entry), Genbank 번호 AY986792는 다수의 BnKRP 계열 일원에 대해 높은 동일성을 갖는 전체 길이 단백질을 암호화하는 573bp의 개방 판독 프레임을 함유하였다. 이 단백질은 ZmKRP4라고 명명되었지만, 반드시 BnKRP4 또는 AtKRP4의 옥수수 상동체인 것은 아니다. BnKRP4와 같이, ZmKRP4는 β-헤어핀에서 BnKRP1과 상이하다. Phe 151번은 BnKRP1과 BnKRP4와 ZmKRP4 간에 보존되어 있었다. 하지만, BnKRP1 F153은 BnKRP4 및 ZmKRP4에서 모두 프롤린이었다. ZmKRP4를 성숙한 옥수수 수염으로부터 분리된 전체 RNA로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시켰다. 올리고뉴클레오타이드의 서열을 Genbank 번호 AY986792로부터 입수하였다. ZmKRP4 5'BamHI/NdeI: GGATCCCATATGGGCAAGTACATGCGC (서열번호 62) 및 ZmKRP4 3'BamHI: GGATCCTCAGTCTAGCTTCACCCA (서열번호 63). PCR 산물을 TOPOII[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하여 서열분석하였다. ZmKRP4의 단백질 산물의 경우, 573bp의 BamHI 단편을 pET16b-5Myc 벡터의 BamHI 부위 속에 클로닝하고, 삽입 배향을 제한 효소 매핑으로 결정하였다. 재조합 단백질을 실시예 4에 기술한 바와 같이 생산하였다.
유사하게 콩에서, 한가지 특정 엔트리, Genbank 번호 AY439104는 다수의 BnKRP 계열 일원에 대해 높은 동일성을 갖는 전체 길이 단백질을 암호화하는 499bp의 개방 판독 프레임을 함유하였다. GmKRP2-2라고 하는 이 단백질은 β-헤어핀 내에서 사실상 BnKRP1과 동일하다. GmKRP2-2를, 성장중인 어린 콩 식물로부터 분리한 전체 RNA로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시켰다. 올리고뉴클레오타이드를 Genbank 번호 AY439104의 서열로부터 설계하였다: GmKRP2-2 5'XhoI/NdeI: ctcgaggacatatggagatggctcaggttaaggca (서열번호 64) 및 GmKRP2-1 3'XhoI: ctcgagtcaactgaacccactcgtatcgtcc (서열번호 65). PCR 산물을 TOPOII[판매원: Invitrogen] 속에 서브클로닝하여 서열분석하였다. GmKRP2-2 단백질 발현의 경우, 499bp의 XhoI 단편을 pET16b-5Myc 벡터의 XhoI 부위 속에 클로닝하고, 삽입 배향을 제한 효소 매핑으로 결정하였다. 재조합 단백질을 실시예 4에 기술한 바와 같이 생산하였다.
ZmKRP4 및 GmKrp2-2를 재조합 사이클린D2;1/CDKA 키나제 복합체를 억제시키는 능력에 대해 검사하였다. ZmKRP4는 IC50이 야생형 BnKRP1의 IC50(0.035㎍)과 매우 유사한 키나제 복합체의 강력한 억제제였다. 유사하게, GmKrp2-2는 또한 키나제 복합체의 강력한 억제제였다. 두 우성 음성 BnKrp1(BnKrp1 #512 및 #598)은 ZmKRP4 및 GmKrp2-2의 키나제 복합체 억제를 차단시킬 수 있었다. 각각의 경우에, 보호는 BnKRP1 억제에 대한 BnKrp1 #512의 보호에 필적하였다. 이 결과는 본 발명의 우성 음성 Krp의 이종(cross species) 효과를 설명한다.
상기 실험은 또한, BnKrp #512 및 BnKrp #598이 벼, 밀, 수수, 사탕수수, 사탕무 등으로부터의 것과 같은 다른 이종 KRP 계열 일원에 대해 유사한 효과를 가질 것이라는 것을 시사한다. 이러한 식물 종 및 기타 종으로부터의 KRP 분자를 유사한 연구에서 클로닝하고, 재조합 단백질로서 발현시키고, 평가하여, BnKrp1 #512 및 BnKrp1 #598이 이러한 계열 일원에 대해 유사한 효과를 갖는다는 것을 증명할 수 있다.
실시예 8. 우성 음성 분자를 생성하는 다른 식물 종 KRP 분자에서의 유사 돌연변이( parallel mutation )
BnKRP1에서 치환되어 우성 음성 효과를 내는 잔기는 캐놀라, 옥수수, 콩, 벼, 알팔파, 포플러나무, 담배 등의 다수의 KRP 계열 일원에서 보존되어 있다. 보존된 페닐알라닌의 알라닌 잔기로의 치환을 이러한 작물 식물의 다수의 KRP에서 수행하여, 우성 음성 분자로서 작용하는 능력에 대해 검사할 수 있다.
F151 및 F153은 캐놀라, 콩, 옥수수에서 전부는 아니지만 일부의 KRP에서 보존되어 있다. 콩 및 옥수수 KRP의 이러한 보존된 잔기의 돌연변이는 유사한 우성 음성 Krp 분자를 생성할 것이다.
실시예 9. Krp1 (F151a;F153a)의 배아-특이적 및 구성적 발현을 위하여 설계된 전이유전자 작제물을 발현하는 유전자전이 캐놀라 식물
상기 실험에서 제시된 시험관내 결과에 따라, 배양된 식물 세포 또는 유전자전이 식물에서의 본 발명의 발현은 내생적 CDK 키나제 활성을 증가시킬 것으로 예측된다. 이러한 CDK 키나제 활성의 증가는 세포 주기에 대해 양성 효과를 줄 것이다. 본 발명물을 식물 발현 세포 속에 클로닝하였다. 식물 발현 벡터는 앞서 기술된 발명물에 연결된 천연 또는 비-천연 프로모터를 함유한다. 프로모터는 강력한, 약한, 유도성, 조직-특이적, 기관 특이적 및 발생 특이적일 수 있다.
BnKrp1(F151A;F153A) 돌연변이의 동등물을 다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 AtKRP1 속에 도입시켰다: "QC AtKrp1 cds F173A;F175A-coding" 5'-TTCAAGAAGAAGTACAATGCCGATGCCGAGAAGGAGAAGCCATTA-3' (서열번호 66) 및 "QC AtKrp1 cds F173A;F175A-noncod" 5'-TTATGGCTTCTCCTTCTGGGCATCGGCATTGTACTTCTTCTTGAA-3' (서열번호 67). Stratagene QuikChange 부위 지시된 돌연변이유발 키트를 사용하여 AtKrp1 #359를 주형으로서 사용하였다. AtKrp1 F173A;F175A(pTG356)을 서열분석으로 확인하였다. LFAH12 프로모터를 두 단계로 pTG 356 내의 돌연변이 AtKrp1(F173A;F175A)의 5' 말단에 삽입시켰다. 우선, pCAMBIA 2381Z(pTG 254)로부터의 SalI 및 PstI LFAH12 프로모터를 pBluescript II[판매원: Stratagene] 속에 SalI 및 PstI 부위 내에 클로닝하여, pTG 357을 생성시켰다. 이어서, LFAH12 프로모터를 PstI 및 BamHI을 사용하여 pTG 357로부터 절단하여 pTG 356 속에 삽입시켜 pTG 361을 생성시켰다. 마지막으로, pTG 361을 KpnI 및 NotI으로 분해시키고, pLAY112를 NotI 및 BglII로 분해시키고 (mas3' utr 구성요소), pCGN 1547을 KpnI 및 BamHI으로 분해시켜, 3 방향 연결(3-way ligation)을 수행하였다. 이로써 LFAH12-At ICK1 cds DN-mas 3' utr 카세트 (pTG 369)가 생성되었다.
구성적 프로모터 35S의 조절 하에 있는 BnKrp1(F151A;F153A)를 함유하는 식물 발현 벡터를 다음의 방법으로 작제하였다. BnKrp1(F151A;F153A) cds를 함유하는 BamHI/XhoI 단편을 동일한 부위를 사용하여 pTG 271 (35S/TOPO Blunt) 속에 클로닝하였다. 생성된 작제물(pTG529)을 KpnI 및 XbaI으로 절단하였다. pLAY112를 XbaI 및 HindIII로 절단하고, pCGN1547을 KpnI 및 HindIII로 절단하여, 3 방향 연결을 수행하였다. 이로써 35S-BnKrp1(F151A;F153A)-mas3 utr 카세트(pTG533)가 생성되었다.
캐놀라 ( 브라시카 나푸스 ) 형질전환
이중 반수체 캐놀라 변종 DH12075를, 문헌[참조: Maloney et al., Plant Cell Reports 8:238, 1989]의 방법에 따른 아그로박테리움-매개된 형질전환 방법을 사용하여 LFAH-12 AtKrp1(F173A;F175A) 및 35-S BnKrp1(F151A;F153A) 전이유전자 발현 작제물 (총칭하여 이 실시예에서 "돌연변이 Krp1 전이유전자 발현 작제물"이라고도 함)로 형질전환시켰다.
멸균된 종자를, 15 X 60 mm 페트리 디쉬에서 1% 수크로스를 함유하는 1/2 MS[판매원: Murashige & Skoog] 배지 상에서 5일 동안 플레이트 당 대략 40 내지 60개의 종자를 발아시켰다. 총 대략 1500개의 종자를 각각의 형질전환 작제물에 대해 발아시켰다. 종자를 발아 배지에 완전히 담그지 않았다. 발아된 모종(seedling)을 조직 배양실 내에서 25℃에서 16시간 낮/8시간 밤 주기로 성장시켰다.
떡잎을 임의의 분열조직이 포함되지 않도록 정단 분열조직(apical meristem) 바로 위에서 잘랐다. 이는 정단 분열조직 영역의 바로 위에서 핀셋으로 2개의 잎자루를 서서히 집어 실시하였다. 핀셋으로 잎자루가 눌리지 않도록 주의하였다. 지시와 같이 핀셋의 끝을 사용하여, 잎자루를 날카로운 12번 칼날이 장착된 외과용 메스(scalpel)를 사용하여 잘랐다. 떡잎을 공동 배양 배지의 15mm X 100mm 플레이트 위에 풀어놓았다. 적당히 절단된 떡잎은 쉽게 분리된다. 그렇지 않은 경우, 분열조직이 포함되었을 가능성이 높고, 이러한 떡잎은 사용하지 않았다. 각각의 플레이트에 대략 20개의 떡잎을 넣었다. 떡잎 외식편(explant)을, 프로토콜의 다음 단계에 음성 영향을 줄 수 있는 시듦을 방지하기 위하여 제조된 플레이트 마다 아그로박테리움으로 접종시켰다.
돌연변이 Krp1 전이유전자 발현 작제물을 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 속에 전기천공으로 도입시켰다. 돌연변이 Krp1 전이유전자 발현 작제물을 보유하는 아그로박테리움을 적당한 항생제가 있는 AB 배지 중에서 2일 동안 28℃에서 진탕하면서 성장시켰다. 떡잎 외식편을 접종시키기 위하여, 소량의 아그로박테리움 배양물을 10mm x 35mm 페트리 디쉬에 첨가하였다. 각각의 외식편의 잎자루를 아그로박테리움 배양물 속에 담그고, 절단된 끝부분을 페트리 디쉬 내의 공동 배양 배지 속에 위치시켰다. 플레이트를 밀봉하여, 25℃, 16시간 낮/8시간 밤 주기의 조직 배양실에 3일 동안 넣어두었다.
3일 후, 외식편을 신초(shoot) 유도 배지를 함유하는 새로운 25mm x 100mm 페트리 디쉬로 10개씩 이동시켰다. 이 배지는 선별제(20mg/L 카나마이신) 및 호르몬(4.5mg/L BA)을 함유하였다. 건강해 보이는 외식편만을 이동시켰다. 외식편을 신초 유도 배지에서 14 내지 21일 동안 유지시켰다. 이 기간에, 녹색 캘러스 및 아마도 일부 신초 발생 및 일부 비-형질전환된 신초가 관찰될 수 있었다. 비-형질전환된 신초는 흰색 및 자주색으로 쉽게 인식되었다. 카나마이신-민감성 신초를 잘라 제거하고, 모든 건강해 보이는 캘러스를 신초 유도 배지가 있는 새로운 플레이트로 이동시켰다. 외식편을 이러한 플레이트에서 추가로 14 내지 21일 동안 유지시켰다.
2 내지 3주 후, 색이 암녹색인 신초를 신초 신장(elongation) 배지를 함유하는 플레이트로 이동시켰다. 이 배지는 선별제(20mg/L 카나마이신)를 함유하였지만, 호르몬은 함유하지 않았다. 5개의 신초를 각각의 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 밀봉하여, 조직 배양실에 다시 넣었다. 투명해 보이는 형질전환된 신초를 플로로글루시놀(150mg/L)을 함유하는 신초 신장 배지로 이동시켰다. 건강해지고 녹색으로 된 신초를 신초 신장 배지 플레이트로 다시 이동시켰다. 투명한 신초를 동일한 배지의 새로운 플레이트로 이동시키는 것을 반복하는 것은, 일부 경우에 정상적으로 보이는 신초를 수득하기 위하여 필요하였다.
정상적인 형태를 갖는 신초를 0.5mg/L 인돌 부티르산을 함유하는 발근(rooting) 배지가 있는 4온스의 유아식 병(baby food jar)으로 이동시켰다. 신초를 병으로 이동시킬 때 임의의 과잉 캘러스를 잘라버렸다. 신초를 0.2mg/L 인돌 부티르산을 함유하는 새로운 병으로 대략 6주 마다 이동시켜, 병 속에서 무한히 유지시킬 수 있었다.
일단 우수한 뿌리 시스템이 형성되면, T0 세대 신초를 병으로부터 옮겨, 한천을 뿌리로부터 제거하고, 어린 식물을 화분용 영양토(potting soil)로 이동시켰다. 각각의 독립적인 T0 식물은, 전이유전자의 캐놀라 게놈 속으로의 삽입의 독립적인 발생을 나타내며, 이들을 이벤트(event)라고 한다. 투명한 컵을 수일 동안 식물 위에 놓아, 식물이 새로운 환경에 순응하게 하였다. 일단 식물이 경화(hardening)되면, 컵을 제거하였다. 이어서, T0 유전자전이 이벤트를 온실에서 성숙시켜 T1 종자를 수거하였다.
T 0 이벤트 특성규명
전이유전자 삽입 부위 좌의 수를 각각의 이벤트에서 서던 분석으로 결정하였다. T0 이벤트에서의 돌연변이 Krp1 전이유전자 발현을 노던 분석 또는 종점(end-point) RT-PCR로 확인하였다. 돌연변이 Krp1 전이유전자 발현 데이터를, 수분(pollination) 19일 후, 배아 발생 중 단일 시점에 대해 얻었다. 이러한 데이터로부터, 상기 발생 시점에서 LFAH12 프로모터가 높은 수준의 AtKrp1(F173A;F175A) mRNA를 유도하고 있었다고 결론지었다. 35S BnKrp1(F151A;F153A) 전이유전자 발현을, 많은 이벤트에서 중간 내지 높은 수준으로 발현되는 잎 샘플에서 모니터하였다. 발현 데이터는, 두 프로모터가 모두 유전자전이 캐놀라 식물에서 돌연변이 Krp1 전이유전자 발현을 유도하는데 있어서 기능성이라는 것을 증명하였다.
키나제 활성을 또한 측정하여 내생적 사이클린-CDK 키나제 활성에 대한 돌연변이 Krp1 단백질 발현의 효과를 결정할 수 있다. 유전자전이 및 비-유전자전이 식물 조직 또는 세포로부터의 동량의 단백질 추출물을 p13Suc1 수지[판매원: Upstate, Chicago, IL]를 사용하여 CDK에 대해 농축시키고, 히스톤 키나제 검정을 실시예 4 또는 문헌[참조: Wang et al., Plant J. 15:501-510, 1998]에 기술된 바와 같이 수행한다. 키나제 반응물을 SDS-PAGE로 분리하고, HHI 인산화를 PhosphorImager로 정량한다.
T0 식물이 두 돌연변이 Krp1 전이유전자 발현 작제물의 경우 모두 성공적으로 발생되었다. 검사한 작제물은 (a) LFAH12/AtKrp1(F173A;F175A); (b) 35S BnKrp1(F151A;F153A)를 포함하였다.
실시예 10. 성장/초기 발아를 가속화시키는 생체내 발현
유전자전이 식물에서의 본 발명의 돌연변이 단백질의 발현은, 사이클린-CDK 키나제 활성을 상승시킴으로써 효과를 발휘할 것이다. 이는 세포 주기에 대해 양성 효과를 주어, 결국 기관의 크기를 증가시킬 것이다. 식물에서, 역위 반복 접근법을 사용하여 배아에서 내생적 Krp 유전자의 발현을 억제시켜 Krp1 발현 수준을 감소시키면, 종자 크기 및 작물 수확량이 증가한다. 수확량에 대한 효과 외에도, 종자 크기 증가는 활력 또는 종자를 증가시킬 수 있다. 보다 큰 종자는, 발아 및 모종 성장 동안에 사용될 보다 많은 양의 저장된 단백질 및 전분 비축물을 함유한다. 이는 초기 발아 및 보다 빠른 초기 성장이 일어나게 할 수 있다. 초기 발아 및 빠른 초기 성장은 작물의 보다 빠른 정착을 유도하므로, 농업경영학적으로 유용한 형질이다. 이는 정착 전에 작물을 손상시키거나 피해를 줄 수 있는 열악한 환경 등에 대해 취약한 기간을 감소시켜 성공적인 작물의 가능성을 증가시킨다.
성장 및 발생 속도의 증가가, 실시예 9에 기술된 AtKrp1(F173A;F175A) 우성 음성 발현 작제물(pTG369)로 형질전환된 유전자전이 캐놀라 식물의 온실-발아된 모종에서 관찰되었다. AtKrp1(F173A;F175A) 우성 음성 발현 작제물의 각각의 15개의 독립적인 형질전환 이벤트로부터의 24개의 종자를 트레이(tray)에서 지피(Jiffy) 이탄 펠릿(peat pellet)에 심고, 온실에서 발아시켰다. 마찬가지로 LFAH12 프로모터의 조절하에 있는 야생형 KRP1 유전자로 형질전환된 각각의 15개의 독립적인 이벤트로부터의 24개의 종자를 동시에 심었다. 또한, 비형질전환된 모계(parental) DH12075 캐놀라 변종, 및 임의의 9개의 관련없는 전이유전자 작제물로 형질전환된 총 135개의 유전자전이 이벤트를 동시에 심었다.
3주간의 성장 후, 모든 모종을 종자로 성장시킬 들판에 이식하였다. 각각의 이벤트에 대한 모종을 각각 24개씩 개개의 조사구(plot)로서 심었다. 이식시에는, 조사구 간의 모종 사이에 성장의 차이가 쉽게 관찰되었다. 모든 유전자전이 작제물에 대한 전체 모종 집단에 걸쳐, 크기가 1인치 높이부터 약 4 내지 5인치 높이까지 다양하였다. 발생 과정도 다양하여, 떡잎만 존재하는 몇몇 모종부터 다수의 본엽(true leaf)이 있는 모종까지 다양하였다. 비형질전환된 모계 변종 조사구는 이 범위의 중간에 속하였다. 유전자전이 조사구의 차이는 작제물 특이적이었다. 크기 및 발생 범위의 최상위에 속하는 모종을 함유한 들판 내의 대부분의 조사구는, AtKrp1(F173A;F175A) 우성 음성 발현 작제물(pTG369)로 형질전환된 식물을 함유하는 조사구였다. 다른 작제물은 이러한 특징을 보이지 않았고, 대부분의 조사구는 비형질전환된 모계 변종 이하의 성장 및 발생을 보였다. 이러한 결과는, 우성 음성 돌연변이 Krp 전이유전자의 발현이 초기 성장 속도 증가 및 가속화된 발생 속도를 제공한다는 것을 나타낸다.
모니터할 추가적인 특징에는, 예를 들면, 출아 전(pre-emergence)/발아 지속기간, 떡잎 출현 시기, 떡잎의 크기, 제1 본엽의 출현 및 제2 본엽의 출현 시기가 포함된다. 로제트(rosette) 직경을 유전자전이 및 비-유전자전이 식물에서 모니터할 수도 있다. 다른 특징을 유전자전이 및 비-유전자전이 식물 간에 모니터할 수도 있고, 여기에는 예를 들면 눈의 출현 시기 및 눈 추대(bud bolt)의 크기, 주화서(main raceme)의 최종 크기, 최초의 개화 시기, 최초의 꼬투리(pod) 출현 시기 등이 포함된다.
실시예 11. 발근을 향상시키는 생체내 발현
캐놀라 종자는 매우 작고, 발아를 위하여 상대적으로 높은 습도를 요구하며, 토양 표면에 가까이 심어야 모종 활력이 최대화된다. 종자가 작고 얕게 심기 때문에 상기 작물은 가뭄 및 홍수와 같은 비생물적 스트레스에 취약하다. 다양한 프로모터의 조절 하에서 본 발명의 돌연변이 폴리펩티드를 편재적으로 발현시키거나 뿌리 발생 초기에 발현시키면, 뿌리 성장 및 발생이 가속화될 것이다. 뿌리 발생 동안 증가된 세포 분열은, 비-유전자전이 식물 대조군보다 보다 일찍 단단한 밑둥(root base) 및 아마도 보다 큰 밑둥을 정착시켜 모종 활력에 이득을 줄 것이다. 유전자전이 식물 뿌리 시스템의 크기를 비-유전자전이 식물과 비교할 수 있다.
실시예 12. 반복 들판 시험에서 배아 발생 동안 캐놀라 수확량에 대한 AtKrp1(F173A;F175A) 전이유전자 발현 효과의 평가
이 실시예에서, LFAH12 배아 특이적 프로모터의 조절 하에 있는 아라비돕시스 Krp1(F173A;F175A) 전이유전자(pTG369)를 포함하는 유전자전이 캐놀라 식물을 들판 시험에서 검사하였다.
유전자전이 AtKrp1 (F173A;F175A) 이벤트의 들판 시험으로의 진행
T0 이벤트를 전이유전자 발현과 전이유전자 삽입 좌 수의 조합에 따라 선별하여 들판 시험으로 진행시켰다. 확인된 전이유전자 발현 및 단일 전이유전자 삽입 좌를 갖는 이벤트를 가장 우선적으로 배정하여 들판 검사를 수행하였다. 일부 예에서, 다수의 유전자가 존재하여 유전자 용량(gene dosage)으로 인해 전체적인 전이유전자 발현 수준이 높은 경우, 다수의 삽입 좌를 갖는 이벤트를 선별하였다.
선별된 이벤트로부터의 T1 종자를 분리된 T1 집단으로서 들판 조사구에서 성장시켰다. 각각의 이벤트를 두 열(列)로 24개의 식물 조사구에 심었다. 단일 전이유전자 삽입 좌를 갖는 이벤트의 경우, 전이유전자가 24개의 T1 식물 가운데 분리되어, 전이유전자가 없는 대략 6개의 결손(null) 식물, 12개의 이형접합(heterozygous) 식물 및 6개의 동형접합(homozygous) 식물로 분포될 것이다. 각각의 T1 식물을 개화 전에 개별적으로 자루에 넣어 이계 교배(out-crossing)를 방지하였다. 각각의 24개의 T1 식물로부터의 T2 종자를 개별적으로 회수하였다.
T2 종자를 사용하여 24개의 모계 T1 식물 중 어느 것이 결손체(null), 이형접합체 또는 동형접합체인지 확인하였다. 각각의 T1 식물로부터의 대략 30개의 T2 종자를, 카나마이신의 유사체인 항생제 G418을 함유하는 용액이 있는 페트리 디쉬 내의 필터 종이에서 발아시켰다. 식물을 선별가능 마커로서의 nptII 내성 유전자와 공동-형질전환시켰기 때문에, 전이유전자를 보유하는 종자만이 발아하여 계속 성장할 것이다. 플레이트 상의 모든 종자가 G418에 대해 민감성인 것으로 확인된 경우, T1 모계를 결손 계열로 판명하였다. 플레이트 상의 모든 종자가 G418에 대해 내성인 경우, T1 모계를 동형접합 계열로 판명하였다. 플레이트 상의 종자 중 대략 25%는 민감성이고 나머지는 내성인 경우, T1 모계를 이형접합 계열로 판명하였다. 동일한 형질전환 이벤트로부터의 이형접합 T1 모계로부터의 T2 종자를 팽화(bulking)시켜 들판 시험 검사를 위한 이형접합 종자를 생성시켰다. 동일한 형질전환 이벤트로부터의 결손 T1 모계로부터의 T2 종자를 팽화시켜 들판 시험 검사를 위한 결손 동일세대(sibling) 종자를 생성시켰다.
들판 시험 설계
유전자전이 캐놀라 계열에서 수확량 형질에 대한 AtKrp1(F173A;F175A) 전이유전자의 효과를, 각각의 유전자전이 계열을 들판에서의 대규모 반복 시험에서 결손 동일세대와 직접 비교하여 평가하였다. 결손 동일세대는 T1 세대에서 전이유전자의 분리로부터 생겨나므로, 결손 및 동형접합 동일세대는 유전적으로 거의 동일하다. 중요한 차이점은 오직 AtKrp1(F173A;F175A) 전이유전자의 존재 또는 부재이다. 이러한 흡사한 유전적 동일성으로 인해 결손 동일세대는 AtKrp1(F173A;F175A) 전이유전자 효과의 평가를 위한 최적의 대조군이 된다. 본 시험의 주목적은 이벤트로부터의 유전자전이 계열을 이의 결손 분리체(segregant)와 비교하는 것이었으므로, 분할된 조사구 설계를 선택하였다. 이 설계는, 유전자전이 및 비-유전자전이 서브엔트리(subentry) 간의 상호작용 및 이벤트 간의 유전자전이 분할구(subplot) 간의 차이(분할구와 주요 조사구의 상호작용)에 대한 높은 수준의 평가, 및 전체 이벤트 또는 주요 조사구 간의 차이에 대한 낮은 수준의 평가를 제공한다.
들판 시험을 프레리(prairie)에 걸쳐 다수의 위치에서 수행하여, 통상적으로 캐놀라가 성장하는 환경 조건의 범위 하에서 수확량 표현형을 평가하였다. 모든 위치에서, 각각의 유전자전이 이벤트를 근처의 조사구에 있는 결손 동일세대와 물리적으로 짝지었다. 동형접합 및 결손 동일세대의 각각의 조사구 쌍을 각각의 시험 위치에서 4회 반복하였다. 각각의 시험에서 4개의 반복 조사구 쌍의 위치는 각각의 시험 위치에서 무작위로 분포하였다. 조사구는 1.6m x 6m였고, 제곱미터 당 대략 142개의 종자의 밀도로 심었다. 식물을 상업적인 캐놀라 생산에 통상적인 표준 농업경영 방법을 사용하여 성숙시켰다.
실시예 13. 배아-특이적 프로모터를 사용하여 배아 발생 동안 AtKrp1 (F173A;F175A)를 발현하는 유전자전이 캐놀라에서의 수확량 증가
각각의 수확 들판 시험 위치의 모든 조사구에서 개별적으로 콤바인(combine)으로 수확하였다. 총 종자 수확량 데이터를, 각각의 조사구로부터 습기 함량에 대해 조정된 총 종자 중량으로서 수집하였다. 각각의 시험에서 모든 유전자전이 이벤트의 경우, 각각의 동형접합 계열의 4개의 반복 조사구로부터의 총 수확량의 평균을, 관련된 결손 동일세대 계열의 4개의 반복 조사구로부터의 총 수확량의 평균과 비교하였다. 이러한 비교를 사용하여 총 종자 수확량에 대한 AtKrp1(F173A;F175A) 전이유전자의 효과를 평가하였다. 각각의 다수의 시험 위치로부터의 결과를 조합하여, 총 종자 수확량에 대한 AtKrp1(F173A;F175A) 전이유전자 효과의 시험간 분석을 수행하였다. 각각의 시험 위치에서의 편차를 통계적으로 분석하여, 동형접합 유전자전이 계열과 이의 결손 동일세대 간의 총 종자 수확량의 차이에 대한 유의성 한계(P = 0.05)를 정할 수 있었다.
총 종자 수확량에서 통계적으로 유의적인 증가를 보인 유전자전이 AtKrp1(F173A;F175A) 캐놀라 계열을 표 3에 요약한다. 이러한 결과는, 배아-특이적 프로모터(LFAH12)를 사용한 AtKrp1(F173A;F175A)의 과발현이 종자 수확량을 증가시킨다는 것을 증명한다.
Figure 112008015367329-PCT00004
본원에서 기술된 실시예 및 양태는 설명 목적으로만 제공된다는 것과, 이에 비추어 당업자에게 다양한 변형 또는 변화가 제안될 것이며 이는 본 출원의 취지 및 범위와 첨부된 청구항의 범위 내에 포함될 것이라는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적상 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
<110> Targeted Growth, Inc. <120> Dominant negative mutant KRP protein protection of active cyclin-CDK complex inhibition by wild-type KRP <130> 25941-1-1PC <150> US 60/703,999 <151> 2005-07-29 <160> 101 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Pro Ser Thr Ala Ile Arg Glu 1 5 <210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 Met Val Arg Lys Tyr Arg Lys Ala Lys Gly Ile Val Glu Ala Gly Val 1 5 10 15 Ser Ser Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Val Arg 20 25 30 Ser Glu Lys Ser Ser Ser Val Ser Val Val Gly Asp Asn Gly Val Ser 35 40 45 Ser Ser Cys Ser Gly Ser Asn Glu Tyr Lys Lys Lys Glu Leu Ile His 50 55 60 Leu Glu Glu Glu Asp Lys Asp Gly Asp Thr Glu Thr Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Arg Gly Thr Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Glu Glu Lys 85 90 95 Glu Glu Leu Ser Lys Ser Met Glu Asn Tyr Ser Ser Glu Phe Glu Ser 100 105 110 Ala Val Lys Glu Ser Leu Asp Cys Cys Cys Ser Gly Arg Lys Thr Met 115 120 125 Glu Glu Thr Val Thr Ala 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<213> Artificial Sequence <220> <223> RACE primer <400> 22 ctctgataat ttaacccact cgtagcgtcc ttctaatggc ttctc 45 <210> 23 <211> 513 <212> DNA <213> Brassica napus <400> 23 atggtgagaa aatgcagaaa aactaaaggg acggtgggag cttcgtctac gtatatgcag 60 cttcgcagcc ggagaatcgt ttacagatcg gaaaaagcta gctcgtcgtc gtcgtcttgt 120 tgcgcgagta acaacaatgg agttatagat cttgaggagg aaagagatgg tgagactgaa 180 acgtcgtcgt gtcgacggag tagtaagagg aagctatttg aaaaccttag agaaaaagaa 240 tctatggaga attcacagca aatcgtagct ggttttgatt ccgccgtgaa agaatcatcg 300 gattgttgtt gcagccggag aacatctttg tcaacgacgg aggagaaggg gaaatcagcg 360 acggagcaac caccaacggc agtggagatt gaagattttt tcgtggaagc tgagaaacag 420 ctccatgata atttcaagaa gaagtataac tttgatttcg aaaaggagaa gccattagaa 480 ggacgctacg agtgggttaa attatcagag taa 513 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR <400> 24 acggatccca tatggtgaga aaatatag 28 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR <400> 25 atcgctcgag tcactctaac tttac 25 <210> 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ccttctaatg gcttctcctt ttcagcatca gcgttatact tcttcttgaa 50 <210> 53 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> site directed mutagenesis anti-sense <400> 53 ttcaagaaga agtataacgc tgatgctgaa aaggagaagc cattagaagg 50 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> site directed mutagenesis-sense <400> 54 aatttcaaga agaaggctaa cgctgatgct gaa 33 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> site directed mutagenesis anti-sense <400> 55 ttcagcatca gcgttagcct tcttcttgaa att 33 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR <400> 56 ctcgagtcaa gcagctaatt taacccactc gta 33 <210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR <400> 57 ctcgagtcac ttcttgaaat tatc 24 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 58 Lys Tyr Asn Phe Asp Phe 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant AtKrp2 <400> 59 Lys Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> 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napus <400> 68 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 69 <211> 192 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 69 Met Gly Lys Tyr Ile Lys Lys Ser Lys Ile Thr Gly Asp Ile Asp Ser 1 5 10 15 Met Glu Ala Thr Glu Ala Thr Ser Leu Gly Val Arg Thr Arg Ala Ala 20 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Glu Leu Glu Xaa Glu Glu Phe Phe Val Ala Ala Glu Lys 1 5 10 15 Asp Ile Gln Lys Arg Phe Gln Asp Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys 20 25 30 Asp Val Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Gln Leu Lys Pro 35 40 45 <210> 81 <211> 45 <212> PRT <213> Glycine max <400> 81 Met Pro Thr Glu Leu Glu Leu Asp Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Lys 1 5 10 15 Asp Ile Arg Lys Arg Phe Ser Asp Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys 20 25 30 Gly Val Ser Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 35 40 45 <210> 82 <211> 44 <212> PRT <213> Glycine max <400> 82 Pro Pro Lys Ala Glu Ile Glu Glu Phe Phe Ala Met Ala Glu Lys Tyr 1 5 10 15 Glu Gln Lys Lys Phe Thr Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Ile Val Arg Asp 20 25 30 Leu Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Gln Trp Val Arg Leu 35 40 <210> 83 <211> 47 <212> PRT <213> Glycine max <400> 83 Ile Pro Thr Ser Arg Glu Met Asp Glu Phe Phe Ala Glu Ile Glu Glu 1 5 10 15 Ala Gln Gln Lys Lys Phe Ile Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Asn 20 25 30 Glu Lys Pro Leu Ser Gly Arg Tyr Glu Trp Glu Lys Leu Lys Pro 35 40 45 <210> 84 <211> 45 <212> PRT <213> Populus tremula <400> 84 Ile Pro Thr Thr Arg Glu Met Asp Glu Phe Phe Gly Pro Ala Glu Glu 1 5 10 15 Glu Gln Leu Arg Gln Phe Thr Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Pro Val Ser 20 25 30 Asp Lys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Glu Lys Leu 35 40 45 <210> 85 <211> 43 <212> PRT <213> Populus tremula <400> 85 Thr Asp Glu Glu Ile Glu Lys Phe Phe Gly Glu Ile Gln Asn Asn Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Phe Lys Asp Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Asp Lys Asp Glu 20 25 30 Pro Leu Glu Gly Arg Tyr Glu Trp Ala Arg Leu 35 40 <210> 86 <211> 45 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 86 Val Pro Ser Ser Leu Glu Met Glu Glu Phe Phe Ala Ala Ala Glu Gln 1 5 10 15 Gln Gln His Gln Ala Phe Arg Glu Arg Tyr Asn Phe Cys Pro Val Asn 20 25 30 Asp Cys Pro Leu Pro Gly Arg Tyr Glu Trp Thr Arg Leu 35 40 45 <210> 87 <211> 46 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 87 Pro Pro Glu Glu Glu Val Glu Ala Phe Leu Ala Ala Ala Glu Ser Ser 1 5 10 15 Val Ala Arg Arg Phe Ala Ala Lys Tyr Asn Tyr Asp Ile Val Lys Asp 20 25 30 Ala Pro Met Asp Gly Arg Tyr Glu Trp Val Arg Val Arg Pro 35 40 45 <210> 88 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F145A;Y149A <400> 88 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Ala Lys Lys Lys Ala Asn Phe Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 89 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKRP1 F145A;Y149A;F151A <400> 89 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Ala Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 90 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F145A;Y149A;F151A <400> 90 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr 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Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 92 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 Y149A;F153A <400> 92 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Ala Asn Phe Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 93 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A <400> 93 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 94 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;Y149A <400> 94 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Trp Val Lys Leu 165 <210> 95 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;E164A <400> 95 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Ala Trp Val Lys Leu 165 <210> 96 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;W165A <400> 96 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Ala Val Lys Leu 165 <210> 97 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;E164A;W165A <400> 97 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Ala Ala Val Lys Leu 165 <210> 98 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;Y149A;E164A <400> 98 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Ala Trp Val Lys Leu 165 <210> 99 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;Y149A;W165A <400> 99 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Glu Ala Val Lys Leu 165 <210> 100 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 F151A;F153A;Y149A;E164A;W165A <400> 100 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Ala Asn Ala Asp Ala Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Ala Ala Val Lys Leu 165 <210> 101 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BnKrp1 E164A;W165A <400> 101 Met Val Arg Lys Cys Arg Lys Thr Lys Gly Thr Val Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Met Gln Leu Arg Ser Arg Arg Ile Val Tyr Arg Ser Glu Lys 20 25 30 Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Cys Ala Ser Asn Asn Asn Gly Val 35 40 45 Ile Asp Leu Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Thr Glu Thr Ser Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ser Ser Lys Arg Lys Leu Phe Glu Asn Leu Arg Glu Lys Glu 65 70 75 80 Ser Met Glu Asn Ser Gln Gln Ile Val Ala Gly Phe Asp Ser Ala Val 85 90 95 Lys Glu Ser Ser Asp Cys Cys Cys Ser Arg Arg Thr Ser Leu Ser Thr 100 105 110 Thr Glu Glu Lys Gly Lys Ser Ala Thr Glu Gln Pro Pro Thr Ala Val 115 120 125 Glu Ile Glu Asp Phe Phe Val Glu Ala Glu Lys Gln Leu His Asp Asn 130 135 140 Phe Lys Lys Lys Tyr Asn Phe Asp Phe Glu Lys Glu Lys Pro Leu Glu 145 150 155 160 Gly Arg Tyr Ala Ala Val Lys Leu 165

Claims (116)

  1. (a) 사이클린에 대한 결합 친화도를 부여하는 사이클린 결합 영역 및 (b) CDK에 대한 결합 친화도를 부여하는 CDK 결합 영역을 포함하는 야생형 식물 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 CKI 아미노산 서열을 포함하는 분리된 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드로서,
    이때, 상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 야생형 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 돌연변이 CKI 폴리펩티드에 CDK에 대한 변형된 결합 친화도를 부여하고;
    상기 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, 야생형 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지하고;
    상기 돌연변이 CKI 폴리펩티드는 CDK 결합 영역에의 결합에 대해 상기 야생형 CKI와 경쟁할 수 있음을 특징으로 하는, 분리된 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 야생형 식물 CKI 폴리펩티드가 KIP 관련 단백질(KRP) 계열 일원인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, KRP 계열 일원이 브라시카 나푸스(Brassica napus), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 글리신 막스(Glycine max), 옥수수, 밀, 벼, 알팔파(alfalfa), 목화 또는 포플러나무 CKI 폴리펩티드인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  4. 제2항에 있어서, KRP 계열 일원이 아라비돕시스 또는 브라시카 KRP1 폴리펩티드인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  5. 제2항에 있어서, 하나 이상의 변형이 브라시카 KRP1(BnKRP1)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응하는 영역 내에 존재하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 브라시카 KRP1(BnKRP1)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응하는 영역 내에 2개 이상의 변형을 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  7. 제5항에 있어서, 하나 이상의 변형이 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  10. 제7항에 있어서,
    (a) BnKRP1의 아미노산 145번에 상응하는 위치;
    (b) BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치;
    (c) BnKRP1의 아미노산 151번에 상응하는 위치;
    (d) BnKRP1의 아미노산 153번에 상응하는 위치;
    (e) BnKRP1의 아미노산 164번에 상응하는 위치; 및
    (f) BnKRP1의 아미노산 165번에 상응하는 위치
    로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 위치에 존재하는 2개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 2개 이상의 아미노산 치환 중의 하나 이상, 임의로 전부가 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환(들)인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  12. 제10항에 있어서, 2개 이상의 아미노산 치환 중의 하나 이상, 임의로 전부가 비-보존적 치환(들)인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  13. 제5항에 있어서, 하나 이상의 변형이 KYNFDF 모티프(motif) 내에 존재하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, KYNFDF 모티프 내에 2개 이상의 변형을 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, KYNFDF 모티프 내의 2개 이상의 변형이 BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 각각의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  18. 제15항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 각각의 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  20. 제15항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  22. 제20항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  23. 제15항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) BnKRP1의 아미노산 164번에 상응하는 위치, 및
    (b) BnKRP1의 아미노산 165번에 상응하는 위치
    중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  24. 제23항에 있어서, (a) 및 (b) 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  25. 제23항에 있어서, (a) 및 (b) 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  26. 제23항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  28. 제26항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  29. 제4항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 BnKRP1 폴리펩티드인 돌연변이 식물 CKI 폴리펩티드.
  30. 제29항에 있어서,
    (1) BnKRP1 F151A;F153A;
    (2) BnKRP1 Y149A;F151A;F153A;
    (3) BnKRP1 E164A;W165A; 또는
    (4) BnKRP1 F151A;F153A;E164A;W165A
    인 돌연변이 BnKRP1 폴리펩티드.
  31. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형이 CDK 결합 영역의 절두(truncation)를 포함하는 돌연변이 CKI 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, 돌연변이 BnKRP1 폴리펩티드인 돌연변이 CKI 폴리펩티드.
  33. 제1항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 따른 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산.
  34. 레플리콘(replicon) 및 제33항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 재조합 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 추가로 포함하는 발현 벡터인 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 프로모터 영역이 식물 세포에서 작동가능한 발현 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 프로모터 영역이 CaMV 35S 프로모터 또는 LFAH12 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
  38. 제35항에 있어서, 프로모터 영역이 조직- 및/또는 기관-특이적 방식으로 전사에 있어 활성인 발현 벡터.
  39. 제33항에 따른 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  40. 제34항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  41. 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현에 적당한 조건 하에서 제39항 또는 제40항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하여, 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 회수함을 추가로 포함하는 방법.
  43. 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 전이유전자(transgene)를 포함하며, (a) 사이클린에 대한 결합 친화도를 부여하는 사이클린 결합 영역 및 (b) CDK에 대한 결합 친화도를 부여하는 CDK 결합 영역을 포함하는 야생형 CKI 폴리펩티드를 발현하는 유전자전이(transgenic) 식물로서,
    이때, 상기 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, (1) 유전자전이 식물에 의해 발현되 는 야생형 식물 CKI 폴리펩티드, 및 (2) (1)에 대해 이종성(heterologous)이고, 유전자전이 식물의 세포 내에서 (1)의 야생형 CKI 기능과 실질적으로 동등한 야생형 CKI 기능을 제공할 수 있는 야생형 CKI 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 CKI 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 상기 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여, CDK에 대한 돌연변이 CKI 폴리펩티드의 변형된 결합 친화도를 부여하고;
    상기 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, 상기 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지함을 특징으로 하는, 유전자전이 식물.
  44. 제43항에 있어서, 외떡잎 식물인 유전자전이 식물.
  45. 제43항에 있어서, 쌍떡잎 식물인 유전자전이 식물.
  46. 제43항 내지 제45항 중의 어느 한 항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 KIP 관련 단백질(KRP) 계열 일원인 유전자전이 식물.
  47. 제46항에 있어서, KRP 계열 일원이 브라시카 나푸스, 아라비돕시스 탈리아 나, 글리신 막스, 옥수수, 밀, 벼, 알팔파, 목화 또는 포플러나무 CKI 폴리펩티드인 유전자전이 식물.
  48. 제46항에 있어서, KRP 계열 일원이 KRP1 폴리펩티드인 유전자전이 식물.
  49. 제46항에 있어서, 하나 이상의 변형이 브라시카 KRP1(BnKRP1)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응하는 영역 내에 존재하는 유전자전이 식물.
  50. 제49항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 브라시카 KRP1(BnKRP1)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응하는 영역 내에 2개 이상의 변형을 포함하는 유전자전이 식물.
  51. 제49항에 있어서, 하나 이상의 변형이 아미노산 치환을 포함하는 유전자전이 식물.
  52. 제51항에 있어서, 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 유전자전이 식물.
  53. 제51항에 있어서, 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 유전자전이 식물.
  54. 제49항에 있어서, 하나 이상의 변형이 KYNFDF 모티프 내에 존재하는 유전자전이 식물.
  55. 제54항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 KYNFDF 모티프 내에 2개 이상의 변형을 포함하는 유전자전이 식물.
  56. 제54항에 있어서, KYNFDF 모티프 내의 2개 이상의 변형이 BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 유전자전이 식물.
  57. 제56항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 유전자전이 식물.
  58. 제57항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 각각의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 유전자전이 식물.
  59. 제56항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 유 전자전이 식물.
  60. 제59항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 각각의 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 유전자전이 식물.
  61. 제56항 내지 제60항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 유전자전이 식물.
  62. 제61항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 유전자전이 식물.
  63. 제61항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 유전자전이 식물.
  64. 제56항 내지 제63항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가,
    (a) BnKRP1의 아미노산 164번에 상응하는 위치, 및
    (b) BnKRP1의 아미노산 165번에 상응하는 위치
    중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 유전자전이 식물.
  65. 제64항에 있어서, (a) 및 (b) 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 유전자전이 식물.
  66. 제64항에 있어서, (a) 및 (b) 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 유전자전이 식물.
  67. 제64항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환을 포함하는 유전자전이 식물.
  68. 제67항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 유전자전이 식물.
  69. 제67항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 유전자전이 식물.
  70. 제46항 내지 제69항 중의 어느 한 항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 BnKRP1 폴리펩티드인 유전자전이 식물.
  71. 제70항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가,
    (1) BnKRP1 F151A;F153A;
    (2) BnKRP1 Y149A;F151A;F153A;
    (3) BnKRP1 E164A;W165A; 또는
    (4) BnKRP1 F151A;F153A;E164A;W165A
    인 유전자전이 식물.
  72. 제43항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형이 CDK 결합 영역의 절두를 포함하는 유전자전이 식물.
  73. 제72항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 BnKRP1 폴리펩티드인 유전자전이 식물.
  74. 제43항 내지 제73항 중의 어느 한 항에 있어서, 브라시카 나푸스, 아라비돕시스 탈리아나, 글리신 막스, 옥수수, 밀, 벼, 알팔파, 목화, 포플러나무 및 동백으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자전이 식물.
  75. 제74항에 있어서, 브라시카 나푸스, 글리신 막스 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유전자전이 식물.
  76. 제75항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 아라비돕시스 탈리아나 CKI 폴리펩 티드인 유전자전이 식물.
  77. 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 전이유전자를 포함하는 벡터를 식물 속에 도입시킴을 포함하여, 제43항 내지 제74항 중의 어느 한 항에 따른 유전자전이 식물을 생산하는 방법.
  78. (a) 사이클린에 대한 결합 친화도를 부여하는 사이클린 결합 영역 및 (b) CDK에 대한 결합 친화도를 부여하는 CDK 결합 영역을 포함하는 야생형 CKI 폴리펩티드를 발현하는 식물 세포에서 세포 분열을 조절하는 방법으로서,
    (1) 식물 세포 내에서 발현되는 야생형 식물 CKI 폴리펩티드, 및 (2) (1)에 대해 이종성이고, 식물 세포 내에서 (1)의 야생형 CKI 기능과 실질적으로 동등한 야생형 CKI 기능을 제공할 수 있는 야생형 CKI 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 CKI 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 세포 내에서 발현시키는 단계 [이때, 상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여, CDK에 대한 돌연변이 CKI 폴리펩티드의 변형된 결합 친화도를 부여하고, 또한 상기 돌연변이 CKI 폴리펩티드는, 참조 CKI 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지한다], 및
    상기 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 식물 세포 내에서 야생형 CKI의 생물학적 활성을 억제하도록 하는 단계
    를 포함하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 KIP 관련 단백질(KRP) 계열 일원인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 식물 세포 내에서 다수의 내생적(endogenous) KRP 계열 일원에 대해 길항작용하는 방법.
  81. 제79항에 있어서, KRP 계열 일원이 브라시카 나푸스, 아라비돕시스 탈리아나, 글리신 막스 또는 옥수수 CKI 폴리펩티드인 방법.
  82. 제79항에 있어서, KRP 계열 일원이 KRP1 폴리펩티드인 방법.
  83. 제79항에 있어서, 하나 이상의 변형이 브라시카 KRP1(BnKRP1)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응하는 영역 내에 존재하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 브라시카 KRP1(BnKRP1)의 아미노산 145번 내지 168번에 상응하는 영역 내에 2개 이상의 변형을 포함하는 방법.
  85. 제83항에 있어서, 하나 이상의 변형이 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 방법.
  87. 제85항에 있어서, 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 방법.
  88. 제83항에 있어서, 하나 이상의 변형이 KYNFDF 모티프 내에 존재하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 KYNFDF 모티프 내에 2개 이상의 변형을 포함하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, KYNFDF 모티프 내의 2개 이상의 변형이 BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 방법.
  92. 제91항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 각각의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 방법.
  93. 제90항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 방법.
  94. 제93항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 151번 및 153번에 상응하는 위치에서의 각각의 아미노산 치환이 반대 전하를 띤 아미노산으로의 아미노산 치환인 방법.
  95. 제90항 내지 제94항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 방법.
  97. 제95항에 있어서, BnKRP1의 아미노산 149번에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 방법.
  98. 제90항 내지 제97항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가,
    (a) BnKRP1의 아미노산 164번에 상응하는 위치, 및
    (b) BnKRP1의 아미노산 165번에 상응하는 위치
    중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, (a) 및 (b) 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 방법.
  100. 제98항에 있어서, (a) 및 (b) 중 하나 이상에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 방법.
  101. 제98항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가 (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환을 포함하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환이 비-알라닌에서 알라닌으로의 치환인 방법.
  103. 제101항에 있어서, (a) 및 (b) 각각에서의 아미노산 치환이 비-보존적 치환인 방법.
  104. 제82항 내지 제103항 중의 어느 한 항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 BnKRP1 폴리펩티드인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드가,
    (1) BnKRP1 F151A;F153A;
    (2) BnKRP1 Y149A;F151A;F153A;
    (3) BnKRP1 E164A;W165A; 또는
    (4) BnKRP1 F151A;F153A;E164A;W165A
    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  106. 제78항 내지 제83항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형이 CDK 결합 영역의 절두를 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 BnKRP1 폴리펩티드인 방법.
  108. 제78항 내지 제107항 중의 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 CKI 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산을 식물 세포 속에 도입시킴을 추가로 포함하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 재조합 핵산이 발현 벡터인 방법.
  110. 제78항 내지 제109항 중의 어느 한 항에 있어서, 식물 세포가 브라시카 나푸스, 아라비돕시스 탈리아나, 글리신 막스 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택 되는 식물로부터 유래되는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 식물이 브라시카 나푸스, 글리신 막스 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 참조 CKI 폴리펩티드가 아라비돕시스 탈리아나 CKI 폴리펩티드인 방법.
  113. (1) 식물 내에서 발현되는 야생형 KRP 폴리펩티드, 및 (2) (1)에 대해 이종성이고, 식물 세포 내에서 (1)의 야생형 KRP 기능과 실질적으로 동등한 야생형 KRP 기능을 제공할 수 있는 야생형 KRP 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 KRP 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 KRP 폴리펩티드를 식물 내에서 발현시키는 단계 [이때, 상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, CDK에 대한 돌연변이 KRP 폴리펩티드의 변형된 결합 친화도를 부여하고, 또한 상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드는, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지한다], 및
    상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드가 식물 내에서 야생형 KRP의 생물학적 활성을 억제하게 하여 식물 활력을 증가시키는 단계
    를 포함하여, 식물 활력(vigor)을 증가시키는 방법.
  114. (1) 식물 내에서 발현되는 야생형 KRP 폴리펩티드, 및 (2) (1)에 대해 이종성이고, 식물 세포 내에서 (1)의 야생형 KRP 기능과 실질적으로 동등한 야생형 KRP 기능을 제공할 수 있는 야생형 KRP 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 KRP 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 KRP 폴리펩티드를 식물 내에서 발현시키는 단계 [이때, 상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, CDK에 대한 돌연변이 KRP 폴리펩티드의 변형된 결합 친화도를 부여하고, 또한 상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드는, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지한다], 및
    상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드가 식물 내에서 야생형 KRP의 생물학적 활성을 억제하게 하여 식물에서 뿌리 질량을 증가시키는 단계
    를 포함하여, 식물에서 뿌리 질량을 증가시키는 방법.
  115. (1) 식물 내에서 발현되는 야생형 KRP 폴리펩티드, 및 (2) (1)에 대해 이종성이고, 식물 세포 내에서 (1)의 야생형 KRP 기능과 실질적으로 동등한 야생형 KRP 기능을 제공할 수 있는 야생형 KRP 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 KRP 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 KRP 폴리펩티드를 식물 내에서 발현시키는 단계 [이때, 상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, CDK에 대한 돌연변이 KRP 폴리펩티드의 변형된 결합 친화도를 부여하고, 또한 상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드는, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지한다], 및
    상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드가 식물 내에서 야생형 KRP의 생물학적 활성을 억제하게 하여 식물 종자 크기를 증가시키는 단계
    를 포함하여, 식물 종자 크기를 증가시키는 방법.
  116. (1) 식물 내에서 발현되는 야생형 KRP 폴리펩티드, 및 (2) (1)에 대해 이종성이고, 식물 세포 내에서 (1)의 야생형 KRP 기능과 실질적으로 동등한 야생형 KRP 기능을 제공할 수 있는 야생형 KRP 폴리펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 하나 이상의 변형을 갖는 KRP 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 KRP 폴리펩티드를 식물 내에서 발현시키는 단계 [이때, 상기 하나 이상의 변형은 CDK 결합 영역 내에 존재하여, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, CDK에 대한 돌연변이 KRP 폴리펩티드의 변형된 결합 친화도를 부여하고, 또한 상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드는, 참조 KRP 폴리펩티드와 비교하여, 사이클린에 대한 결합 친화도를 실질적으로 유지한다], 및
    상기 돌연변이 KRP 폴리펩티드가 식물 내에서 야생형 KRP의 생물학적 활성을 억제하게 하여 식물에서 초기 발아를 증가시키는 단계
    를 포함하여, 식물에서 초기 발아를 증가시키는 방법.
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