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CN1798575A - 高浓度抗体和蛋白制剂 - Google Patents

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CN1798575A
CN1798575A CNA2004800155562A CN200480015556A CN1798575A CN 1798575 A CN1798575 A CN 1798575A CN A2004800155562 A CNA2004800155562 A CN A2004800155562A CN 200480015556 A CN200480015556 A CN 200480015556A CN 1798575 A CN1798575 A CN 1798575A
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antibody
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ige
disease
acid
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刘骏
史蒂文·希雷
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Novartis AG
Genentech Inc
Original Assignee
Novartis AG
Genentech Inc
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Abstract

本申请涉及具有降低的粘度的、稳定的、相对等渗的和低混浊度的高度浓缩抗体和蛋白制剂。所述制剂特别适合于皮下施用。本申请进一步描述了包含这种制剂的制品，和利用它们来治疗可用所述配制的抗体或蛋白医治的疾病的方法。所述制剂包含精氨酸－HCl，组氨酸和聚山梨醇酯。

Description

高浓度抗体和蛋白制剂
背景技术
发明领域
本发明涉及特别适合于皮下施用的高度浓缩的抗体制剂。本发明进一步的提供稳定的、高度浓缩的(例如≥100mg/ml蛋白质)液体制剂。
相关技术的说明
对高度浓缩的液体抗体制剂存在着显著的需求。然而，高度浓缩的蛋白制剂遇到了几个难题。一个难题是由于形成微粒(particulate)而导致的不稳定性。用重构(reconstituted)的冻干制品来生产液体制剂，已经通过使用表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)解决了这个难题，但是表面活性剂不适于液体制剂，因为表面活性剂为进一步的处理带来了困难。此外，表面活性剂也不能减少增加了的粘性，增加的粘性是抗体的高分子性质带来的大量分子间相互作用导致的结果。
尽管已经显示出表面活性剂能显著地减少蛋白微粒形成的程度，但它们不能解决增加了的粘性的难题，增加的粘性给浓缩的抗体制剂的操作和施用造成了困难。由于抗体的高分子性质和潜在的分子间相互作用，抗体在高浓度时倾向于形成粘性溶液。此外，药学上可接受的糖常常作为稳定剂大量使用。这样的糖可以增强分子间相互作用，从而增加制剂的粘性。高粘性制剂很难制造、难以吸入到注射器中并且难以皮下地注射。在操作粘性制剂中使用压力引起过多的泡沫，泡沫会导致活性生物产品的变性和失活。这个难题还缺乏令人满意的解决方案。
虽然现有技术指出了能适当地应用于制造药物制剂的赋形剂的大量实例，但几乎没有蛋白质被成功地配制成超过100mg/ml的浓度，也几乎没有人描述过将蛋白质配制成超过100mg/ml的浓度的技术。
申请人发现精氨酸，特别是精氨酸-HCl特别适合于高度浓缩的液体蛋白或抗体制剂。
在1997年2月13日公开的PCT出版物WO97/04801中公开了稳定的等渗冻干蛋白制剂，其全部公开的内容在此引入本文作参考。该公开的冻干制剂可以被重构产生高蛋白浓度的液体制剂而没有稳定性的明显损失。然而，与重构的制剂的高粘度有关的潜在问题没有被解决。已经预先通过添加糖降低了蛋白质聚集，但是这样做会显著地增加粘性和渗透压，从而导致不能实施加工和使用。
申请人的PCT申请、2002年4月18日公开的WO02/30463公开了高蛋白浓度但低粘度的制剂，是通过(1)低pH值(约4.0到5.3)；(2)高pH值(约6.5到12.0)或(3)通过添加盐或缓冲液来增加制剂的总离子强度而取得的。然而，当增加的离子强度降低制剂的粘性时(例如用NaCl)，其也可导致溶液混浊度增加，这常与蛋白粒子的形成(例如，聚集)有关。因此最佳的高浓度蛋白制剂必须克服稳定性、粘性、渗透压和混浊性的难题。
发明概述
本发明涉及稳定的并且是低粘度和低混浊度的高度浓缩的蛋白或抗体制剂。
特别地，本发明涉及低混浊度的高度浓缩的抗体制剂，包含蛋白质或抗体(100-260mg/ml)、组氨酸(10-100mM)、精氨酸-HCl(50-200mM)和聚山梨醇酯(0.01％-0.1％)，具有5.5-7.0的pH值、50cs或更低的粘度和200mOsm/kg-450mOsm/kg的渗透压。做为选择，在制剂中的蛋白或抗体可以在120-260mg/ml、做为选择150-260mg/ml、做为选择180-260mg/ml、做为选择200-260mg/ml的范围中。或者所述渗透压在250mOsm/kg-350mOsm/kg的范围中。做为选择，精氨酸-HCl的浓度在100-200mM、或者150-200mM、或者180-200mM的范围中。
做为选择，本发明涉及低混浊度的高度浓缩的抗体制剂，包含抗体(40-150mg/ml)、组氨酸(10-100mM)、糖(例如海藻糖或蔗糖，20-350mM)和聚山梨醇酯(0.01％-0.1％)。
在一个特定的实施方式中，本发明提供包含高浓度的大分子量蛋白，例如抗体或免疫球蛋白的制剂。抗体可以是，例如，针对特定的预定抗原的抗体。在一个特定的方面，抗原是IgE(例如，在美国专利6,329,509和WO99/01556中描述的rhuMAbE-25和rhuMAbE-26)。做为选择，抗IgE抗体可以是在Corne等，J.Clin.Invest.99(5)：879-887(1997)、WO92/17207中描述的CGP-5101(Hu-901)，和ATTC保藏号No.BRL-10706和11130、11131、11132、11133。做为选择，抗原可包括：CD蛋白CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34和CD40；HER受体家族的成员例如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；2C4、4D5、PSCA、LDP-2、细胞粘附分子例如LFA-1、Mac1、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和包括其α-和β-亚基的αv/β3整联蛋白(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子例如VEGF；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体、CTLA-4和蛋白C。
本发明的制剂可以是药物制剂。在一个特定的方面，所述制剂是皮下给药的。
在又一个实施方式中，本发明提供对可用配制的蛋白或抗体医治的疾病的医治、预防或治疗方法，包括施用此处公开的包含治疗有效量的蛋白或抗体的制剂。这种制剂对皮下施用是特别有用的。一方面，所述疾病是IgE介导的疾病。更进一步地，所述IgE介导的疾病是过敏性鼻炎、哮喘(例如，过敏性哮喘和非过敏性哮喘)、特应性皮炎、过敏性胃肠病、超敏反应(例如，过敏反应、荨麻疹、食物过敏等)、过敏性支气管肺曲霉病、寄生虫疾病、间质性膀胱炎、高IgE综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Wiskott-Aldrich综合征、胸腺淋巴发育不全、IgE骨髓瘤和移植物抗宿主反应(graft-versus-hostreaction)。
在一个实施方式中，本发明提供一种制品，包括装有此处公开的制剂的容器。一方面，所述制品是预填充的注射器。另一方面，所述预填充的注射器进一步包含在注射装置中。另一方面，所述注射装置是自动注射器(auto-injector)。
附图说明
附图1.胃蛋白酶消化的抗IgE单克隆抗体的疏水作用层析。在不同的pH值和缓冲液中配制样品：(●)20mM醋酸盐，(△)20mM琥珀酸盐，(▲)20mM Na2HPO4，(Λ)20mM K2PO4和(*)20mM Tris缓冲液。样品在30℃保存6个月。
附图2.在40℃保存6个月的抗IgE单克隆抗体的大小排阻层析。在不同的pH值和缓冲液中配制样品：(■)20mM谷氨酸盐，(●)20mM醋酸盐，(△)20mM琥珀酸盐，(□)20mM组氨酸，(▲)20mM Na2HPO4，()20mMK2PO4和(*)20mM Tris缓冲液。
附图3.在30℃保存6个月的抗IgE单克隆抗体的活性。在不同的pH值和缓冲液中配制样品：(●)20mM醋酸盐，(△)20mM琥珀酸盐，(□)20mM组氨酸，(▲)20mM Na2HPO4，()20mM K2PO4和(*)20mM Tris缓冲液。
附图4.聚山梨醇酯20对受压的(stressed)抗IgE单克隆抗体的混浊度的影响。样品包含100mg/ml抗体、20mM琥珀酸盐、192mM海藻糖和各个量的聚山梨醇酯20，pH6.0。聚山梨醇酯浓度是(■)0，(▲)0.01％，(●)0.02％和(△)0.05％。
附图5.抗IgE单克隆抗体在～150mg/ml与不同的赋形剂(▲)CaCl2，())MgCl2和(△)精氨酸-HCl的混浊度。
附图6.抗IgE单克隆抗体在～150mg/ml与各种赋形剂的混浊度。样品保存在(▲)-70℃，(■)2-8℃，(△)15℃，(□)30℃和())40℃。
附图7.木瓜蛋白酶消化的抗IgE单克隆抗体的疏水作用层析分析。样品以～150mg/ml与各种赋形剂配制，保存在()-70℃，(■)2-8℃，(▲)15℃，(△)30℃和(□)40℃。
附图8.抗IgE单克隆抗体以～150mg/ml在(■)200mM精氨酸-HCl、23mM组氨酸、pH6.0，(▲)182mM精氨酸-HCl、20mM组氨酸、pH6.0，(●)182mM精氨酸-HCl、20mM组氨酸、91mM蔗糖、pH6.0，(□)50mM MgCl2、27mg/ml海藻糖、0.01％醋酸盐，(△)50mM MgCl2、30mM MgAc2、0.01％醋酸盐，和(○)50mM MgCl2、45mM MgAc2、0.01％醋酸盐中的大小排阻层祈。样品在30℃保存6个月。
附图9.木瓜蛋白酶消化的抗IgE单克隆抗体的疏水作用层析分析。显示的样品配制在(■)200mM精氨酸-HCl、23mM组氨酸，(▲)182mM精氨酸-HCl、20mM组氨酸，(●)182mM精氨酸-HCl、20mM组氨酸、91mM蔗糖，(□)50mM MgCl2、27mg/ml海藻糖、0.01％醋酸盐，(△)50mM MgCl2、30mM MgAc2、0.01％醋酸盐，和(○)50mM MgCl2、45mM MgAc2、0.01％醋酸盐之中。样品在30℃保存6个月。
附图10.显示了抗IgE抗体E25、E26和Hu-901的可变链和恒定链的全长序列的比较。Hu-901的CDR区用下划线表示。对于E25和E26，Chotbia定义的CDR区用黑体字表示，而Kabat定义的CDR区用方框画出。附图10A显示了E25、E26和Hu-901的轻链序列(SEQ ID NO：1-3)，而附图10B显示了E25、E26和Hu-901的重链序列(SEQ ID NO：4-6)。
优选实施方式的详细说明
I.定义
“蛋白质”是指氨基酸序列，链长度足以产生高水平的三级结构和/或四级结构。这是与“多肽”或其它没有这种结构的小分子量药物的区别。通常，这里的蛋白质的分子量至少约为15-20kD，最好至少约为20kD。
这里定义所包括的蛋白质的例子有哺乳动物蛋白质，例如，生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促滤泡激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织型因子和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白质C；心钠素；肺表面活性剂；纤维蛋白溶解酶原激酶，如尿激酶或组织型纤溶酶原激酶(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；趋化因子RANTES(活化后可调节的通常由T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；鼠促性腺素伴随肽；脱氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养性因子如骨衍神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGN-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白质；CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生长素(EPO)；血小板生长素(TPO)；成骨诱导因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；膜表面蛋白质；衰变加速因子(DAF)；病毒性抗原，例如AIDS的部分包被；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；免疫粘附素；抗体；和任何上述多肽的生物活性片段或变异体。
制剂的蛋白质最好是基本上纯净，最好基本上是均相的(即没有杂蛋白等)。“基本上纯净”的蛋白质指的是组分包含至少约90％(重量)(以组分的总重量计)的蛋白质，较佳的为至少约95％(重量)。“基本上均相”的蛋白质指的是以组分的总重量计，组分包含至少99％(重量)的蛋白质。
在一些例子中，蛋白质是抗体。例如抗体可与上述的任一分子结合。本发明中抗体典型的靶分子包括CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20，CD34和CD40；HER受体家族的成员，例如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；2c4、4D5、PSCA、LDP-2；细胞粘附分子，如LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括它的α或β亚单元(如，抗-CD11a、抗-CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；多脂性(OB)受体；mpl受体；CTLA-4和蛋白C等。
其中使用的术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体(diabody)，和单链分子，以及抗体片段(例如，Fab、F(ab′)2和Fv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)在此与“抗体”可互换地使用。
基本的4链抗体单位是由两个同一的轻(L)链和两个同一的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单位与额外的称为J链的多肽组成，包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本的4链单位，基本的4链单位能与J链共同聚合形成多价的集聚物。对于IgG来说，4链单元一般约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链相连，而两个H链取决于H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。每个H和L链也具有有规则地间隔的链内二硫键。每个H链在N-末端具有可变区(VH)，对于每个α和γ链继之以三个恒定区(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH区。每个L链在N-末端具有可变区(VL)，在另一个末端继之以恒定区。轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对应(align)，而轻链可变区与重链可变区相对应。特殊的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变区之间形成界面。VH和VL的配对一同形成了单一抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和性质，参见例如，Basic and Clinical Immunology，8th Edition，Daniel P.Sties，Abba I.Terr and Tristram G Parsolw(eds)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以根据它们恒定区的氨基酸序列被分派为两个明显不同类型中的一种，称为kappa和lambda。取决于它们的重链(CH)恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分派为不同的种类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH的序列和功能方面的相对小的差异，γ和μ类被进一步分成亚类，例如，人类表达以下的亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变”是指在抗体之间可变区的某些片段在序列上有很大差异的事实。V区介导抗原结合并确定了特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个可变区上不是均匀分布的。而是，V区由被几个较短区域分隔的相对不变的区域组成，相对不变的区域被称为骨架区(FR)、约15-30个氨基酸残基，较短区域被称为“高变区”或有时称为“互补决定区”(CDR)，有极度的可变性、每个长度约9-12个氨基酸残基。每个天然重链和轻链的可变区都包含四个FR，大多采取β-折叠结构，通过三个高变区连接，高变区形成环形连接，有些情况下形成部分β-折叠结构。每个链中的高变区通过FR紧密邻近地结合在一起，与来自另一个链的高变区一同，形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。恒定区没有直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出各种效应物功能，例如参与对抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)。
在此使用术语“超变区”(也称为“互补决定区”或CDR)时，是指位于免疫球蛋白V区结构域内部的抗体氨基酸残基(通常为三个或四个极度序列可变性的短区域)，其形成抗原结合位点，并且是抗原特异性主要决定基。有至少两种方法来鉴定CDR残基：(1)根据跨种(cross-species)序列可变性的方法(即，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Instituteof Health，Bethesda，MS 1991))；和(2)根据抗原抗体复合物的结晶研究的方法(Chothia，C.等，J.Mol.Biol. 196：901-917(1987))。然而，在这个意义上，两种残基鉴定技术判定重叠的区域，而不是同一的区域，可以组合它们来判定杂交CDR。
这里所用的术语“单克隆抗体”指的是从基本上均一的抗体种群中获得的抗体，即单个抗体包括的种群是相同的，除了少量可能发生天然的突变。单克隆抗体对单一的抗原位点有高度的特异性。而且，与常规的(多克隆)抗体制备物，即通常有不同抗体针对不同的决定簇(表位)不同，每个单克隆抗体只针对抗原单一的决定簇。除了特异性外，单克隆抗体的优点是它们是用杂交瘤培育来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆”指从基本上均一的抗体种群中获得的抗体的特征，不应被理解为需要任何特殊的方法来生产抗体。例如，本发明所用的单克隆抗体可用Kohler等人描述的杂交瘤方法(Nature，256：495(1975))来制备，或用重组DNA技术来制备(见美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可用如Clackson等人(Nature，352：624-628(1991))和Marks等人(J.Mol.Biol.222：581-597(1991))描述的技术从噬菌体抗体文库中分离获得。
在此单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗体中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而链的其余部分与来源于另一个物种或属于另一个抗体种类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，还包括这种抗体的片段，只要它们显示出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81：6851-6855(1984))。在此感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primitized)”的抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，Old World Monkey，Ape等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列。
“完整的”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然的序列恒定区(例如，人类天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。优选的，完整的抗体具有一种或多种效应器功能。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选的包括完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双功能抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化生产两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，其是反映易于结晶能力的命名。Fab片段由完整的L链以及H链的可变区(VH)和一条重链的第一个恒定区(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合是单价的，即，它具有单个抗原结合位点。对抗体进行胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab′)2片段，其大略地相应于具有不同抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段，并仍具有交联抗原的能力。Fab′片段不同于Fab片段，Fab′在CH1区的羧基末端具有几个额外的残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。Fab′-SH在此是指在恒定区的半胱氨酸残基携带有游离硫醇基的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初作为Fab′片段的成对物而产生，其具有Fab′片段之间的铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含由二硫化键连接的两个H链的羧基末端部分。抗体的效应器功能由Fc区的序列决定，该区也是在某些种类的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的区域。
“Fv”是含有完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密地非共价连接的一个重链可变区与一个轻链可变区的二聚体组成。在这个构象中每个可变区的三个超变区相互作用，在VH-VL二聚体表面限定一个抗原结合位点。这六个超变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或FV上仅含有二个抗原特异性高变区的那一半)也具有识别和结合抗原的能力，但与完整的结合位点相比其亲和力较低。
“单链Fv”也可简写成“sFv”或“scFv”抗体片段，包括抗体的VH和VL结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含一个多肽接头，它能使sFv形成抗原结合所需的结构。关于sFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)。
术语“双功能抗体”是指小的抗体片段，通过用VH和VL区之间的短接头(约5-10残基)构建sFv片段(参见前段)，因而取得链间、而不是链内的V区对而制得，从而产生二价的片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双功能抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚物，在其中两个抗体的VH和VL区存在于不同的多肽链上。双功能抗体在例如EP404,097；WO93/11161；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90：6444-6448(1993)中有更详细的描述。
“特异性结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽上的表位的抗体，是与该特定多肽或特定多肽上的表位结合、基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的那种抗体。
术语“固相”描述了无水的基质，本发明的抗体可以附着在上面。此处包括的固相的实例包括那些部分地或全部由玻璃(例如，控制孔隙大小的玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅树脂形成的那些固相。在某些实施方式中，取决于具体情况，固相可以包括分析平板的孔；在其它实施方式中，其是纯化柱(例如，亲和层析柱)。这个术语还包括完整物品的分开的固相，例如那些在美国专利No.4,275,149中描述的。
非人体来源(如鼠源型)的“人源化”抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或包含从非人源型免疫球蛋白中获得的最小序列的片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或其它与抗原结合的抗体序列)。人源化抗体的大部分是人源型免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)的残基被非人源型的有所需特异性、亲和性和容量的抗体如鼠、大鼠或兔子抗体(供体抗体)的CDR残基替代。在一些例子中，人源型免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人源型残基取代。而且，人源化抗体可包括在受体抗体和输入的CDR或构架序列中均没有的残基。这些修饰可进一步精修并优化抗体的性能。人源化抗体最理想地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般地是人免疫球蛋白的恒定区的一部分。有关详细情形，参见Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature， 332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.， 2：593-596(1992)。
“物种依赖性抗体(species-dependent antibody)”，例如哺乳动物抗人IgE抗体，是对来自第一哺乳动物物种的抗原、与对来自第二哺乳动物物种的该抗原的同系物相比，具有更强的结合亲合性的抗体。通常，物种依赖性抗体“特异性地结合”人类抗原(即，具有不超过约1×10-7M的结合亲合性(Kd)值，或者不超过1×10-8M，或者不超过1×10-9M)，但对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原的同系物的结合亲和性、与其对所述非人抗原的亲和性相比，弱至少约50倍、至少约500倍，或至少约1000倍。物种依赖性抗体可以是如上述定义的各种类型的抗体中的任何一种，但优选的是人源化或人类抗体。
抗体“效应物(器)功能”是指归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)、随抗体同种型变化的那些生物学的活性。抗体效应物功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”是指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起该靶细胞裂解。介导ADCC作用的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞则表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。关于造血细胞上FcR表达的总结见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的464页上的表三。为了评价目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC检测，例如美国专利5500362或5821337中所述。用于这类检测的有效效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者(或另外)，可在体内，例如在Clynes等(PNAS(USA)，95：652-656(1998))所述的动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。
术语“Fc受体”或“FcR”用来描述与抗体Fc段结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类(包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接型)。FcγRII受体包括具有相似的氨基酸序列的FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其主要区别在于其细胞浆结构域。活化受体FcγRIIA在其细胞浆结构域中含有免疫受体酪氨酸为基础的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞浆结构域中含有免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(ITIM)。(见综述M.in Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)；Capel等，免疫学方法4：25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。本文中术语“FcR”函盖其它FcR，包括那些在将来将被鉴定的FcR。该术语还包括负责将母体IgG转移到胎儿的新生期受体FcRn(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。
“人类效应物(器)细胞”是表达一或多种FcR并执行效应功能的白细胞。优选所述细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应功能。介导ADCC作用的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。所述效应细胞可从其天然来源中分离，例如从本文所述血液或PBMC中分离。
“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在的条件下分子裂解靶的能力。补体系统的第一个组分(C1q)与结合相关(cognate)抗原的分子(例如抗体)的结合可起始补体激活途径。为了评价补体活化作用，可进行CDC检测，如Gazzano-Santoro等(免疫学方法杂志202：163(1996))所述。
″分离的″多肽，是指已从其天然环境组分中鉴定和分离和/或收获的多肽。肽的天然环境中的污染成分是那些将干扰使用多肽进行诊断和治疗的物质，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶质。在优选的实施方案中，多肽被纯化为：(1)用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或者(2)使用考马斯蓝或优选银染色，达到在非-还原或还原条件下SDS-PAGE电泳同质性的程度。分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为多肽天然环境中的至少一个组分是不存在的。然而，通常用至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
编码此处的多肽和抗体的“分离的”核酸分子是鉴定和分离自至少一个污染物核酸分子的核酸分子，所述核酸分子通常在其产生的环境中与污染物核酸分子缔合。优选的，所述分离的核酸免于与其产生环境相关的所有组分缔合。编码此处的多肽和抗体的分离的核酸分子处于与其在自然状态中被发现的形式或环境不同的形式。因此分离的核酸分子不同于自然存在于细胞中的编码此处的多肽或抗体的核酸。
术语“控制序列”是指在特定的宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合于原核生物的控制序列包括启动子、选择性地包括操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
当一种核酸与另一种核酸序列处于功能相关的位置时，该核酸与该另一种核酸“可操作相连”。例如如果一种多肽表达为参与该多肽的分泌的前体蛋白，则将前序列或分泌前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作相连；启动子或增强子当能影响编码序列的转录时可与该编码序列可操作相连；或核糖体结合位点当其位置能促进翻译时可与编码序列可操作相连。通常“可操作相连”指被连接的DNA序列是相邻的，而且，如果是分泌前导序列，则相邻且为阅读状态。然而，增强子不必是相邻的。连接可通过在方便的限制性位点相连而实现。如果不存在这样的位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在此处使用术语“标记的表位(epitope tagged)”时，是指包含与“标记物多肽”融合的此处描述的多肽或抗体的嵌合多肽。标记物多肽具有足够的残基以提供表位，针对该表位可以产生抗体，而该标记物多肽又足够短从而不干扰与其融合的多肽的活性。标记物多肽优选还是十分独特的，以致所述抗体基本上不与其它表位交叉反应。适合的标记物多肽一般地具有至少六个氨基酸残基，通常在约8到50个氨基酸残基之间(优选的，在约10到20个氨基酸残基之间)。
在本文中术语“免疫粘附素”定义为抗体样分子，其将异源“粘附素”蛋白(例如受体、配体或酶)的结合结构域与免疫球蛋白恒定区组合。结构上，免疫粘附素包括具有所需结合特异性之粘附素氨基酸残基与免疫球蛋白恒定区序列的融合，所述粘附素氨基酸不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点)(即为“异源性”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是包括受体或配体的至少一个结合位点的邻接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。Ig融合物优选的包括在Ig分子内的至少一个可变区的位置用此处描述的多肽或抗体的区域替代。在一个特别优选的实施方式中，免疫球蛋白融合物包括IgG1分子的铰链、CH2和CH3，或铰链、CH1、CH2和CH3区域。关于免疫球蛋白融合物的生产也参见1995年6月27日授权的美国专利5,428,130。
“稳定的”制剂是一种制剂，在该制剂中、在保存期间其中的蛋白质基本上保持它的物理和化学稳定性和完整性。本领域现有各种测量蛋白质稳定性的分析技术，在Peptide and Protein Drug Delivery，247-301，Vincent LeeEd.，Marcel Dekker，Inc.New York，New York，Pubs.(1991)和Jones A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中有综述。可以在选定的温度测量在一选定的时段的稳定性。对于快速筛选，制剂可以被保持在40℃ 2周到1个月，在这个时间测量稳定性。当制剂将被保存在2-8℃时，一般地该制剂应当在30℃或40℃稳定至少1个月和/或在2-8℃稳定至少2年。当制剂将被保存在30℃时，一般地该制剂应当在30℃稳定至少2年和/或在40℃稳定至少6个月。例如，在保存期间的聚集程度可以被用作蛋白质稳定性的指标。因而，“稳定的”制剂可以是一种制剂，在其中少于约10％、和优选的少于约5％的蛋白在该制剂中以聚合体存在。在另一个实施方式中，可以确定在制剂的保存期间在聚合体形成方面的任何增加。
“重构的(reconstituted)”制剂是一种已经通过将冻干的蛋白或抗体制剂溶解在稀释剂中以使蛋白遍及其中而制备的制剂。重构的制剂适合于向需要用感兴趣的蛋白治疗的病人施用(例如，肠胃外施用)，在本发明的某些实施方式中，可以是适合于皮下施用的制剂。
“等渗的”制剂是一种基本上具有与人类血液相同的渗透压的制剂。等渗的制剂一般地具有从约250到350mOsm的渗透压。术语“低渗的”描述了渗透压低于人类血液渗透压的制剂。相应地，术语“高渗的”被用于描述渗透压高于人类血液渗透压的制剂。例如，可以利用蒸气压或冰冻型渗透压计来测量等渗性。作为添加盐和/或缓冲液的结果，本发明的制剂是高渗的。
“药学上可接受的酸”包括无机酸和有机酸，在它们被配制的浓度和方式下是无毒的。例如，适合的无机酸包括盐酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫磺酸、磺酸、亚磺酸、硫酸、磷酸、碳酸，等等。适合的有机酸包括直链和支链的烃基的、芳族的、环状的、环脂肪族的、芳脂肪族的、杂环的、饱和的、不饱和的、单羧基、双羧基、三羧基的酸，包括例如、蚁酸、乙酸、2-羟基乙酸、三氟乙酸、苯乙酸、三甲基乙酸、t-丁基乙酸、邻氨基苯甲酸、丙酸、2-羟基丙酸、2-羰基丙酸、丙二酸、环戊烷丙酸(cyclopentanepropionic)、环戊烷丙酸(cyclopentane propionic)、3-苯基丙酸、丁酸、丁二酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲基)苯甲酸、2-乙酸基-苯甲酸、抗坏血酸、肉桂酸、十二烷基硫磺酸、硬脂酸、粘康酸、扁桃酸、琥珀酸、恩贝酸、反丁烯二酸、苹果酸、马来酸、羟基马来酸、丙二酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、乙二醇酸、糖酸、葡糖酸、丙酮酸、乙醛酸、草酸、甲磺酸、琥珀酸、水杨酸、邻苯二甲酸、棕榈酸(palmoic acid)、palmeic acid、硫氰酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-chorobenzenesulfonicacid、萘-2-磺酸、p-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环(2，2，2)-辛-2-烯-1-羧酸，葡庚糖酸、4，4′-甲撑双-3-(羟基-2-烯-1-羧酸)、羟基萘甲酸。
“药学上可接受的碱“包括无机碱和有机碱，在它们被配制的浓度和方式下是无毒的。例如，适合的碱包括那些由成无机碱金属，例如锂、钠、钾、镁、钙、铵、铁、锌、铜、锰、铝，N-甲基葡糖胺，吗啉，哌啶形成的碱，和有机无毒碱，包括伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺、环胺和碱离子交换树脂，[例如，N(R′)4+(其中R′独立的是H或C1-4烃基，例如，铵，Tris)]，例如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、trimethamine、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙撑二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机无毒碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、trimethamine、二环己基胺、胆碱和咖啡因。
本发明可用的另外的药学上可接受的酸和碱包括那些来源于氨基酸的酸和碱，所述氨基酸例如，组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。
“药学上可接受的”缓冲液和盐包括那些来源于上述指明的酸和碱的加成盐的缓冲液和盐。特定的缓冲液和/或盐包括组氨酸、琥珀酸盐和醋酸盐。
“溶解保护剂(1yoprotectant)”是一种分子，当其与感兴趣的蛋白质结合时，在冻干和随后的保存中有效地防止或减少蛋白质的化学的和/或物理的不稳定性。举例性的溶解保护剂包括糖和它们相应的糖醇；氨基酸，例如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三元的或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤藓醇、甘油(glycerol)、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics；和其组合。另外的示范性溶解保护剂包括甘油和明胶，和蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏四糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括非还原的多羟基化合物的糖苷，多羟基化合物选自糖醇及其它直链多元醇。优选的糖醇是单糖苷，特别是那些通过将二糖，例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖还原而获得的化合物。糖苷的侧基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的另外的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的溶解保护剂是非还原糖海藻糖或蔗糖。
以“溶解保护量”将溶解保护剂添加到冻干前的制剂意思指，在存在溶解保护量的溶解保护剂的情况下对蛋白质冻干之后，在冻干和保存期间蛋白质基本上保持它的物理的和化学的稳定性以及完整性。
在制备本发明的降低的粘度的制剂时，需要小心利用上述枚举的赋形剂以及其它添加剂，特别是以高浓度添加时，以使得不增加制剂的粘度。
“药学上可接受的糖”是一种分子，当其与感兴趣的蛋白质组合时，在保存中有效地防止或减少蛋白的化学的和/或物理的不稳定性。当制剂将要被冻干然后被重构时，“药学上可接受的糖”也可作为“溶解保护剂”。举例性的糖和它们相应的糖醇包括：氨基酸，例如谷氨酸单钠或组氨酸；甲胺，例如甜菜碱；易溶盐，例如硫酸镁；多元醇，例如三元的或更高分子量的糖醇，例如甘油(glycerin)、葡聚糖、赤藓醇、甘油(glycerol)、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；Pluronics；和其组合。另外的示范性溶解保护剂包括甘油和明胶，和蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水苏四糖。还原糖的实例包括葡萄糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、异麦芽酮糖和乳果糖。非还原糖的实例包括非还原的多羟基化合物的糖苷，多羟基化合物选自糖醇及其它直链多元醇。优选的糖醇是单糖苷，特别时那些通过将二糖，例如乳糖、麦芽糖、乳果糖和麦芽酮糖还原而获得的化合物。糖苷的侧基可以是葡糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的另外的实例是葡糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇和异麦芽酮糖。优选的药学上可接受的糖是非还原糖海藻糖或蔗糖。
以“保护量”将药学上可接受的糖添加到制剂(例如，冻干前)是指，在保存期间(例如，在重构和保存之后)蛋白质基本上保持它的物理的和化学的稳定性以及完整性。
此处感兴趣的“稀释剂”是一种药学上可接受的(对于向人类施用是安全的和无毒的)、对于配制液体制剂有用的试剂，液体制剂例如在冻干之后重构的制剂。举例性的稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水、Ringer’s溶液或葡萄糖溶液。在替换性的实施方式中，稀释剂可以包括盐和/或缓冲液的水溶液。
“防腐剂”是一种可被添加到此处的制剂中以降低细菌活性的化合物。添加防腐剂可以，例如便于生产多次使用(多剂量)的制剂。可能的防腐剂的实例包括十八烷二甲基苯基氯化铵、氯化六烃季铵、氯化苯甲烃铵(烷基苯基二甲基氯化铵的混合物，其中烃基基团是长链化合物)和氯化苄乙氧铵。其它类型的防腐剂包括芳香醇类，例如苯酚、丁基和苯甲基醇、烃基对羟苯甲酸，例如甲基或丙基对羟苯甲酸、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、和m-甲酚。在此最优选的防腐剂是苯甲醇。
“治疗”是指治疗处理以及预防或防范措施。需要医冶的对象包括那些已经发生疾病以及那些需要防止疾病的对象。
对于医治来说“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类、家畜和农畜、和动物园、竞技或玩赏动物，例如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、白鼬、家鼠、猫，等等。优选的，哺乳动物是人。
“疾病”是将受益于用蛋白质医治的任何状况。这包括慢性的和急性的疾病或病症，包括那些使得哺乳动物倾向于所患疾病的病理学状况。此处需医治的疾病的非限制性实例包括癌和过敏。
“治疗有效量”至少是对于特定的疾病引起可测量的改善或预防所需的最小浓度。已知蛋白的治疗有效量是本领域公知的，在下文中揭示的蛋白质的有效量可以通过熟练技术人员，例如普通医师的能力范围内的标准技术来确定。
此处使用的“粘度”可以是“运动粘度(kinematic viscosity)”或“绝对粘度(absolute viscosity)”。“运动粘度”是测量在重力的影响下抵抗液体流动的尺度。当将两个等体积的流体置于同一的毛细管粘度计并允许重力自流时，粘性流体比较低粘性流体花费更长的时间流过该毛细管。如果一个流体花费200秒完成其流动，而另一个花费400秒，在运动粘度的尺度上第二个流体的粘度是第一个的两倍。“绝对粘度”，有时称为动态粘度或简单粘度，是运动粘度和流体密度的积：
绝对粘度＝运动粘度×密度
运动粘度的单位是L2/T，其中L是长度、T是时间。通常，运动粘度用厘司(cSt)表示。运动粘度的国际标准单位是mm2/s，是1cSt。绝对粘度用单位厘泊(cP)表示。绝对粘度的国际标准单位是毫帕-秒(mPa-s)，1cP＝1mPa-s。
此处使用的“抗组胺剂”是对抗组胺的生理效应的药剂。组胺与其受体，H1和H2结合产生特有的过敏性症状和影响，或搔痒、发红、肿胀等。许多抗组胺剂通过阻断组胺与其受体H1、H2的结合来起作用；而其它的抗组胺剂被认为通过抑制组胺的释放来起作用。抗组胺剂的实例是氯芬胺、苯海拉明、普鲁米近、色甘酸钠、阿司咪唑、马来酸哌吡庚啶、bropheniramine maleate、马来酸氯苯吡醇胺、盐酸西替利嗪、延胡索酸氯马斯汀、盐酸二苯环庚啶、马来酸右溴苯那敏、马来酸右旋氯苯吡胺、氯茶碱苯海拉明、盐酸苯海拉明、琥珀酸杜克西拉明、fexofendadine hydrochloride、terphenadine hydrochloride、盐酸羟嗪、loratidine、盐酸敏克静、柠檬酸曲吡那敏、盐酸曲吡那敏、盐酸丙吡咯啶。
此处使用的“支气管扩张剂”描述了对抗或逆转支气管收缩的药剂，支气管收缩通常是在早期阶段哮喘反应中发生的、并导致肺活量降低和喘气的生理学事件。支气管扩张剂的实例包括广泛作用的α和β肾上腺素能的肾上腺素，β肾上腺素能的舒喘宁，吡布特罗，间羟异丙肾上腺，沙美特罗和新异丙肾上腺素。支气管扩张也可以通过施用黄嘌呤，包括氨茶碱和茶碱来实现。
此处使用的“糖皮质激素”描述了具有抗炎活性的基于甾族的药剂。糖皮质激素通常用于减弱晚期阶段哮喘反应。糖皮质激素的实例包括，脱氢可的松、二丙酸氯地米松、丙酮氟羟脱氢皮醇、氟尼缩松、倍他米松、布地缩松、地塞米松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氢化可的松、甲基强的松龙、氢化泼尼松、脱氢可的松和氟羟脱氢皮质醇。
此处使用的“非甾族抗炎药”或“NSAID”描述了具有抗炎活性的、不基于甾族的药剂。NSAID的实例包括醋氨酚、乙酰水杨酸、溴芬酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠、二氟苯水杨酸、依托度酸、苯氧基氢化阿托酸钙、氟比洛芬、布洛芬、吲哚氯甲酰、酮洛芬、meclofenamate sodium、甲灭酸、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、羟保泰松、phenylbutzone、吡罗昔康、舒林酸、甲苯酰吡酸钠。
II.实施本发明的方法
A.多肽和抗体制备
以下说明主要涉及此处描述的多肽或抗体的产生，通过培养用包含编码相同多肽或抗体的核酸的载体转化或转染的细胞，和纯化所产生的蛋白质或抗体来实现。当然，可以预期的是，本领域公知的替换方法也可被用来制备这种多肽或抗体。举例来说，这样的序列或其部分，可以通过利用固相技术进行直接的肽合成来生产[参见，例如，Stewart等，Solid-Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.， 85：2149-2154(1963)]。可以利用人工技术或通过自动装置进行体外蛋白质合成。举例来说，可以利用Applied Biosystems肽合成仪(FosterCity，CA)利用厂商的说明实现自动化合成。可以分别化学合成此处描述的蛋白质或抗体的各个部分，利用化学的或酶促的方法组合。
1.分离编码此处描述的蛋白质的DNA
编码此处描述的蛋白质的DNA可以从cDNA文库中获得，cDNA文库从被认为拥有相应的mRNA并以可检测的水平表达该mRNA的组织中制备得来。因此，这种人类蛋白质编码DNA可以方便地从由人类组织制备的cDNA文库中获得，如在实施例中所描述的。蛋白质编码基因也可以从基因组文库或通过已知的合成步骤(例如，自动化核酸合成)获得。
可以用设计用来鉴定感兴趣基因的探针(例如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)来筛选文库。可以利用标准程序，例如在Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的程序，用选定的探针筛选cDNA或基因组文库。分离编码所期望的基因的基因的替代方法是PCR方法[Sambrook等，同上；Dieffenbach等，PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)]。
以下的实例描述筛选cDNA文库的技术。选择作为探针的寡核苷酸应当足够长，和足够明确，从而使假阳性最小化。寡核苷酸优选的是标记了的，从而在与需筛选的文库中的DNA杂交时能被检测到。标记的方法是本领域公知的，包括用象32P标记的ATP这样的放射性标记、生物素化或酶标记。在Sambrook等，同上，中提供了杂交条件，包括中度严紧和高度严紧的杂交条件。
在这种文库筛选方法中鉴定的序列可以与其它已知的序列比较和序列对比，其它已知的序列被保存在公众的数据库，例如Genbank或其它私有的序列数据库中，并可从中获得。处于分子的确定区域中、或跨越全长序列的序列的身份(氨基酸水平或核苷酸水平)可以利用本领域已知的方法和如在此描述的方法来确定。
可以首先利用在此公开的推导的氨基酸序列通过筛选选定的cDNA或基因组文库来获得具有蛋白质编码序列的核酸，如有必要，利用如Sambrook等，同上，中描述的常规的引物延伸步骤来检测可能未被反转录成cDNA的mRNA的前体和加工中间物。
2.宿主细胞的选择和转化
用包含此处描述的要生产的蛋白质或抗体的表达载体或克隆载体转染或转化宿主细胞，在视诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望的序列的基因的情况而修改了的常规培养基中进行培养。由熟练技术人员无需过度实验就可以选择培养条件，例如培养基、温度、pH值，等。一般而言，可以在Mammalian Cell Biotechonolgy：A Practical Approach，M.Butler，ed.(IRLPress，1991)和Sambrook等，同上，中找到最大化细胞培养物的生产能力的原则、方案和实用技术。
真核细胞转染和原核细胞转化的方法对于普通熟练技术人员是已知的，例如，CaCl2、CaPO4、脂质体介导的方法和电穿孔的方法。取决于使用的宿主细胞，利用适合于这种细胞的标准技术进行转化。如Sambrook等，同上，中描述的应用氯化钙的钙处理，或电穿孔一般用于原核生物。如Shaw等，Gene， 23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859中描述的，使用根瘤土壤杆菌的感染被用于转化某些植物细胞。对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，可以使用Graham和van der Eb，Virology， 52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况已经在美国专利No.4,399,216中描述了。一般根据Van Solingen等，J.Bact.， 130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 76：3829(1979)的方法向酵母进行转化。然而，也可以使用其它用于将DNA导入细胞中的方法，例如核显微注射、电穿孔、与完整细胞的细菌原生质体融合、或聚阳离子，例如Polybrene、聚鸟氨酸的方法。转化哺乳动物细胞的各种技术参见Keown等，Methods inEnzymology， 185：527-537(1990)和Mansour等，Nature， 336：348-352(1988)。
用于克隆或表达此处的在载体中的DNA的适合的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适合的原核生物包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或格兰氏阳性生物，例如，肠杆菌族，例如大肠埃希氏菌。各种大肠埃希氏菌菌株都是公众可获得的，例如大肠埃希氏菌K12菌株MM294(ATCC 31，446)；大肠埃希氏菌X1776(ATCC 31，537)；大肠埃希氏菌菌株W3110(ATCC 27，325)和K5772(ATCC 53，635)。其它适合的原核宿主细胞包括肠细菌族，例如埃希氏杆菌属，例如，大肠埃希氏菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD 266，710中公开的地衣芽孢杆菌41P)，假单胞菌属，例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属。这些实例是说明性的而不是限制性的。菌株W3110是特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是重组DNA产物发酵的通用宿主菌株。优选的，宿主细胞分泌最小数量的蛋白水解酶。例如，可以修改菌株W3110以引起对编码宿主内源蛋白质的基因的遗传突变，这种宿主的实例包括大肠埃希氏菌W3110菌株1A2，其具有完整的基因型tonA；大肠埃希氏菌W3110菌株9E4，其具有完整的基因型tonA ptr3；大肠埃希氏菌W3110菌株27C7(ATCC 55，244)，其具有完整的基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT kanr；大肠埃希氏菌W3110菌株37D6，其具有完整的基因型tonAptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr；大肠埃希氏菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；和在1990年8月7日出版的美国专利No.4,946,783中公开的具有特别的周质蛋白酶的大肠埃希氏菌菌株。做为选择，体外克隆方法，例如，PCR或其它核酸聚合酶反应，是适合的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适于使编码FGF-19的载体克隆或表达的宿主。酿酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最为常用。其它真核微生物包括：粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290：140[1981]；1985年5月2日公布的EP 139383)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9：968-975(1991))，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)：737-742[1983])、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、成克曼氏克鲁维酵母(K.wickeraml])(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和克鲁维氏酵母属(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278[1988])；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP 244234)；粗糙链孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263[1979])；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP 394538)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉属宿主如构巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112：284289[1983]；Tilburn等，Gene，26：205-221[1983]；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474[1984])和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4：475-479[1985])。在本文中嗜甲基(Methylotropic)酵母是适宜的，包括但不限于选自下述属的能够在甲醇中生长的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)，念珠菌属(Candida)，克勒克酵母属(Kloeckera)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属，球拟酵母属和红酵母属。此类酵母的例证性特定酵母属的清单见C.Anthony，The Biochemistrvof Methylotrophs，269(1982)。
表达此处描述的多肽和抗体的糖基化形式的适合的宿主细胞来自于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞(例如果蝇属S2和草地夜蛾Sf9)和植物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和COS细胞。更特异的实例包括转化了SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)的猴肾CV1细胞系；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆培养成在悬浮培养液中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；鼠赛尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌细胞(MMT 060562，ATCC CCL51)。选择合适宿主细胞是本领域常识。
3.复制型载体的选择和应用
可以将编码此处描述的多肽或抗体的核酸(例如，cDNA或基因组DNA)插入到可复制载体中用于克隆(DNA扩增)或表达。各种载体是公众可以获得的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。使用各种方法可将合适的核酸序列插入载体。通常，利用本领域已知技术将DNA插入到合适的限制性核酸内切酶位点。载体组成部分一般包括但不限于：一个或多个信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。使用本领域熟练技术人员熟知的标准连接技术，构建包括这些组成部分中一个或多个元件的适宜载体。
多肽或抗体的重组产物不仅可直接重组制备，而且还可制备成与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽为信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特异性裂解位点的其它多肽。通常，信号序列可以是载体的一个组分，或者可以是被插入载体中编码多肽或抗体的DNA的一部分。信号序列可以是选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导区的原核信号序列。对于酵母分泌，可以是例如酵母转化酶前导区、α因子前导区(包括糖酵母属和克鲁维酵母属的α因子前导区，后者在美国专利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前导区、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导区(1990年4月4日公布的EP 362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信号序列。在哺乳动物细胞表达时，可使用哺乳动物信号序列以直接分泌蛋白，如得自相同物种或相关物种分泌型多肽的信号序列以及病毒分泌前导区。
表达载体和克隆载体均含有使载体在一个或多个选定宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌、酵母和病毒中，这样的序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适宜于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒复制起始点适于酵母，各种病毒复制起始点(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)适宜于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达载体和克隆载体通常包含筛选基因，也称为可筛选标记。典型的筛选基因编码蛋白，该蛋白(a)提供对抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素等的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供从复合培养基中不能得到的关键营养物质，例如编码芽孢杆菌属D-丙氨酸消旋酶的基因。
适于哺乳动物细胞的筛选标记实例是那些允许鉴定细胞的可选择标记物，例如DHFR或胸苷激酶。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是按照Urlaub等在Pric.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980)中描述的方法制备和繁殖的DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。适用于酵母的合适筛选基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，282：39(1979)；Kingsman等，Gene，7：141(1979)；Tschemper等，Gene，10：157(1980)]。trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了筛选标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
表达和克隆载体通常含有可操作地连接于所述DNA序列的启动子，以指导mRNA合成。被各种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子，包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统[Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979)]，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统[Goeddel，Nucleic acids Res.，8：4057(1980)；EP 36776]，和杂化启动子如tac启动子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)]。适用于细菌系统的启动子，也含有可操作地连接于所述DNA序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
适用于酵母宿主的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7：149(1968)；Holl和Biochemistrv，17：4900(1978)]的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母启动子，即那些具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区，即乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73657中进一步描述了用于酵母表达系统的适当载体和启动子。
在哺乳动物宿主细胞中，对载体的转录可受下述启动子调控，所述启动子来自病毒基因组如多瘤病毒(polyoma virus)、鸟痘病毒(fowlpox virus)(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，和来自热休克启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
高等真核生物对编码此处的多肽或抗体的核酸的转录可以通过将增强子序列插入到载体中来增加。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA的顺式作用元件，一般约10～300bp。目前已经知道了很多哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，人们通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。所述增强子可以被剪接到载体中编码序列的5’或3’端，但优选位于启动子的5’端。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA结构所必须的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含核苷酸片段，所述核苷酸片段在编码此处描述的多肽或抗体的mRNA的非翻译区中被转录为多聚腺苷酸化片段。
适合在重组脊椎动物细胞培养中合成此处描述的多肽或抗体的其它适宜方法、载体和宿主细胞，见Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP 117060和EP 117058中的描述。
4.检测基因扩增/表达
基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测定，例如，根据此处提供的序列并利用适当的标记探针，通过常规技术如Southern印迹、测定mRNA转录量的Northern印迹[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980)]、点印迹(DNA分析)或原位杂交，可以直接在样品中测定基因扩增和/或表达。或者，使用能够识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂化双链体或者DNA-蛋白双链体。依次标记抗体，对双链体与表面哪个部位结合进行分析，从而基于双链体在表面的形成，探测到与双链体结合的抗体。
或者，为直接定量测定表达的基因产物，用免疫学方法测定基因表达，所述方法如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液分析。适用于免疫组化染色和/或样品液分析的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以在任何哺乳动物中制备抗体。方便地，可以针对此处描述的多肽，或针对根据此处提供的DNA序列合成的肽，或针对与编码这种多肽和抗体的DNA融合的外源序列，和与编码特异性抗体表位的DNA融合的外源序列，来制备抗体。
5.多肽纯化
可从培养基或宿主细胞裂解物中回收多肽。如果所述多肽与膜结合，那么使用适宜去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶裂解使之自细胞膜释放。使用各种物理或化学手段，如冻融循环、超声、机械破裂或细胞溶解剂，使表达此处描述的多肽或抗体所用的细胞破裂。
可以期望从重组细胞蛋白或其它多肽中纯化此处描述的多肽或抗体。下述程序是例证性适宜的纯化步骤：在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石或阳离子-交换树脂如DEAE上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如交联葡聚糖(Sephadex)G-75进行凝胶过滤；过蛋白A琼脂糖柱以除去污染物如IgG；和结合表位-标记形式FGF-19的金属螯合剂柱。可以使用蛋白纯化的各种方法，这些方法是本领域熟知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principes and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)中作了描述。纯化步骤的选择，取决于例如，生产方法的性质和所产生的特定多肽或抗体。
B.抗体制备
在本发明的某些实施方式中，选择的蛋白质是抗体。以下是生产抗体的技术，包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的和异源偶联物抗体。
(1)多克隆抗体。
一般通过多次皮下的(sc)或腹膜内的(ip)注射相关抗原和佐剂，在动物中引发出多克隆抗体。利用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰硫酸琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1独立的是低级烃基基团，将相关的抗原结合到在被免疫的物种中是免疫原性的蛋白质上，是有用的，所述蛋白质例如，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物。可以使用的佐剂的实例包括弗氏不完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的双白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。本领域技术人员无需过度的实验就可以选择免疫方案。
用所述抗原、免疫原性偶联物，或衍生物免疫动物，通过使例如100μg或5μg所述蛋白质或偶联物(分别对于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂组合，皮内在多个位置注射所述溶液来实现。一个月后，用1/5到1/10初始量的肽或偶联物在弗氏完全佐剂中通过在多个位置皮下注射来对动物进行强化免疫。七到十四天后，对动物抽血，血清用于分析抗体滴度。对动物进行强化免疫，直到滴度达高峰水平。偶联物也可作为蛋白质融合物在重组细胞培养物中制备。此外，聚集剂例如明矾(alum)适合于增强免疫反应。
(2)单克隆抗体。
单克隆抗体是从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能自然发生的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)之外，包含所述群体的每个抗体都是相同的。因而，修饰语“单克隆”表明抗体的特征不是不同抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可以通过由Kohler等，Nature， 256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(美国专利No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，按上文中描述的免疫小鼠或其它适当的宿主动物，例如仓鼠，引发出淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。做为选择，可以体外致敏淋巴细胞。然后利用适合的的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(AcademicPress，1986)。
所述免疫剂一般地包括抗原性蛋白质或其融合变体。一般而言，如果需要来源于人的细胞，则使用外周血淋巴细胞(“PBLs”)，如果需要非人哺乳动物来源的细胞，那么就使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用适宜的融合试剂如聚乙二醇，将淋巴细胞与无限增殖细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞[Goding，单克隆抗体：Principles和Practice，Academic Press，(1986)59-103页]。
无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人类起源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在适宜培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的无限增殖细胞生长或生存的物质。例如，亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(″HAT培养基″)，这些物质抑制HGPRT-缺陷细胞生长。
优选的永生骨髓瘤细胞是那些有效地融合、支持选定的抗体生产细胞以稳定的高水平产生抗体、和对培养基，例如HAT培养基敏感的细胞。在这些之中，优选的是鼠骨髓瘤细胞系，例如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤、可以从Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA获得的那些，和可以从美国典型培养物保藏中心，Manassus，Virginia USA获得的SP-2细胞(和其衍生物，例如，X63-Ag8-653)。也已经描述了将人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体的生产((Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker Inc.，New York，1987))。
分析杂交瘤细胞生长的培养基生产针对所述抗原的单克隆抗体的产量。优选的，杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外结合分析，例如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来确定。
可以分析培养杂交瘤细胞的培养基，分析其中是否存在针对期望的抗原的单克隆抗体。优选的，所述单克隆抗体的结合亲合性和特异性可以通过免疫沉淀法或通过体外结合分析，例如放射性免疫测定(RIA)或酶联分析(ELISA)来确定。这种技术和分析方法是本领域已知的。例如，可以通过Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来确定结合亲合性。
在鉴定了产生期望特异性、亲合性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，通过限制性稀释步骤和通过标准方法(Goding，同上)培养来对所述克隆进行亚克隆。用于这个目的的适合的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在体内，如哺乳动物的腹水瘤中生长。
通过常规的免疫球蛋白纯化步骤，例如蛋白质A琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，适当地将所述亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹腔积液或血清分离。
也可通过重组DNA方法，例如在美国专利No.4,816,567和如上述描述的方法，来制造单克隆抗体。利用常规程序容易地分离编码单克隆抗体的DNA并测序(例如，利用能与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞充当了这种DNA的优选的来源。一旦被分离出来，DNA可以被置入表达载体中，然后用该载体转染宿主细胞，所述宿主细胞如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs. 130：151-188(1992)。
在进一步的实施方式中，可以从利用McCafferty等，Nature， 348：552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体。Clackson等，Nature， 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.， 222：581-597(1991)分别描述了利用噬菌体文库分离鼠的和人类的抗体。随后的出版物描述了通过链改组(strain shuffle)(Marks等，Biol/Technology， 10：779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为构建庞大噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nucl.acids Res.， 21：2265-2266(1993))，来生产高亲合力(nM范围)的人类抗体。因而，这些技术是对分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行性替换。
例如，也可以通过用人类重链和轻链恒定区的编码序列代替同源的鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison，等，Proc.Natl Acad.Sci.USA， 81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分共价连接，来修改DNA。一般地这种非免疫球蛋白多肽代替抗体的恒定区，或可以取代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合的二价抗体，所述二价抗体包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同的抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
此处描述的单克隆抗体可以是单价的，其制备方法是本领域公知的。例如，一种方法包括免疫球蛋白轻链和修饰后的重链的重组表达。一般地重链在Fc区域的任一点被截断以阻止重链交联。做为选择，相关的半胱氨酸残基可以被另一个氨基酸残基代替，或被删除，以阻止交联。体外方法也适用于制备单价的抗体。可以利用本领域已知的常规技术来实现对抗体的消化，以产生其片段，特别是Fab片段。
也可以在体外利用已知的合成蛋白化学方法，包括那些利用交联剂的方法来制备嵌合的或杂交抗体。例如，可以利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于这个目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
(3)人源化抗体。
本发明的抗体可进一步包括人源化抗体或人抗体。非-人(例如，鼠)的人源化抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，它们包含极少的非人免疫球蛋白序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)中受者互补决定区(CDR)残基被具有所需特异性、亲和力和性能的小鼠、大鼠、家兔等非人源物种抗体(供体抗体)的CDR残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基由相应的非人类残基所取代。人源化抗体也可包含受者抗体或供体CDR或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体基本上包括至少一个、通常两个可变区的全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还任选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详见Jones等，自然，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化非-人抗体的方法是本领域技术人员所已知的。通常，人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))所述，用一个或多个CDR序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4816567)，其中完整人类可变区的很大一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
在制造人源化抗体中人类可变区，包括轻链和重链可变区的选择，对减少抗原性是非常重要的。根据所谓的“best-fit”方法，相对于已知的人类可变区序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变区序列。然后将与啮齿动物的序列最接近的人类序列作为人源化抗体的人类骨架(FR)。Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.， 196：901(1987)。另一种方法使用了特定的骨架，所述骨架来源于特定轻链或重链亚群的人类抗体的共有序列。相同的骨架可被用于几个不同的人源化抗体。Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89：4285(1992)；Presta等，J.Immnol.， 151：2623(1993).。
更重要的是，抗体被人源化后仍保持着对抗原的高亲合性及其它有利的生物学性质。为了实现这个目标，根据优选的方法，通过利用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的人源化产物的过程，来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，为本领域技术人员所熟知。图解和显示选定的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示结果的检查，可以分析在候选免疫球蛋白序列的功能中残基可能起的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。这样，可以从接受者和输入序列中选择和组合FR残基，从而获得期望的抗体特性，例如对目标抗原的增加的亲合性。一般地，CDR残基直接并且极其充分地(most substantially)影响抗原结合。
各种形式的人源化抗体都是本发明所涉及的。例如，人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab，其选择性地与一个或多个细胞毒性药剂结合以产生免疫偶联物。做为选择，人源化抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgG1抗体。
(4)人类抗体
作为对人源化的替代，可以产生人类抗体。例如，可以制备转基因动物(如小鼠)，所述转基因动物可以通过免疫，在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(JH)基因的纯合性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到此胚系突变小鼠，将导致产生针对抗原攻击的人抗体。例如，见Jakobovits等，美国国家科学院院刊，90：2551(1993)；Jakobovits等，自然，362：255-258(1993)；；美国专利No.5,591,669和WO97/17852。
或者，噬菌体呈现技术可被用于从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因所有组成部分体外生产人类抗体或抗体片段。McCafferty等，Nature348：552-553(1990)；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol. 227：381(1991)。依据这种技术，抗体V区基因被克隆到丝状噬菌体的主要和次要外壳蛋白基因读框中，所述丝状噬菌体例如M13或fd，在噬菌体粒子的表面上被呈现为功能性抗体片段。由于丝状粒子包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体功能性质的选择，也产生了对编码显示出那些性质的抗体的基因的选择。因而，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。可以用各种形式进行噬菌体展示，例如这在Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Curr.Opin Struct.Biol. 3：564-571(1993)中有综述。数种来源的V基因片段可被用于噬菌体展示。Clackson等，Nature  352：624-628(1991)从来源于免疫小鼠的脾的V基因的小随机组合文库中分离了多种抗唑酮抗体的阵列(array)。遵循Marks等，J.Mol.Biol. 222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)中描述的技术，可以构建来自未免疫人类供体的V基因的所有组成部分，可以基本上分离出针对各种抗原(包括自体抗体)的抗体。参见，美国专利No.5,565,332和5,573,905。
也可获得Cole等人和Boerner等人的技术用于制备人类单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)和Boerner等，J.Immunol. 147(1)：86-95(1991)。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，例如小鼠来制造人类抗体，在所述转基因的动物中内源性免疫球蛋白基因已经被部分地或完全地失活了。在攻击时，观察人类抗体产物，在各个方面其都与在人类中所见的类似，包括基因重排，装配和抗体所有组成部分(antibody repertoire)。例如，这个方法在美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中，和在以下科学出版物：Marks等，Bio/Technology  10：779-783(1992)；Lonberg等Nature  368：856-859(1994)；Morrison，Nature  368：812-13(1994)，Fishwild等，Nature Biotechnology  14：845-51(1996)，Neuberger，Nature Biotechnology14：826(1996)和Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol. 13：65-93(1995)中有描述。
最后，也可在体外通过活化的B细胞来产生人类抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
(5)抗体片段
在某些情形下，使用抗体片段比使用整个抗体有好处。较小的片段大小允许被快速的清除，可产生对实体肿瘤的增加的接触机会。
已经开发出各种技术用于产生抗体片段。传统上，通过对完整抗体进行蛋白水解消化来派生出这些片段(参见，例如Morimoto等，J.Biochem Biophys.Method. 24：107-117(1992)；和Brennan等，Science  229：81(1985))。然而，现在可以直接通过重组宿主细胞生产这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都能够在大肠埃希氏菌中表达和从大肠埃希氏菌分泌，因而容许容易的产生大量的这些片段。可以从如上所述的抗体噬菌体文库从分离抗体片段。做为选择，可以直接从大肠埃希氏菌回收Fab′-SH片段，化学地连接形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology  10：163-167(1992))。根据另一个方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab′)2片段。在美国专利No.5,869,046中描述了具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2。在其它实施方式中，可选的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894和美国专利No.5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如，如在美国专利5,641,870中描述的。这种线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(6)抗体依赖的酶介导的前体药物治疗(ADEPT)
通过将抗体与前体药物激活酶结合，本发明的抗体也可被用于ADEPT，所述前体药物激活酶将前体药物(例如肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转换成活性的抗癌药物。参见，例如，WO 88/07378和美国专利No.4,975,278。
对于ADEPT有用的免疫偶联物的酶组分包括能以一定方式作用于前体药物以将其转变成其更具活性、细胞毒性的形式的任何酶。
对本发明的方法有用的酶包括但不限于，糖苷酶、葡萄糖氧化酶、人溶菌酶、人葡糖醛酸酶、对于将包含磷酸盐的前体药物转变成游离药物有用的碱性磷酸酶；对于将包含硫酸盐的前体药物转变成游离药物有用的芳基硫酸酯酶；对于将无毒的5-氟胞嘧啶转变成抗癌药物5-氟尿嘧啶有用的胞嘧啶脱氨基酶；蛋白酶，例如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶(例如，羧肽酶G2和羧基肽酶A)和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，对于将包含肽的前体药物转变成游离药物是有用的；D-丙氨酰基羧肽酶，对于转化包含D-氨基酸取代基的前体药物是有用的；碳水化合物裂解酶，例如将糖基化的前体药物转变成游离药物有用的β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶；对于将β-内酰胺衍生的药物转变成游离药物有用的β-内酰胺酶；和青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，对于在胺氮上用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物分别转变成游离药物是有用的。做为选择，具有酶活性的抗体，本领域也称为“抗体酶”，可被用于将本发明的前体药物转变成游离的活性药物(参见，例如Massey，Nature  328：457-458(1987))。可以如在此描述的来制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送到肿瘤细胞群体中。
可以通过本领域公知的技术，例如使用上述的异双功能交联剂，将上述酶共价连接到此处描述的多肽或抗体上。做为选择，至少包含本发明的抗体的抗原结合区的、与本发明的酶的至少一个功能活性部分连接的融合蛋白质，可以利用本领域公知的重组DNA技术来制备(参见，例如，Neuberger等，Nature  312：604-608(1984))。
7)双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体(BsAb)是那些具有与至少两个不同表位的结合特异性的抗体，包括那些在同一个或另一个蛋白质上的表位。做为选择，可以装备一条臂以与目标抗原结合，另一条臂可以与一种与白细胞上的触发分子结合的臂化合，所述触发分子例如T细胞受体分子(例如，CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以将细胞防卫机制聚焦和定位到表达目标抗原的细胞上。这种抗体可以来源于全长抗体或抗体片段(例如，F(ab′)2双特异性抗体)。
双特异性抗体也可以被用于将细胞毒性药剂定位到表达目标抗原的细胞。这种抗体拥有与期望的抗原结合的一条臂和与细胞毒性药剂结合的另一条臂(例如，saporin、抗干扰素-a、vinca alkoloid、篦麻毒素A链、氨甲蝶呤或放射性同位素半抗原)。已知的双特异性抗体的实例包括抗ErbB2/抗FcgIII(WO 96/16673)、抗ErbB2/抗FcgRI(美国专利5,837,234)、抗ErbB2/抗-CD3(美国专利5,821,337)。
制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产是根据共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中两个链具有不同的特异性。Millstein等，Nature， 305：537-539(1983)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10个不同抗体分子的潜在混合物，在其中仅有一个具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化，是相当繁琐的，产物产率很低。在WO 93/08829和在Traunecker等，EMBO J.， 10：3655-3659(1991)中公开了类似的步骤。
根据不同的方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。所述融合优选的是与免疫球蛋白重链恒定区融合，至少包含铰链、CH2和CH3区域的部分。具有包含为轻链结合所必需的位点的第一个重链恒定区(CH1)是优选的，存在于至少一个所述融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA、和如果需要将编码免疫球蛋白轻链的DNA，插入到独立的表达载体中，共转染到适合的宿主生物中。当用于构建时三个多肽链的不等比例提供了最适的产量时，在实施方式中这为调整所述三个多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，当至少两个多肽链以相等的比例表达导致高产量时，或当所述比例没有特别的意义时，有可能将两个或全部三个多肽链编码序列插入到一个表达载体中。
在这个方法的优选实施方式中，所述双特异性抗体由在一条臂上具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链、和在另一条臂上的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。据发现，这个不对称的结构便于从不需要的免疫球蛋白链结合物中离期望的双特异性化合物，在仅半个所述双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离路线。在WO 94/04690中公开了这个方法。产生双特异性抗体的进一步细节，参见，例如，Suresh等，Methods in Enzymology  121：210(1986)。
根据在WO 96/27011或美国专利5,731,168中描述的另一个方法，可以设计在抗体分子对之间的接触面来最大化从重组细胞培养物中回收杂二聚物的百分比。优选的接触面至少包含抗体恒定区的CH3区的一部分。在这个方法中，来自第一抗体分子的接触面的一个或多个小的氨基酸侧链被大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换。通过用小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的接触面上产生与大的侧链相同或类似大小的补偿“腔”。这提供了一种相对其它不需要的终产物，例如同型二聚体、用于增加杂二聚体的产量的机制。
已经在文献中描述了从抗体片段产生双特异性抗体的方法。例如，可以利用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science  229：81(1985)描述了一种步骤，其中完整的抗体被蛋白水解化地剪切以产生F(ab′)2片段。在存在二巯基化物络合剂亚砷酸钠以稳定邻近的二巯基化物和阻止分子间的二硫化物形成的情况下，这些片段被减少了。然后将产生的Fab′片段转变成三硝基苯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物中的其中一个再转变成Fab′-TNB衍生物，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可被用作用于酶的选择性固定化的药剂。
可以直接从大肠埃希氏菌中回收Fab′片段，并化学地联结以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med. 175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的生产。分别地从大肠埃希氏菌分泌每个Fab′片段，在体外进行直接的化学偶联以形成双特异性抗体。这样形成的双特异性抗体能够与过量表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，并且能触发人细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶点的溶解活性。
也已经描述了直接从重组细胞培养物中制造和分离二价抗体片段的各种技术。例如，已经利用亮氨酸拉链结构产生了二价的杂二聚物。Kostelny等，J.Immunol.， 148(5)：1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链结构肽通过基因融合被连接到两个不同抗体的Fab′部分。在绞链区还原抗体同二聚体以形成单体，然后重氧化以形成抗体异二聚物。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90：6444-6448(1993)描述的“双功能抗体”技术提供了制造双特异性/二价抗体片段的可选择的机制。所述片段包括通过接头连接到轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)，所述接头非常短从而不容许在相同链的两个区域间的配对。因此，一个片段的VH和VL区不得不与另一个片段的互补VL和VH区配对，从而形成两个抗原结合位点。已经报道了利用单链Fv(sFv)二聚体制造双特异性/二价抗体片段的另一个策略。参见Gruber等，J.Immunol.， 152：5368(1994)。
具有超过两个化合价的抗体也在本发明的范围内。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol. 147：60(1991)。
举例性的双特异性抗体可以与给定分子上的两个不同表位结合。做为选择，可以将抗蛋白质臂与结合白细胞上的触发分子的臂化合，所述触发分子例如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受体(FcγR)，例如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以将细胞的防卫机制聚焦到表达特定蛋白质的细胞上。双特异性抗体也可以被用于将细胞毒性药剂定位到表达特定蛋白质的细胞。这种抗体拥有蛋白结合臂和与细胞毒性药剂或放射性核素螯合剂，例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA结合的臂。另一种感兴趣的双特异性抗体与感兴趣的蛋白质结合，并进一步结合组织因子(TF)。
6)异偶联物抗体
异偶联物抗体也在本发明的范围内。异偶联物抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，在异偶联物中的一个抗体可以与抗生物素蛋白联结，另一个与生物素联结。例如，这种抗体已经被计划用来将免疫系统细胞靶向不需要的细胞，美国专利4,676,980，和用来医治HIV感染。WO 91/00360，WO92/200373和EP 0308936。预期的是，也可以在体外利用已知的合成蛋白化学方法，包括那些利用交联剂的方法来制备所述抗体。例如，可以利用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于这个目的的适合的试剂的实例包括亚氨基硫醇化物和甲基-4-巯基丁亚氨酸酯，和那些例如在美国专利No.4,676,980中公开的试剂。可以利用任何方便的交联方法来制造异偶联物抗体。适合的交联剂是本领域公知的，在美国专利No.4,676,980中随同许多交联技术一起被公开。
(7)效应物功能改造
根据效应物功能修饰本发明的抗体是可取的，以便增强抗体在治疗癌症中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基导入Fc区中，从而容许在该区中形成链间的二硫键。这样产生的同型二聚化抗体具有增加的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med，. 176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol. 148：2918-2922(1992)。也可以利用如Wolff等，Cancer Research  53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联接头来制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚化抗体。做为选择，可以设计抗体具有双Fc区，从而抗体具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design  3：219-230(1989)。
(8)免疫偶联物
本发明还涉及免疫偶联物，所述免疫偶联物包含与细胞毒性药剂结合的抗体，细胞毒性药剂例如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射偶联物)。
对产生这种免疫偶联物有用的化学治疗剂包括BCNU、streptozoicin、长春新碱、长春花碱、阿霉素和5-氟尿嘧啶。
可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。
抗体与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学238：1098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，癌症研究52：127-131(1992))。
另外，小分子毒素例如卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)(美国专利5,208,020)、trichothene和CC1065也可望作为可结合的毒素用于本发明的制剂。在一个实施方式中，全长抗体或其抗原结合片段可以与一个或多个美登木素生物碱(maytansinoid)分子结合(例如，每个抗体分子与约1-10个美登木素生物碱分子结合)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。已经描述了从天然来源分离的、或合成制备的美登木素生物碱，包括美登素、maytansinal和其衍生物和类似物，参见美国专利No.5,208,020和其中引用的参考文献(见第2栏第53行至第3栏第10行)和美国专利3,896,111和4,151,042。在美国专利No.5,208,020中也描述了制备抗体-美登木素生物碱偶联物的方法。在优选的实施方式中，美登木素生物碱通过二硫化物或其它含硫的接头基团与抗体连接。例如，可以将美登素转变成May-SS-Me，其可以被还原为May-SH3并与修饰的抗体反应产生美登木素生物碱-抗体免疫偶联物。Chari等，Cancer Res. 52：127-131(1992)。可以通过已知的方法修饰抗体，包含游离或保护的硫醇基的抗体然后与包含二硫化物的美登木素生物碱反应产生所述偶联物。所述抗体-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性可以在体外或体内通过已知的方法来测定并可用IC50确定。
加利车霉素(calicheamicin)是另一个感兴趣的免疫偶联物。加利车霉素家族的抗生素能在亚-皮摩尔浓度产生双链DNA中断。可以使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 1、α2 1、α3 1、N-乙酰-γ1 1、PSAG和θ1 1(Hinman等，Cancer Res. 53：3336-3342(1993)和Lode等，Cancer Res. 58：2925-2928(1998))。可以连结抗体的其它抗肿瘤药物包括QFA，其是一种抗叶酸物。加利车霉素和QFA都具有细胞内的作用位点，不容易穿越质膜。因此，通过抗体介导的内在化作用对这些药剂的细胞摄取大大地增强了它们的细胞毒性效果。
在抗体和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，例如脱氧核糖核酸酶，DNase))之间形成的免疫偶联物也是预期的。
抗体也可以与高放射性原子结合。用于产生放射性共轭抗体的各种放射性核素是可获得的。实例包括At211、Bi212、I131、In131、Y90、Re186、Re188、Sm153、P32和Pb212和Lu的放射性同位素。当所述偶联物是用于诊断时，其可以包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如Tc99或I123、或用于核磁共振(nmr)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以用已知的方法将放射标记物或其它标记物掺入到所述偶联物中。例如，可以利用包含，例如适当位置的氟-19或氢的适合的氨基酸前体，通过化学的氨基酸合成来生物合成或化学合成所述肽。Tc99或I123、Re186、Re188和In111标记物可以通过肽中的半胱氨酸残基附着上。钇-90可以通过赖氨酸残基附着。IODOGEN法可用于掺入碘-123，Fraker等，Biohem.Biophys.Res.Commun. 80：49-57(1978)。在″Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy″(Chatal，CRC Press1989)中描述了结合放射性核素的其它方法。
做为选择，可以通过重组技术或肽合成来制造包含抗体和细胞毒性药剂的融合蛋白。DNA的长度可包含编码所述偶联物的两个部分的各自的区域，所述区域可以是相互邻近的，或由编码接头肽的区域分隔开来，所述接头肽不破坏所述偶联物的期望的性质。
在另一个实施方式中，抗体可以与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)结合用于在肿瘤的预靶向中使用，其中向病人施用抗体-受体偶联物，然后用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，再施用与细胞毒性药剂(例如，放射性核苷酸)结合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。
(9)免疫脂质体
此处公开的抗体也可被配制为免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的类脂、磷脂和/或表面活性物质组成的小的泡囊，对于向哺乳动物投送药物是有用的。脂质体的组分通常排列成双分子层形式，类似于生物膜的脂质分布。
通过本领域已知的方法制备包含抗体的脂质体，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；和美国专利No.4,485,045和4,544,545中描述的方法。在美国专利No.5,013,556中公开了具有增强的循环时间的脂质体。
可以通过反相蒸发法，用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的类脂组合物来产生特别有用的脂质体。通过规定孔径大小的过滤材料挤出脂质体来产生具有期望直径的脂质体。可以如Martin等，J.Biol.Chem.， 257：286-288(1982)中描述的，通过二硫化物交换反应将本发明的抗体的Fab′片段结合到脂质体上。选择性地将化学治疗剂(例如阿霉素)包含在脂质体内。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst. 81(19)：1484(1989)。
(10)其它抗体修饰
在此对抗体的其它修饰是预期的。例如，抗体可以与各种非蛋白的多聚体连接，非蛋白多聚体例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。也可以将抗体包裹在处于胶体药物给药系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳粒子和毫微囊剂)或大乳剂中的微囊中，所述微囊通过，例如，凝聚技术或界面聚合作用(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊，和聚-(甲基丙烯酸甲脂)微囊)来制备。在Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，20th Ed.，Alfonso Gennaro，Ed.，PhiladelphiaCollege of Pharmacy and Science 2000)中公开了这种技术和适合的制剂。
C.冻干制剂
此处描述的制剂也可以被制备为重构的冻干制剂。冻干此处描述的蛋白或抗体，然后重构以产生本发明的降低了粘度的稳定的液体制剂。在这个特定的实施方式中，在如上所述制备了感兴趣的蛋白之后，生产“预冻干制剂”。存在于所述预冻干制剂中的蛋白的量考虑到期望的剂量、施用的方式等来确定。例如，完整抗体的起始浓度可以从约2mg/ml到约50mg/ml，优选的从约5mg/ml到约40mg/ml和最优选的约20-30mg/ml。
(1)冻干制剂的制备
需配制的蛋白一般存在于溶液中。例如，在本发明的增加了离子强度降低了粘度的制剂中，蛋白可以存在于pH值约4-8，优选的约5-7的pH缓冲溶液中。取决于，例如，缓冲液和期望的制剂张力(例如重构的制剂的张力)，缓冲液浓度可以从约1mM到约20mM，做为选择从约3mM到约15mM。举例性的缓冲液和/或盐是那些药学上可接受的、并可以从适合的酸、碱和它们的盐产生的缓冲液或盐，例如那些用“药学上可接受的”定义的酸、碱或缓冲液。
在一个实施方式中，向预冻干制剂中添加溶解保护剂。在预冻干制剂中溶解保护剂的量一般地要使得在重构时产生的制剂是等渗的。然而，高渗的重构制剂也可能是适合的。此外，溶解保护剂的量不能太低，以致在冻干时发生无法接受量的蛋白质降解/聚集。然而，在预冻干制剂中举例性的溶解保护剂浓度是从约10mM到约400mM，做为选择从约30mM到约300mM，做为选择从约50mM到约100mM。举例性的溶解保护剂包括糖和糖醇，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇。然而，在特定的环境下，某些溶解保护剂也可增加制剂的粘度。同样地，应当小心地选择能最小化和中和这些影响的特定的溶解保护剂。在“溶解保护剂”的定义下，以上描述了额外的溶解保护剂，在此也称为“药学上可接受的糖”。
对于每个特定的蛋白或抗体与溶解保护剂的组合，蛋白与溶解保护剂的比例可以变化。对于抗体作为备选蛋白和糖(例如，蔗糖或海藻糖)作为溶解保护剂、用来产生高蛋白浓度的等渗重构制剂的情况，溶解保护剂对抗体的摩尔比例可以是从约100到约1500摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体，和优选的从约200到约1000摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体，例如从约200到约600摩尔溶解保护剂比1摩尔抗体。
在优选的实施方式中，向预冻干制剂(pre-lyophilized formulation)添加表面活性剂是可取的。做为选择，或此外，可以向冻干制剂和/或重构制剂中添加表面活性剂。举例性的表面活性剂包括非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或80)；polyoxamers(例如poloxamer 188)；Triton；辛基糖苷钠；十二烷基-、十四烷基-、亚麻油基(linoleyl)-、或硬脂酰-硫代甜菜碱(sulfobetaine)；十二烷基-、十四烷基-、亚麻油基-或硬脂酰-肌氨酸；亚麻油基-、十四烷基-、或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基(lauroamidopropyl)-、椰油酰胺丙基(cocamidopropyl)-、亚油酰胺丙基(linoleamidopropyl)-、肉豆蔻酰胺丙基(myristamidopropyl)-、棕榈酰胺丙基(palmidopropyl)-、或异硬脂酰胺丙基(isostearamidopropyl)-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油基牛磺酸钠(sodiummethyl cocoyl-taurate)或甲基油烯基牛磺酸二钠(disodium methyloleyl-taurate)；和MONAQUATM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，NewJersey)，聚乙二醇、聚丙二醇和乙烯和丙二醇的共聚物(例如Pluronics、PF68等等)。添加的表面活性剂的量使得其能降低重构蛋白的微粒形成，并最小化重构之后的微粒形成。例如，存在于预冻干制剂中的表面活性剂的量约0.001-0.5％，做为选择约0.005-0.05％。
可以在所述预冻干制剂的制备中使用溶解保护剂(例如蔗糖或海藻糖)和填充剂(bulking agent)(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物。填充剂可以容许产生没有过多空穴在其中的均匀的冻干块。其它药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂，例如那些在Remington′s Phannaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)中描述的，可以被包括在预冻干制剂(和/或冻干制剂和/或重构制剂)中，只要它们不会对制剂的期望特性有不利的影响。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在应用的剂量和浓度下对于接受者是无毒的，包括：另外的缓冲剂；防腐剂；辅助溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；螯合剂，例如EDTA；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；可生物降解的聚合物，例如聚酯；和/或成盐反离子，例如钠。
只要是对需医治的特定症状是必需的，此处的制剂也可包含超过一个蛋白，优选的包含那些具有不给另一种蛋白带来不利影响的互补活性的蛋白。例如，在单个制剂中提供与期望的靶点(例如，受体或抗原)结合的两种或更多种抗体是可取的。这样的蛋白以对预定目标有效的数量适当地存在于组合物中。
体内施用的制剂必须是无菌的。在冻干和重构之前，或在之后，这可以用过滤除菌膜来过滤很容易的实现。做为选择，例如，可以通过对除蛋白以外的成分，在约120℃高压灭菌30分钟来实现完整混合物的无菌化。
在蛋白、可选的溶解保护剂及其它可选的组分混合在一起之后，将制剂冻干。为此，许多不同的冷冻干燥器是可用的，例如Hull50TM(Hull，USA)或GT20TM(Leybold-Heraeus，Germany)冷冻干燥器。通过冷冻制剂，随后在适合于初次干燥的温度下从冷冻的内容物中将冰升华来实现冻干。在这个条件下，产品温度低于制剂的共熔点或坍缩温度(collapse temperature)。一般地，用于初次干燥的保存温度(shelf temperature)范围从约-30℃到25℃(假如初次干燥期间产物保持冷冻)，处于适当的压力下，范围一般从约50到250mTorr。制剂、容纳样品的容器的大小和类型(例如，玻璃小瓶)和液体的体积将主要决定干燥所需的时间，其可以在几小时到几天的范围内变动(例如，40-60小时)。任选地，取决于产品中期望的残留水分水平，也可以进行第二次干燥。进行第二次干燥的温度范围从约0到40℃，主要取决于容器的类型和大小以及使用的蛋白的种类。例如，在冻干的整个除水阶段中保存温度可以是约15-30℃(例如，约20℃)。第二次干燥所需的时间和压力是能产生适合的冻干块的时间和压力，取决于，例如温度及其它参数。第二次干燥时间由在产物中期望的残留水分水平来决定，一般地需要至少约5小时(例如，10-15小时)。压力可以是与初次干燥步骤期间使用的相同。取决于制剂和小瓶的大小，冻干条件可以变化。
2.冻干制剂的重构
在向病人施用之前，用药学上可接受的稀释剂重构冻干制剂，从而使在重构制剂中的蛋白浓度为至少约50mg/ml，例如约50mg/ml到约400mg/ml，做为选择约80mg/ml到约300mg/ml，做为选择约90mg/ml到约150mg/ml。当希望在皮下投递重构制剂时，在重构制剂中的这种高蛋白浓度被认为是特别有用的。然而，对于其它给药途径，例如静脉内施用，重构制剂中较低的蛋白浓度可能是所期望的(例如，在重构制剂中的蛋白为约5-50mg/ml，或约10-40mg/ml)。在某些实施方式中，重构制剂中的蛋白浓度比预冻干制剂中的浓度显著的高。例如，重构制剂中的蛋白浓度可以是预冻干制剂中的蛋白浓度的约2-40倍、做为选择3-10倍、做为选择3-6倍(例如至少三倍或至少四倍)。
尽管也可以自由地使用其它温度，一般地在约25℃发生重构以确保完全的水化。重构所需的时间取决于，例如，稀释剂的类型、赋形剂的数量和蛋白。举例性的稀释剂包括无菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水、Ringer溶液或葡萄糖溶液。稀释剂选择性地包含防腐剂。举例性的防腐剂已经在上文中描述了，芳香醇类例如苯甲醇或酚醇是优选的防腐剂。使用的防腐剂的数量通过评定不同的防腐剂浓度对蛋白的兼容性和防腐效率试验来确定。例如，如果防腐剂是芳香醇类(例如苯甲醇)，其数量可以是约0.1-2.0％和优选的约0.5-1.5％，但最优选的约1.0-1.2％。
优选的，重构制剂少于每瓶6000个粒子，粒子大小≥10μm。
D.液体制剂
通过将具有期望的纯度的活性成分与可选的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂混合，制备保存所用的治疗制剂(Remington′s PharmaceuticalSciences 18th edition，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.18042[1990])。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，包括缓冲液，抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂，等渗剂，稳定剂，金属复合物(例如Zn蛋白质复合物)；螯合剂例如EDTA和/或非离子型表面活性剂。
当治疗剂是抗体片段时，特异地与目标蛋白的结合区结合的最小的抑制片段是优选的。例如，根据抗体的可变区序列，抗体片段乃至肽分子可以被设计为保持了与目标蛋白序列结合的能力。这种肽可以化学合成和/或通过DNA重组技术生产(参见，例如，Marasco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  90：7889-7893[1993])。
使用缓冲液来将pH值控制在一定范围，该pH值能使疗效最优化，特别是稳定性依赖于pH值时。缓冲液优选的浓度范围从约50mM到约250mM。本发明使用的适合的缓冲剂包括有机的和无机的酸，和它们的盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、醋酸盐。另外，缓冲液可以由组氨酸和三甲胺盐组成，例如Tris。
添加防腐剂以抑制微生物生长，一般地范围为0.2％-1.0％(w/v)。本发明使用的适合的防腐剂包括，例如十八烷二甲基苯基氯化铵；氯化六烃季铵；苯甲烃铵卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)，氯化苄乙氧铵；硫柳汞，苯酚，丁基甲醇或苯甲醇；烃基对羟苯甲酸，例如甲基对羟苯甲酸或丙基对羟苯甲酸；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇，3-戊醇，和m-甲酚。.
含有张力剂(tonicity agent)，有时被称为“稳定剂”，来调整或维持组合物的液体张力。当使用大的、带电生物分子例如蛋白和抗体时，它们通常称为“稳定剂”，因为它们能与氨基酸侧链的带电基团作用，从而减少分子内和分子间相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对数量，张力剂可以以重量计在0.1％到25％之间，优选的1到5％之间的任何量存在。张力剂包括多羟基糖醇，优选的三羟基或更高级的糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。
另外的赋形剂包括可以充当一个或多个以下试剂的试剂：(1)填充剂，(2)溶解增强剂，(3)稳定剂和(4)抑制变性或对容器壁的附着的药剂。稳定剂的范围可以是从0.1到10,000重量份的活性蛋白或抗体。典型的稳定剂包括：多羟基糖醇(在上文中列举了)；氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、等等；有机糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏四糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、myoinisitose、myoinisitol、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，环己六醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水多聚体，例如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，例如棉子糖；和多聚糖例如糊精或葡聚糖。
含有非离子型表面活性剂或洗涤剂(也称为“润湿剂”)以帮助治疗剂溶解，以及保护治疗蛋白对抗搅动引起的聚集，其也容许制剂遭受剪切表面应力而不导致活性治疗蛋白或抗体的变性。非离子型表面活性剂的范围约0.05mg/ml到约1.0mg/ml，优选的约0.07mg/ml到约0.2mg/ml。
适合的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80，等等)，polyoxamers(184、188等)，Pluronicpolyols，Triton，聚氧化乙烯山梨聚糖单醚(polyoxyethylene sorbitan monoether)(Tween-20，Tween-80，等等)，lauromacrogol 400，聚氧40硬脂酸盐(酯)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(polyoxyethylene hydrogenated castor oil)10、50和60，单硬脂酸甘油酯，脂肪酸糖酯，甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子洗涤剂包括十二烷基硫酸钠，磺基丁二酸二辛基钠(dioctyle sodum sulfosuccinate)和二辛基磺酸钠(dioctyl sodium sulfonate)。阳离子洗涤剂包括氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)或氯化苄乙氧铵(benzethonium chloride)。
为了将制剂用于体内施用，它们必须是无菌的。可以用过滤除菌膜过滤来使制剂无菌化。此处的治疗组合物一般地被放入到具有无菌的进人孔的容器中，例如，静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。
施用途径是按照已知的和公认的方法，例如通过单个或多个大丸剂给药(bolus)，或以合适的方式在一段长时间内输注，例如，通过皮下的、静脉的、腹膜内的、肌肉内的、动脉内的、病灶内的或关节内的途径，局部施用，吸入或通过持续释放或延时释放的方法。
只要是对需医治的特定症状是必需的，此处的制剂也可包含超过一个活性化合物，优选的包含那些具有不会相互带来不利影响的互补活性的活性化合物。做为选择，或此外，所述组合物可包括细胞毒性药剂、细胞因子或生长抑制剂。这样的分子以对预定目标有效的数量适当地存在于组合物中。
也可以将活性成分包裹在处于胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳粒子和毫微囊剂)或大乳剂中的微囊中，所述微囊通过，例如，凝聚技术或界面聚合作用(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊，和聚-(甲基丙烯酸甲脂)微囊)来制备。在Remington′s PharmaceuticalSciences 18th edition，同上，中公开了这种技术。
可以制备持续释放制备物。持续释放制备物的适合的实例包括，包含抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质处于有形物的形式，例如薄膜，或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸)，或聚(乙烯基乙醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。已经用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2和MN rpg 120成功地进行了用于持续释放的重组蛋白微囊化。Johnson等，Nat.Med. 2：795-799(1996)；Yasuda等，Biomed.Ther. 27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology  8：755-758(1990)；Cleland，″Design and Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems，″in Vaccine Design：The Subunit andAdjuvant Approach，Powell和Newman，eds.，(Plenum Press：New York，1995)，pp.439-462；WO 97/03692；WO 96/40072；WO 96/07399；and美国专利No.5,654,010.
这些蛋白的持续释放制剂可以利用聚乳酸-羟基乙酸(polylactic-coglycolic acid)(PLGA)聚合物来开发，因为PLGA具有生物适应性和广泛的生物可降解性质。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可以很快地从人体中清除。此外，取决于其分子量和组成，这个聚合物的降解性可以从数月到数年间调整。Lewis，″Controlled release of bioactive agents fromlactide/glycolide polymer″，in Biodegradable Polymers as Drug DeliverySystems(Marcel Dekker；New York，1990)，M.Chasin and R.Langer(Eds.)pp.1-41。
聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸允许释放分子超过100天，某些水凝胶在较短的时期内释放蛋白。当封装的抗体在体内保持很长时间时，作为暴露在37℃的潮湿环境的结果，它们可能变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能在免疫原性方面产生变化。取决于其中包含的机制，为了稳定性可以设计出合理的策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形成，可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、利用适当的添加剂、和开发特别的聚合物基质组合物来实现稳定。
脂质体或类蛋白组合物也可被用于配制此处公开的蛋白或抗体。参见美国专利No.4,925,673和5,013,556。
此处描述的蛋白和抗体的稳定性可以通过使用无毒的“水溶性多价金属盐”来增强。实例包括Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Sn2+、Sn4+、Al2+、和Al3+。可以与上述多价金属阳离子形成水溶性的盐类的阴离子的实例包括那些由无机酸和/或有机酸形成的阴离子。这种水溶盐在水中的溶解度(20℃)至少约20mg/ml，做为选择至少约100mg/ml，做为选择至少约200mg/ml。
可用于形成所述“水溶性多价金属盐”的适合的无机酸包括盐酸、乙酸、硫磺酸、硝酸、硫氰酸和磷酸。可以使用的适合的有机酸包括脂肪族羧酸和芳香酸。在这个定义下的脂肪族酸可被定义为饱和的或不饱和的C2-9羧酸(例如，脂肪族的单、二和三羧酸)。例如，在这个定义下举例性的一元羧酸包括饱和的C2-9一元羧酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、capryonic酸，和不饱和的C2-9一元羧酸，丙烯酸、propriolic甲基丙烯酸、巴豆酸和异巴豆酸。举例性的二羧酸包括饱和的C2-9二羧酸，丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸和庚二酸，而不饱和C2-9二羧酸包括顺丁烯二酸、反丁烯二酸、柠康酸和甲基延胡索酸。举例性的三羧酸包括饱和的C2-9三羧酸，丙三羧酸和1，2，3-丁烷三羧酸。另外，这个定义的羧酸类还包含一个或两个羟基形成羟基羧酸。举例性的羟基羧酸类包括乙二醇酸、乳酸、甘油酸、羟基戊二酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸。这个定义下的芳香酸包括苯甲酸和水杨酸。
通常使用的能用来帮助稳定本发明的封装的多肽的水溶性多价金属盐包括，例如：(1)卤族的无机酸金属盐(例如，氯化锌、氯化钙)、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫氰酸盐；(2)脂肪族羧酸金属盐(例如，乙酸钙、醋酸锌、calcium proprionate、羟乙酸锌、乳酸钙、乳酸锌和酒石酸锌)；和(3)芳香族羧酸金属盐，苯甲酸盐(例如，苯甲酸锌)和水杨酸盐。
E.医冶方法
为了预防或医冶疾病，活性药剂的合适剂量将取决于需医治的如上文定义的疾病类型、疾病的严重度和进程、施用药剂是为了预防目的还是治疗目的、先前的治疗、病人的病史和对药剂的反应，和主治医师的判断。一次性或在医治的系列过程中将药剂适当地施用给病人。
优选的医冶方法是医治IgE介导的疾病。IgE介导的疾病包括特应性疾病(atopic disorder)，其特征在于对许多普通的自然发生吸入和摄取的抗原产生免疫应答、和持续不断的产生IgE抗体的这样一种遗传的倾向。特定的特应性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎和过敏性胃肠病。特应性病人常常具有多发的过敏，意思是他们有针对许多环境过敏原，包括花粉、真菌(例如，霉菌)、动物和昆虫碎屑和某些食物的IgE抗体，和由之产生的症状。
然而与增加的IgE水平有关的疾病并不局限于那些具有遗传的(特应性)病因的疾病。看来是IgE介导的、并可以用本发明的制剂医治的、与增加的IgE水平有关的其它疾病包括，超敏反应(例如，过敏性超敏反应)、湿疹、荨麻疹、过敏性支气管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis)、寄生虫病、间质性膀胱炎(interstitial cystitis)、高IgE综合征、共济失调性毛细血管扩张症(ataxia-telangiectasia)、Wiskott-Aldrich综合征、胸腺淋巴发育不全(thymic alymphoplasia)、IgE骨髓瘤和移植物抗宿主反应。
过敏性鼻炎，也称为过敏性鼻结膜炎或枯草热，是对吸入的过敏原的特应性反应的最常见的表现形式，其严重程度和持续时间常常与暴露于过敏原的强度和时间有关。这是一种慢性病，可以在任何年龄首次出现，但通常在儿童期或青春期发作。典型的发作包括大量的水样鼻溢液，阵发性的喷嚏、鼻塞和鼻、腭瘁、。鼻后的粘液引流还导致咽喉炎、throat clearing和咳嗽。也可以有过敏性睑缘结膜炎的症状，伴有结膜和眼睑的强烈搔痒、发红、流泪和畏光。严重的发作常常伴有全身性的不适、虚弱、疲劳，和有时候在剧烈的喷嚏期间伴有肌肉疼痛。
哮喘，也称为可逆的阻塞性气道疾病，特征在于气管支气管树对呼吸刺激物和支气管收缩化学物质的超反应性，产生喘气、呼吸困难、胸闷和咳嗽的发作，这种发作是自然可逆的、或由医治而可逆的。这是涉及整个气道的慢性病，严重程度从偶然的轻微瞬时反应到严重的、慢性的、危急生命的支气管阻塞。哮喘和特应性反应(atopy)可以共存，但仅约一半的哮喘患者也是特应性的，更小比例的特应性反应的病人同时具有哮喘。然而，特应性和哮喘不是完全独立的，因为哮喘在特应性的个体中比在无特应性的个体中发生得更频繁，特别是在儿童期。哮喘在历史上已经被进一步分解为两个亚群，外因性哮喘和内因性哮喘。
外因性哮喘，也称为过敏性、特应性、或免疫性哮喘，是对那些一般在年轻时、通常在幼儿期或儿童期出现哮喘的病人的描述。常常同时产生特应性反应的其它表现形式，包括湿疹或过敏性鼻炎。在花粉季节、存在动物时、或暴露于室内尘埃、羽毛枕或其它过敏原中时，可以发生哮喘发作。皮肤试验显示出对病因过敏原的阳性疹块和红斑反应。令人感兴趣的是，总血清IgE浓度经常增加，但有时是正常的。
内因性哮喘，也称为非过敏性或特发性哮喘(idiopathic asthma)，一般地在成年期首次发生，之后有明显的呼吸道感染。症状包括与花粉季节或与暴露于其它过敏原无关的慢性的或复发性的支气管阻塞。对常见的特应性过敏原皮肤试验是阴性的，血清IgE浓度正常。额外的症状包括痰血和嗜曙红细胞增多。将哮喘分类为亚群的其它的方案，象阿斯匹林敏感的、运动诱导的、传染性的和不过是心理上的，定义了与其它人相比对某些病人影响更大的外触发因子。
最后，重点要注意的是，虽然一些分类方法以前仅将过敏性哮喘与IgE依赖性联系起来，但现在有有力的统计学上显著的数据显示了IgE和哮喘(过敏性的和非过敏性的)之间的相关性。Chapter 27，“The Atopic Diseases”，A.I.Terr in Medical Immunology，9th Ed.，Simon and Schuster，Stites等，Ed.(1997)。因此，术语“IgE介导的疾病”对于本申请而言，包括过敏性的和非过敏性的哮喘。
哮喘发作的体征包括呼吸急促、可听到的喘气声、和辅助呼吸肌的使用。一般也存在快速的脉搏和升高的血压，也有外周血中嗜曙红细胞水平升高和鼻分泌物增多。肺机能显示出在肺通量和第1秒用力呼气量方面的下降。总肺活量和功能性残气量一般是正常的或稍有增加，但在极度的支气管痉挛时会减少。
哮喘的病状可以被区分为早期阶段和晚期阶段反应。早期阶段的特点在于平滑肌收缩、浮肿和分泌过多，而晚期反应的特点在于细胞炎症。哮喘可以被各种非特定的触发物诱导，包括感染(例如，病毒性呼吸道感染)、生理因素(例如，运动、换气过度、深呼吸、心理因素)、大气的因素(例如，二氧化硫、氨、冷空气、臭氧、蒸馏水蒸汽)，食入物(例如，普萘洛尔(propranolol)、阿斯匹林、非甾类抗炎药物)、试验性吸入物(例如，高渗溶液、柠檬酸、组胺、乙酰甲胆碱、前列腺素F2α)和职业性的吸入物(例如，isocyantes)。引起过敏性哮喘的各种其它职业性或环境过敏原包括，动物产品、昆虫尘屑、海洋生物、植物产品、水果、种子、叶子和花粉、有机染料和墨水、微生物药剂、酶、治疗剂、杀菌剂、无机的和有机的化学药品。
特应性皮炎，也称为湿疹、神经性皮肤炎、特应性湿疹或Besnier′s痒疹，是常见的皮肤疾病，是具有家族性和特应性免疫学特征的病人群体特有的。基本特征是瘙瘁的皮肤炎症性反应，其诱导了偏爱某些部位的特征性对称分布的皮疹。B淋巴细胞过量产生IgE也是常见的。虽然特应性皮炎由于其与过敏性鼻炎和哮喘和高IgE水平的相关性被分类为特异反应的皮肤表现形式，然而，皮炎的严重程度不一定与皮肤试验上暴露于过敏原相关，脱敏疗法不能有效的治疗(不同于其它过敏性疾病)。虽然高量血清IgE是诊断过敏性哮喘的确证，但正常的水平不能排除其可能性。疾病的发作可以发生在任何年龄，病变急性地开始，具有红斑状的水肿丘疹或带鳞屑的斑块。搔痒导致渗液和结痂，然后导致慢性的苔癣样硬化。在细胞水平上，急性病变是水肿性的，真皮被单核细胞、CD4淋巴细胞浸润。嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、浆细胞和嗜碱性细胞很少，但是存在脱粒化的肥大细胞。慢性病变的特征是表皮增生、皮肤角化过度和角化不全，真皮被单核细胞、郎格汉斯细胞和肥大细胞浸润。也可以有病灶区域的纤维化，包括累及小神经的神经束膜。
过敏性胃肠病也称为嗜酸性胃肠病(eosinophilic gastroenteropathy)，是少见的特应性表现形式，其中多种IgE食物敏感性与局部的胃肠道粘膜反应相关。在成年人中是少见的，但是更常见的，但为瞬时性的，在婴儿中存在。当摄取的食物过敏原与空肠粘膜上的局部IgE抗体反应释放肥大细胞调节物时产生这种情况，导致进餐后不久的消化系统症状。持续性暴露产生的慢性炎症，导致胃肠蛋白丧失和低蛋白性水肿。可以有足够明显的经由发炎的肠粘膜的失血从而导致缺铁性贫血。在暴露于过敏原之后在上部胃肠道粘膜局部地发生过敏反应，但可以通过避开过敏原而解除。
过敏反应和荨麻疹明显的是IgE介导的，但是没有遗传决定性，对于特应性的个体没有偏爱。过敏反应是急性的、同时涉及几个器官系统的全身性过敏反应，涉及的器官系统通常为心血管系统、呼吸系统、皮肤系统和胃肠系统。所述反应是免疫介导的，当暴露于患者先前已被其致敏的过敏原时发生反应。荨麻疹和血管性水肿是指物理的肿胀、红斑和搔痒，由表皮血管上的受组胺刺激的受体引起，是全身过敏的标志性皮肤特征。全身过敏是由药物、昆虫毒液或食物引起的同时在多个器官中发生的IgE介导的反应。其是由过敏原诱导的、负载在肥大细胞上的IgE突然引起，导致在各种重要器官的功能方面影响深远的和危急生命的变化。几乎同时地发生血管坍缩(collapse)、急性气道阻塞、皮肤血管舒张和水肿、和胃肠的和泌尿生殖器的肌肉痉挛，尽管不一定达到相同的程度。
过敏反应的病状包括血管性水肿和肺过度膨胀，具有气道的粘液栓和局限性肺膨胀不全。在细胞水平上，肺部与急性哮喘发作期间的表现类似，出现支气管粘膜下腺分泌过多、粘膜和粘膜下层水肿、支气管周的血管充血和支气管壁中的嗜曙红细胞增多。可能存在肺水肿和出血。也可能存在支气管肌肉痉挛、过度膨胀、甚至肺泡破裂。人过敏反应的重要的特征包括水肿、血管充血，和喉、气管、会厌和舌的固有层中嗜曙红细胞增多。
暴露于过敏原可以是经由摄食、注射、吸入或与皮肤或粘膜的接触。在暴露于过敏原后数秒或数分钟内开始反应。可能存在最初的濒死恐惧或感觉，随后很快出现一个或多个靶器官系统中的症状，靶器官系统是：心血管系统、呼吸系统、皮肤系统和胃肠系统。
导致过敏反应的过敏原与那些通常和特应性相关的过敏原不同。食物、药物、昆虫毒液或胶乳(latex)是常见的来源。食物过敏原包括那些在甲壳动物、软体动物(例如，龙虾、虾、蟹)、鱼、豆类(legume)(例如，花生、豌豆、蚕豆、甘草)、种子(例如，芝麻、棉籽、葛缕子、介子、亚麻子、葵花子)、坚果、浆果、蛋白、荞麦和牛奶中的过敏原。药物过敏原包括那些在异源蛋白质和多肽、多聚糖和半抗原药物中存在的过敏原。昆虫过敏原包括膜翅目昆虫，包括蜜蜂、小黄蜂、大黄蜂、胡蜂和火蚁。
肾上腺素是用于过敏反应的典型的医冶手段，对于不太严重的荨麻疹或血管性水肿反应一般开出抗组胺剂或其它组胺阻断剂的处方。
F.组合治疗
可以将本发明的方法与已知的医治IgE介导的疾病的方法组合，既可以作为组合的或附加的医治步骤，也可以作为治疗制剂的额外组分。
例如，可以在本发明的抗IgE抗体之前，或与之成比例地施用抗组胺剂，特别是非镇静性抗组胺剂。适合的抗组胺剂包括属于烷基胺(例如，氯芬胺)、乙醇胺(例如，苯海拉明)和吩噻嗪(例如，普鲁米近)的那些抗组胺剂。许多抗组胺剂通过阻断效应细胞上的组胺受体位点来对拮抗组胺的药理学效应，其它常见的抗组胺剂通过阻断组胺从肥大细胞释放来起作用，所述肥大细胞已经被过敏原-特异性的IgE致敏或装备(例如，色甘酸钠)。抗组胺剂的实例包括阿司咪唑、马来酸哌吡庚啶、马来酸bropheniramine、马来酸氯苯吡醇胺、盐酸西替利嗪、延胡索酸氯马斯汀、盐酸二苯环庚啶、马来酸右溴苯那敏、马来酸右旋氯苯吡胺、氯茶碱苯海拉明、盐酸苯海拉明、琥珀酸杜克西拉明、盐酸fexofendadine、盐酸terphenadine、盐酸羟嗪、loratidine、盐酸敏克静、柠檬酸曲吡那敏、盐酸曲吡那敏、盐酸丙吡咯啶。
IgE介导的疾病(例如，早期阶段反应)的特定症状可以用拟交感神经药或具有支气管舒张效应的药物来改善。肾上腺素是有广泛作用的阿尔法和贝塔肾上腺素能药物，常常以0.2-0.5mL的1∶100水溶液皮下施用。当期望有更长持续时间的影响时，也可以以1∶200悬浮液使用肾上腺素的长久作用形式(例如，间羟叔丁肾上腺素)。适合的其它贝塔肾上腺素能药物包括鼻部施用(例如，手持喷雾器、间歇性正压呼吸装置或计量加压吸入器)或口服的舒喘宁、吡布特罗、间羟异丙肾上腺、salmeterol、新异丙肾上腺素和formoterol。
也可以通过施用黄嘌呤来实现支气管扩张，特别是通过与上述拟交感神经药物共同施用来实现。黄嘌呤的实例包括氨茶碱(静脉注射，250-500mg)和茶碱(口服，10-20μg/ml血清浓度)。
其它来自各种IgE介导的疾病(例如，晚期阶段反应)的症状可以通过用糖皮质激素或其它具有抗炎效果的药物的治疗来减弱。对于严重的发作全身地施用脱氢可的松(30-60mg每天)，而对于长期的维持治疗，以气雾剂形式施用二丙酸氯地米、氟羟脱氢皮质醇丙酮化物和氟尼缩松。具有抗炎效应的其它类固醇包括：倍他米松、布地缩松、地塞米松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氢化可的松、甲基强的松龙、氢化泼尼松、脱氢可的松、氟羟脱氢皮质醇。
也可用于与本发明的治疗方法相联合的非甾族抗炎药物包括醋氨酚、乙酰水杨酸、溴芬酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠、二氟苯水杨酸、etodolac、苯氧基氢化阿托酸钙、氟比洛芬、布洛芬、吲哚氯甲酰、酮洛芬、甲氯胺苯酸钠、甲灭酸、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、羟保泰松、phenylbutzone、吡罗昔康、舒林酸、甲苯酰吡酸钠。
此外，也可以施用减充血剂(例如，苯肾上腺素、苯丙醇胺、pseudoephadrin)、咳嗽抑制剂(例如，美沙芬、可待因或氢可酮)或镇痛药(例如，醋氨酚、阿斯匹林)来实现治疗效益的最大化。
过敏原脱敏感作用是一种治疗形式，其中将过敏原注入到病人体内来达到降低或消除过敏反应的目的。这也称为过敏原免疫疗法、脱敏作用或过敏症注射治疗。通常与其它过敏症治疗方法组合使用，但常不会作为主要医治方法。其已经成功地应用在不可能回避过敏原的情况。典型的过敏原脱敏治疗包括以不断增加的剂量每周一次或两次皮下注射无菌过敏原，直到能够在注射部位生产瞬时的微小局部炎症的剂量为止。然后按照维持时间表每2-4周给予这个剂量。过敏性脱敏感作用最常用于过敏性哮喘和过敏性鼻炎的医治，尽管其在医治过敏反应中也已经获得了成功。通过使用佐剂也有效地进行了脱敏感作用，佐剂例如弗氏不完全佐剂，其是一种在矿物油中含水性抗原的乳剂。其生理效应产生了一种不溶解的液体保存库，从其中可以逐渐地释放过敏原的微滴。过敏原脱敏感作用的另一个形式是将单体的过敏原与戊二醛聚合以产生相对低的过敏原性(例如，导致过敏反应)的分子，而保持免疫原性的有效水平。
G.药物剂量：
本发明的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可取决于预想的特定用途而变化。确定合适剂量或给药途径完全在普通技术人员的能力范围内。动物试验为确定用于人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以根据Mordenti，J.和Chappell，W.″The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics，″In Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等，Eds，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-46中提出的原则进行有效剂量的种间换算。
当进行此处描述的多肽或抗体的体内施用时，正常的剂量数取决于给药途径可以从每天约10ng/kg直到约100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选的约1mg/kg/天到10mg/kg/天。已经在文献中提供了对给药的特别剂量和方法的指导，参见，例如美国专利No.4,657,760；5,206,344或5,225,212。包含在本发明的范围之内的是，不同的制剂对于不同的医冶和不同的疾病是有效的，以及意图医治特定器官或组织的施用可能必需以不同于医治另一个器官或组织的方式来给药。此外，可以通过一次或多次独立的的施用，或通过连续的输注来按剂量给药。对于持续几天或更长时间的重复施用，取决于其条件，持续进行医冶直到产生期望的对疾病症状的抑制。然而，其它给药方案也是有用的。可以通过传统的技术和分析来容易地监测治疗的进展。
H.制剂的施用
本发明的制剂，包括但不限于重构制剂，根据已知的方法，例如以大丸剂形式(bolus)静脉施用，或通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊髓内的、皮下的、关节内的、滑液内的、鞘膜内的、口服的、局部的或吸入的途径，在一段时间内的连续输注，来向需要用蛋白医治的哺乳动物施用，所述哺乳动物优选的是人。
在优选的实施方式中，通过皮下施用(例如，在皮肤之下)将所述制剂施予哺乳动物。为此，可以利用注射器注射所述制剂。然而，用于施用所述制剂的其它装置是可用的，例如注入装置(例如，Inject-easeTM和GenjectTM装置)；注射笔(例如GenPenTM)；自动注射装置、无针的装置(例如，MediJectorTM和BioJectorTM)和皮下小片给药系统(subcutaneous patch delivery systems)。
在特定的实施方式中，本发明涉及用于单剂量给药单位的试剂盒。这种试剂盒包括治疗蛋白或抗体的水性制剂的容器，包括单腔的或多腔的预填充注射器。举例性的预填充注射器可从Vetter GmbH，Ravensburg，Germany获得。
所述蛋白的合适剂量(“治疗有效量”)将取决于，例如，需医治病情、病情的严重度和进程、施用蛋白是为了预防目的还是治疗目的、先前的治疗、病人的病史和对蛋白的反应，使用的蛋白种类、和主治医师的判断。一次性或在一系列医冶过程中向病人施用蛋白，也可自诊断后任何时候向病人施用。所述蛋白可以作为唯一的医冶方法来施用，或与在医治当前病情中有用的其它药物或治疗方法组合施用。
备选的蛋白是抗体，约0.1-20mg/kg是向病人施用的最初候选剂量，例如，不论是一次还是多次的独立施用。然而，其它给药方案也是有用的。可以通过传统的技术来容易地监测治疗的进展。
抗IgE制剂(例如，rhuMAbE-25、rhMAbE-26、Hu-901)的用途包括医治或预防例如IgE介导的过敏性疾病、寄生虫感染、间质性膀胱炎(interstitialcystitis)和哮喘。取决于需医治的疾病或病症，向病人施用治疗有效量(例如，约1-15mg/kg)的抗IgE抗体。
I.制品
在本发明的另一个实施方式中，提供包含所述制剂的制品，优选提供它的使用说明。所述制品包括容器。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶(例如，双腔小瓶)、注射器(例如，单腔或双腔注射器)和试管。所述容器可以由各种材料例如玻璃或塑料制成。装有所述制剂的容器和位于容器上，或与之关联的标签，可以标明重构和/或使用的指示。标签可进一步说明所述制剂对皮下施用有用或是供皮下施用的。带有所述制剂的容器可以是多次使用的小瓶，其容许重复施用(例如，2-6次施用)重构制剂。所述制品可进一步包括包含适合的稀释剂(例如，BWFI)的第二容器。在混合所述稀释剂和冻干制剂时，在重构制剂中的最终蛋白浓度一般地是至少50mg/ml。所述制品可进一步包括从商业和用户立场出发的其它所需的材料，包括其它的缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和带使用说明的包装插页。
通过参考以下实施例将能更充分地理解本发明。然而，这些实施例不能被看作是对本发明的范围的限制。在此引用的所有内容全文纳入本文作参考。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含此处描述的制剂用于在自动注射器装置中施用的制品。自动注射器可被描述为一种在启动时无需病人或施用者的额外的必要动作而投送其内容物的注射装置。当给药速率必需恒定和给药时间比较长时，它们特别适合于治疗制剂的自我药疗。
实施例1
抗IgE rhuMAbE25(“E25”)制剂的制备
从E25散装物(bulk residual)Lot K9094A(40mg/ml rhuMAb E25，85mM海藻糖，5mM组氨酸，pH6，0.01％吐温20)或rhuMAbE25Q-Pool(5mg/mlrhuMAb E25，25mM Tris，200mM NaCl)制备单克隆抗IgE抗体rhuMAbE25的制剂。
通过利用Slide-A-Lyzer透析盒(Pierce)在2-8℃透析到不同的缓冲液(20mM His-HCl和200mM Arg-HCl，pH6.0)中来制备rhuMAbE25的水溶液。然后将样品转移到Centricon-30离心微型浓缩器(Amicon)的样品储存器中。通过在4000-5000g旋转Centricon-3浓缩器浓缩所述蛋白，直到达到期望的蛋白浓度。
然后利用超滤作用将样品浓缩到～150mg/ml rhuMAb E25。向每个制备物添加吐温20到0.02％的终浓度。过滤所有制剂，在Class 100房间中无菌地填入3cc FormaVitrum小瓶中，用13-mM Diakyo塞子塞住。
实施例2
方法和材料：
稳定性研究：在Class 100无菌灌装房间内将所有制剂1ml填入3ccFormaVitrum玻璃小瓶中，用13-mm Diakyo塞子塞住。将小瓶置于-70℃、2-8℃、15℃和30℃的不透光容器中。
搅动研究：将每个制剂的等分量置于玻璃小瓶中。在Glas-Col Bench Top摇动器上在室温水平地搅动小瓶。将摇动器设定为70，具有30cm臂长(最大的)。在搅动以后，根据以下方案检查和分析样品。
冻融研究：使E25的样品经历三个冻融循环。每个循环包括在-70℃冷冻过夜，和随后在室温解冻约一小时。在每个循环之后，利用光箱(light box)视觉上检查样品以评定液体的颜色和透明度。遵循如下所述的方案测量混浊度和可溶解的聚集体。
分析方法：通过表1中列出的方法分析样品稳定性
                        表1：分析方法
  分析  目的
  颜色、透明度、外观a  对液体制剂的可视检查
  大小排阻层析(SEC)b  测量单体、可溶性聚集体(aggregate)和低分子量组分的百分率
  疏水性相互作用层析(HIC)c  测量Asp-32的异构化和游离硫醇的水平
  UV Spec Scan(Gravimetric)f  测量蛋白浓度
  混浊度(平均OD 340-360nm)d  测量可溶的和不可溶的聚集体
  活性e  确定抗IgE的结合活性
a 颜色、外观和透明度的检查：
相对于检查用的白色和黑色背景视觉上评定样品的颜色、外观和透明度，与等体积的阴性对照相对比。应对样品小心地打旋以确保同质的混合，但不应太大力以致产生气泡。
b 大小排阻层析：
将TSK SUPER SW3000(4.6×300mm)柱用于HP 1100层析系统中。柱用20μg蛋白质上样，在0.1M磷酸钾中洗脱，pH6.8。用UV检测器在280nm检测样品。
c 疏水性相互作用层析(HIC)：
利用TSK Phenyl-5PW(7.5×75mm)柱(TosoHaas)在HP 1100液相色谱系统上进行HIC实验。柱用28μg木瓜蛋白酶消化的Fab片段上样，用20mMTris缓冲液中的硫酸铵浓度梯度从2M到0M洗脱。通过UV检测器在210nm监视波峰。
d 混浊度：
在1cm通光长度的比色杯中利用HP分光光度计确定样品的混浊度。按照340-360nm的平均吸光率计算混浊度。
e抗IgE单克隆抗体的活性通过受体结合抑制分析来确定。在包含磷酸缓冲液、0.5％BSA、0.05％聚山梨醇酯20、0.01％Thimerosol的分析稀释剂中将样品稀释到100和1.56μg/ml的标准曲线范围内。用IgE受体包被微量滴定板，然后用IgE-生物素和稀释的抗IgE样品温育。利用链霉抗生物素蛋白-HRP测定与抗IgE单克隆抗体的活性相关的、与受体结合的IgE-生物素的量。利用4参数逻辑曲线拟合程序分析数据。
f在Hewlett Packard 8453双列分光光度计上用1cm石英比色杯得到抗体的浓度。用1.5cm-1(mg/ml)-1的吸光率计算浓度。
                             液体制剂的概要
  制剂   蛋白范围   缓冲液/范围   赋形剂/范围
  80mg/ml E2550mM组氨酸-HCl150mM海藻糖0.05％聚山梨醇酯20pH6.0   40-150mg/ml   His-HCl或His-醋酸盐范围：10mM-100mM   海藻糖或蔗糖糖范围：20mM-350mM聚山梨醇酯：0.01％-0.1％
  150mg/ml E2520mM组氨酸-HCl200mM ArgHCl0.02％聚山梨醇酯20pH6.0   40-260mg/ml   His-HCl或His-醋酸盐范围：10mM-100mM   ArgHCl范围：50mM-200mM聚山梨醇酯：0.01％-0.1％
150mg/ml E25在组氨酸和ArgHCl制剂中的稳定性数据
  温度(℃)   时间(月)   视觉检查   pH   SECa单体％   HICb％Main   效力c   混浊度d
5   01316   通过通过通过通过   6.26.06.06.0   99.099.299.398.9   64636362   10610011183   0.250.270.250.27
30   1316   通过通过通过   5.96.16.0   98.4397.5390.63   544219   916528   0.250.300.54
80mg/ml E25在组氨酸和海藻糖制剂中的稳定性数据
  温度(℃)   时间(月)   视觉检查   pH   SECa单体％   HICb主要成分％   效力c   混浊度d
5   01361424   通过通过通过通过通过通过   5.75.85.75.75.75.7   99.198.798.899.199.098.8   646363636262   10092124978384   0.200.200.200.210.210.20
30   13614   通过通过通过通过   5.85.75.85.7   98.797.495.593.1   55413122   77764830   0.200.290.380.48
a.测量可溶性的聚集体和片段的大小排阻层析
b.对木瓜蛋白酶消化的E25的疏水性相互作用层析
c.IgE受体结合抑制分析
d.平均OD值(340-360nm)
搅动研究：
               达到                  摇动3天后
  制剂   视觉检查  SEC(单体％)   混浊度   视觉检查   SEC(单体％)   混浊度
  12   通过       99.5           0.18通过       99.0           0.19   通过          99.3            0.18通过          99.4            0.19
制剂1：156mg/ml E25、200mMArgCl、23mM His、0.02％T20
制剂2：150mg/ml E25、182mMArgCl、20mM His、0.02％T20
冻融研究：
            达到           第1个循环后            第3个循环后
制剂   视觉检查   SEC(单体％) 混浊度   视觉检查   SEC(单体％) 混浊度   视觉检查   SEC(单体％) 混浊度
  12   通过     99.5       0.18通过     99.0       0.19   通过     99.3       0.17通过     99.2       0.19   通过通过   99.499.2   0.170.18
制剂1：156mg/ml E25、200mMArgCl、23mM His、0.02％T20
制剂2：150mg/ml E25、182mMArgCl、20mM His、0.02％T20
实施例3
在20mM缓冲液中制备抗IgE单克隆抗体(E26)液体制剂的样品，然后保存在30℃和40℃。E26的稳定性通过层析和活性测量来确定。用大小排阻层析测定可溶性的聚集体，用对胃蛋白酶消化的样品进行疏水性相互作用层析测量异构化。利用IgE受体结合抑制分析监视样品的活性。如图1、2和3所示，E26的降解高度依赖于缓冲液的pH值。E26在pH6.0左右显得最稳定。
实施例4
微粒制剂是制造高浓度液体制剂的主要挑战，因为在应力状态下它通常随着蛋白浓度的增加而增加。图4显示了对浓缩的E26液体制剂的搅动研究的结果。在20mM琥珀酸盐、192mM海藻糖，pH6.0，和不同浓度的聚山梨醇酯20中制备制剂。用浑浊度测定监视微粒制剂。结果显示随着搅动时间E26溶液的混浊度增加。在应力状态下添加至少0.01％的聚山梨醇酯对于降低微粒形成是必不可少的。对于浓缩的E25液体制剂也观察到了类似的结果。
实施例5
图5显示了通过重构冻干的E25来制备的150mg/ml E25的液体制剂。盐浓度的增加抑制了可逆的微粒形成并导致混浊度读数的降低。在所有测试的盐之中，含有Arg-HCl的制剂看来具有最小的混浊度。对于用TFF方法制备的E25也观察到了盐浓度对于降低混浊度读数的效果。
实施例6
存在ArgHCl的E25液体制剂看来也比其它液体制剂有更好的稳定性。图6和7显示了在包含ArgHCl、CaCl2和MgCl2的液体制剂中150mg/ml的E25的稳定性研究结果。对于包含ArgHCl、有或者没有蔗糖的液体制剂，就混浊度、异构化和片段化而言在它们的稳定性方面有少许的差异。包含ArgHCl的液体制剂比包含MgCl2和CaCl2的液体制剂更稳定。
实施例7
图8显示了对含有醋酸盐的E25液体制剂和组氨酸制剂的稳定性研究的结果。含有组氨酸的制剂比醋酸盐制剂有更高的pH值。结果清楚地表明在组氨酸、ArgHCl液体制剂中E25比在其它条件下更稳定。
实施例8
在存在某些离子，例如柠檬酸盐、琥珀酸盐和硫酸盐(表1)，特别是在2-8℃的贮存温度的情况下高浓度的E25可以形成固体凝胶。利用精氨酸-HCl作为赋形剂允许我们配制E25达到超过200mg/ml而不形成凝胶或沉淀。
表1：各种赋形剂对125mg/ml，pH～6.0的E25凝胶化的影响
赋形剂   赋形剂浓度MM 制品   混浊度(340-360nm)   抗体浓度mg/ml   视觉外观
  SWFINaCl琥珀酸盐琥珀酸盐柠檬酸盐柠檬酸盐Na2SO4Na2SO4磷酸盐醋酸盐醋酸盐醋酸盐组氨酸组氨酸精氨酸-HCl精氨酸-HCl精氨酸-SO4CaCl2MgCl2 188941918819待定待定待定18894199447150200150125125   Lyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconLyo ReconTFFLyo ReconTFFTFF   0.210.250.310.28待定待定待定待定待定待定待定待定0.190.240.250.190.270.320.48   125125125125125125125125125125125125125125137162137147147   清澈清澈凝胶凝胶凝胶凝胶凝胶乳白乳白清澈清澈清澈清澈清澈清澈清澈凝胶清澈乳白
实施例9
在大肠埃希氏菌中表达蛋白或抗体
这个实施例说明了通过在大肠埃希氏菌中重组表达制备期望的蛋白或抗体的非糖基化形式。
最开始利用选定的PCR引物扩增编码期望的蛋白或抗体的DNA序列。引物应包含相应于选定的表达载体上的限制性内切酶位点的限制性内切酶位点。可以使用各种表达载体。适合的载体的一个实例是包含氨苄青霉素和四环素抗性基因的pBR322(来源于大肠埃希氏菌；参见Bolivar等，Gene，2：95(1977))。用限制性内切酶消化载体并脱去磷酸。然后将PCR扩增的序列连接到载体中。载体优选的包括编码抗生素抗性基因的序列、trp启动子、polyhis前导区(包括开始的六个STII密码子、polyhis序列和肠激酶裂解位点)、期望的蛋白或抗体的编码区、λ转录终止子和argU基因。另外，载体可至少包括编码期望的蛋白或抗体的天然核酸序列的非翻译的5′和3′片断的无意义的部分。
然后利用在Sambrook等，同上，中描述的方法用连接混合物转化选定的大肠埃希氏菌菌株。通过能在LB平板上生长的能力鉴定出转化体，然后选出抗生素抗性菌落。可以分离质粒DNA，通过限制性分析和DNA测序来确认。
选出的克隆可以在液体培养基中，例如在补充有抗生素的LB肉汤中生长过夜。过夜的培养物随后可用于接种更大规模的培养物。然后使细胞生长到期望的光密度，在这时开放表达启动子。
对细胞再培养几个小时之后，可通过离心作用收获细胞。通过离心作用获得的细胞团用本领域已知的各种试剂溶解，然后可以利用金属螯合柱在容许紧密结合蛋白或抗体的条件下纯化溶解了的期望的蛋白或抗体。
利用以下步骤可以在大肠埃希氏菌中以聚-His标记的形式表达期望的蛋白或抗体。最开始利用选定的PCR引物扩增编码期望的蛋白或抗体的DNA序列。引物包含相应于选定表达载体上的限制性内切酶位点的限制性内切酶位点，以及其它为有效和可靠的翻译起始、在金属螯合柱上快速纯化、用肠激酶蛋白水解去除所提供的有用序列。然后将PCR扩增的、聚-His标记的序列连接到表达载体中，用于转化基于菌株52的大肠埃希氏菌宿主(W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq)。首先将转化体在包含50mg/ml羧苄青霉素的LB中在30℃摇动培养，直到达到3-5的O.D.600。然后将培养物稀释50-100倍到CRAP培养基(通过在500mL水中混合3.57g(NH4)2SO4、0.71g柠檬酸钠$2H2O、1.07g KCl、5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF，以及110mM MPOS、pH7.3、0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO4来制得)，在30℃摇动生长约20-30小时。采取样品通过SDS-PAGE分析来证实表达，大批量培养物进行离心以团粒化细胞。将细胞团冷冻，直到进行开始纯化和重折叠。
将从0.5到1L发酵液中取得的大肠埃希氏菌(6-10g细胞团)重悬浮于10倍量(w/v)的7M胍、20mM Tris，pH8缓冲液中。添加固体亚硫酸钠和连四硫酸钠使终浓度分别达到0.1M和0.02M，将溶液在4℃搅拌过夜。这个步骤产生了所有半胱氨酸残基都亚硫酸化阻断的变性蛋白。在BeckmanUltracentifuge中以40,000rpm将溶液离心30分钟。用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍、20mM Tris、pH7.4)稀释上清液，通过0.22微米过滤器过滤澄清。将澄清的提取物加载到在金属螯合柱缓冲液平衡过的5ml QiagenNi-NTA金属螯合柱上。柱用包含50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)pH7.4的另外的缓冲液洗涤。用包含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。收集包含期望的蛋白的级分，保存在4℃。通过在280nm的吸光率利用根据其氨基酸序列计算的消光系数来估计蛋白浓度。
通过将样品慢慢地稀释到新鲜制备的重折叠缓冲液来使蛋白重折叠，所述重折叠缓冲液由：20mM Tris，pH8.6、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和1mM EDTA组成。选择重折叠体积使得最终蛋白浓度在50-100微克/ml之间。在4℃轻微地搅拌正在重折叠的溶液12-36小时。通过添加TFA到0.4％的终浓度(pH约3)来结束重折叠反应。在进一步的蛋白纯化之前，通过0.22微米过滤器过滤溶液，添加乙腈到终浓度2-10％。在Poros R1/H反相柱上对重折叠的蛋白进行层析，利用0.1％TFA的流动缓冲液，用从10％到80％的乙腈梯度洗脱。具有A280吸光率的级分的等分量在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析，收集包含均质的重折叠蛋白的级分。一般地，大多数蛋白的适当重折叠的种类是在最低的乙腈浓度下洗脱的，因为这些折叠的蛋白种类是最紧凑的，它们的疏水内部被遮蔽而不与反相树脂相互作用。聚集的种类通常在较高乙腈浓度下洗脱。除了从期望形式的蛋白中除去了错误折叠形式的蛋白之外，反相步骤还从样品中除去了内毒素。
收集包含折叠的期望蛋白或抗体的级分，利用在溶液中温和的氮气流除去乙腈。通过透析或通过利用在制剂缓冲液中平衡的G25Superfine(Pharmacia)树脂进行凝胶过滤，将蛋白配制为20mM Hepes，pH6.8，含有0.14M氯化钠和4％甘露醇的溶液，并进行无菌过滤。
实施例10
在哺乳动物细胞中表达蛋白或抗体
这个实施例说明了通过在哺乳动物细胞中重组表达制备期望的蛋白或抗体的潜在糖基化形式。
使用载体pRK5(参见1989年3月15日公开的EP 307,247)作为表达载体。选择性地，用选定的限制性内切酶以容许利用例如在Sambrook等，同上，中描述的连接方法插入这种DNA，将编码期望的蛋白或抗体的DNA连接到pRK5中。
在一个实施方式中，选择的宿主细胞可以是293细胞。人293细胞(ATCCCCL 1573)在组织培养平板上在培养基中，例如补充有胎牛血清和选择性地补充了营养成分和/或抗生素的DMEM中，生长至汇合。约10μg连接到pRK5中的、编码期望的蛋白或抗体的DNA与约1μg编码VA RNA基因[Thimmappaya等，Cell， 31：543(1982)]的DNA混合，并溶于500μl的1mMTris-HCl，0.1mM EDTA，0.227M CaCl2中。向这个混合物中滴加500μl的50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPO4，在25℃容许形成沉淀10分钟。悬浮沉淀，添加到293细胞，在37℃容许沉积约四小时。吸净培养基，添加2ml含20％甘油的PBS中30秒。然后用无血清培养基洗涤293细胞，添加新鲜培养基，温育细胞约5天。
在转染后约24小时，移除培养基，替换为培养基(单独地)或包含200μCi/ml35S-半胱氨酸和200μCi/ml35S-甲硫氨酸的培养基。在温育12小时之后，收集条件培养基，在旋转过滤机上浓缩，加载到15％SDS凝胶上。可以干燥加工后的凝胶，在胶片上暴露选定的时段来显示期望的蛋白或抗体的存在。包含转染的细胞的培养物可以经历进一步的温育(在无血清培养基中)，在选定的生物检测方法中测试培养基。
在替换性的技术中，利用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci. 12：7575(1981)描述的硫酸葡聚糖方法，可以将期望的蛋白或抗体瞬时地导入293细胞。在旋转烧瓶中使293细胞生长到最大密度，添加700μg连接到pRK5中、编码期望的蛋白或抗体的DNA。通过离心从旋转烧瓶中第一次浓缩细胞，用PBS洗涤。DNA-葡聚糖沉淀物在细胞团上温育四小时。用20％甘油处理细胞90秒，用组织培养基洗涤，重新加入到包含组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛转铁蛋白的旋转烧瓶中。约四天后，离心和过滤条件培养基以除去细胞和碎屑。然后可以通过任何选择的方法，例如透析和/或柱层析来浓缩和纯化包含表达的期望蛋白或抗体的样品。
在另一个实施方式中，可以在CHO细胞中表达期望的蛋白或抗体。可以利用已知的试剂，例如CaPO4或DEAE-葡聚糖将连接到pRK5中编码期望的蛋白或抗体的DNA转染到CHO细胞中。如上所述，可以温育细胞培养物，将培养基替换为培养基(单独)或包含放射性标记例如35S-甲硫氨酸的培养基。在确定了期望的蛋白或抗体的存在之后，培养基可以被替换为无血清培养基。优选的，培养物温育约6天，然后收获条件培养基。然后可以通过任何选择的方法来浓缩和纯化包含表达的期望蛋白或抗体的培养基。
也可以在宿主CHO细胞中表达期望的蛋白或抗体的表位标记的变体。可以从pRK5载体中亚克隆出连接到pRK5中的编码期望的蛋白或抗体的DNA。亚克隆插入物可以进行PCR，在阅读框中与选定的表位标记物，例如聚-his标记物融合到杆状病毒表达载体中。然后可以将聚-his标记的、编码期望的蛋白或抗体插入物的DNA亚克隆到包含用于选择稳定克隆的选择标记物例如DHFR的SV40驱动的载体中。最后，可以用所述SV40驱动的载体转染(如上所述)CHO细胞。可以如上所述进行标记来证实表达。然后可以通过任何选择的方法，例如Ni2+螯合物亲和层析来浓缩和纯化包含表达的聚-His标记的期望蛋白或抗体的培养基。
也可以通过瞬时的表达步骤在CHO和/或COS细胞中，或通过另一个稳定的表达步骤在CHO细胞中表达期望的蛋白或抗体。
利用以下步骤进行CHO细胞中的稳定表达。蛋白被表达为IgG结构(免疫粘附素)，在其中各个蛋白质的可溶形式(例如，细胞外区域)的编码序列与包含铰链区、CH2和CH2区的IgG1恒定区序列融合，和/或是聚-His标记的形式。
在PCR扩增后，利用如Ausubel等，Current Protocols of Molecular Biology，Unit 3.16，John Wiley and Sons(1997)中描述的标准技术，将各个DNA亚克隆到CHO表达载体中。构建CHO表达载体，使之具有与感兴趣的DNA兼容的限制性位点5＝和3＝以允许方便地移动cDNA。在CHO细胞表达中使用的载体如Lucas等，Nucl.Acids Res. 24：9(1774-1779(1996)中所述，使用SV40早期启动子/增强子来驱动感兴趣的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达允许在转染后选择稳定地维持了质粒的细胞。
利用商售的转染试剂SuperfectTM(Quiagen)、DosperTM或FugeneTM(Boehringer Mannheim)将十二微克期望的质粒DNA导入到约1000万个CHO细胞中。如Lucas等，同上，中描述的使细胞生长。将约3×10-7细胞冷冻在安瓿瓶中，用于如下所述的进一步生长和生产。
包含质粒DNA的安瓿瓶通过放入水浴中来解冻，并通过涡流混合。将内容物移液到包含10mL培养基的离心管中，在1000rpm离心5分钟。吸出上清液，将细胞重悬浮于10mL选择培养基(含有5％0.2m过滤的胎儿牛血清的0.2m过滤的PS20)中。然后将细胞等分到包含90mL选择培养基的100mL旋转器中。1-2天后，将细胞转移到加注了150mL选择性生长培养基的250mL旋转器中，在37℃温育。再经过2-3天后，按3×105细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL旋转器。通过离心作用和重悬浮于生产培养基来用新鲜的培养基替换细胞培养基。尽管可以使用任何适合的CHO培养基，实际上可以使用在1992年6月16日出版的美国专利No.5,122,469中描述的生产培养基。以1.2×106个细胞/mL接种3L生产旋转器。在0天，确定细胞数和pH。在第1天，对旋转器取样，开始用过滤的空气进行通气。在第2天，对旋转器取样，温度变化到33℃，加30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL 10％防沫剂(例如，35％聚二甲硅氧烷乳剂、Dow Coming 365医学级乳剂)。在整个生产过程中，根据需要调整pH，保持在7.2附近。10天后，或直到存活率降低到低于70％，通过离心和经0.22m过滤器过滤收获细胞培养物。滤液可以保存在4℃，或紧接着加载到用于纯化的柱上。
对于聚-His标记的结构，利用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白。在纯化之前，向条件培养基中添加咪唑到5mM的浓度。将条件培养基以4-5ml/min的流速泵到在20mM Hepes，pH7.4包含0.3M NaCl和5mM咪唑的缓冲液中平衡了的6ml Ni-NTA柱上。在加载之后，所述柱用另外的平衡缓冲液洗涤，用包含0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白。然后用25ml G25Superfine(Pharmacia)柱将高度纯化的蛋白脱盐，置入包含10Hepes、0.14MNaCl和4％甘露醇，pH6.8的存储缓冲液中，保存在-80℃。
如下述从条件培养基中纯化免疫粘附素(包含Fc)结构。将条件培养基泵到5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，蛋白A柱已经过20mM Na磷酸盐缓冲液，pH6.8平衡。在加载之后，用平衡缓冲液仔细地洗涤所述柱，然后用100mM柠檬酸，pH3.5洗脱。通过收集1ml的级分到包含275L 1M Tris缓冲液，pH9的试管中，立即将洗脱的蛋白中和。随后将高度纯化的蛋白脱盐，置入如上所述用于聚-His蛋白的存储缓冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶和通过Edman降解的N-末端氨基酸测序来评定同质性(homogeneity)。
实施例11
在酵母中表达抗体或蛋白
以下方法描述了在酵母中重组表达期望的蛋白或抗体。
首先，构建酵母表达载体以从ADH2/GAPDH启动子对期望的蛋白或抗体进行细胞内生产或分泌。将编码期望的蛋白或抗体的DNA和启动子插入到选定的质粒中适合的限制性内切酶位点来直接进行细胞内表达。为了分泌，同编码ADH2/GAPDH启动子、天然信号肽或其它哺乳动物信号肽，或，例如酵母α因子或转化酶分泌信号/前导序列，和接头序列(如果需要的话)的DNA一起，将编码期望的蛋白或抗体的DNA克隆到选定的质粒中，用于表达期望的蛋白或抗体。
然后可用如上所述的表达质粒转化酵母细胞，例如酵母菌株AB110，并在选定的发酵培养基中培养。可以通过对转化的酵母上清液用10％三氯乙酸沉淀、通过SDS-PAGE分离、用考马斯蓝对凝胶着色来进行分析。
随后通过离心从发酵培养基中除去酵母细胞，然后用选定的筒式过滤器浓缩培养基，分离和纯化重组蛋白或抗体。可以进一步利用选定的柱层析树脂纯化包含重组蛋白或抗体的浓缩物。
实施例12
在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达蛋白或抗体
以下方法描述了在杆状病毒感染的昆虫细胞中重组表达期望的蛋白或抗体。
将编码期望的蛋白或抗体的序列融合到包含在杆状病毒表达载体中的表位标记的上游。这种表位标记包括聚-his标记和免疫球蛋白标记(象IgG的Fc区)。可以使用各种质粒，包括衍生自商售的质粒，例如pVL1393(Novagen)。简要地，通过PCR利用与5′和3′区互补的引物来扩增编码蛋白或抗体的期望部分的序列，例如，编码跨膜蛋白的细胞外区的序列，或如果蛋白是细胞外蛋白，编码成熟蛋白的序列。5′引物可包括侧翼的(选定的)限制性内切酶位点。然后用那些选定的限制性内切酶消化产物，亚克隆入表达载体。
通过利用lipofectin(可从GIBCO-BRL购得)将上述质粒和BaculoGoldTM病毒DNA(Pharmingen)共转染入Spodoptera frugiperda(“Sf9”)细胞(ATCCCRL 1711)来产生重组杆状病毒。在28℃温育4-5天后，收获释放的病毒用于进一步的扩增。如O′Reilley等，Baculovirus expression vectors：A LaboratoryManual，Oxford：Oxford University Press(1994)描述的进行病毒感染和蛋白表达。
然后可以通过例如如下的Ni2+螯合亲和层析纯化表达的聚-his标记的蛋白或抗体。如Rupert等，Nature， 362：175-179(1993)描述的从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简要地，洗涤Sf9细胞，重悬浮在超声处理缓冲液(25mL Hepes，pH7.9；12.5mM MgCl2；0.1mM EDTA；10％甘油；0.1％NP-40；0.4M KCl)中，在冰上超声降解两次20秒。离心澄清超声降解物，在加载缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH7.8)中将上清液稀释50倍，经由0.45m过滤器过滤。用5mL的柱床体积制备Ni2+-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen购得)，用25mL水洗涤，用25mL加载缓冲液平衡。以0.5mL每分钟将过滤的细胞提取物加载到所述柱上。用加载缓冲液将柱洗涤到基线A280，在这个点上开始级分收集。然后，所述柱用第二洗涤缓冲液(50mM磷酸盐；300mMNaCI，10％甘油，pH6.0)洗涤，洗脱非特异性结合的蛋白。在再次到达A280基线后，用在第二洗涤缓冲液中0到500mM咪唑梯度对柱进行操作。收集一毫升级分，通过SDS-PAGE和银染色或Western印迹，用与碱性磷酸酶结合的Ni2+-NTA(Qiagen)进行分析。收集包含洗脱的His10标记的蛋白或抗体的级分，用加载缓冲液透析。
做为选择，可以利用已知的层析技术，包括例如蛋白A或蛋白G柱层析来进行IgG标记的(或Fc标记的)蛋白或抗体的纯化。
实施例13
抗体的制备
这个实施例说明了制备能与感兴趣的蛋白或期望的抗原结合的单克隆抗体。
生产单克隆抗体的技术是本领域已知的，例如，在Goding，同上，中有描述。可以使用的免疫原包括纯化的期望的蛋白或目标抗体，包含期望的蛋白或目标抗原的融合蛋白，和在细胞表面表达这种重组蛋白或抗原的细胞。熟练技术人员无需过度的实验就可以选择免疫原。
用在完全弗氏佐剂中乳化的所述期望的蛋白或目标免疫原，以1-100微克的数量皮下或腹膜内注射来免疫小鼠，例如Balb/c。做为选择，在MPL-TDM佐剂(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化免疫原，注入到动物的后足垫中。然后在10到12天后用在选定的佐剂中乳化的额外(additional)免疫原对免疫的小鼠进行强化。此后几个星期，也可用额外的免疫注射来强化小鼠。通过后眼窝采血来周期性地从小鼠获取血清样品，用于在ELISA分析中检测针对期望的蛋白或抗原的抗体。
在检测到适合的的抗体滴度之后，可以用期望的蛋白或目标抗原对对于抗体而言是“阳性”的动物进行最后的静脉注射。三到四天后，处死小鼠，收获脾细胞。然后使脾细胞与选定的鼠骨髓瘤细胞系，例如可从ATCC，No.CRL 1597获得的P3X63AgU.1融合(利用35％聚乙二醇)。融合产生杂交瘤细胞，然后可将杂交瘤细胞置于包含HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷)培养基的96孔组织培养平板中，以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂交体和脾细胞杂交体的增值。
用ELISA来筛选杂交瘤细胞对期望的蛋白或目标抗原的反应性。确定分泌这种单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞是本领域技术人员能力范围内的。
可以将所述阳性杂交瘤细胞腹膜内注射到同基因的Balb/c小鼠中以产生包含这种单克隆抗体的腹腔积液。做为选择，可以使杂交瘤细胞在组织培养烧瓶或滚瓶中生长。可以利用硫酸铵沉淀、继之以凝胶排阻层析法来纯化腹腔积液中产生的单克隆抗体。做为选择，可以使用基于抗体对蛋白A或蛋白G的结合的亲和层析。
实施例14
利用特定的抗体纯化期望的蛋白
可以通过蛋白纯化领域中的各种标准技术来纯化天然形式或重组形式的期望的蛋白。例如，可以利用特异于期望的蛋白的抗体通过免疫亲和层析来纯化期望的蛋白的前体多肽、成熟多肽、或前多肽形式。一般地，通过将特异性结合所述期望的蛋白的抗体共价连结到活化的层析树脂上来构建免疫亲和层析柱。
通过用硫酸铵沉淀或通过在固定化的蛋白A(Pharmacia LKBBiotechnology，Piscataway，N.J.)上纯化来从免疫血清中制备多克隆的免疫球蛋白。同样地，通过硫酸铵沉淀或在固定化的蛋白A上层析来从小鼠腹腔积液中制备单克隆抗体。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着到层析树脂上，例如CnBr-活化的SEPHAROSETM(Pharmacia LKB Biotechnology)。根据厂家的说明将抗体偶联到树脂上，封闭树脂，和洗涤衍生的树脂。
通过从以可溶形式表达蛋白的细胞中制备级分，利用这种免疫亲和柱来纯化期望的蛋白。通过添加洗涤剂或本领域公知的其它方法，将通过差速离心获得的整个细胞或亚细胞部分溶解，来取得这种制备物。做为选择，可以以有效量将包含信号序列的可溶性蛋白分泌到细胞生长的培养基中。
使包含期望的蛋白的溶解的制备物通过免疫亲和柱，在容许优先吸收所述期望的蛋白的情况下(例如存在洗涤剂的高离子强度缓冲液)洗涤柱。然后在破坏抗体与蛋白的结合的情况下(例如，低pH缓冲液，例如约pH 2-3，或高浓度的促溶剂(chaotrope)，例如尿素或硫氰酸根离子)冲洗柱，收集期望的蛋白。

Claims (50)

1.一种稳定的、低混浊度的液体制剂，包含(a)100到260mg/ml量的蛋白或抗体，(b)50到200mM量的精氨酸-HCl，(c)10到100mM量的组氨酸，(d)0.01到0.1％量的聚山梨醇酯，其中所述制剂进一步具有从5.5到7.0的pH值、约50cs或更小的运动粘度和从200mOsm/kg到450mOsm/kg的渗透压。
2.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从120mg/ml到260mg/ml。
3.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从150mg/ml到260mg/ml。
4.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从180mg/ml到260mg/ml。
5.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从200mg/ml到260mg/ml。
6.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度约150mg/ml。
7.权利要求1所述的制剂，其中所述渗透压范围从250mOsm/kg到350mOsm/kg。
8.权利要求1所述的制剂，其中精氨酸-HCl的浓度范围从100mg/ml到200mg/ml。
9.一种稳定的、低混浊度的液体制剂，包含(a)100到260mg/ml量的抗IgE单克隆抗体，(b)50到200mM量的精氨酸-HCl，(c)10到100mM量的组氨酸，(d)0.01到0.1％量的聚山梨醇酯，其中所述制剂进一步具有从5.5到7.0的pH值、约50cs或更小的运动粘度和从200mOsm/kg到450mOsm/kg的渗透压。
10.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从120mg/ml到260mg/ml。
11.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从150mg/ml到260mg/ml。
12.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从180mg/ml到260mg/ml。
13.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度范围从200mg/ml到260mg/ml。
14.权利要求1所述的制剂，其中所述蛋白或抗体的浓度约150mg/ml。
15.权利要求1所述的制剂，其中所述渗透压的范围从250mOsm/kg到350mOsm/kg。
16.权利要求1所述的制剂，其中所述抗IgE抗体选自rhuMAbE25、rhuMAbE26或Hu-901。
17.权利要求1所述的制剂，其中所述抗IgE抗体是rhuMAbE25。
18.权利要求1所述的制剂，其中所述抗IgE抗体是rhuMAbE26。
19.权利要求1所述的制剂，其中所述抗IgE抗体是Hu-901。
20.一种稳定的、低混浊度的液体制剂，包含(a)量约150mg/ml的抗IgE抗体，(b)量为200mM的精氨酸-HCl，(c)量为20mM的组氨酸，(d)量为0.02％的聚山梨醇酯，其中所述制剂更进一步具有6.0的pH值。
21.权利要求20所述的制剂，其中所述抗IgE抗体是E25。
22.一种制品，包含装有权利要求1所述的制剂的容器。
23.权利要求22所述的制品，其中所述容器是注射器。
24.权利要求23所述的制品，其中所述注射器进一步被包含在一注射装置中。
25.权利要求24所述的制品，其中所述注射装置是自动注射器。
26.权利要求1所述的制剂，其中所述制剂是重构的。
27.权利要求26所述的制剂，其中在所述重构的制剂中所述蛋白或抗体的浓度比在冻干前的浓度大约高2-40倍。
28.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人施用治疗有效量的权利要求20的制剂。
29.权利要求28所述的方法，其中所述IgE介导的疾病选自过敏性鼻炎、哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、特应性皮炎或胃肠病。
30.权利要求28所述的方法，其中所述IgE-介导的疾病是过敏性鼻炎。
31.权利要求28所述的方法，其中所述IgE-介导的疾病是过敏性哮喘。
32.权利要求28所述的方法，其中所述IgE-介导的疾病是哮喘。
33.权利要求28所述的方法，其中所述IgE-介导的疾病是特应性皮炎。
34.权利要求28所述的方法，其中所述IgE介导的疾病选自超敏反应、过敏性支气管肺曲霉病、寄生虫疾病、间质性膀胱炎、高IgE综合征、共济失调性毛细血管扩张症、Wiskott-Akdrich综合征、胸腺淋巴发育不全、IgE骨髓瘤或移植物抗宿主反应。
35.权利要求28所述的方法，其中所述IgE介导的疾病是超敏反应。
36.权利要求35所述的方法，其中所述超敏反应疾病选自过敏反应、荨麻疹或食物过敏。
37.权利要求36所述的方法，其中超敏反应疾病是食物过敏。
38.权利要求37所述的方法，其中所述食物过敏是由对豆类的暴露而引起。
39.权利要求38所述的方法，其中所述豆类是花生。
40.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药有效量的与抗组胺剂组合的权利要求20的制剂。
41.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合抗组胺剂的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂。
42.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药治疗有效量的与支气管舒张剂组合的权利要求20的制剂。
43.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合支气管舒张剂的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂。
44.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药治疗有效量的与糖皮质激素组合的权利要求20的制剂。
45.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合糖皮质激素的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂。
46.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药与糖皮质激素组合的治疗有效量的权利要求20的制剂。
47.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合糖皮质激素的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂。
48.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合过敏原脱敏疗法的施用，向需要医治的病人给药治疗有效量的权利要求20的制剂。
49.医治IgE介导的疾病的方法，包括向需要医治的病人给药治疗有效量的与NSAID组合的权利要求20的制剂。
50.医治IgE介导的疾病的方法，包括联合NSAID的施用，向需要医治的病人施用治疗有效量的权利要求20的制剂。
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