CN1330664C

CN1330664C - 用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术

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Publication number: CN1330664C
Application number: CNB028060644A
Authority: CN
Inventors: S·D·吉利斯; J·韦; 劳健明
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-07
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2022-03-07
Also published as: KR100900176B1; WO2002072605A3; BR0207854A; AU2002248571B2; RU2003129528A; US7148321B2; DK1366067T3; MXPA03008031A; CA2440221A1; KR20090010127A; EP1366067A2; JP2004525630A; HUP0303428A2; PL366981A1; KR20030092015A; EP1366067A4; EP1366067B1; ZA200307792B; WO2002072605A2; US20030044423A1

Abstract

本发明公开了用于有效表达抗体融合蛋白质的方法和组合物。本发明的抗体融合蛋白质包括一杂合抗体部分，所述杂合抗体部分含有来自一种以上抗体的序列和/或突变体抗体序列。本发明的杂合抗体融合蛋白质可以高水平产生，且除了非抗体部分的功能活性外还可以将不同抗体类型的特征性功能活性组合在一起。

Description

用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术

相关申请

本申请要求U.S.S.N.60/274,096的优先权及利益，其中所述U.S.S.N.60/274,096在2001年3月7日提交，其全部内容在此加入作为参考。

发明领域

本发明一般涉及这样的方法和组合物，其用于带有源自两种或多种同种型的部分的抗体及来自此抗体的融合蛋白质，包括含有具有改变的效应子功能、增强的蛋白质表达和/或降低的寡聚化的抗体部分的蛋白质。本发明特别涉及这样的抗体和融合蛋白质，其中铰链区源自一种同种型而CH2结构域源自不同的同种型。

发明背景

从遗传改造细胞中表达蛋白质的效率是一重要的商业问题。一些商业上重要的蛋白质最好从真核细胞中产生以保证正确的折叠和糖基化，所述真核细胞如哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞。但是，维持大规模真核细胞培养的费用意味着用此方法生产的蛋白质是昂贵的。因此，在本领域内需要对真核细胞内蛋白质的表达水平实现最大化。

一相关的问题是产生于真核细胞的治疗性蛋白质必须以正确的构象形态进行表达。通常，转录和翻译的机制确保了遗传改造细胞产生的蛋白质的序列由编码该蛋白质的核苷酸决定。但是，转录及翻译过后，蛋白质可能没有正确折叠且可能被降解。备选地，蛋白质可以以聚集状态产生，结果降低了活性。即使聚集的蛋白质具有活性，由于与非聚集蛋白质相比其免疫原性增加而不能被药理学接受。这样，药理学可接受的蛋白质制品一般应基本不含有聚集的蛋白质。

从遗传改造的真核细胞中表达的蛋白质的数量取决于编码基因的转录速率、mRNA剪切及移出细胞核的效率及翻译效率。这些事件在蛋白质表达中起到的作用已被充分理解，遗传工程和蛋白质表达领域内的技术人员通常可将合适的核酸序列加入到表达构建体的设计中，以实现高效的转录、剪切、mRNA移出和翻译。

但是，产生于真核细胞的正确折叠的非聚集蛋白质的数量也取决于蛋白质的氨基酸序列以及决定转录、剪切、mRNA移出、翻译和翻译后修饰的核酸序列。例如，细胞内合成的相当大一部分蛋白质被认为会发生降解。蛋白质中决定是否应被降解的特征目前正是一个深入研究的主题，但当前还不可能仅通过检查蛋白质的序列来预测蛋白质折叠、降解或聚集的效率。一些天然存在的蛋白质以高效率折叠、抵抗蛋白质水解且不发生聚集。相反，其他的蛋白质折叠效率低、迅速被降解且发生聚集。

抗体和含抗体一部分的人工蛋白质，此处命名为抗体融合蛋白质或Ig融合蛋白质，对于许多涉及抗体可变区的靶向能力以及恒定区结合多种其他蛋白质的能力的目的是有用的。抗体和抗体融合蛋白质制备物当它们正确折叠且非聚集时是非常有用的。因此，本领域内需要能用于生产聚集减少的抗体和抗体融合蛋白质制备物的方法和组合物。

此外，由于抗体和抗体融合蛋白质能结合多种其他蛋白质而导致，例如，引起特异的效应子功能，故所述抗体和抗体融合蛋白质是有用的。在一些情况中可能需要特异效应子功能，但经常的情况是优选使效应子功能丧失。通过利用修饰抗体，融合蛋白质的抗体成分可经过改变而减小或消除效应子功能。当抗体和抗体融合蛋白质制备物经过修饰而改变了功能性时也是有用的。因此，本领域内存在对如下方法和组合物的需要，所述方法和组合物可用于生产具有改变的效应子功能的修饰抗体和抗体融合蛋白质。

蛋白质药物可被蛋白酶降解，因此它们的递送和药物动力学特性并非最佳。本领域内存在对改进的蛋白质药物的需要，所述改进的蛋白质药物具有某些蛋白质的有用特性，但具有更大的蛋白酶抵抗力。

发明概述

本发明着重描述用于生产完整抗体、免疫细胞因子、免疫融合体、免疫配体和其他抗体和Fc融合蛋白质的方法和组合物，其可以促进所需融合蛋白质的表达、正确寡聚化、纯化和蛋白酶抗性，其中所述所需融合蛋白质任选地具有修饰的、组合的或减弱的Fc效应子功能。特别是，本发明提供具有杂合同种型的抗体部分，及任选地突变Ig成分在完整的抗体中以及在含抗体部分的融合蛋白质中的应用。

IgG/IgG杂合同种型

在一组优选的实施方案中，本发明提供了具有减弱的效应子功能和增强的组装功能的融合蛋白质。在使用Ig部分增强表达和提高血清半衰期，而又不需要此Ig部分的免疫学功能时，此类融合蛋白质特别有用。

在这些实施方案中，融合蛋白质优选地包含IgG2或IgG4的CH1、CH2和/或CH3结构域，以及来自IgG1的铰链区或来自IgG4的铰链区，后一铰链区优选包含可在重链来源的部分间促进二硫键正确形成的突变(Angal S，等.分子免疫学(Mol Immunol)1993年，一月；30(1)：105-8)。该实施方案的融合蛋白质将有利于完整抗体和含Fc区域的Ig融合蛋白质的高水平表达及提高其正确组装。

在一更为优选的实施方案中，融合蛋白质在Ig部分内还含有一个或多个突变。例如，Ig部分可以经过突变而进一步减少不需要的任何残留的效应子功能。例如，可以对IgG2的CH2结构域内的C1q结合位点实施突变。例如正常的IgG4由于在相应IgG1的331位的脯氨酸处含有丝氨酸而不能够结合补体(Eu命名法)(Tao，MA等(1993)J.Exp.Med.178：661-667；Brekke，OH等(1994)Eur.J.Immunol.24：2542-2547)；在IgG2中的一个类似突变减弱了Clq结合。也可以对其他已知参与C1q结合的残基进行修饰，例如对318、320、322和297位的残基进行修饰(Duncan AR(1988)自然(Nature)：332：738-740)，导致Clq结合的减弱。

在另外一组优选的实施方案中，铰链区也存在突变。例如，在抗体轻链也存在的情况下，优选的IgG1铰链区的形式为在其正常位置存在有正常数目的半胱氨酸残基。但是，在抗体轻链不作为一条独立多肽链存在时，优选IgG1铰链的第一个半胱氨酸被突变为另一个残基。例如，在Fc-X蛋白质、X-Fc蛋白质和单链抗体中应用此突变的铰链区是有利的，其中所述单链抗体中轻链可变区通过多肽接头连接重链。在此情形下，IgG1铰链中的第一半胱氨酸优选地突变为丝氨酸。

在涉及突变铰链区的第二类实施方案中，应用突变形式的IgG4铰链以允许在两重链间有效形成二硫键。

在涉及突变铰链区的第三类实施方案中，在杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质中使用突变形式的IgG2铰链(其中头两个半胱氨酸每一个均突变为另一氨基酸)。也可方便地将此突变铰链用于完全来自IgG2的抗体或Ig融合蛋白质中。例如，可将具有ERKSSVECPPCP(SEQ ID NO：1)序列的修饰IgG2铰链用于抗体或Ig融合蛋白质中。另一有用的铰链类型为IgG2铰链和IgG4铰链的杂合体，例如序列ESKYG-VECPPCP(SEQ IDNO：2)，其中破折号前的5个氨基酸来自IgG4而剩余的氨基酸来自IgG2。这些实施方案在抗体和Ig融合蛋白质从真核细胞表达和分泌的情形下特别有用，因为这些铰链实施方案可以促进蛋白质的正确折叠。这些实施方案可用作IgG1铰链的备选。这些抗体铰链实施方案的一个关键特征是它们仅含有两个半胱氨酸残基。

再一类实施方案涉及杂合同种型Ig融合蛋白质的Ig部分内的突变，突变位于Ig和非Ig部分的连接处。在一个实施方案中，融合蛋白质氨基酸序列内的改变优选地位于Ig部分和非Ig部分的连接处，且优选地位于连接点的10个氨基酸内。更优选地，氨基酸的改变涉及抗体部分C末端的赖氨酸变为疏水氨基酸，如丙氨酸或亮氨酸。

一备选实施方案用于需要缩短融合蛋白质的半衰期的情形中。IgG3由于位于CH3结构域内的FcRn/FcRp结合位点内发生修饰(H435变为R)而与其他IgG同种型相比半衰期较短(参见Ward，ES.和Gheti，V[1995]治疗免疫学(Therapeutic Immunology)2：77-94)。具有IgG3的CH2和CH3结构域的融合蛋白质可用于需要短期暴露的情况。根据该实施方案，应用IgG3 CH3结构域联合IgG1铰链是有用的；例如IgG1(铰链)-IgG3(CH3)融合蛋白质与含IgG3铰链和IgG3 CH3结构域的Ig融合蛋白质相比具有更佳的表达和组装特性。

在一更为优选的实施方案中，当Ig融合蛋白质被设计为具有短的血清半衰期、减弱的效应子功能和有效的组装性能时，可以应用杂合Ig区域，其中铰链区来自IgG1、CH2结构域来自IgG2且CH3结构域来自IgG3。

IgG/IgA杂合同种型

本发明的一个独特的实施方案提供了杂合同种型Ig融合蛋白质，其具有增强的蛋白酶抵抗力及延长的血清半衰期。当Ig融合蛋白质将暴露于富含蛋白酶的环境时，该实施方案特别有用，所述富含蛋白酶的环境如消化道或其他的粘膜组织，例如口服Ig融合蛋白质药物的过程中。根据此实施方案，提供了含IgG和IgA恒定区元件的Ig融合蛋白质。在一优选的实施方案中，应用了IgA1的铰链和IgG的CH2和CH3结构域。在一独特的优选实施方案中，编码IgA Fc区域内的O-连接糖基化位点的氨基酸片段被移植到IgG的Fc区域中。

IgG/IgM杂合同种型

本发明的再一实施方案提供了具有IgA或IgM的寡聚化特性但具有IgG的特征效应子功能的杂合同种型抗体和Ig融合蛋白质。例如，提供的蛋白质含IgG1或IgG3的铰链区以及CH2结构域和与之相融合的IgM的CH3和CH4结构域。在一更为优选的实施方案中，提供的抗体包含重链和轻链可变区，且还包含融合在一起的IgG铰链及CH2区域和IgM的CH3及CH4结构域。在一备选更为优选的实施方案中，提供了X-Fc形式的Ig融合蛋白质，其中X优选地为细胞表面受体的配体，且Fc部分包含IgM的CH3和CH4结构域。此分子将IgG的ADCC效应子功能和IgM的高效价联合在一起。

在应用IgM或IgA的CH4结构域的杂合同种型的优选实施方案中，CH4结构域的C末端半胱氨酸被突变以阻断与J链的二硫键连接。这减少了Ig融合蛋白质向消化道的分泌。

优选的非-Ig部分

本发明的融合蛋白质内非Ig部分的优选类型为这样的蛋白质或部分，当其不是Ig融合蛋白质的一部分时通常位于细胞外。例如，激素、细胞因子、趋化因子、分泌酶或跨膜受体的胞外部分。

在一优选的实施方案中，非免疫球蛋白成分为一种蛋白质，如抗肥胖蛋白质。例如，非免疫球蛋白成分为leptin、CNTF、CLC/CLF-1或Acrp30的一部分。

而在另一优选实施方案中，非免疫球蛋白成分为一种蛋白质，如红细胞生成素或EPO。

在一备选实施方案中，融合蛋白质的非免疫球蛋白成分为激素。例如，非免疫球蛋白成分可为胰岛素、生长激素或胰高血糖素样肽1(GLP-l)。

在另一实施方案中，融合蛋白质的非免疫球蛋白成分为细胞因子。此处应用的术语″细胞因子″用以描述可在具有该细胞因子受体的细胞内诱发特异反应的天然或重组蛋白质、其类似物和其片段。优选的细胞因子为可由细胞产生和分泌的蛋白质。优选地，细胞因子包括白介素，如白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18，造血因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、G-CSF和红细胞生成素，肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα、淋巴因子如淋巴毒素，代谢过程的调节物如leptin，干扰素如α干扰素、β干扰素和γ干扰素，以及趋化因子。优选地，本发明Ig细胞因子融合蛋白质显示出细胞因子生物活性。

在一备选的优选实施方案中，融合蛋白质的非免疫球蛋白成分为具有生物活性的配体结合蛋白质。此配体结合蛋白质可以，例如，(1)阻断细胞表面的受体配体相互作用；或(2)中和血液的液相中的分子(如细胞因子)的生物活性，从而阻止其到达细胞靶位。优选的配体结合蛋白质包括CD4、CTLA-4、TNF受体，或白介素受体如IL-1和IL-4受体。优选地，本发明抗体-受体融合蛋白质显示出配体结合蛋白质的生物活性。一高度优选的实施方案包括用于蛋白质药物Enbrel中的胞外TNF受体结构域片段，其形式为TNFR-铰链-CH2-CH3或铰链-CH2-CH3-TNFR，其中CH2和CH3结构域源自IgG2或IgG4，且在二聚化Fc中这两铰链区域中的每一个具有三个或更少的半胱氨酸，且甚至更优选地，具有两个或更少的半胱氨酸。

另一类型的优选配体结合蛋白质具有结合小分子而不是蛋白质的能力。例如，可方便地将抗生物素蛋白融合到杂合同种型Ig部分，如抗体上。然后将杂合同种型抗体-抗生物素蛋白融合体施用给哺乳动物，如鼠或人，由抗体V区的特异性所决定的，此融合体将集中在机体的靶组织中。在抗体-抗生物素蛋白融合蛋白质被充分地从体内清除后，可施用生物素和治疗分子的缀合物。生物素缀合物由于与抗生物素蛋白的结合将集中在靶组织中，这导致减轻了由于非靶组织中治疗分子的集中而引起的副作用。该策略可用于其他配体/配体结合蛋白质对。

另一类型的优选非免疫球蛋白部分为酶。例如，可将具有独特特异性的酶融合到杂合同种型Ig部分，如抗体上。然后将杂合同种型抗体-酶融合体施用给哺乳动物，如鼠或人，该融合体将集中于机体的靶组织内(这是由抗体V区的特异性所决定的)。在本发明的一种优选的治疗方法中，在抗体-酶融合蛋白质被充分地从体内清除后，施用可通过该酶裂解成活性形式的前体药物。此活化的药物将集中在靶组织内，这就导致减轻了由于在非靶组织中活化药物分子的集中而引起的副作用。在该实施方案的一高度优选的形式中，活化药物为抗癌药物，例如细胞毒性剂。在一备选的高度优选实施方案中，酶本身具有治疗活性。例如，可以将RNAse，如Onconase与杂合同种型抗体融合蛋白质偶联，且通过抗体V区域靶向肿瘤。

核酸

本发明也包括新的核酸序列，所述核酸序列将有利于具有杂合同种型的Ig融合蛋白质和完整抗体的表达和分泌；以及包括用于构建此核酸的方法。

编码抗体蛋白质的基因组序列的一个特别有用的特征是可变区、CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域由分别的外显子编码。该特征使得可通过′外显子改组′实现杂合同种型融合蛋白质的工程化(Zuckier等，癌症研究(Cancer Research)[1998]58：3905-8；Poon等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)270：8571-7；Jefferis R，等，分子免疫学(Mol Immunol.)[1990]27：1237-40；Chappel MS，Proc Natl Acad Sci U S A.[1991]88：9036-40；Senior BW，等，感染免疫(Infect Immun.)[2000]68：463-9.)。

对于Fc融合蛋白质，核酸分子可编码多种构型的蛋白质。在一组优选的实施方案中，核酸分子以5′到3′方向连续编码，(i)信号序列、免疫球蛋白Fc区域和靶蛋白质序列，或(ii)信号序列、靶蛋白质序列和免疫球蛋白Fc区域，或(iii)信号序列、第一靶蛋白质、免疫球蛋白Fc区域和第二靶蛋白质。导致产生的核酸分子由此编码Fc-X、X-Fc或X-Fc-Y结构，其中X和Y为一种或多种靶蛋白质。例如，X和Y可各自为融合蛋白质。任选地在这些部分间编码接头。

类似地，根据本发明，编码完整抗体Ig融合蛋白质的核酸也可设计为在每一重链部分和每一轻链部分的N末端编码一段信号序列。

本发明的核酸可以以功能性连接方式加入到复制表达载体中，然后可以将所述载体导入能够产生融合蛋白质的真核宿主细胞。最终的Ig融合蛋白质得以从真核宿主细胞中有效地产生和分泌。分泌的Ig融合蛋白质可从培养基中收集，而无需裂解真核宿主细胞。可以对蛋白质产物进行活性测试，和/或按需要应用普通试剂进行纯化和/或从融合配偶体中切离，前述全部可以应用常规技术实现。备选地，本发明的核酸可导入细菌细胞，且产生的Ig融合蛋白质根据标准技术进行纯化。

本发明也提供了提高细胞内抗体和Ig融合蛋白质生产水平的方法。方法优选地应用于在真核细胞，优选地哺乳动物细胞内的生产。例如，根据本方法，起始抗体或Ig融合蛋白质产量的提高可以通过将编码Ig部分的结构域的核酸序列与编码其他抗体同种型的结构域的相应序列或与突变序列进行交换、通过测试如此处描述的改变的蛋白质的产量来比较表达水平，以及选择可给出最高水平的特定表达构建体而实现。该方法可重复使用。交换铰链区是特别有用的。

治疗

本发明也提供了应用修饰抗体和Ig融合蛋白质进行治疗的方法。相应地，本发明提供了有效且价廉的方法，以及提供了低免疫原性的蛋白质。

本发明前述的及其他的目的、特征和优点将在以下的详细描述、图表和实施例中更为彰显。

附图简述

图1A-D为用于制备本发明某些方面的融合蛋白质的IgG杂合同种型的示意性图解；黑线代表连接半胱氨酸残基的二硫键；抗体结构域在图A中标示；IgG1结构域以黑色显示，IgG2结构域以白色显示，且可变区和轻链结构域以条纹显示。

图1A显示IgG1同种型。

图1B显示IgG2同种型。

图1C显示带有IgG2和IgG1铰链的同种型杂合体，所述铰链的第一个半胱氨酸发生了突变。

图1D显示IgG杂合体γ1(CH1-H)γ2(CH2-CH3)。

图2A-C为Ig融合蛋白质的示意性图解，所述Ig融合蛋白质包含的Fc区域含有杂合同种型；″X″和″Y″可为任何的非Ig部分。

图2A显示Fc-C构象的Ig融合蛋白质，其包含来自一种抗体同种型的铰链和由来自另一种同种型的CH2和CH3结构域组成的Fc部分；在Fc部分的C末端为蛋白质部分″X″。

图2B显示X-Fc构象的Ig融合蛋白质，其包含来自一种抗体同种型的铰链和由来自另一种同种型的CH2和CH3结构域组成的Fc部分；在Fc部分的N末端为蛋白质部分″X″。

图2C显示X-Fc-Y构象的Ig融合蛋白质，其包含来自一种抗体同种型的铰链和由来自另一种同种型的CH2和CH3结构域组成的Fc部分；在Fc部分的N末端为蛋白质部分″X″，其可为任何的蛋白质，而在Fc部分的C末端为蛋白质部分″Y″

图3A-D为包含可变区且含有杂合同种型的Ig融合蛋白质的示意性图解；″X″和″Y″可为任何的非Ig部分。

图3A显示Ig融合蛋白质，其包含的铰链来自一种抗体同种型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3区域来自一不同的同种型；非Ig蛋白质″X″在重链的C末端进行融合。

图3B显示Ig融合蛋白质，其包含的铰链来自一种抗体同种型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3区域来自一不同的同种型；非Ig蛋白质″X″在重链的C末端进行融合；箭头显示了抗体部分内的一部分可能突变位点，见本文描述。

图3C显示Ig融合蛋白质，其包含的铰链和CH1区域来自一种抗体同种型(黑色)而包含的CH2和CH3区域来自一不同的同种型；非Ig蛋白质″X″在重链的C末端进行融合；从铰链发出的分枝结构代表糖基化部分。

图3D显示Ig融合蛋白质，其包含的铰链来自一种抗体同种型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3区域来自一不同的同种型；非Ig蛋白质″X″，在重链的C末端进行融合；第二非Ig蛋白质″Y″在轻链的N末端进行融合。

图3E显示Ig融合蛋白质，其包含的铰链来自一种抗体同种型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3区域来自一不同的同种型；非Ig蛋白质″X″在重链的C末端进行融合；第二非Ig蛋白质″Y″在重链的N末端进行融合。

图4示意性图解了这样的Ig融合蛋白质，其包含可变区及多种同种型且与IgG相比具有增强的效价；黑色的椭圆代表来自IgM的CH3和CH4结构域；白色的椭圆代表来自IgG的CH1、铰链和CH2结构域；带条纹的椭圆代表可变区和轻链恒定区；粗线代表正常存在于IgG1内的二硫键；用′s′标记的细线代表正常存在于IgM内的二硫键。

定义

根据本发明，同种型意指免疫球蛋白重链恒定区(C)的种类，所述恒定区决定了抗体的功能活性。存在五种主要的同种型，包括IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA意指以α重链为特征的免疫球蛋白种类。IgD意指以δ重链为特征的免疫球蛋白种类。IgE意指以ε重链为特征的免疫球蛋白种类。IgM意指以μ重链为特征的免疫球蛋白种类。IgG意指以γ重链为特征的免疫球蛋白种类。″伽马a1″或″γ1″是指源自IgG1的重链或其部分。同样，″伽马2″或″γ2″是指源自IgG2的重链或其部分，依此类推。

根据本发明，同种异型免疫球蛋白意指相同免疫球蛋白重链C基因的等位基因多态性。这些决定因子存在于物种的一些而非全部成员中。

根据本发明，独特型意指存在于抗体可变区(V)上的抗原决定族，其由VH和VL基因的特定重排形成。

根据本发明，FcRn，也称作FcRp，意指含β-2微球蛋白的新生儿肠内转运受体，所述受体调节IgG的清除，且对于抗体的体内循环半衰期非常重要。

根据本发明，FcγR意指可结合IgG分子的Fc部分并能诱发效应细胞功能的细胞表面受体，包括FcγRI、RII和RIII。FcγR在吞噬细胞、B淋巴细胞、NK细胞和树突细胞上表达。

根据本发明，″IgG1″或″IgG2″或其他Ig分子意指包括重链或轻链的完整抗体，或其部分。

根据本发明，″二价单体″意指抗体、Fc融合体或抗体融合体，其通常可通过在正常抗体中形成的二硫键而进行二聚化。通常可以根据含Fc的蛋白质在变性的非还原SDS胶上作为单一的条带移动的能力，及其表观分子量为在还原状态下观察到的表观分子量的约两倍，以推断此二硫键的形成。二价单体的存在也可通过在大小排阻层析中存在与正确分子量对应的峰而进行推断。其他确定蛋白质大小的方法也可用于鉴定二价单体的存在。

根据本发明，″Ig融合蛋白质″意指这样的融合蛋白质，其包含与第二部分连接的部分或全部抗体，所述第二部分优选地全部或部分为非抗体或非免疫球蛋白(非-Ig)蛋白质。免疫细胞因子、Fc-X蛋白质、X-Fc蛋白质和X-Fc-Y蛋白质均为Ig融合蛋白质的示例。同样，其中非Ig部分置于两个Ig部分或结构域之间的融合蛋白质亦构成了Ig融合蛋白质的一种类型。

根据本发明，蛋白质的″组装″意指蛋白质正确折叠及寡聚化为正确的多聚体状态。组装可用本领域内建立的多种方法进行监测。实际上，就二硫键而言，蛋白质的正确组装可方便地通过比较蛋白质在非还原和还原SDS胶上的迁移进行监测：如果给定的蛋白质种类在非还原胶上形成多条带，而在还原SDS胶上形成单一条带，则可推测出在非还原SDS胶上至多仅有一条带为正确组装的蛋白质。备选地，大小排阻层析法也可用于区别单元蛋白和可由不正确的二硫键或非共价键相互作用形成的更高级寡聚体和聚合体。

根据本发明，抗体部分的″结构域″意指结构性结构域，其对应于人类抗体基因中的单个外显子所编码的氢基酸片段。例如，IgG的恒定结构域为CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在一些例子中，位于铰链和CH2结构域由同一外显子编码。在这样的例子中，铰链和CH2结构域间的连接处通过与其他铰链/CH2连接处进行比对而定义(参见Paul，前面引用的文献.，46-49页)。

根据本发明，结构域、蛋白质、区域或分子意指完整的结构域、蛋白质、区域或分子，或其部分、突变体或改造形式，或主要由其来源的形式。所述部分、突变体或改造形式优选地具有完整结构域、蛋白质、区域或分子特有的功能特性。根据本发明，″主要由其来源″意指衍生物具有的氨基酸序列中至少95％源自天然存在的蛋白质或结构域的特定序列。例如，主要由人IgG2 CH2结构域来源的序列在氨基酸比对中至少有95％与人IgG2CH2结构域的序列相同。

根据本发明，″修饰的IgG1铰链″意指来自IgG1的铰链区，在该铰链中半胱氨酸，优选地第一个半胱氨酸突变为另一种氨基酸。该半胱氨酸通常与抗体轻链形成二硫键。此修饰的IgG1铰链在缺乏轻链或具有可结合轻链的其它半胱氨酸的蛋白质中特别有用。

根据本发明，″红细胞生成素分子″意指这样的分子，其一般具有与脊椎动物红细胞生成素相同的结构和类似的氨基酸序列，任选地包括突变。例如实施例18描述了无突变的人红细胞生成素以及具有四个突变的人红细胞生成素的应用。

发明详述

本发明提供了用于提高免疫球蛋白融合蛋白质的体内和体外产量的方法和组合物。特别是，本发明提供了用于提高免疫球蛋白融合蛋白质的表达、聚合和/或折叠特性的有用方法。本发明部分基于如下令人惊异的发现，即当应用杂合免疫球蛋白而不是野生型免疫球蛋白作为融合配偶体时，免疫球蛋白融合蛋白质的表达水平提高、聚集减少和/或折叠问题减少。与杂合免疫球蛋白相关的融合蛋白质生产特性的提高是出乎预料的，因为如IgG1和IgG2等野生型免疫球蛋白被认为是可良好折叠的蛋白质且能在体内和体外有效表达。

相应地，本发明的一个方面包括可用于表达包含杂合免疫球蛋白(或杂合Ig)部分的免疫球蛋白融合蛋白质的方法和组合物。优选的杂合免疫球蛋白包含IgG1铰链和IgG2的CH2和CH3结构域。其他优选的杂合体包含IgG1和IgG4结构域。

抗体结构

抗体为Y字形的分子且由两条重链(H)和两条轻链(L)组成。每一条重链通过二硫键连接轻链，且两条重链依赖共价和非共价相互作用彼此相对正确定向。这两条链在氨基末端的可变结构域含有抗原结合位点，且与CH1结构域一起，限定了分子的Fab端。

四条链应用重链间的疏水键以及一个或多个链间的二硫键来稳定复合体。这样，完整的免疫球蛋白为二价，具有两个相同的抗原结合位点。某些免疫球蛋白通常还要进行多聚化，例如IgM和IgA。

每一多肽链具有两个到五个结构域；轻链含两个结构域而重链含四或五个。每条链的各氨基末端结构域由于存在大量的序列变异而被命名为可变区，而几个羧基端结构域被称为恒定区。重链区编号为CH1、铰链、CH2、CH3、CH4，且负责多种重要的抗体功能，包括Fc受体(FcR)结合和补体固定。

重链C区存在五种主要的同种型，分类为IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每一种均具有特征性的效应子功能(IgG分为四种γ同种型亚类：γ1、γ2、γ3、γ4)。轻链的恒定区仅含有一个C结构域，其可为Ck和Cλ两类中的一个，所述结构域不具有已知的明确的功能特性(参见W.E.Paul，ed.，1993，基础免疫学(Fundamental Immunology)，Raven Press，New York，N.Y)。

所有的免疫球蛋白在它们的重链CH1结构域的C末端均存在一铰链区，所述铰链区将分子分成Fab和Fc区域。多数情况下，铰链区使得在分子的抗原结合(Fab端)组分和效应物-相互作用(Fc)组分间存在很大程度的柔性，由此连接起抗体的两个主要功能元件。在IgG同种型中，链间二硫键一般在该铰链区内形成，从而生成最终的四聚体分子。

除IgM外，铰链区主要由脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸组成，这些氨基酸趋向于阻止二级结构的形成且被认为可赋予铰链柔性。IgG1同种型常被用于融合蛋白质，在其铰链区含有的两个二硫键将两条重链彼此连接起来。相反，IgG2同种型具有四个二硫键(图1)。根据本发明，这些二硫键倾向于促使抗体和Ig融合蛋白质的不正确组装，如在实施例的意外发现中所证实的。

Ig融合蛋白质的有用构型

免疫细胞因子为利用本发明的方法和组合物靶向肿瘤的融合蛋白质治疗剂的唯一一个示例。其他肿瘤毒性分子也可通过融合到本发明的肿瘤特异抗体上而靶向肿瘤。此外，根据本发明的抗体融合蛋白质也可攻击其他类型的病变细胞，例如病毒感染的细胞。

本发明的方法和组合物也可与Fc-X和X-Fc技术联用。根据本发明，在融合蛋白质中使用杂合抗体同种型还进一步提高了连接到免疫球蛋白Fc部分上的靶蛋白或目的多肽的产生和积集。对于Fc-X融合蛋白质，信号肽及随后的免疫球蛋白基因Fc片段构成了靶蛋白质的N末端融合配偶体。然后融合蛋白质可在宿主细胞内表达，例如哺乳动物细胞，如天然表达免疫球蛋白的细胞。N末端融合配偶体内的信号肽-Fc片段将指导靶蛋白通过分泌路径，以使融合蛋白质易于分泌。此外，Fc片段通常为糖基化的且在中性pH下高度带电，这样Fc片段的应用可提高硫水性较高的蛋白质的溶解性。使Fc-X融合蛋白质定向通过分泌路径也减轻了与胞内蛋白质毒性相关的问题，且促进了稳定细胞系的分离。融合蛋白质产物可容易地进行分析和纯化，因为其可容易地以天然构象形式从培养基中得以收集并保留生物活性和酶活性。该技术的功效已经用Fc-leptin和Fc-红细胞生成素进行了证明。这些优点中的一部分也是X-Fc蛋白质所固有的。

根据本发明，抗体部分的有用融合的示例包括Fc-X、X-Fc和X-Fc-Y蛋白质。此类蛋白质含有Fc区域，而非抗体蛋白质或蛋白质片段在N末端、C末端或N末端和C末端同时进行融合。与Fc区域融合的一个有利的效果是融合配偶体的血清半衰期可显著延长。第二个有利的效果是′X′可通过附着Fc而有效进行二聚化。例如，Enbrel为由TNF受体的一部分和人IgG1 Fc区域组成的融合蛋白质。

在本发明的一些实施方案中，沿X-Fc方向设计具杂合同种型的融合蛋白质是特别有利的。这些构建体中靶蛋白质为N末端融合蛋白质且随后为Fc片段。该方法对一些蛋白质可能是有用的，例如对于淋巴细胞表面的糖蛋白(LHR)(参见美国专利5,428,130)。

根据本发明，尽管应用基于重组抗体的融合蛋白质进行治疗优于单独的蛋白质或细胞因子治疗，但这种应用可因融合蛋白质的快速体内循环清除而受到限制，这是因为抗体融合蛋白质的体内循环半衰期显著低于自由抗体的体内循环半衰期。循环半衰期的减小可能是通过Fc受体(FcR)的清除增加的结果。已证明同种型的转换是对半衰期实行改变的一个机制。通过将人重链C区域从IgGγ1或IgGγ3同种型变为IgGγ4同种型已经证明可提高两种免疫细胞因子的半衰期(癌症研究(Cancer Research)59(9)：2159-66，1999)，其中所述IgGγ4为具有降低的FcR结合能力的同种型。基于IgG4的免疫细胞因子和融合蛋白质与起始的基于IgGγ1的融合蛋白质相比，其FcR结合力降低10倍且Fc受体效应子功能如ADCC也降低，但在鼠肿瘤模型中其仍显示出类似或更好的功效。但是，本发明提供了基于杂合抗体的融合蛋白质，所述融合蛋白质在一个单一分子内结合了不同抗体类型的功能和结构特性。

相应地，对于某些申请，由于IgG2同种型的Fc受体结合力低得多，IgG2同种型为抗体融合蛋白质赋予了更好的特性(Hulett等.免疫学进展(Adv.Immunol.)57：1127)。对于整个的抗体融合蛋白质，在仅含Fc区域的融合蛋白质中应用γ2同种型有时是有利的。原理与用于完整抗体的相同：即，通常需要避免由源自其他同种型的Fc区域介导的与Fc受体的结合。

但是，融合蛋白质中IgG2同种型的应用一般会导致某种程度的不适当组装，见本文的描述。本发明的方法和组合物提供了这样的抗体融合蛋白质，其具有最小化的IgG2同种型的效应子功能，但又不具有该同种型的聚集特性。

根据本发明，新杂合同种型抗体和融合蛋白质较之基于IgG2的融合蛋白质显示出增强的表达和改进的组装。此外，杂合同种型抗体和融合蛋白质可在不需要Fc受体效应子功能的治疗中具有提高的功效。

铰链的类型

本发明的杂合同种型抗体也包括其铰链区为突变铰链区的抗体，优选半胱氨酸残基数目减少的铰链区，例如，第一个半胱氨酸突变为丝氨酸的修饰IgG1铰链区。IgG1铰链区的第一个半胱氨酸通常结合到轻链上。在Fc-X蛋白质或X-Fc蛋白质或其他任何缺乏轻链的抗体融合蛋白质中，该半胱氨酸不能行使其天然功能，并因此可进行突变。但是，根据本发明，具有缺失第一个半胱氨酸的IgG1铰链和IgG2的CH1结构域的杂合同种型抗体可与轻链连结，因为轻链通常会与IgG2的CH1结构域内的半胱氨酸形成二硫键。IgG2铰链内的四个半胱氨酸被认为彼此形成二硫键。

根据本发明，抗体或Ig融合蛋白铰链区中参与重链-重链同二聚化的半胱氨酸可对抗体或Ig融合蛋白质的表达和组装产生显著的影响。特别是，较高数目的半胱氨酸可由于二硫键的错误形成而导致抗体或Ig融合蛋白质的错误组装。这样，本发明公开了对参与重链同二聚化的一个或多个半胱氨酸的突变可导致抗体或Ig融合蛋白质表达或组装的提高。在一优选的实施方案中，重链同二聚化半胱氨酸可突变为，以通常优选的顺序，丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或硒代半胱氨酸。

应用在最N末端的第一个半胱氨酸发生突变的IgG1铰链是特别适宜的。该铰链区的优势在于其仅含有两个半胱氨酸。IgG1铰链的第一个半胱氨酸通常与轻链中的半胱氨酸形成二硫键。但是，在缺乏轻链的Ig融合蛋白质中，如Fc-X、X-Fc和X-Fc-Y蛋白质，IgG1铰链中的此最N端半胱氨酸不起这样的作用，因此可进行突变(Lo等.蛋白质工程(ProteinEngineering)11：405-500[1998])。如在实施例中所描述，具两个半胱氨酸的IgG1铰链也可用于其中CH1结构域源自IgG2的完整抗体或完整抗体融合蛋白质，因为IgG2的CH1结构域具有可与轻链形成二硫键的半胱氨酸。

Fc受体

IgG分子可与多种细胞受体相互作用，包括三类对IgG类抗体具特异性的Fcγ受体(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcyγIII。这些受体负责摄取抗原抗体复合物。Fc上的Fc受体结合位点位于铰链附近的CH2结构域中，且据认为V区与抗原的结合可帮助轻链恒定区移位以不再在空间上封闭铰链。由此，结合抗原的抗体将优先地与Fc受体结合。

第四种受体，又可称为′保护受体′(FcRp)或′新生儿受体′(FcRn)，负责在抗体抗原复合体被内吞以及它们在内体中解聚后从内体中回收抗体。FcRp的结合位点存在于三维抗体结构中CH2和CH3结构域间的连接处。IgG抗体的血清半衰期取决于与功能性FcRp的生产性相互作用。其他的抗体类型，例如IgM、IgD、IgE和IgA，不与FcRp结合。

某些抗体的另一结合配偶体是C1q，其介导补体固定。

与Fc受体和FcRp的相互作用也影响到含Fc部分的融合蛋白质的生物活性和代谢。

例如，结合FcR的能力较弱的融合蛋白质与具有较好FcR结合能力的相应融合蛋白质相比具有较长的血清半衰期。结合FcRp的能力较弱的融合蛋白质与具有较好FcRp结合能力的相应融合蛋白质相比具有较短的血清半衰期。

例如，含IgG2的CH2和CH3结构域的Ig融合蛋白质比含IgG1的融合蛋白质具较长的血清半衰期。同样，含源自IgG3的Fc区域的融合蛋白质比含IgG1或IgG2的相应融合蛋白质具有较短的血清半衰期。含源自IgM、IgD、IgE和IgA的CH2和CH3结构域的融合蛋白质比源自IgG的相应融合蛋白质具有甚至更短的血清半衰期。

为说明本发明的应用，可方便地将抗体和Ig融合蛋白质分为两个大类：需要免疫球蛋白的效应子功能的蛋白质以及其中Ig部分用作免疫学惰性载体且缺乏效应子功能的蛋白质。在前一类蛋白质中，可方便地构建如下具有杂合同种型的蛋白质，在该蛋白质中产生多种效应子功能的特定集合。在后一类别中，可方便地构建如下具有杂合同种型的蛋白质，所述杂合同型蛋白质包括具有最小效应子功能的某些同种型的区域和可促进如蛋白质的组装的来自其他同种型的区域，见如下描述。

抗体和Ig融合蛋白的组装

本发明公开了如下发现，即抗体或Ig融合蛋白质的铰链在融合蛋白质(例如从哺乳动物细胞分泌的Ig融合蛋白质)的正确组装和减少聚集方面起到重要作用。例如，不希望被理论束缚，认为抗体和Ig融合蛋白质的组装包括这样的步骤，其中两条重链首先通过CH3内的疏水斑进行非共价连接。此连接之后，铰链区进行对齐且链间二硫键得以形成。铰链区距CH3结构域的疏水斑约50埃。

在设计抗体或Ig融合蛋白质构建体时，改变铰链区是有益的。例如，将特定表达构建体中的编码铰链区的DNA替换为编码不同的铰链区，例如来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE或IgY的铰链区的DNA是有益的。

根据本发明的理论，例如，含有带较多半胱氨酸的铰链区的抗体和Ig融合蛋白质不能与带有较少半胱氨酸的相应蛋白质一样有效地组装。不希望被理论束缚，具有较多半胱氨酸的铰链区将表现出更多的错误匹配半胱氨酸及错误形成二硫键的机会。结果是，与具有含较少半胱氨酸的铰链区的相应抗体和Ig融合蛋白质相比，可发现具有含较多半胱氨酸的铰链区的抗体和融合蛋白质更易于发生高度聚集并且其存在多种电泳类型。此现象的举例说明在实施例中给出。

例如，含具有四个半胱氨酸的铰链区的抗体和Ig融合蛋白质的组装效率低于含三个或两个半胱氨酸的抗体和Ig融合蛋白质的组装效率。例如，含源自IgG2的铰链区的蛋白质的组装效率低于含源自IgG1的铰链区的相应蛋白质。在一独特的实例中，含源自IgG3的铰链区的蛋白质组装效率低下；IgG3铰链区含有11个半胱氨酸。

本发明的用途尤其可在需要最小限度结合Fc受体I的情形下得以阐明。例如，在融合蛋白质的情形中，可方便地应用来自IgG2的CH2和CH3结构域，由于与FcR的结合显著减少，故可以减少ADCC和延长血清半衰期。但是，IgG2铰链区的应用导致产生的抗体或Ig融合蛋白质组装效率低下。而应用IgG2的CH2和CH3区与IgG1铰链联合是特别适宜的，见在以下的多个实施例中的阐述。

在一些实施例中还举例阐明了一个类似发现，即，特定铰链或其他结构域的选择可影响抗体或Ig融合体的生产水平。该发现具有重要的经济价值，因为诸如完整抗体等蛋白质药物经常需要大剂量给药，例如每个病人的每次给药为几百毫克。通常发现，选择具有最少数目半胱氨酸的铰链，例如具有三个或两个半胱氨酸的铰链能提高真核表达系统中抗体或Ig融合蛋白质的生产。降低半胱氨酸的数目可通过突变或通过用一种同种型的铰链替换另一同种型的铰链或同时采用二者而实现。

提高蛋白酶抵抗力

铰链区对蛋白酶特别敏感。在经典实验中，通过在铰链区进行蛋白酶切割将抗体分成Fab区和Fc区。

可方便地构建其铰链区来自IgA且其他组分来自其他抗体同种型的抗体和Ig融合蛋白质。例如，如果抗体或Ig融合蛋白质需经口或经过另外的粘膜表面，如鼻、肺、子宫或直肠粘膜递送时，应用具有强蛋白酶抗性的蛋白质可以保护抗体或Ig融合蛋白质免受存在的蛋白酶的作用。例如，构建含IgA铰链和来自IgG的CH2和CH3结构域的抗体或Ig融合蛋白质是有利的，这样该杂合同种型蛋白质将具有蛋白酶抵抗特性及，在蛋白质进入循环后，延长的血清半衰期。IgA1铰链为优选的铰链，因为IgA1铰链内的糖基化位点具有广谱的蛋白酶抗性。相反，IgA2的铰链较短且能抵抗特异切割IgA1铰链的细菌蛋白酶。

其他同种型重链也含有对抵抗蛋白酶起作用的糖基化位点。例如，IgA、IgD、IgE和IgM在恒定区含有对抵抗蛋白酶起作用的糖基化位点。例如，IgE的CH1结构域含有三个N连接的糖基化位点。将IgE的CH1结构域与，例如，来自IgA的铰链以及与来自IgG的CH2和CH3结构域结合是有利的。

将来自一种同种型的糖基化位点掺入到另一同种型的CH2或CH3区中也是有利的。在此情况下，以完整结构域，即由单一外显子编码的区域所限定的结构域，构建抗体或Ig融合蛋白质一般是不够的，因此构建杂合结构域是有利的。例如，将IgG同种型特有的FcRp结合特性与其他同种型的蛋白酶抵抗特性进行结合是有利的。为获得此类特性结合，需要构建具有来自两个不同同种型的氨基酸序列的单一结构域。然后生成的杂合结构域可用于构建Ig与非Ig部分的融合体。

例如，可方便地用来自IgE CH2结构域且包含序列VNLTW(SEQ IDNO：3)的一段氨基酸替换IgG CH2结构域内的相应氨基酸。例如，在IgG1中这些氨基酸为VKFNW(SEQ ID NO：4)且在IgG3中这些氨基酸为VQFKW(SEQ ID NO：5)。根据本发明，在其他CH2结构域内的相应氨基酸可通过与其他同种型的CH2结构域进行计算机比对或结构比对来确定，或由已发表文献确定(Paul，WE基础免疫学(Fundamental Immunology)，第四版，第3章，46-47页)。

类似地，将其他糖基化位点掺入到IgG中也是有利的。例如，可以使用来自IgD的含NTSGF(SEQ ID NO：6)或LNASR(SEQ ID NO：7)序列的序列片段替换抗体或Ig融合蛋白质中源自IgG的Fc区域内的相应序列。根据本发明，抗体恒定区内的其他有用糖基化位点在Paul(基础免疫学(Fundamental Immunology)，第四版，第3章)及其中的参考文献中公开。

在本发明的一些实施方案中，非IgG糖基化位点的掺入减弱了与FcRp的相互作用。在此情况下，需要在提高蛋白酶抗性和降低血清半衰期间作出权衡，且此杂合同种型蛋白质的有用性必须在特定的应用环境下进行评估。

根据本发明，特定杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质的蛋白酶抗性可以根据标准方法进行测试。蛋白酶可购自供应商且根据生产者的说明书在特定杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质存在条件下进行孵育。蛋白水解的检测，例如，可以通过SDS胶电泳和对起始材料和切割产物进行定量而实现。

根据本发明，杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质与FcRp相互作用的能力也可根据标准方法进行测定。例如，抗体或Ig融合蛋白质的药物动力学特性可在哺乳动物中进行检测，所述哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、狗、非人灵长类或人。抗体或Ig融合蛋白质的药物动力学特性为FcRp结合的一个实际指征，且通常，将FcRp结合特性掺入到抗体或Ig融合蛋白质中是意在提高抗体的药物动力学特性。也可方便地检查FcRp-Fc复合体的三维结构以确定特定的杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质是否可能与FcRp互相作用(Martin，W.L.，等：以2.8A检测的FcRn/异源二聚体Fc复合体的晶体结构：pH-依赖性结合的机制Mol.Cell 7 pp.867[2001]；structure ID 1 I1A于http://www.rcsb.org/pdb/)。

根据本发明的此方面，构建Fc-X形式的蛋白质是特别有用的，其中Fc区含来自IgA1的铰链区，且其所含CH2和CH3区包含IgG2中介导FcRp结合的那些元件以及与其他IgG相比具有减少的效应子功能的那些CH2元件。

提高抗体或Ig融合蛋白质的效价

根据本发明，构建高效价的、但又具有低效价抗体特有的效应子功能或其他特性的杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质有时是有利的。IgA和IgM由于通过CH3区内的链间二硫键寡聚化而具有高的效价。IgA和IgM在CH4的C末端附近的半胱氨酸到J链间也存在二硫键。IgA为二聚体而IgM为五聚体或六聚体，这样IgA具有4个抗原结合位点而IgM具有10或12个抗原结合位点。

但是，IgM和IgA并不介导ADCC。为构建介导ADCC的多价抗体或Ig融合蛋白质，构建具有IgG的CH2结构域和IgM或IgA的CH3和CH4结构域的蛋白质是有利的。通常，优选地应用IgM的CH3和CH4结构域，因为产生的杂合同种型蛋白质的效价高于相应的含IgA的杂合同种型蛋白质的效价。

以下的申请阐明了具有增高效价的杂合同种型蛋白质的应用。许多肿瘤细胞在其细胞表面过表达EGF受体。EGF也在许多正常细胞的表面表达，因此正常细胞和肿瘤细胞间EGF受体的表达仅在数量上有区别。根据本发明的一个实施方案，有用的IgG-IgM杂合同种型抗体包含与人EGF受体具有弱相互作用的V区域。对V区亲合力的选择使得融合蛋白质不能有效的与正常细胞上的EGF-R作用，但由于亲合力效应却可与肿瘤细胞上过表达的EGF受体相互作用。应用IgG的CH2结构域，例如IgG1的CH2结构域可介导抗肿瘤细胞的ADCC。

为提高特异的杀肿瘤细胞效应，将抗EGF-R的IgG-IgM杂合同种型蛋白质与具有抗肿瘤活性的蛋白质进行融合是有利的，所述具有抗肿瘤活性的蛋白质如细胞因子。例如，可应用IL-2。备选地，将放射性原子缀合到杂合同种型蛋白质上是有利的，这样杂合同种型蛋白质在肿瘤区的聚积将促成对肿瘤的优先辐射。例如，可将钇90缀合到IgG-IgM杂合同种型蛋白质上。将ADCC与IL-2活性或ADCC与放射性结合对杀肿瘤细胞是特别有利的。

在IgG-IgM融合蛋白质，例如以上所描述的抗肿瘤蛋白质中，应用IgG(优选的为IgG1)铰链区一般也是有利的。对于许多应用，来自IgG3的铰链区为最次的IgG铰链区，因为该铰链区趋向于造成可变组装；此外，IgG3铰链易于发生蛋白水解(Baici A，等，Scand J Immunol.[1980]12：41-50)。

前述的实例阐明了本发明此方面的一般原则：即在靶细胞类型上的表达高于正常细胞上的表达的抗原更可能被具有高效价但相对低的单价亲合力的抗体或Ig融合蛋白质有效靶向。

例如，在自体免疫性疾病中，某些免疫细胞如T细胞表达较高水平的细胞表面蛋白质，例如细胞因子受体。用高效价的针对此上调的表面蛋白质的IgG1、IgG2或IgG4-IgM抗体或Ig融合蛋白质攻击此类免疫细胞是有利的。在此方法中，将最小限度地靶向细胞表面存在此蛋白质但此蛋白的量未被上调的细胞。例如，在攻击自体免疫性疾病的过程中，有用的是，用于治疗患者的IgG-IgM融合蛋白质中的V区指导对抗，例如IL-2受体、IL-12受体或任何的其他上调的受体。铰链区和CH2结构域优选地来自IgG1、IgG2或IgG4，且CH3和CH4区优选地来自IgM。为治疗自体免疫性疾病，V区优选与IL-2或IL-12受体弱结合。该治疗具有杀伤一个亚类的T细胞而不是整个的T细胞库的效应。

表达具有杂合同种型的抗体和Ig融合蛋白质的表达质粒的构建

本发明也提供了编码本发明的抗体和融合蛋白质的核酸。当编码核酸也编码分泌盒子时本发明可以得到最好的实施，所述盒子在转录和翻译后产生信号肽。信号肽一般从成熟产物中切除。分泌的融合蛋白质可由培养基中收集而不需裂解宿主细胞，然后可测试其活性或按需要应用普通试剂进行纯化。在一些情况中，某些融合配偶体的存在，例如细胞因子CNTF，允许在不存在分泌盒子的条件下分泌Ig融合蛋白质。

本领域内的普通技术人员可应用带有内含子的DNA进行重组DNA的构建，因为天然存在的内含子将编码铰链的DNA与编码CH1和CH2结构域的DNA分隔开来。可应用内含子内的限制性位点。备选地，由于铰链区的长度一般仅为约15-70个氨基酸，故可以构建出编码整个铰链区的合成DNA，例如应用寡核苷酸合成、PCR或它们的组合进行。然后可以应用标准重组DNA技术，将合成的编码铰链的区域放入编码Ig融合蛋白质的表达质粒中。

本发明由以下非限定的实施例进行进一步的阐述。

实施例

实施例1：表达具有来自不同抗体同种型的铰链区和CH2结构域的Fc-X融合蛋白质的质粒的构建。

表达HuFcγ1-Leptin的质粒的构建已在PCT出版物WO00/040615A2中描述。

如下所述构建具有IgG2来源的Fc和C末端融合配偶体的融合体的表达质粒。

首先，获得人γ2Fc的基因组序列。编码人Fcγ2的基因组DNA通过PCR从分离自人PBMC的细胞DNA中获得。正向引物的序列为5′CCTTAAGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG(SEQ ID NO：8)，其中AFlII限制性位点C TTA AG被导入到γ2铰链编码区GAG CGC AAA TGTTGT GTC GAG(SEQ ID NO：9)的紧上游。反向引物的序列为5′CCTCGAG TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA G(SEQ ID NO：10)，其中XhoI限制性位点CTCGAG被导入到紧接翻译终止密码(反密码子TCA)之后。此外，反向引物也通过沉默突变(划线的A到G替换)导入了SmaI位点CC CGG G。910 bp的PCR片段克隆到TOPO TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用于确认序列。

第二，将人γ2Fc放入表达载体。存在于编码CH3上部区域的DNA序列CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG(SEQ ID NO：11)中的天然SmaI限制性位点通过沉默突变得以去除，此沉默突变通过重叠PCR技术导入(Daugherty，B.L.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)19：2471-6，1991)。正向引物的序列为5′CTG CCC CCA TC A CGG GAG GAGATG ACC AAG(SEQ ID NO：12)，其中划线处为C到A的替换；且反向引物的序列为5′GGT CAT CTC CTC CCG TGATGG GGG CAG GGTGTA C(SEQ ID NO：13)，其中划线处为G到T的替换。确认了序列后，产生的编码Fcγ2的AflII、XhoI限制性片段在翻译终止密码子上游含有唯一的SmaI位点，且在终止密码子的下游含有一个XhoI位点。然后编码Fcγ2的AflII-SmaI片段用于替换pdCs-huFcγl-Leptin(PCT出版物WO00/040615A2)中编码Fcγ1的相应限制性片段以产生pdCs-huFcγ2-Leptin。

第三，编码Fcγ2铰链的DNA由来自γ1的改变的铰链替换。γ2铰链区含有四个半胱氨酸二硫键。以下显示的是含γ2铰链外显子的AflII-StuI片段。AflII位点(C TTA AG)位于编码信号肽的DNA序列之后。谷氨酸(E)为γ2铰链的第一个氨基酸残基。小写字母代表γ2铰链外显子之后的内含子序列。由于C甲基化存在于序列ccagg和反向链cctgg中，StuI限制性位点(aggcct)在大多数的大肠杆菌菌株中由DCM甲基化酶进行了C-甲基化；当甲基化时，该位点不能被StuI切割。

ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：

14)

C TTA AGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC CCA CCG TGC CCA G

gtaagccagcccaggcct(SEQ ID NO：15)

pdCs-huFcγ2-Leptin中含γ2铰链外显子的AflII-StuI片段被来自pdCs-huFcγ1-Leptin的含γ1铰链外显子的相应AflII-StuI片段替换，此相应片段的序列如下所示：

EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：

16)

C TTA AGC GAG CCC AAA TCT TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA G

Gtaagccagcccaggcct(SEQ ID NO：17)

pdCs-huFcγ1中的γ1铰链序列含有Cys到Ser突变(划线处)，这就消除了与IgG1轻链形成二硫键的Cys残基(Lo等，(1998)蛋白质工程(Protein Engineering)11：495-500)。由于在γ1和γ2外显子内的StuI位点均发生C-甲基化且StuI限制性内切酶对甲基化敏感，故在用StuI酶消化之前，从DCM阴性的细菌菌株中分离这两种质粒。产生的具有来自pdCs-huFcγ1的铰链区的pdCs-huFcγ2-Leptin命名为pdCs-huFcγ2h-Leptin(γ2h：具有改变的铰链的γ2)。

实施例2：表征huFcγ2-leptin和huFcγ2h-leptin免疫融合体的寡聚化状态。

我们对应用具γ1、γ2和γ2h同种型的表达载体pdCs-huFc-huLeptin从NS/0细胞中表达蛋白质进行了评估。并评估了不同形式的huFc-hu-Leptin的物理状态，其中HuFc部分源自γ1、γ2和γ2h同种型。

根据标准方法，用如上和如在Lo等的描述中所产生的DNA构建体转染NS/0细胞并产生稳定的表达细胞系。

在此实施例和以下的实施例中，稳定的转染子按以下的方法产生。质粒DNA通过电穿孔导入鼠骨髓瘤NS/0细胞。NS/0细胞生长在Dulbecco改良Eagle培养基中，此培养基补充了10％的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素。约5×10⁶个细胞用PBS洗涤一次并重悬于0.5ml的PBS中。10μg的线性化质粒DNA与细胞在Gene电击杯(0.4cm的电极间隙，BioRad)中冰上孵育10min。应用Gene电穿孔仪(BioRad，Hercules，CA)进行电穿孔，设置条件为0.25V和500μF。细胞在冰上复苏10min后重悬在生长培养质中并接种两个96孔板。在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下通过生长来筛选稳定转染的克隆，所述氨甲喋呤在转染后两天加入。每3天饲喂细胞共两到三次或更多次，且抗MTX的克隆在两到三周内形成。来自克隆的上清液用抗Fc ELISA试验测定以鉴定高产克隆。分离高产克隆并在含100nM MTX的生长培养基中繁殖。

应用抗huFc抗体(辣根过氧化物酶连接的山羊抗-huIgG、Fcγ1或Fcγ2，来自Jackson ImmunoResearch)通过抗huFc ELISA测定上清中HuFc-hu-Leptin的浓度。γ1和γ2h构建体在瞬时和稳定转染中都以高水平表达，而γ2构建体上清中检测到的表达水平相对较低。用编码huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的等价表达载体进行的瞬时转染中，huFcγ2h-huLeptin的产量高8倍。

对于纯化，使组织培养上清中的融合蛋白质结合到蛋白质ASepharose上，然后在磷酸钠缓冲液(100mM NaH₂PO₄，pH3，和150mMNaCl)中洗脱。然后洗脱物用0.1体积的2M Tris-盐酸pH8)中和，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和HPLC-大小排阻层析(SEC)评估。

融合蛋白质在非还原条件下用SDS-PAGE检测。通过考马斯染色观察到的蛋白质条带显示HuFcγ1-huLeptin的表观分子量为96kD，这表明其为二价单体。SDS-PAGE分析显示多数huFcγ2-huLeptin融合蛋白质为较高分子量形式，迁移时显示为梯形条带，表观分子量比Fc-Leptin的分子量高得多。相反，huFcγ2h-huLeptin主要为单一种类，迁移到96kD处。

huFcγ2h构建体的大小排阻层析(SEC)分析与SDS-PAGE的结果相关联，且显示出huFcγ2h-leptin和huFcγ1-leptin均有约83％为单体，而类似的huFcγ2-huLeptin融合蛋白质有约55％为单体。

用固定的J774细胞(所述细胞富含FcγR类受体)进行的研究表明，仅huFcγl-huLeptin融合蛋白质显示有Fc结合。此外，还应用了BAF-3细胞，该细胞经过转染可表达leptin受体，这样leptin可刺激这些细胞的增殖(Gainsford，T.，等.PNAS[1996] 93：14564-14568)。对BAF3/leptin受体细胞的研究表明huFcγ1-huLeptin、huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin具有等价的leptin生物活性。

我们还鉴定了表达huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的稳定哺乳动物细胞克隆。在基本相同的条件下转染细胞且克隆了相同数目的稳定转染的细胞并测试了huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的产生。对于huFcγ2h-huLeptin的最佳表达克隆，其huFc-huLeptin产量约比huFcγ2-huLeptin的最佳表达克隆的产量多5倍。

实施例3：具有来自不同抗体同种型的铰链区和CH2区的X-Fc融合蛋白质的表达质粒的构建。

编码胰高血糖素样肽1(GLP-1)第7到37位氨基酸残基(SEQ ID NO：19)的合成DNA序列(SEQ ID NO：18)如以下公开。

HAEGTFTSDVSSYLEG

C TTA AGC CAT GCT GAA GGG ACC TTT ACT AGT GAT GTA AGT TCT TAT TTG GAA GGC

QAAKEFIAWLVKGRG

CAA GCT GCC AAG GAA TTC ATT GCT TGG CTG GTG AAA GGC CGA GGA GGA TCC TTA

AGC

编码GLP-1肽的DNA之前为C TTA AGC，在此处应用AflII限制性位点将此DNA片段与编码信号肽序列的DNA片段(Lo等.蛋白质工程(Protein Engineering))进行连接。在3′末端，编码GLP-1的DNA之后为BamHI限制性位点(GGA TCC，其编码氨基酸残基G和S)和AflII限制性位点(所述位点用于连接具有翻译终止密码子的编码Fcγ2(或Fcγ2h)的AflII-XhoI限制性片段(参见实施例1))。

实施例4：GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h免疫融合体的寡聚化状态表征。

由实施例3产生的载体pdCs GLP-1 huFcγ1、pdCs GLP-1 huFcγ2和pdCs GLP-1 huFcγ2h用于瞬时和稳定转染哺乳动物细胞，以表达GLP-1(7-37)huFcγ1、GLP-1(7-37)huFcγ2和GLP-1(7-37)huFcγ2h。

在用蛋白质A Sepharose纯化后，对每一GLP-1 huFc融合蛋白质的聚集状态和总蛋白质表达通过SDS-PAGE和HPLC-SEC进行评估，所述评估应用在实施例2中描述的一般方法进行。蛋白质条带用考马斯染色显示。GLP-1 huFcγ2和GLP-1 huFcγ2h的SDS-PAGE表观分子量约为60kD。上清中的GLP-1 huFc变体的浓度由抗huFc ELISA测定。用编码GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h的等价表达载体的瞬时转染中，GLP1-huFcγ2h的产量约提高1.5倍。

总细胞裂解物的SDS-PAGE分析表明，约一半的GLP1-huFcγ2融合蛋白质具有不正确的二硫键，这由存在多条表观分子量为100到200KD的高分子量迁移形式所证明。相反，基本上所有可检测的GLP1-huFcγ2h融合蛋白质都以约60kD的表观分子量进行移动。当样本在进行SDS-PAGE前被还原，GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h蛋白质以基本相同的约34KD的表观分子量移动。

γ1、γ2和γ2h融合蛋白质的HPLC-SEC比较分析表明，修饰的γ2h融合蛋白质的单体形式显著多于其他融合蛋白质。如由单峰所显示，修饰的GLP1-huFcγ2h融合蛋白质有84％为二价单体，而GLP1-huFcγ1和GLP1-huFcγ2融合蛋白质具有分别对应于约42％和33％的二价单体的多峰。

由此证实，具有IgG1的铰链和IgG2的CH2和CH3结构域的GLP-1-Fc融合蛋白质的组装特性令人惊奇地优于具有来自IgG1或IgG2的完整Fc区域的GLP1-Fc融合蛋白质。

实施例5：含IgG2的CH1、CH2和CH3结构域和IgG1铰链的特异针对病变细胞的完整抗体的构建。

应用分离自人PBMC的细胞DNA通过PCR获得编码免疫球蛋白γ2恒定区(CH1、铰链、CH2和CH3)的基因组DNA。正向引物的序列为5′CAAGCTTTCTGGGGCGAGC(SEQ ID NO：20)，其中HindIII限制性位点AAGCTT导入到距CH1外显子上游约220bp处的内含子序列内。反向引物序列为5′CCTCGAG TCA TTT ACC CGG GGA CAG GGA G(SEQ ID NO：21)，其中XhoI限制性位点CTCGAG导入到紧接翻译终止密码子(反密码TCA)之后，且通过沉默突变产生SmaI CCCGG G，如已在实施例1中描述的。编码CH3上部区域的DNA序列中的天然SmaI限制性位点也通过沉默突变进行消除，所述突变通过重叠PCR引入，如在实施例1中所描述的。本领域内的技术人员将认识到，通过利用实施例1中获得的编码Fcγ2的限制性片段，可容易地构建出编码CH1、铰链、CH2和CH3区及含有单一SmaI限制性位点的约1810碱基对(bp)的HindIII-XhoI限制性片段。进行序列确认之后，用编码γ2恒定区的HindIII-XhoI片段置换pdHL7-huKS γ1-IL2中编码γ2恒定区的HindIII-XhoI片段，以产生pdHL7-huKS γ2抗体。

huKS γ2h抗体的表达载体的构建如下所示。质粒pdCs-huFcγ2h-Leptin用作PCR模板以产生～130bp的PstI-PvuII限制性片段，所述限制性片段仅编码修饰的γ1铰链区，该区中半胱氨酸改变为丝氨酸。正向引物的序列为5′CTGCAGAGCCCAAATCTTC(SEQ ID NO：22)，其中在γ1铰链外显子的起始处(具有如上所述的C到S的突变)恢复了天然的PstI(CTGCAG)限制性位点。反向引物的序列为5′CAGCTGGGGCCTGTCCCTG(SEQ ID NO：23)，其与铰链和CH2外显子间的内含子中的Pvu II位点(CA GCTG)对应。确证了序列后，用该～130bpPstI-PvuII限制性片段替换pdHL7-huKSγ2抗体中的相应片段以产生pdHL7-huKSγ2h抗体。

实施例6：非还原状态下抗病变细胞的γ2抗体和相应γ2h抗体的表征。

带有IgGγ1、γ2和γ2h同种型的KS抗体的载体pdHL7用Lipofectamine Plus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通过脂转染导入哺乳动物细胞以用于瞬时转染，所述操作根据供应商的实验指南进行。稳定转染子的产生如在实施例2中的描述。

条件培养基(10％血清)中的KS抗体用蛋白质A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)捕获，并在用SDS-PAGE表征前通过在含或不含2-巯基乙醇的蛋白质上样缓冲液中煮沸而得以洗脱。考马斯染色可见非还原的KSγ2抗体以几种形式迁移，分子量约为150kD。相反，KSγ2h抗体以一条主要带迁移，表观分子量为150kD。当KSγ2抗体和KSγ2h抗体在SDS-PAGE前用巯基乙醇还原时，对于KSγ2抗体和KSγ2h抗体可观察到对应于重链和轻链条带的相同条带图形。

不被理论所束缚，这些观察结果暗示KSγ2所表现的多个不同迁移种类是二硫键接合模式变化的结果。

表达KSγ2抗体和KSγ2h抗体的稳定哺乳动物细胞克隆也得以鉴定。在基本相同的条件下进行细胞转染且克隆了类似数目的稳定转染细胞并测试huFc KSγ2抗体和KSγ2h抗体的产量。四株最佳表达KSγ2h抗体的克隆在每ml组织培养上清中约产生114、98、85和49毫克的抗体，而在相同的条件下，四株最佳表达huFc KSγ2抗体的克隆在每ml组织培养上清中约产生36、34、15和13毫克的抗体。

实施例7：包括完整抗体的融合蛋白质的构建，所述完整抗体含IgG2的CH1、CH2和CH3结构域和IgG1铰链。

在此实施例中，测试了抗体融合蛋白质的有用性，所述融合蛋白质中的抗体部分具有杂合同种型。

用分离自pdHL7-huKS-IL2的SmaI-XhoI限制性片段替换pdHL7-huKSγ2抗体中的SmaI-XhoI限制性片段，以构建出用于huKSγ2-IL2的表达载体pdHL7-huKSγ2-IL2，所述pdHL7-huKSγ2抗体中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQ ID NO：24)，随后为XhoI粘性末端。pdHL7-huKS-IL2中的SmaI-XhoI限制性片段含有序列GGGTAAA及其后紧随的编码成熟IL2的DNA序列，包括翻译终止密码子。产生的表达载体pdHL7-huKSγ2-IL2用于转染细胞以表达蛋白质。

同样，用前一自然段所描述的分离自pdHL7-huKS-IL2的SmaI-XhoI限制性片段替换pdHL7-huKSγ2h抗体中的SmaI-XhoI限制性片段，以构建出用于huKSγ2h-IL2的表达载体pdHL7-huKSγ2h-IL2，所述pdHL7-huKSγ2h抗体中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQID NO：24)，随后为XhoI粘性末端。产生的表达载体pdHL7-huKSγ2h-IL2用于转染细胞以表达蛋白质。

实施例8：非还原状态的γ2-抗体融合蛋白质和相应γ2h抗体融合蛋白质的表征。

编码KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的质粒用Lipofectamine Plus(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)通过脂转染导入哺乳动物细胞以实现瞬时转染，所述操作根据供应商的实验指南进行。

为获得稳定转染的克隆，质粒DNA通过电穿孔导入鼠骨髓瘤NS/0细胞，如在实施例2中所描述的。

具有γ2和γ2h同种型的KS-IL2融合蛋白质通过SDS-PAGE进行表征，如在实施例6中所描述的。条件培养基(10％血清)中的抗体融合蛋白质被捕获在蛋白质A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上，并在用SDS-PAGE表征前通过在含或不含2-巯基乙醇的蛋白质上样缓冲液中煮沸而得以洗脱。考马斯染色可见非还原的KSγ2-IL2以几个种类迁移，分子量大小约为180kD。相反，KSγ2h-IL2以一条主要带迁移，表观分子量为约180kD。当KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2在SDS-PAGE前用巯基乙醇还原时，对于KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2观察到对应于重链-IL2和轻链的相同条带图形。

不被理论所束缚，这些观察结果暗示KSγ2-IL2所表现出的多个不同迁移种类是二硫键接合模式变化的结果。

对修饰的γ2h免疫细胞因子进行了动物试验，且在动物肿瘤模型中与起始的基于IgGγ1的免疫细胞因子比较而言，修饰的γ2h免疫细胞因子具有延长的半衰期和更好的功效。

我们还鉴定出表达KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的稳定哺乳动物细胞克隆。在基本相同的条件下转染细胞且克隆了类似数目的稳定转染细胞，并测试KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的产量。四株最佳表达KSγ2h-IL2的克隆在每ml组织培养上清中约产生52、37、31和30毫克的融合蛋白质，而在相同的条件下四株最佳表达KSγ2-IL2的克隆在每ml组织培养上清中约产生31、27、27和17毫克的融合蛋白质。

实施例9：表达抗体融合蛋白质的质粒的构建，所融合蛋白质具有杂合同种型和影响融合蛋白质活性的第二突变

HuKSγ2-Ala-IL2对huKSγ2h-Ala-IL2

用分离自pdHL7-huKSγ1-Ala-IL2的相应SmaI-XhoI限制性片段分别替换pdHL7-huKSγ2抗体和pdHL7-huKSγ2h抗体中的SmaI-XhoI限制性片段，以构建pdHL7-huKSγ2-Ala-IL2和pdHL7-huKSγ2h-Ala-IL2表达载体(如上所描述)，所述pdHL7-huKSγ2抗体和pdHL7-huKSγ2h抗体中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQID NO：24)，随后为XhoI粘性末端。pdHL7-huKSγ1-Ala-IL2的SmaI-XhoI片段含有序列GGGTGCA，其后紧随编码成熟IL2的DNA序列，所述DNA序列包含翻译终止密码子。在融合蛋白质的连接处，GCA编码赖氨酸到丙氨酸的替换。产生的载体用于转染细胞以生产huKSγ2-Ala-IL2和huKSγ2h-Ala-IL2。

实施例10：非还原状态下携带影响融合蛋白质功能的第二突变的γ2-抗体融合蛋白质和相应的γ2h抗体融合蛋白质的表征。

编码KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的质粒用LipofectaminePlus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通过脂转染导入哺乳动物细胞以实现瞬时转染，所述操作根据供应商的实验指南进行。

我们还鉴定出表达KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的稳定哺乳细胞克隆，如在实施例2中描述。在基本相同的条件下进行细胞转染且克隆了类似数目的稳定转染细胞并测试KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的产量。三株最佳表达KSγ2h-Ala-IL2的克隆在每ml组织培养上清中约产生39、38和29毫克的融合蛋白质，而在相同条件下三株最佳表达KSγ2-Ala-IL2的克隆在每ml组织培养上清中约产生22、17和6毫克的融合蛋白质。具有γ2和γ2h同种型的KS-Ala-IL2融合蛋白质通过SDS-PAGE进行表征，如在实施例6中的描述。条件培养基(10％血清)中的KS-Ala-IL2融合蛋白质被捕获在蛋白质A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上，并在SDS-PAGE实验前通过在含或不含2-巯基乙醇的蛋白质上样缓冲液中煮沸而得以洗脱。考马斯染色可见非还原的KSγ2-Ala-IL2以几个种类迁移。相反，KSγ2h-Ala-IL2以一条主要带迁移。当KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2在SDS-PAGE前用巯基乙醇还原时，对于KSγ2Ala--IL2和KSγ2h-Ala-IL2观察到对应于重链-IL2和轻链的相同条带图形。

不被理论所束缚，这些观察结果暗示KSγ2-Ala-IL2所出现的不同迁移种类是由于二硫键接合模式变化的结果。

实施例11：具有源自不同同种型的恒定区的抗体融合蛋白质的表达。

在一些情况中，可能还需要构建这样的Ig融合蛋白质，其中除了铰键区，不同的恒定区也源自不同的重链同种型。为检测此类分子的特性，进行了以下实验。

huKS(γ1：CH1-H)(γ2：CH2-CH3)-Ala-IL2蛋白质为抗体-IL2融合蛋白质，具有含KS VH、来自IgG1的CH1和铰链区以及来自IgG2的CH2-CH3区的IgG重链(在融合连接处具有赖氨酸到丙氨酸的替换，如以上所描述)及随后的IL-2，该蛋白质按如下进行表达。通过用来自pdHL7-KS-IL2的含CH1和铰链区的相应HindIII-AflIII限制性片段替换pdHL7-KSγ2-Ala-IL中的HindIII-AflIII限制性片段构建出表达载体pdHL7-huKS(γ1：CH1-H)(γ2：CH2-CH3)-Ala-IL2。将该表达载体转染导入培养的哺乳动物细胞，如上所述，以产生具有杂合同种型的抗体融合蛋白质。

HuKS(γ1：CH1-H)(γ2：CH2-CH3)(Ala)-IL2杂合体和HuKSγ2(Ala)-IL2抗体-细胞因子融合蛋白质通过非还原SDS-PAGE进行表征，如在实施例6中所描述的。HuKS(γ1：CH1-H)(γ2：CH2-CH3)(Ala)-IL2杂合同种型融合蛋白质迁移为一主要条带，分子量约为180kD。相反，HuKSγ2(Ala)-IL2抗体-细胞因子融合蛋白质在180kD大小范围内以多条带迁移。

当HuKS(γ1：CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2杂合体和HuKS(γ2)(Ala)-IL2抗体-细胞因子融合蛋白质通过还原SDS-PAGE进行表征时，两种蛋白质给出相同的带形，与轻链和重链-IL2融合多肽对应。

不被理论所束缚，看起来HuKS(γ2)(Ala)-IL2抗体-细胞因子融合蛋白质存在至少两种不同的异构体构型，其中差异是由于二硫键结合模式的不同而引起。

实施例12：具有非蛋白质抗原特异性和多亚单位融合配偶体的杂合同种型抗体融合蛋白质的表达。

14.18抗体结合糖脂抗原GD2。白介素-12为异源二聚体细胞因子，包括p35和p40亚单位，它们通过二硫键共价结合。

如以上所描述，杂合同种型，例如IgGI/IgG2杂合体的应用导致与天然同种型如IgG2相比组装增强。组装增强可由表达水平提高证实。

在一个例子中，构建出14.18(γ2)-Ala-IL12和14.18(γ2h)-Ala-IL12表达质粒并在相同的条件下平行瞬时转染导入细胞，如在以上和Gillies等(W009929732)中所描述的。应用了人IL-12。用14.18(γ2h)-Ala-IL12表达质粒转染的培养物比用14.18(γ2)-Ala-IL12转染的培养物在组织培养上清中蛋白质的水平约高40％。

14.18(γ2)-Ala-IL12和14.18(γ2h)-Ala-IL12表达质粒也稳定转染导入细胞，如以上所描述，且对每一转染的四株最佳表达克隆进行了进一步的研究。对于14.18(γ2h)-Ala-IL12，四株最佳表达克隆的平均值比源自14.18(γ2)-Ala-IL12表达质粒的四株最佳表达克隆约高45％。

在第二个例子中，构建了14.18(γ2)-IL12和14.18(γ2h)-IL12表达质粒并在相同的条件下平行瞬时转染导入细胞，如以上所描述的。应用了鼠IL-12。用14.18(γ2h)-IL12表达质粒转染的培养物比用14.18(γ2)-IL12转染的培养物在组织培养上清中蛋白质的水平约高40％。

应用鼠IL-12的14.18(γ2)-IL12和14.18(γ2h)-IL12表达质粒也通过稳定转染导入细胞，如以上所描述，且对每一转染的四株最佳表达克隆进行了进一步的研究。对于14.18(γ2h)-IL12，四株最佳表达克隆的平均值比源自14.18(γ2)-IL12表达质粒的四株最佳表达克隆约高35％。

这些结果表明在融合蛋白质中应用杂合同种型导致表达增强，甚至应用与先前实施例中不同的抗体和不同的非Ig部分也是如此。在此实施例中，将IL-12用作非Ig部分预期可使Ig融合蛋白质的组装明显变得复杂，因为IL-12为异源二聚体。然而，杂合同种型的应用具有有利的效应。

实施例13：应用来自IgA的铰链区的杂合同种型抗体融合蛋白质的表达。

为构建具有增强的蛋白酶抗性的Ig融合蛋白质，生产了IgA/IgG融合蛋白质。

例如，构建Fc-X融合蛋白质，其含人IgA1的铰链区和IgG2的CH2和CH3区。

以下所示为构建产生Fc-X融合蛋白质的表达载体的一个例子，该蛋白质包含来自人IgA1的铰链区和IgG2的CH2和CH3区。实施例1中的质粒pdCs-huFcγ2-Leptin用作载体。

pdCs-huFcγ2-Leptin的含γ2铰链区外显子的AflII-StuI片段被相应的含IgA1铰链区外显子的AflII-StuI片段(SEQ ID NO：25，显示如下)替换：

(AflII)PSTPPTPSPSTP

CTTAAG T CCC TCA ACT CCA CCT ACC CCA TCT CCC TCA ACT CCA

PTPSPSCCH(SEQ ID NO：26)(StuI)

CCT ACC CCA TCT CCC TCA TGC TGC CAC Ggtaagccagcccaggcct

具体地，合成了以下寡核苷酸：

上链：

5′-

TTAAGTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCC

TCATGCTGCCACGGTAAGCCAGCCCAGG-3′(SEQ ID NO：27)

下链：

5′-

CCTGGGCTGGCTTACCGTGGCAGCATGAGGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAGA

TGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAC-3′(SEQ ID NO：28)

将这些寡核苷酸退火，并用于替换pdCs-huFcγ2-Leptin中的相应片段。

由于γ2外显子中StuI位点存在C-甲基化且StuI限制性内切酶对甲基化敏感，因此从DCM阴性细菌菌株分离质粒后用StuI酶消化。产生的具有IgA1铰链区的pdCs-huFcγ2-Leptin命名为pdCs-huFcα1/γ2-Leptin。

将质粒pdCs-huFc α1/γ2-Leptin转染导入真核细胞，且α1(铰链)-γ2(CH2，CH3)-leptin形式的Fc-X蛋白质将以分泌蛋白质形式得以表达。例如，利用实施例2中的细胞和方法。对产生的α1-γ2-leptin蛋白质进行纯化、表征，发现其具有leptin活性且在铰链区对蛋白酶切割相对不敏感。

实施例14：应用IgG和多价免疫球蛋白的组分的杂合同种型抗体融合蛋白质的表达。

为构建具有IgG(如IgG1或IgG3)效应子功能且效价提高的抗体融合蛋白质，可用IgG的CH1、铰链和CH2区以及IgA或IgM的CH3和CH4区构建杂合同种型Ig融合蛋白质。图4显示了IgG-IgM杂合同种型融合抗体的结构。可方便地将非Ig部分融合到IgA或IgM的CH4结构域的C末端。

也可方便地在最C末端的半胱氨酸前截短IgA或IgM重链或突变该半胱氨酸，特别是在IgG/IgA或IgG/IgM杂合同种型融合蛋白质在缺乏J链的情况下进行表达时。该C末端半胱氨酸的正常功能是与J链形成二硫键。通常需要在缺乏共表达J链的条件下表达IgG/IgA或IgG/IgM杂合同种型融合蛋白质，特别是当将非Ig部分融合到重链的C末端上时。

例如，IgG-IgM杂合同种型融合蛋白质可按如下所示构建。质粒pdHL7-huKSγ1-IL2表达的抗体具有可结合上皮细胞粘附分子的可变区和人IgG1的恒定区。该质粒在IgG1 CH2和CH3编码序列间的内含子内含有单一的Ngo M IV位点，并在IgG1 CH3和IL-2部分的编码序列间的连接处含有单一的XmaI位点。编码人IgM CH3和CH4序列的DNA片段通过PCR扩增从人类基因组DNA中产生，所述扩增应用以下的引物：

5’-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3’(SEQ ID NO：29)；和

5’-GCT CCCGGG TCAGTAGCAGGTGCCAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO：30)

备选地，可应用以下的引物；这些引物的特征在于在IgM部分内最靠C末端的半胱氨酸被突变为丝氨酸。

5’-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3’；(SEQ ID NO：31)和

5’-GCT CCCGGG TCAGTAGCTGGTGCCAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO：32)；

产生的DNA片段用Ngo M IV和XmaI切割，然后直接或间接连入已经用Ngo M IV和XmaI切割的pdHL7-huKSγ1-IL2中。例如，可以将编码IgM CH3和CH4结构域的PCR片段首先亚克隆到载体，如TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad CA)中，确认插入的序列，然后用Ngo M IV和XmaI将插入物移出并连入pdHL7-huKSγ1-IL2。产生的杂合同种型重链的氨基酸序列融合到人IL-2上，见SEQ ID No：33中显示。划线处为融合蛋白质的IgM部分。由于人IgM重链中天然存在多态性，也可能产生功能类似的密切相关序列。

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS

WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT

YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG

PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW

YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK

EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK DQDTAIRVFAIPPSFAS

IFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNI

SESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSP

LKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLV

TGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYF

AHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKST

GKPTLYNVSLVMSDTAGTCY

(SEQ ID NO：33)

许多备选的DNA构建策略也是可能的。例如，编码IgM CH3和CH4结构域的DNA序列可从表达IgM的细胞系或细胞群中通过RT-PCR产生。3′PCR引物可与如上所示的相同，但5′引物在Ngo M IV位点和IgM CH3编码序列开头之间掺入一个人工5′剪切位点。

然后用产生的质粒pdHL7-huKSγ1/μ-IL2转染真核细胞，产生的蛋白质从细胞中表达和分泌。例如，应用在先前的实施例中描述的细胞和方法。测试纯化的蛋白质，例如通过电镜或通过大小排阻层析，可发现其具有多聚体结构。对纯化的蛋白质进行进一步的研究，例如通过肽作图，可发现序列...ASICEDD...(SEQ ID NO：34)中的半胱氨酸与其他IgG/IgM杂合同种型亚单位形成链间二硫键。此连接的一个实例在图4中说明。除了图4中的五聚体结构，IgG/IgM杂合同种型蛋白质的最终形式可为六聚体或一些其他类型的多聚体结构。

可发现产生的IgG/IgM杂合同种型融合蛋白质结合Fcγ受体。例如，融合蛋白质将以和人IgG竞争的方式结合J774细胞。

实施例15：应用IgG1和IgG4的组分的杂合同种型抗体的表达。

实施例15-17中的实验目的部分是为了证明杂合同种型抗体在提高主要由IgG4组成的分子的组装中的效用。通常，一般优选形式的IgG分子为H₂L₂形式，具有两条重链和两条轻链。但是，相当大部分的IgG4抗体合成为HL″半分子″，具有一条重链和一条轻链。Angal等(1993；Molec.Immunol.30：105)描述了丝氨酸到脯氨酸的替换，此替换减少了存在于分泌的人IgG4中的″半分子″的数量。

此实施例比较了含相同V区的三种抗体的组装特性，所述三种抗体为：IgG4形式，具有IgG1铰链和IgG4的CH1、CH2和CH3结构域的IgG形式，以及在铰链区具有突变的IgG4形式(Angal等，出处同上)。

应用标准质粒构建技术，构建出名为pdHL7-KS-γ4的质粒。除了该质粒编码IgG4重链恒定区而不是IgG2重链恒定区之外，该质粒与在实施例5中描述的质粒pdHL7-huKSγ2相同。

为构建pdHL7-KS-γ4h，将质粒pdHL7-KS-γ2h生长在dcm(-)大肠杆菌菌株中，分离质粒DNA，且分离编码修饰的IgG1铰链区的60bpPstI-StuI片段用于替换pdHL7-KS-γ4中的相应片段。

为实施比较，按如下构建出铰链区具有突变的IgG4形式(Angal等，出处同上)。设计编码γ4铰链的寡核苷酸双链体，其具有丝氨酸到脯氨酸的替换、5′PstI粘性末端和3′StuI钝性末端，所述寡核苷酸双链体如下：

PstI ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：35)

GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC CCA GGTAAG

ACGT CTC AGG TTT ATA CCA GGGGGT ACG GGT GGA ACG GGT CCATTC

StuI

CCAACCCAGG(SEQ ID NO：36的互补链)

GGTTGGGTCC(SEQ ID NO：36)

该寡核苷酸双链体用于替换pdHL7-KS-γ4中相应的DNA片段以产生pdHL7-KS-γ4(S到P)。

根据如在Lo等，(1998；蛋白质工程(Protein Engineering)11：495-500)中所描述的常规方法，将质粒pdHL7-KS-γ4、pdHL7-KS-γ4h和pdHL7-KS-γ4(S到P)转染导入哺乳动物细胞。从转染细胞的上清中纯化由pdHL7-KS-γ4、pdHL7-KS-γ4h和pdHL7-KS-γ4(S到P)编码的抗体蛋白质，并通过SDS凝胶电泳进行表征，其中对还原和非还原样本进行比较。

通过检测非还原分子，发现KS-γ4抗体群中存在约50％的HL″半分子″和50％的H₂L₂分子。相反，KS-γ4h抗体群和KS-γ4(S到P)抗体群几乎全部以H₂L₂分子存在。HL半分子的比例在KS-γ4h抗体群和KS-γ4(S到P)抗体群中基本相同。当检测还原分子时，KS-γ4、KS-γ4h和KS-γ4(S到P)所显示的重链和轻链图形无可区分的差异。

实施例16：应用IgG1和IgG4的组分的杂合同种型抗体融合蛋白质的表达。

质粒pdHL7-KS-γ4-IL2在Gillies等(癌症研究(CancerResearch)[1999]59：2159)中描述。该质粒编码的抗体融合蛋白质具有识别EpCAM抗原的V区且包含在C末端融合有白介素-2的IgG4重链。

通过与实施例15中所用类似的重组DNA方法，构建出质粒pdHL7-KS-γ4h-IL2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL2。将质粒pdHL7-KS-γ4-IL2、pdHL7-KS-γ4h-IL2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL2转染导入哺乳动物细胞，并根据标准方法表达和纯化相应蛋白质，所述方法例如在Lo等.(参考文献)中描述的方法。从转染细胞的上清中纯化由pdHL7-KS-γ4-IL-2、pdHL7-KS-γ4h-IL-2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL-2编码的融合蛋白质，并通过SDS凝胶电泳进行表征，其中对还原和非还原样本进行比较。

通过测试非还原分子，发现KS-γ4-IL-2融合蛋白质群体中存在约50％的HL″半分子″和50％的H₂L₂分子。相反KS-γ4h-IL-2融合蛋白质群体和KS-γ4(S到P)-IL-2融合蛋白质群体几乎全部以H₂L₂分子存在。HL半分子的比例在KS-γ4h-IL-2融合蛋白质群体和KS-γ4(S到P)-IL-2融合蛋白质群体中大约相同。当检测还原分子时，KS-γ4-IL-2、KS-γ4h-IL-2和KS-γ4(S到P)-IL-2所显示的重链和轻链图形无可区分的差异。

实施例17：应用IgG1和IgG4的组分的杂合同种型Fc融合蛋白质的表达。

进行以下的步骤，以产生表达融合蛋白质的一组质粒，所述蛋白含铰链区、CH2和CH3结构域和非Ig部分，其中的Ig部分源自IgG4和IgG1。

首先，应用与实施例1中所述类似的方法，通过将pdCs-huFcγ1中IgG1来源的DNA序列(Lo等，蛋白质工程(Protein Engineering)[1998]11：495-500)替换为编码IgG4相应部分的序列以产生编码IgG4的Fc区域的表达载体。具体地，以下的寡核苷酸序列

ESKYGPPCPSC(SEQ ID NO：

37)

C TTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC(SEQ ID NO：

38)

在其5′端编码一AflII位点，用作扩增编码IgG4铰链、CH2和CH3区的DNA片段的5′引物。3′引物在其5′端含有一XhoI位点，与用于实施例1中扩增IgG2 Fc区的引物类似。产生的AflII-XhoI片段插入到XhoI+AflII切割的pdCs-huFcγ1中以生成pdCs-huFcγ4。

为促进编码非IgG部分的核酸在Fcγ4的C末端插入，通过在pdCs-huFcγ4中于Fcγ4编码区C末端附近导入以下的Leu到Pro的改变而产生一个SmaI位点，见如下：

SLGK STOP SPGK STOP

(SEQ ID NO：39) (SEQ ID NO：40)

TCT CTG GGT AAA TGA改变为TC C C CG GGT AAA TGA.

(SEQ ID NO：41)(SEQ ID NO：42)

应用标准定点诱变技术将SmaI位点导入pdCs-huFcγ4中。

名为pdCs-huFcγ4h的质粒编码修饰的IgG1铰链及随后IgG4的CH2和CH3结构域，为生成pdCs-huFcγ4h质粒，将编码IgG2的CH2和CH3结构域的pdCs-huFcγ2h(实施例1)中的StuI-XhoI片段，替换为pdCs-huFcγ4中的相应片段。在此构建中，每一亲本质粒都来自dcm(-)大肠杆菌菌株。由于在编码γ4的DNA中存在一额外的StuI位点，质粒pdCs-huFcγ4用XhoI作彻底消化并用StuI作部分消化，产生约300、500和800碱基对的片段。约800碱基对的片段用于替换pdCs-huFcγ2h中的相应片段。

应用PCR克隆IFNβ cDNA，应用的有义引物为CCCGGGT ATGAGC TAC AAC TTG CTT GGA TTC(SEQ ID NO：43)，其中的ATG为成熟蛋白质的N末端残基且CCCGGG为引入的SmaI限制性位点，反向引物为CTCGAG TCA GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG(SEQ ID NO：44)，其中TCA为翻译终止密码子的反密码子且CTCGAG为引入的XhoI限制性位点。模板DNA为pLG117R(Taniguchi等，[1980]Proc.Nat.Acad.Sci.USA 77：5230-5233)且购自美国典型培养物保藏中心(ATCC编号31903)。对序列进行确认之后，克隆的SmaI-XhoI片段连入pdCs-huFcγ4表达载体的SmaI和XhoI位点间以产生pdCs-huFcγ4-IFNβ。类似的pdCs-huFcγ4h-IFNβ表达质粒也通过相似的方法构建。

为构建pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ表达质粒，合成了编码γ4铰链的寡核苷酸双链体，所述双链体具有丝氨酸到脯氨酸的替换和5′AflII粘端和3′StuI钝端，见如下：

AflII ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO：

45)

TTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA CCT TGC CCA GGT

G CTC AGG TTT ATA CCA GGG GGT ACG GGT GGA ACG GGT CCA

StuI

AAGCCAACCCAGG(SEQ ID NO：46)

TTC GGTTGGGTCC(SEQ ID NO：46的互补链)

该DNA用于替换pdCs-Fc-g4-IFNβ中的相应DNA片段以生成pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ。

将质粒pdCs-huFcγ4-IFNβ、pdCs-huFcγ4h-IFNβ和pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ分别转染导入哺乳动物细胞。纯化含Fc的表达蛋白质并用还原和非还原SDS凝胶电泳进行检测。发现从哺乳动物细胞中表达的huFcγ4-IFNβ蛋白质中有相当大部分为单体半分子而不是二聚体的正常抗体。但是，表达的huFcFγ4h-IFNβ和huFcγ4(S到P)-IFNβ融合蛋白质几乎全部为正确组装的二聚体。对于huFcγ4h-IFNβ和huFcγ4(S到P)-IFNβ融合蛋白质，单体的比例几乎相同。

总之，实施例15、16和17的结果表明，对于主要由IgG4组成但具有修饰的IgG1铰链的杂合同种型抗体和Ig融合蛋白质，其具有的组装特性优于完全源自IgG4的相应蛋白质。此外，实施例15-17的结果与其他实施例一道表明，杂合同种型蛋白质的组装提高可以以几个不同的方式显现。例如，在一些情况中，杂合同种型抗体或融合蛋白质与相应单一同种型抗体或Ig融合蛋白质相比显示出聚集减少；而在其他情况中杂合同种型抗体或融合蛋白质与相应的单一同种型抗体或Ig融合蛋白质相比显示出增强的正确寡聚化。

实施例18：应用IgG1和IgG4的组分的杂合同种型Fc融合蛋白质的表达。

为产生从哺乳动物细胞中表达时最低限度聚集的Fc-红细胞生成素融合蛋白质，应用标准分子生物学技术构建以下的表达质粒。应用在WO01/36489中公开的XmaI-XhoI DNA片段，该片段含一种形式的人红细胞生成素编码序列，所述序列具有导致His32Gly、Cys33Pro、Trp88Cys和Pro90Ala氨基酸替换的突变。相应的蛋白质序列显示在SEQ ID NO：47中：

APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLAL

LSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTF

RKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR

将该XmaI-XhoI DNA片段插入到编码IgG1铰链区和IgG2 CH2和CH3区的质粒载体中，该载体除了存在两组突变导致在CH3 C末端产生了氨基酸替换外与在实施例1中构建的载体基本相同，这样CH3 C-末端和Epo N-末端的连接处的序列如下：

....TQKSATATPGA-APPRLI....(SEQ ID NO：48)

第一组突变将IgG2的CH3区序列KSLSLSPG(SEQ ID NO：49)改变为KSATATPG(SEQ ID NO：45)，所述突变在美国专利申请系列No.60/280,625中公开。用Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO：50的3位到6位)替换Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO：49的3位到6位)的作用是除去潜在人非己T细胞抗原表位，该表位可以因为人Fc和人红细胞生成素间的连接处含有非己肽序列而产生。第二组突变由CH3区C末端氨基酸的K到A的单氨基酸替换组成，在美国专利申请系列No.09/780,668中公开。

将产生的质粒转染导入NS/0细胞并根据实施例1和2中的方法表达和纯化Fc-Epo融合蛋白质。基于与蛋白质A的结合进行纯化之后，含如上所述的IgG2 CH3和红细胞生成素替换的huFcγ2h-huEpo蛋白质通过大小排阻层析表征，发现在两个独立制备物中此蛋白质由97％的单体及90％的单体组成。发现以摩尔为基础，在检测红细胞生成素蛋白质刺激TF-1细胞分裂的能力的基于细胞的试验中，包含如上所述的IgG2 CH3和红细胞生成素替换的huFcγ2h-huEpo蛋白质具有与人促红细胞生成素几乎一样的活性。试验的进行如在WO01/36489中的描述。

此外，表征了非突变人红细胞生成素与Fc区C末端的融合物，所述Fc区由IgG1(铰链-CH2-CH3)、IgG2(铰链-CH2-CH3)或IgG1(铰链)-IgG2(CH2-CH3)组成。构建了含非突变人Fc序列和非突变红细胞生成素序列的表达质粒，所用方法类似于构建上述及实施例1的质粒的方法。用Fcγ1-Epo、Fcγ2-Epo和Fcγ2h-Epo表达质粒转染NS/0细胞，并对于每一质粒在筛选了大约相同数目的克隆后分离稳定的克隆。产量最佳的克隆产生50μg/ml的Fcγ1-Epo、20μg/ml的Fcγ2-Epo和120μg/ml的Fcγ2h-Epo。

等价方案

本发明可以以其他特定的形式体现，而不偏离其精神和本质特征。因此认为前述的实施方案在所有的方面均为例证性的而非限定在此描述的发明。本发明的范围因此由附属的权利要求而不是前面的描述来说明，并且所有的在此权利要求的等价范围和意义内的变化均意在包括于其中。

参考引入

所有以上提及的专利、专利申请和科学出版物均完整引入本申请作为参考。

序列表

<110>默克专利有限公司

<120>用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术

<130>LEX-016PC

<150>US60/274,096

<151>2001-03-07

<160>50

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG2铰链序列

<400>1

Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG2-IgG4杂合铰链序列

<400>2

Glu Ser Lys Tyr Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210>3

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgE-CH2结构域序列

<400>3

Val Asn Leu Thr Trp

1 5

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG1 CH2结构域序列

<400>4

Val Lys Phe Asn Trp

1 5

<210>5

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG3 CH2结构域序列

<400>5

Val Gln Phe Lys Trp

1 5

<210>6

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自IgD的糖基化位点

<400>6

Asn Thr Ser Gly Phe

1 5

<210>7

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>来自IgD的糖基化位点

<400>7

Leu Asn Ala Ser Arg

1 5

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人Fcγ2的正向引物

<400>8

ccttaagcga gcgcaaatgt tgtgtcgag 29

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人Fcγ2铰链编码区

<400>9

gagcgcaaat gttgtgtcga g 21

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于人Fcγ2的反向引物

<400>10

cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对CH3上部区域的DNA序列

<400>11

ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在CH3上部区域中引入C到A的替换的正向引物

<400>12

ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag 30

<210>13

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于在CH3区域中引入C到A的替换的反向引物

<400>13

ggtcatctcc tcccgtgatg ggggcagggt gtac 34

<210>14

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>γ2铰链

<400>14

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210>15

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>γ2铰链外显子

<400>15

cttaagcgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc 60

ct 62

<210>16

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有Cys到Ser突变的γ1铰链序列

<400>16

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210>17

<211>71

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有γ1铰链外显子的DNA片段

<400>17

cttaagcgag cccaaatctt ctgacaaaactcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc 60

agcccaggcc t 71

<210>18

<211>112

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码胰高血糖素样肽1的序列

<400>18

cttaagccat gctgaaggga cctttactag tgatgtaagt tcttatttgg aaggccaagc 60

tgccaaggaa ttcattgctt ggctggtgaa aggccgagga ggatccttaa gc 112

<210>19

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>胰高血糖素样肽1

<400>19

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly

20 25 30

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于免疫球蛋白γ2恒定区的正向引物

<400>20

caagctttctggggcgagc 19

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于免疫球蛋白γ2恒定区的反向引物

<400>21

cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于γ1铰链区的正向引物

<400>22

ctgcagagcc caaatcttc 19

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于γ1铰链区的反向引物

<400>23

cagctggggc ctgtccctg 19

<210>24

<211>10

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pDHL2-huKs抗体中的序列

<400>24

gggtaaatga 10

<210>25

<211>89

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IgA1铰链外显子

<400>25

cttaagtccc tcaactccac ctaccccatc tccctcaact ccacctaccc catctccctc 60

atgctgccac ggtaagccag cccaggcct 89

<210>26

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgA1铰链区

<400>26

Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser

1 5 10 15

Pro Ser Cys Cys His

20

<210>27

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上置换链

<400>27

ttaagtccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60

tgctgccacg gtaagccagc ccagg 85

<210>28

<211>81

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下置换链

<400>28

cctgggctgg cttaccgtgg cagcatgagg gagatggggt aggtggagttgagggagatg 60

gggtaggtgg agttgaggga c 81

<210>29

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于IgM CH3和CH4的引物

<400>29

gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg 33

<210>30

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于IgM CH3和CH4的引物

<400>30

gctcccgggt cagtagcagg tgccagctgt gtcg 34

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于将IgM中最C端的Cys突变为Ser的引物

<400>31

gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg 33

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于将IgM中最C端的Cys突变为Ser的引物

<400>32

gctcccgggt cagtagctgg tgccagctgt gtcg 34

<210>33

<211>460

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG1-IgM杂合体的恒定区

<400>33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Asp

210 215 220

Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser

225 230 235 240

Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu

245 250 255

Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu

260 265 270

Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr

275 280 285

Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser

290 295 300

Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro

305 310 315 320

Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro

325 330 335

Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu

340 345 350

Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val

355 360 365

Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr

370 375 380

Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe

385 390 395 400

Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu

405 410 415

Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr

420 425 430

Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val

435 440 445

Ser Leu Val MetSer Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr

450 455 460

<210>34

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG1-IgM杂合体中的肽序列

<400>34

Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp

1 5

<210>35

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有ser到Pro的突变的IgG4铰链区

<400>35

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210>36

<211>56

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸双链体

<400>36

acgtctcaggtttataccag ggggtacggg tggaacgggt ccattcggtt gggtcc 56

<210>37

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG4铰链

<400>37

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys

1 5 10

<210>38

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于IgG4铰链、CH2和CH3区的引物

<400>38

cttaagcgag tccaaatatg gtcccccatg cccatcatgc 40

<210>39

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>邻近Fcγ4编码区C端的肽序列

<400>39

Ser Leu Gly Lys

1

<210>40

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有Leu到Pro突变的邻近Fcγ4编码区C端的肽序列

<400>40

Ser Pro Gly Lys

1

<210>41

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>邻近Fcγ4编码区C端的序列

<400>41

tctctgggta aatga 15

<210>42

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>具有Leu到Pro突变的邻近Fcγ4编码区C端的序列

<400>42

tccccgggta aatga 15

<210>43

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IFNβ有义引物

<400>43

cccgggtatg agctacaact tgcttggatt c 31

<210>44

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>IFNβ反向引物

<400>44

ctcgagtcag tttcggaggt aacctgtaag 30

<210>45

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>具有Ser到Pro突变的Fcγ4铰链区

<400>45

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210>46

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>含有Ser到Pro突变的编码Fcγ4的寡核苷酸双链体

<400>46

ttaagcgagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccttgcc caggtaagcc aacccagg 58

<210>47

<211>166

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>红细胞生成素蛋白质突变形式的蛋白质序列

<400>47

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu Gly

20 25 30

Pro Ser Leu Ash Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe

35 40 45

Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp

50 55 60

Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Cys Glu Gly Leu Gln Leu His Val Asp

85 90 95

Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala

115 120 125

Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val

130 135 140

Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala

145 150 155 160

Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>48

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>CH3-Epo连接处的序列

<400>48

Thr Gln Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Ala Pro Pro Arg Leu

1 5 10 15

Ile

<210>49

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG2 CH3序列

<400>49

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5

<210>50

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>IgG2 CH3区

<400>50

Lys Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly

1 5

Claims

1、融合蛋白质，其包含与非免疫球蛋白部分融合的免疫球蛋白部分，其中所述免疫球蛋白部分包含：

(i)位于所述免疫球蛋白部分N末端的IgG1铰链区；和

(ii)从由IgG2和IgG4组成的组中选择的抗体同种型的CH2和CH3结构域。

2、权利要求1的融合蛋白质，其中IgG1铰链区邻近于所述非免疫球蛋白部分。

3、权利要求1的融合蛋白质，其中IgG1铰链区的多数N末端半胱氨酸是突变的。

4、权利要求1的融合蛋白质，其中IgG1铰链区包含两个或更少的半胱氨酸残基。

5、权利要求1-4中任一项的融合蛋白质，其中所述非免疫球蛋白部分是细胞因子。

6、权利要求1-4中任一项的融合蛋白质，其中所述非免疫球蛋白部分是红细胞生成素分子。

7、权利要求1-4中任一项的融合蛋白质，其中所述非免疫球蛋白部分融合于所述免疫球蛋白部分的N末端。

8、权利要求1-4中任一项的融合蛋白质，其中所述非免疫球蛋白部分融合于所述免疫球蛋白部分的C末端。

9、权利要求1-4中任一项的融合蛋白质，其中所述免疫球蛋白部分是完全抗体。