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CN100522242C - 具有降低的免疫原性的人工蛋白质 - Google Patents

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CN100522242C CNB028051580A CN02805158A CN100522242C CN 100522242 C CN100522242 C CN 100522242C CN B028051580 A CNB028051580 A CN B028051580A CN 02805158 A CN02805158 A CN 02805158A CN 100522242 C CN100522242 C CN 100522242C
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Abstract

本发明涉及人工改变的蛋白质，优选地涉及融合蛋白，当暴露于物种体内时其与亲本未改变分子相比具有降低的免疫原性。本发明尤其涉及新的免疫球蛋白融合蛋白，其基本上由免疫球蛋白分子或其片段通过其C-末端共价融合至生物活性的非免疫球蛋白分子(优选多肽或蛋白质或其生物活性片段)的N-末端组成。在一个具体的实施方案中，本发明涉及这样的融合蛋白，其由抗体的Fc部分按如上所述融合至引起生物或药学功效的非免疫靶分子上组成。本发明的分子与未改变的分子相比具有在一个或多个氨基酸残基位置处被改变的氨基酸序列但原则上相同的生物活性。这些改变是在分子中鉴定为T细胞表位的区域内进行的，其中所述T细胞表位对活的宿主体内的免疫反应起作用。因此，本发明也涉及通过鉴定所述表位制备此类融合蛋白的新方法，其包括使用计算机辅助方法计算肽中针对MHC II类分子结合位点的T细胞表位值。

Description

具有降低的免疫原性的人工蛋白质
本发明的技术领域
本发明涉及改变的人工蛋白质，优选地涉及融合蛋白，当暴露于物种体内时其与亲本未改变分子相比具有降低的免疫原性。尤其是，本发明涉及作为单一组分通常不具有强免疫原性，但当其与第二蛋白质部分连接形成通常地人工融合蛋白时具有增强的免疫原性的蛋白质。本发明尤其涉及改变的并因此为新的免疫球蛋白(Ig)融合蛋白，其基本上由免疫球蛋白分子或其片段通过其C-末端共价融合至具有生物活性的非免疫球蛋白分子(优选多肽或蛋白质或其生物活性片段)的N-末端组成。在一个具体的实施方案中，本发明涉及这样的融合蛋白，其由抗体的Fc部分如上所述融合至可以引起生物或药学功效的非免疫靶分子上组成。
与未改变的分子相比，本发明的分子具有在一个或多个氨基酸残基位置处被改变的氨基酸序列但原则上仍具有相同的生物活性。这些改变是在分子中鉴定为T细胞表位的区域内进行的，其中这些区域对在活的宿主体内引起免疫反应有作用。因此，本发明也涉及通过鉴定所述表位制备该融合蛋白的新方法，其包括使用计算机辅助方法计算肽中针对MHC II类分子结合位点的T细胞表位值。
发明背景
治疗性融合蛋白通常为人工分子，产生其是为了组合单一组分的已知有利特性或产生新的特性。例如，融合蛋白可包含免疫原性部分，此部分可以引起通常为非免疫原性的融合部分具有免疫原性。在其它情况下，每一组分均具有免疫原性，且融合分子保留了该通常不想要的特性。最后，通过形成键，尤其是通过连接区将无免疫原性或具有较小免疫原性的组分融合在一起时，产生的融合产物也有可能具有免疫原性。
在本文中尤其感兴趣的融合蛋白为免疫接合物。自从几年前以来就已知免疫接合物，并且它们中的许多在体外和体内已显示出药学功效。免疫接合物为嵌合分子，其通常由来自免疫球蛋白或其片段的部分和与此免疫球蛋白分子连接的靶多肽或蛋白质组成。最初，制备的免疫接合物由全抗体和细胞毒性剂如细胞因子组成，其中细胞因子通过其N-末端融合至免疫球蛋白恒定区的C-末端，或备选地，通过其C-末端融合至抗体可变区的N-末端(参见如EP 0439 095，WO 92/08495，US 5,349,053，EP 0659 439，EP 0706 799)。这些嵌合分子为双功能的，其通过抗体部分或其片段的可变区CDR中的结合位点靶向如位于肿瘤细胞表面的特定抗原并通过与免疫球蛋白偶联的细胞因子同时引起细胞毒效应，因此理论上其可只攻击或主要攻击靶向细胞。本文中，也研发了三功能和多功能免疫接合物，其包括由不同抗体的sFv-、Fab-、Fab′或F(ab′)2片段组成的构建体，其中在每种情况下都有利地使用了免疫球蛋白部分的寻靶功能。
另一免疫球蛋白的改变是使用抗体的Fc区。抗体包含两个功能独立的部分，与抗原结合的称作＂Fab＂、＂Fab＂、＂F(ab′)2＂的可变区(这取决于消化此分子的类型)，和称作＂Fc＂的恒定区(其提供与效应子功能如补体或吞噬细胞的连接)。免疫球蛋白的Fc部分具有长的血浆半衰期，而Fab片段为短寿的(Capon等人，自然(Nature)337：525-531(1989))。
已使用Fc结构域构建了治疗性蛋白质产物，用来提供较长的半衰期或用于引入功能如Fc受体结合功能、蛋白质A结合功能、补体固定和胎盘转移功能，这些功能均存在于免疫球蛋白的Fc部分中。例如，已将IgG1抗体的Fc区融合至CD30-L的N-末端，其中CD30-L分子可以和在何杰金氏病肿瘤细胞、退行发育性淋巴瘤细胞，T细胞白血病细胞和其它恶性细胞类型表面表达的CD30受体结合(US 5,480,981)。IL-10为一种抗炎和抗排斥因子，已将其融合至鼠Fcγ2a上以延长该细胞因子短的循环半衰期(Zheng等人，免疫学杂志(The Journal of Immunology)，154：5590-5600(1995))。研究也评估了使用与人IgG1的Fc部分连接的肿瘤坏死因子受体来治疗脓毒性休克的患者(Fisher等人，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)，334：1697-1702(1996)；Van Zee等人，免疫学杂志(The Journalof Immunology)，156：2221-2230(1996))。也已将Fc与CD4受体融合以产生用来治疗AIDS的治疗性蛋白质(参见Capon等人，自然(Nature)，337：525-531(1989))。主要地，分别通过Fc的C-或N-末端与蛋白质的N-和C-末端连接，Fc可融合至靶蛋白质或肽上。EP 0464 533(Hoechst/General Hospital)公开了Fc与TNF和EPO的嵌合体，其中Fc的N-末端偶联至蛋白质的C-末端(X-Fc)。公开在WO 97/00319(SKB)和WO97/24440(Genentech)的leptin-Fc嵌合体选择了同样的连接。有许多出版物和专利申请描述了Fc-蛋白质嵌合体的反向连接(Fc-X)，如Fc-(IL-2)、Fc-EPO、Fc-PSMA、Fc-(IL-12)、Fc-TNFa、Fc-(GM-CSF)、Fc-TNFR、Fc-内皮抑素(endostatin)、Fc-制管张素、Fc-gpl20、Fc-leptin、Fc-IFNa、Fc-(G-CSF)。实例为WO 96/08570(Fuji/Merck KGaA)、WO 98/28427(Amgen)、WO 99/02709(Beth Israel Medical Care Center)和WO99/58662(Fuji/Merck KGaA)。WO 00/24782(Amgen)公开了大量可能的Fc-X接合物，其中在两个部分间的连接可为Fc-X或X-Fc。Lexigen/MerckKgaA对Fc-X分子进行了全面的研发，如在US5,541,087，WO 99/43713，WO 99/29732，WO 99/52562，WO 99/53958，WO 00/11033，WO 01/07081，PCT/EP00/10843中所公开的。这样，已＂失去＂其抗原结合位点的X-Fc和Fc-X分子以及其中保留了结合位点并因此保留了抗原特异性靶向功能的分子作为有前途的治疗性蛋白质是很令人感兴趣的，并进一步需要开发类似组合物用于不同的临床应用。非天然的治疗性蛋白质通常具有显著的免疫原性。例如，Enbrel为由肿瘤坏死因子受体(TNF-R)的胞外结构域融合至抗体的Fc区组成的融合蛋白。已报道约16％用Enbrel治疗的患者产生了针对该融合蛋白的抗体(Physician′s Desk Reference[2001]3372页)。类似地，发现由促红细胞生成素(Epo)和粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)组成的融合蛋白为高免疫原性的(Coscarella A，等人，[1998]细胞因子(Cytokine)10：964-9；Coscarella A，分子生物技术(Mol Biotechnol.[1998]10：115-22)。当注射至灵长类动物中，发现Epo-GMCSF融合蛋白诱导针对该融合蛋白Epo部分的强抗体反应，导致贫血。CeredaseTM和CerezymeTM为用于治疗Gaucher病的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶形式，作为基因工程的结果，葡糖脑苷脂酶与不寻常的高甘露糖糖基化作用连接。Gaucher病的患者在其溶酶体中缺乏葡糖脑苷脂酶，结果导致患者的巨噬细胞倾向于积聚脂类而成为泡沫细胞(遗传性疾病的代谢和分子基础(TheMetabolic and Molecaclar Bases of Inherited Disease)，第8版[2001]，Scriver等人编辑，第146章，＂Gaucher病＂3635-3668页)。施用CeredaseTM或CerezymeTM后，该治疗性蛋白质被巨噬细胞上的甘露糖受体结合，胞吞并经内体运送至其正确的位置溶酶体中。用CeredaseTM治疗的患者往往产生针对葡糖脑苷脂酶的抗体(Pastores GM等人，血液(Blood)[1993]82：408-16；Physicians′Desk Reference[2001]1325-1326页)。此类抗体可干扰治疗(Brady RO等人，儿科学(Pediatrics)[1997]100(6)：E11.)。在使用抗体-细胞因子融合蛋白的I期临床试验中，一些患者产生了针对该治疗性融合蛋白的抗体。在此情况下，抗体部分为14.18抗体的人源化形式，细胞因子为白细胞介素-2(IL-2)。许多反应性患者的血清中包含显著水平的抗-独特型抗体。
许多肽、多肽和蛋白质的治疗性应用由于它们在哺乳动物，尤其是人中的免疫原性而受到限制。例如，当鼠抗体施予没有被免疫抑制的患者时，大多数患者显示出对导入的外源物质的免疫反应，产生人抗鼠抗体(HAMA)(例如Schroff，R.W.等人(1985)癌研究(Cancer Res.)45：879-885；Shawler，D.L.等人(1985)免疫学杂志(J.Immunol.)135：1530-1535)。这引起两个严重的后果。其一，患者的抗鼠抗体可结合治疗性抗体或免疫接合物且在治疗性抗体或免疫接合物有机会结合如肿瘤并实施其治疗功能之前将其清除。其二，患者可对鼠抗体产生变态敏感性并在将来暴露于鼠免疫球蛋白后有出现过敏性休克的危险。
已使用了一些技术来解决HAMA问题，由此可在人身上使用治疗性单克隆抗体(参见例如，WO89/09622，EP0239400，EP0438310，W091/09967)。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中的鼠的遗传信息同时增加人的遗传信息。但是，所得的＂人源化＂抗体在一些情况下仍然会使患者产生免疫反应(Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2：449,456；Rebello，P.R.等人(1999)移植(Transplantation)68：1417-1420)。
这些方法的一个共同方面是向治疗性抗体，通常为啮齿动物来源的治疗性抗体中引入与存在于人抗体蛋白质中的那些氨基酸残基相同的氨基酸残基，甚至是显著量的氨基酸残基序列。对抗体，该方法可归因于不同物种间抗体分子的结构(和功能的)相对高保守性。但是对潜在的治疗性肽、多肽和蛋白质，当在宿主种(如人)中不存在结构同系物时，此类方法将不适用。而且，这些方法假定人氨基酸残基序列的一般性导入将使重构抗体成为非免疫原性的。但是，正如已知的，某些短肽序列(＂T细胞表位＂)可在肽、多肽或蛋白质的细胞内降解期间释放，并接下来被主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以启动T细胞活化。对于被MHC II类呈递的肽，T细胞的活化然后可通过直接刺激产生抗体的B细胞引起抗体反应。因此，可能希望消除肽、多肽或蛋白质中的潜在T细胞表位。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫反应。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)5：1353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413)。
在过去的几年中，已发表了一些技术，其中提出了使得抗体和具有不同生物功能的靶蛋白质没有或至少具有较小免疫原性的解决方案。其实例为WO 92/10755和WO 96/40792(Novo Nordisk)，EP 0519 596(Merck &Co.)，EP 0699 755(Centro de Immu nologia Moelcular)，WO 98/52976和WO 98/59244和WO 00/34317(Biovation Ltd.)。
在现有技术中公开的并涉及从蛋白质中消除T细胞表位的通用方法(例如WO 98/52976，WO 00/34317)包括下列步骤：
(a)确定多肽或其部分的氨基酸序列；
(b)使用任一方法在该蛋白质的氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位，所述方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合；
(c)设计在已确定的潜在T细胞表位中具有一个或多个氨基酸改变的新序列变体，以实质上减少或消除T细胞表位的活性，此效果可以通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合而确定。构建此类序列变体时应避免由该序列变体产生新的潜在T细胞表位，否则再对此新的潜在T细胞表位进行改变以实质性减少或消除T细胞表位的活性；
(d)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以确定一个或多个具有所希望特性的变体。
其它利用重组MHC分子与合成肽组合形成的可与来自人或实验动物受试者外周血样本的T细胞克隆结合的可溶复合体的技术已用于本领域[Kern，F.等人(1998)自然医药(Nature Medicine)4：975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫学趋势(TRENDS in Immunology)22：583-588]，这些技术也可用于表位鉴定策略。
潜在的T细胞表位一般定义为具有结合MHC II类分子的能力的任何氨基酸残基序列。可测定此类潜在的T细胞表位来建立MHC结合。在一般性的了解中，术语＂T细胞表位＂为这样的表位，当其结合MHC分子时可被T细胞受体识别，并且其可以至少在原则上引起这些T细胞活化。但是，通常都知道，可以将某些被发现可以结合MHC II类分子的肽保留在蛋白质序列中，因为此类肽在最终蛋白质所施用至的生物体内具免疫耐受性。
本发明旨在克服这样的实际问题：将可溶蛋白质导入欲治疗的自体宿主中时可引发免疫反应而产生结合该可溶蛋白质的宿主抗体。例子之一为干扰素α2，尽管该蛋白质为内源产生的但部分人类患者仍产生针对它的抗体[Russo，D.等人(1996)Brit.J.Haem.94：300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)318：1409-1413]。
MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，也是本发明的主要集中点。但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用，因此本发明同样适用于它们。MHC HLA-DR分子为同源二聚体，其中每＂一半′为由α和β链组成的异源二聚体。虽然结合沟可容纳最多9-11个氨基酸，但每一异源二聚体具有一个能结合长度在9至20个氨基酸之间的肽的配体结合结构域。配体结合结构域由α链的1至85位氨基酸和β链的1至94位氨基酸组成。最近证实DQ分子具有同源结构，预期DP家族的蛋白质亦非常相似。人类已知存在DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ已知存在30种不同的同种异型且对于DP已知存在47种不同的同种异型。每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)364：33；Stern等人(1994)自然(Nature)368：215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫反应的能力方面有最大的灵活性。
在配体结合结构域内有相当多的多态性，其中在不同地理人群和种族群体中具有不同的＂家族＂。该多态性影响肽结合结构域的结合特性，因此DR分子的不同＂家族＂将对具有不同序列特性的肽存在特异性，虽然可能存在一些重叠。该特异性决定了Th-细胞表位的识别(II类T细胞反应)，其最终负责驱动对B细胞表位的抗体反应，其中所述B细胞表位存在于Th-细胞表位所来自的同一蛋白质上。这样，个体对蛋白质的免疫反应很大程度上受T细胞表位识别的影响，其随个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性而改变。因此，为了在世界人群中鉴定蛋白质或肽中的T细胞表位，就可能希望考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型集合的结合特性，由此覆盖尽可能高的世界人口百分率。
诱导免疫反应的一个主要因素是在蛋白质中存在可通过在MHC II类分子上呈递刺激T细胞活化的肽。这样，为了消除或降低免疫原性，就希望鉴定并去除蛋白质的T细胞表位。
根据上述方法和相关步骤，已制备了一些显示出降低的免疫原性和变应原性的生物分子，基本上是通常的靶蛋白质和抗体。例子为：WO99/55369(SKB)，WO 99/40198和WO 96/21016(Leuven Research &Development VZW)，WO 00/08196(Duke University)，WO 96/21036(Chiron Viragen)，WO 97/31025(Chiron Corp.)，WO 98/30706(AlliancePharmaceutical Corp.)。
在所有这些上述申请中，引起了产生较低免疫反应的单一蛋白质或抗体；没有暗示对融合蛋白，尤其是免疫球蛋白融合蛋白的完全或部分地去免疫，特别是借助于部分计算方法通过减少所述分子序列中的T细胞表位数实施的去免疫。在WO 97/24137(Tannox Biosystems Inc.)中，公开了在Fc部分的N-末端和IFNα的C-末端之间包含非免疫原性接头分子的IFNα-Fc嵌合体。
因此，仍需要提供没有或具较小免疫原性的生物分子，如免疫接合物。尤其是，提供Fc接合物，优选地提供Fc-X嵌合体是特别有意义的，其中X为所选择的具治疗意义的蛋白质或多肽。
发明概述
本发明涉及四个总的方面：
(a)免疫反应机制细节在涉及融合蛋白和其它人工蛋白质的情况中的新应用，用于帮助确定改造的或新的蛋白质是否可能具免疫原性并因此去免疫方法的应用是否合适，
(b)欲施用的，特别是欲施用于人的，且尤其是用于治疗性用途的新生物活性人工蛋白质，
(c)设计改良的、具较小免疫原性的人工蛋白质的方法，其中所述人工蛋白质一般情况下具有增强的免疫原性，该方法包括在人工蛋白质中鉴定一个或多个侯选T细胞表位并导入突变来去除一个或多个T细胞表位，以及
(d)一种方便而有效的计算法，其用于针对全球多种多样的MHC II类分子鉴定和计算T细胞表位，及基于该认知，设计并构建生物分子的具有改良特性的新序列变体。一旦在人工蛋白质中确定了T细胞表位，可如(c)中所述通过突变去除它们。
具有可结合免疫系统细胞表面受体的组分的人工蛋白质通常具有显著的免疫原性。由于具有结合免疫细胞表面受体的部分而具有免疫原性的人工蛋白质为本发明方法用于降低免疫原性的特别好的侯选蛋白质。
不被理论所束缚，图1-6为含有结合免疫细胞表面受体如Fc受体、细胞因子受体或寡糖受体的部分的人工蛋白质的图示。
本发明的一个方法由以下步骤组成：鉴定含有结合免疫细胞表面受体的部分的人工蛋白质，这可通过序列观察完成；鉴定在人工蛋白质中的侯选T细胞表位；设计人工蛋白质的突变衍生物，其中减少了T细胞表位数；产生一个或多个突变衍生物；测试突变衍生物的活性和任选地其它所希望特性；以及选择在T细胞表位减少、活性保留且任选地其它所需特性保留方面具有最佳平衡的突变衍生物。其它所需特性可包括但不限于药物动力学特性以及蛋白质表达和组装特性。
趋向于形成聚集物的人工蛋白质为第二类可通过本发明方法改良的蛋白质。
一类尤其可通过本发明改良的人工蛋白质为Ig融合蛋白，如含完整抗体的融合蛋白、以及Fc-X和X-Fc融合蛋白。具体而言，含功能性Fc受体结合位点的免疫球蛋白融合蛋白尤其可通过本发明方法改良。
本发明提供了改良形式的此类抗体融合蛋白，其包括含V区的融合蛋白，所述V区识别肿瘤特异性抗原、其它组织特异性抗原或其它疾病特异性抗原。在一个优选的实施方案中，这些抗体中的每一种都与细胞因子如IL-2融合。
例如，本发明提供了含导向肿瘤的抗EpCAM抗体KS1/4和抗GD2抗体14.18的融合蛋白，其中抗体V区包含去除了T细胞表位的突变。
在一个不同的实施方案中，突变了与抗体部分融合的部分，从而去除T细胞表位。例如，本发明公开了抗体-IL-2融合蛋白，其中IL-2部分已被改变以去除T细胞表位。
可以进行显著改良的第二大类Ig融合蛋白为Fc-X和X-Fc融合蛋白。不被理论所束缚，这些蛋白质被认为将具有显著免疫原性，因为在完整抗体中通常多少被轻链空间封阻的Fc受体结合位点被暴露出来。在任何情况下，已从经验上确立了Fc融合蛋白可以较其融合伙伴自身更具免疫原性(WO01/07081)。
另一类免疫原性融合蛋白为与细胞因子融合的蛋白质。不被理论所束缚，这些蛋白质可以是特别具有免疫原性的，因为当融合伙伴蛋白质与免疫细胞例如载有可识别融合伙伴蛋白质的抗体的细胞结合时，细胞因子会以某种方式刺激细胞(见图4)。
具显著免疫原性的一类人工蛋白质为包含不适当寡糖的常规蛋白质。例如，含有可以被免疫细胞上的特异受体结合的寡糖的蛋白质常常被发现是具免疫原性的。例如，蛋白质，优选可用于治疗溶酶体贮积疾病的如β-葡糖脑苷脂酶的蛋白质包含高的甘露糖寡糖。当此免疫原性蛋白质根据本发明改变后显示出明显降低的免疫原性。
本发明提供了掺入融合蛋白中的下列蛋白质部分的较小免疫原性形式(其中若非此种形式，该融合蛋白将具有免疫原性)：如促红细胞生成素、leptin、角质细胞生长因子、G-CSF、GM-CSF、IL-1R拮抗剂、sTNFR、TNF抑制剂、sTNFR-Fc
Figure C02805158D00141
BNTF、CNTF、干扰素家族成员、hGH、β-葡糖脑苷脂酶。上面所列出的所有这些生物活性蛋白质部分可以根据本发明衍生自熟知的未改变(亲本)蛋白质部分。
本发明的改变蛋白质可通过“发明详述”部分中所述方法产生。该方法包括通过计算方式鉴定T细胞表位的新方法。该方法步骤按照本发明是优选的，在实施例1中进行了较详细的描述。
作为本发明的优选实施方案，本发明公开并要求保护来自亲本融合蛋白的改变了的或修饰了的融合蛋白，所述亲本融合蛋白基本上由免疫球蛋白分子或其片段和非免疫球蛋白靶多肽(X)组成，其中所述非免疫球蛋白靶多肽(X)优选地通过其N-末端连接至免疫球蛋白分子或其片段的C-末端，其中改变了的融合蛋白具有不同于所述亲本融合蛋白的氨基酸序列，并且改变了的融合蛋白相对于亲本融合蛋白而言，当暴露于给定物种(优选地暴露于人)的免疫系统时显示出降低的免疫原性。
根据本发明在实践中用于降低免疫原性融合蛋白的免疫原性的策略将详细地用抗体-细胞因子融合蛋白进行阐述。这些一般性的策略包括：
●检查融合蛋白中的氨基酸序列，并根据胸腺中T细胞负选择期间这些氨基酸序列的预期存在和丰度将它们按可能的免疫原性先后排列。例如，确定完全的非己表位，其为最优先地通过突变去除T细胞表位的地方。对于去除T细胞表位具最小优先性的序列为在丰富的血清蛋白质中存在的序列，如抗体恒定区或在未重排的抗体V区中存在的序列。对于通过突变去除T细胞表位具中间优先性的序列为在低丰度蛋白质如细胞因子中存在的自身序列。不被理论所束缚，预计低丰度蛋白质在胸腺中的存在量可能并不足以促进T细胞负选择并因此使其被识别为非己T细胞表位。
●当选择了一个区域用于通过突变去除T细胞表位时，将该区域与高丰度蛋白质中天然存在的人序列比较。导入突变使任一非己序列更接近于自身序列。例如，为降低小鼠V区的免疫原性，将该序列与未重排的人V区比较，并找出最紧密相关的序列。导入“贴面化(Veneering)”变化，其中将一些氨基酸从小鼠的变换为人的。它具有将一些非己T细胞表位变换为自身T细胞表位的作用(公开在US 5712120中用于降低免疫原性的方法)，并且它也具有去除一些B细胞表位的作用。但是，仍必需去除来自高变区序列的T细胞表位。
●为了去除大多数或所有残存的T细胞表位，导入突变，所述突变根据上述定义的基于计算机的标准可以防止肽结合入MHC II类分子的沟中。对于抗体V区，优选在自身CDR外部导入突变，以避免干扰抗原结合。
●对于任一类型融合蛋白，通常的情况是融合蛋白的接合部位含有非己T细胞表位。这些T细胞表位也可通过突变去除。
作为本发明的一个特定实施方案，包括嵌合的免疫球蛋白或其片段，其中在所述改变的融合蛋白的靶多肽部分X和免疫球蛋白部分或其片段位置，免疫原性降低、T细胞表位数减少或与MHC II类分子结合的肽的数量减少。
本发明也包括本发明定义的嵌合免疫球蛋白，其中免疫球蛋白分子和非免疫球蛋白靶多肽(X)通过接头分子(L)融合。作为本发明的一个特定的实施方案，该接头分子本身没有或具有较低的免疫原性。这样，本发明可包括这样的免疫接合物，其中单独而言接头分子是去免疫的。具有降低的免疫原性或没有免疫原性的接头分子为本领域公知，或可根据公知的方法或根据本发明的方法制备。本发明也包括这样的免疫球蛋白融合蛋白，其中融合分子的免疫球蛋白部分和靶蛋白质(X)部分以及任选地接头分子和连接区(见下文)在免疫原性方面被改变。备选地，该分子只有一个或多个部分而非所有部分根据本发明进行了改变。
进一步地，本发明涉及这样的上述免疫接合物，其在原则上可以衍生自所有的免疫球蛋白类；但优选IgG。本发明的一个目的是提供衍生自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的此类嵌合免疫球蛋白。优选IgG1和IgG2免疫球蛋白；最优选IgG2免疫球蛋白。
因为已证实即使人源的重组蛋白质和人源化抗体也可对人产生不希望的免疫反应，故本发明的目的是提供这样的融合蛋白，其中免疫球蛋白部分和靶多肽部分(X)可选自非人源的及人源的。因为人源化或来自于人的分子通常具有较少的T细胞表位数，对于去免疫而言优选此类分子，因为对于其只需改变较少的氨基酸残基。
本发明的免疫接合物(免疫球蛋白(Ig)融合蛋白)也包括抗体片段如sFv，Fab，Fab′，F(ab′)2和Fc。本发明特别的和优选的一个目的是提供以上和以下定义的融合蛋白，其中免疫球蛋白部分为抗体的Fc结构域，抗体优选地为IgG1或IgG2抗体。对Fc受体具有降低的亲和性的本发明Fc-X分子为本发明的优选对象。对Fc受体具有降低的亲和性的Fc分子在本领域是熟知的，可通过改变Fc结构域的氨基酸序列而制备(例如WO99/43713)。
详细地说，本发明是指：
●衍生自亲本融合蛋白的、免疫原性被改变的融合蛋白，其基本上由第一蛋白质/多肽和第二蛋白质/多肽组成，其中第一蛋白质为免疫球蛋白分子或其片段，且第二蛋白质/多肽为非免疫球蛋白靶多肽(X)，它们之间直接连接或通过接头分子连接；所述改变的融合蛋白与所述亲本融合蛋白具有不同的氨基酸序列，并且其相对于亲本融合蛋白而言，当暴露于给定物种的免疫系统时由于其氨基酸序列中T细胞表位数的减少而显示出降低的免疫原性；
●相应的融合蛋白，其中所述T细胞表位为可结合MCH II类分子结合基团的肽序列；
●相应的融合蛋白，其中靶多肽(X)通过其N-末端连接至免疫球蛋白部分的C-末端；
●相应的改变的融合蛋白，其中给定物种为人；
●相应的融合蛋白，其中融合组分通过接头分子L融合；
●根据权利要求4的改变的融合蛋白，其中所述接头分子L无免疫原性或具较小免疫原性；
●相应的融合蛋白，其中由免疫球蛋白部分的C-末端区和非免疫球蛋白靶多肽(X)的N-末端区所代表的连接区没有T细胞表位或具有减少的T细胞表位数；
●相应的融合蛋白，其中免疫球蛋白部分或其片段或靶多肽(X)部分具较小的免疫原性；
●相应的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子或其片段为IgG1或IgG2；
●相应的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白片段为Fc部分，其中优选地所述Fc部分对Fc受体具有降低的亲和性；
●具有式Fc-Ln-X的免疫原性改变的融合蛋白，其中
Fc为免疫球蛋白分子(抗体)的Fc部分，
X为非免疫球蛋白靶多肽
L为接头肽，
n＝0或1，且
其中X和/或L包含与亲本分子相比引起降低的免疫原性的氨基酸残基改变。
这些免疫原性改变的Fc融合分子的优选实施方案为：
Fc-Xm，其中只改变X，
Fc-Lm-Xm，其中改变X和L以具有降低的免疫原性，
Fc-Xm，其中改变X以及Fc和X之间的连接区，
Fc-Lm-Xm，其中改变X、L以及Fc、X和L之间的连接区；
●相应的Fc-(L)-X融合蛋白，其中至少X的免疫原性被改变；
●具有式A-Ln-X的免疫原性改变的融合蛋白，其中
A为完整抗体或其sFv，Fab，Fab′，F(ab′)2片段
X为非免疫球蛋白靶多肽，
L为接头肽，
n＝0或1，且
其中A和/或X和/或L包含与亲本分子相比引起降低的免疫原性的氨基酸残基改变；
这些免疫原性改变的融合分子的优选实施方案为：
A-Xm，其中只改变X，任选地改变A-X连接区，
Am-Xm，其中改变A和X，任选地改变它们的连接区，
A-Lm-Xm，其中仅改变X和L以具有降低的免疫原性，
Am-X，其中只有A具有降低的免疫原性，任选地A-X连接区也具有降低的免疫原性，
Am-Lm-Xm，其中A、L和X的免疫原性被改变，任选地A-L-X连接区的免疫原性也被改变；
●相应的A-(L)-X融合分子，其中至少X或A的免疫原性被改变；
●相应的融合蛋白，其中A选自：
抗EGF受体(HER1)抗体，
抗HER2抗体，
抗CDx抗体，其中x为1-25的整数，
抗细胞因子受体抗体，
抗17-1A抗体，
抗KSA抗体，
抗GP IIb/IIIa抗体，
抗整合素受体抗体，
抗VEGF受体抗体；
●相应的融合蛋白，其中抗体选自：
单克隆抗体225及其衍生物，
单克隆抗体425及其衍生物，
单克隆抗体KS1/4及其衍生物，
单克隆抗体14.18及其衍生物，
单克隆抗体4D5/HER2
Figure C02805158D00191
及其衍生物，
单克隆抗体17-1A及其衍生物，
单克隆抗CD3抗体，
单克隆抗体7E3及其衍生物，
单克隆抗体LM609，P1F6和14D9.F8及其衍生物，
单克隆抗体DC-101及其衍生物，
单克隆抗Il-2R抗体
Figure C02805158D00192
及其衍生物；
●相应的融合蛋白，其中靶多肽X选自：
细胞因子、整合素抑制剂、可溶性细胞因子受体、糖蛋白、激素、糖蛋白激素、leptin、生长激素、生长因子、抗血友病因子、抗原、细胞因子受体拮抗剂；
●相应的融合蛋白，其中靶多肽X选自：
IL-2、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、干扰素家族成员、TNFα、可溶性TNF受体、IL-12、IL-8、因子VIII、FGF、TGF、EGF、VEGF、PMSA、IGF、胰岛素、RGD-肽、内皮抑素、制管张素、BDNF、CNTF、蛋白质c、因子VIII和IX、及它们的生物活性片段；
●更具体的相应融合蛋白选自：
MAb KS 1/4-IL2，MAb 14.18-IL2
MAb 425-IL2，MAb c425-IL2，MAb h425-IL2，MAb 425-TNFα
MAb 225-IL2，MAb c225-IL2
MAb 4D5-IL2，MAb DC 101-IL2，MAb LM609-IL2，
Fc-IL2，Fc-TNFα，Fc-G-CSF，Fc-EPO，Fc-Leptin，Fc-KGF，
Fc-BFNF，Fc-β-脑苷脂酶，Fc-TPO，Fc-GM-CSF；
●衍生自亲本人工蛋白质的、选自以下的免疫原性改变的人工蛋白质：
(i)Y-(L)-X，其中Y为细胞因子，且X、(L)为上述定义的分子，
(ii)P-(L)-X，其中P为具有罕见糖基化部分的蛋白质，且X、(L)为上述定义的分子，
(iii)A-(L)-X，其中A、X、(L)为上述定义的分子，
所述改变的人工蛋白质具有不同于所述亲本人工蛋白质的氨基酸序列，并且相对于亲本融合蛋白而言，当暴露于给定物种的免疫系统时由于其T细胞表位数的减少而显示出降低的免疫原性，其中所述T细胞表位为通过本发明中描述的方法得到的或可得到的可结合MCH II类分子结合基团的肽序列；
●编码上文和下文描述的任一融合蛋白的DNA序列；
●编码相应融合蛋白的DNA序列，该序列包含
(i)信号序列
(ii)编码IgG1、IgG2或IgG3抗体的所有结构域或Fc、sFV、Fab、Fab′或F(ab′)2结构域的DNA序列，以及
(iii)编码多肽(X)的DNA序列，以及任选地
(iv)编码接头分子的DNA序列；
●包含相应DNA序列的表达载体；
●药物组合物，其包含上文和下文描述的融合蛋白，任选地还包含合适的载体、赋形剂或稀释剂或另一治疗有效药物，如化学治疗剂或细胞毒药物；
●用于制备所述免疫原性改变的融合蛋白的方法，包括以下步骤：
(i)确定亲本融合蛋白或其部分的氨基酸序列；
(ii)用任一方法鉴定出融合蛋白氨基酸序列中的一个或多个潜在的T细胞表位，所述方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合，
(iii)通过在最初确定的T细胞表位序列中改变至少一个氨基酸残基来设计新的序列变体，其中通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，所述变体以实质上减少或消除T细胞表位序列的活性或数量和/或以实质上减少或消除可结合来自所述生物分子的肽的MHC同种异型的数量的方式而改变，
(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体以确定一个或多个具有所希望特性的变体，以及
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)，
所述方法的特征在于步骤(ii)对T细胞表位序列的鉴定按如下实现：
(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性地降低该肽的治疗性用途；
●相应的方法，其中步骤(c)通过应用改进的
Figure C02805158D0022164937QIETU
评分函数通过如下方式实施，其中所述
Figure C02805158D0022164937QIETU
评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，所述方式为：(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)针对所述MHC II类分子模型提供容许的肽主链的第二数据库；(3)从所述第一数据库选择一个模型；(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及任选地(7)对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)；
●相应的方法，其中采集的氨基酸残基片段由13个氨基酸残基组成和/或连续采集的氨基酸残基片段有一至五个氨基酸残基的重叠；
●相应的方法，其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变1-9个氨基酸残基，优选地改变一个氨基酸残基；
●相应的方法，其中氨基酸残基的改变为在特定位点处将最初存在的氨基酸残基用别的氨基酸残基替换、或将其删除或添加别的氨基酸残基；
●相应的方法，其中额外地进一步通过替换、删除或添加而进行改变以恢复所述生物分子的生物活性。
本发明的多肽也包括抗原，如PMSA等。引起不希望的和太强的免疫反应的抗原可根据本发明方法改变，由此得到具有降低但又足够强的免疫原性以致可以用作如疫苗的抗原。本发明也包括特定多肽、蛋白质、融合蛋白、免疫球蛋白或免疫接合物的变体和其它改变形式，它们大体上具有相同的生物活性和相似的(降低的)免疫原性。上面提及的所有蛋白质为本领域熟知并已被描述或已经是通过商业途径可获得的。它们中的大多数已知具有被确证的治疗价值。前导序列或信号序列以及接头序列可任选存在。
根据如上所述步骤(ii)，通过将免疫球蛋白组分的C-末端或其片段连接至非免疫球蛋白靶多肽(X)的N-末端，任选地借助接头分子连接而制备融合蛋白可以按照以下方式实现：
(i)制备基因构建体，其包含编码多肽X的DNA序列、编码免疫球蛋白分子或其片段[sFv，Fab，Fab′，F(ab′)2，Fc]的DNA序列、以及任选地接头分子的DNA序列，和
(ii)通过表达系统表达该基因构建体。
本发明的免疫接合物显示出增强的特性。因此可检测到减少的蛋白质降解、增加的稳定性和增强的血清循环半衰期以及明显降低的免疫原性和/或变应原性。令人吃惊的是，降低的免疫原性在许多情况下导致进一步上升的半衰期，特别是当使用本发明的Fc-X分子时。降低的免疫原性使得本发明的融合蛋白较未改变的融合蛋白相比更易于被特定物种所耐受，并因此在需要时可以以较高的剂量施用。
附图简述
图1阐述了融合蛋白显示增强的免疫原性的机制之一。图1a显示与Fc部分融合的蛋白质(＂X＂)结合至带有Fc受体的细胞上。图1b显示该融合蛋白被加工，这样“X”部分被优先降解。图1c显示＂X＂的肽残余物由MHC分子呈递给T细胞。
图2显示了包含Fc部分和第二部分的融合蛋白具有增强的免疫原性的机制。图2a显示该融合蛋白与在其表面表达＂X＂特异性抗体的B细胞结合。该融合蛋白被特异性抗体和未被抗体结合的Fc受体两者结合。
图3阐述了融合蛋白显示增强的免疫原性的第二种机制。图3a显示与细胞因子部分融合的蛋白质(＂X＂)结合至具有表面结合抗体的B细胞上。图3b显示该融合蛋白被加工。图3c显示＂X＂的肽残余物由MHC分子呈递给T细胞，同时其它的X-细胞因子融合蛋白与B细胞表面结合。
图4阐述了工程化蛋白质显示增强的免疫原性的另一机制。此时，细胞因子-X融合蛋白直接活化B细胞。B细胞合成X的特异性抗体，这增加了该细胞因子在此B细胞附近区域的局部浓度。
图5阐述了工程化蛋白质显示增强的免疫原性的另一机制。图5a显示了带有糖基化部分的蛋白质与免疫细胞上该糖基化部分的特异性细胞-表面受体相结合。图5b显示该糖基化蛋白质的摄入和降解。图5c显示该糖基化蛋白质的肽残余物由MHC分子呈递给T细胞。
图6显示了抗体-细胞因子融合蛋白呈现增强的免疫原性的机制。图6a显示抗体-细胞因子融合蛋白与表达特异针对该抗体-细胞因子融合蛋白CDR的抗体的B细胞结合。该融合蛋白被特异性抗体和未被抗体结合的Fc受体两者结合。图6b显示该融合蛋白被加工。图6c显示CDR的肽残余物由MHC分子呈递给T细胞，同时其它的抗体-细胞因子融合蛋白与B细胞表面结合。
发明详述
术语＂T细胞表位＂根据本发明的理解是指这样的氨基酸序列，其可以以合理的效率结合MHC II类分子(或结合它们在非人物种中的等同物)、可刺激T细胞和/或也可在与MHC II类的复合体中结合(不必可测得地活化)T细胞。
此处及所附权利要求书中引用的术语＂肽＂为包括两个或多个氨基酸的化合物。氨基酸通过肽键(定义在下文中)连接。有20种不同的天然存在氨基酸参与肽的生物产生，它们可以以任何数目及任意顺序连接形成肽链或环。用于肽生物产生中的天然存在氨基酸均具有L-构型。可使用L-氨基酸、D-氨基酸、或两种不同构型的氨基酸的各种组合通过常规的合成法制备合成肽。某些肽仅包含为数不多的氨基酸单元。短肽，如具有少于10个氨基酸单元的短肽，有时称为“寡肽”。其它肽包含大量的氨基酸残基，例如高达100个或更多个残基，被称为“多肽”。按照惯例，认为“多肽”可为包含三个或多个氨基酸的任何肽链，而“寡肽”通常为特定类型的“短”多肽。因此，如此处所用，谈及“多肽”时也包括寡肽。而且任何谈及的“肽”都包括多肽、寡肽和蛋白质。氨基酸的每一种不同排列都将形成不同的多肽或蛋白质。可形成的多肽数及因此形成的不同蛋白质的数目实际上是不受限的。
此前和此后所用术语＂较小或降低的免疫原性＂为相对术语，涉及当暴露于同一类型物种体内时，将各最初的源分子与本发明的改变分子进行免疫原性的比较。
术语“改变的蛋白质“如本发明所用，描述的是具有较少的T细胞表位数并因此当暴露于给定物种的免疫系统时相对于亲本蛋白质而言引起降低的免疫原性的蛋白质。术语“未改变的蛋白质”如本发明所用，描述的是“改变的蛋白质”的“亲本”蛋白质，其具有较多的T细胞表位，并因此当暴露于给定物种的免疫系统时相对于改变的蛋白质而言具有增强的免疫原性。
术语“生物活性蛋白质”如此处及权利要求书中所用，如果不另外指出的话，根据本发明包括产生生物学和/或治疗作用的多肽、蛋白质、免疫球蛋白(如抗体、抗体片段)、融合蛋白、酶、抗原等。
术语“细胞因子”此处用于描述这样的蛋白质、其类似物及其片段，它们由细胞产生并分泌、且在具有该细胞因子的受体的细胞中引起特异性反应。优选地，细胞因子包括白细胞介素如白细胞介素2(IL-2)、血细胞生成因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)如TNFα、以及淋巴因子如淋巴毒素。优选地，本发明的抗体-细胞因子融合蛋白显示细胞因子生物活性。原则上，本发明包括最近根据它们的受体代码分类的所有细胞因子(Inglot，1997，Archivum Immunologiae etTherapie Experimentalis，45：353)。
术语“单链Fv”或“scFv”是指将常规双链抗体的重链和轻链连接形成一条链的抗体。一般在两条链之间插入接头肽，以允许活性结合位点的正确折叠和产生。
术语＂Fc区＂或＂Fc结构域＂如本发明中所用，应理解为免疫球蛋白重链恒定区的羧基端部分，或其可结合Fc受体的类似物或其部分。已知每一免疫球蛋白重链恒定区包含四至五个结构域。这些结构域依次命名如下：CH1-铰链区-CH2-CH3(-CH4)。CH4存在于IgM中，IgM无铰链区。用于本发明实践中的免疫球蛋白重链恒定区优选地包含免疫球蛋白铰链区，并优选地也包括CH3结构域。免疫球蛋白重链恒定区最优选地包含免疫球蛋白铰链区、CH2结构域和CH3结构域。本发明优选的Fc结构域因此由铰链区-CH2-CH3结构域组成。
如此处所用，术语免疫球蛋白“铰链区”应理解为是指全部的免疫球蛋白铰链区或免疫球蛋白铰链区的至少一部分，该部分应足以与第二免疫球蛋白铰链区形成一个或多个二硫键。
如此处所用，术语“信号序列”应理解为是指在宿主细胞中翻译后可以引导融合蛋白分泌并于此后被切割的片段。本发明的信号序列为编码启动蛋白质跨过内质网膜转运的氨基酸序列的多核苷酸。用于本发明的信号序列包括抗体轻链信号序列，如抗体14.18(Gillies等人(1989)免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)125：191)，和本领域公知的任何其它信号序列(参见如Watson，1984，核酸研究(Nucleic Acid Research)12：5145)。
至于对特定蛋白质而言，所用术语＂突变体或变体＂包括相关蛋白质的任何分子，如截短的分子或其它衍生物，在人体中它们实质上保留了与相关蛋白质同样的活性。此类其它衍生物可通过氨基酸的添加、删除、替换或重排或通过氨基酸的化学修饰而制备。
免疫球蛋白重链恒定区可考虑来自于属于被称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的各免疫球蛋白类的抗体，但优选来自IgG类的免疫球蛋白重链恒定区。而且，免疫球蛋白重链恒定区可考虑来自任何IgG抗体亚类，本领域中这些亚类被称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。免疫球蛋白重链恒定区的结构域在免疫球蛋白类中具有交叉同源。例如，IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域同源，并与IgM和IgE的CH3结构域同源。在US5,541,087和5,726,044中详细讨论了适宜的免疫球蛋白重链恒定区的选择。选择来自某些免疫球蛋白类和亚类的特定免疫球蛋白重链恒定区序列以达到特定结果，这被认为在本领域的技术水平内。在一些情况下，改变免疫球蛋白重链恒定区可能是有用的，例如通过突变、删除或遗传工程介导的或其它方法介导的其它改变，从而降低或消除某些活性如补体固定或抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)刺激。如果免疫球蛋白重链恒定区不能产生可检测的抗体反应，则认为Fc区没有或具有弱免疫原性。
而且，在本发明的实践中，可考虑在免疫球蛋白重链恒定区中进行氨基酸的替换或删除。一个例子包括在CH2的上部区域导入氨基酸替换以产生Fc变体，该变体具有降低的Fc受体亲和性(Cole等人(1997)免疫学杂志(J.Immunol.)159：3613)。体内循环半衰期增加的基于抗体的融合蛋白可通过构建具有降低的Fc受体结合亲和性的融合蛋白并避免使用来自可结合Fc受体的抗体同种型的序列而获得(WO99/43713)。例如，在四种已知的IgG同种型中，IgG1(Cγ1)和IgG3(Cγ3)已知以高亲和性结合FcRγ1，而IgG4的结合亲和性小10倍，且IgG2(Cγ2)不结合FcRγ1。这样，具有降低的Fc受体结合亲和性的基于抗体的融合蛋白可通过构建具Cγ2恒定区(Fc区)或Cγ4Fc区的融合蛋白并避免具有Cγ1Fc区或Cγ3Fc区的构建体而获得。体内循环半衰期增加的基于抗体的融合蛋白可通过改变在具有Fc受体结合亲和性的同种型中结合Fc受体所必需的序列以减少或去除结合而获得。
对于FcγR结合重要的序列为Leu-Leu-Gly-Gly(Cγ1中残基234至237)，其位于邻近铰链区的CH2结构域中(Canfield和Morrison，实验医学杂志(J.Exp.Med.)173：1483-1491(1991))。对于有效的FcR结合所必需的另一重要结构组分为存在与Asn297共价结合的N-连接糖链。酶促去除该结构或突变Asn残基可有效消除或至少显著降低与所有FcγR类的结合。
所得到的基于抗体的融合蛋白较未连接的第二非免疫球蛋白蛋白质具有更长的体内循环半衰期。配体的二聚体化可提高配体和其受体间的表观结合亲和力。例如，如果Fc-X融合蛋白的第一X部分可以以一定的亲和性结合细胞上的受体，则同样的Fc-干扰素α融合蛋白的第二X部分可以以高得多的亲合力(表观亲和力)结合同一细胞上的第二受体。其发生是因为在第一X部分结合受体后，第二X部分与受体将是物理上接近的。在抗体结合抗原的情况下，表观亲和力可上升至少1万倍。每一蛋白质亚单位，即“X”都具有其独立的功能，因此在一个多价分子中，蛋白质亚单位的功能可以是相加的或协同的。这样，常规二聚化的Fc分子或另一抗体片段与多肽X的融合可提高X的活性。
可用于本发明实践中的编码人免疫球蛋白Fc区，尤其是Fcγ1、Fcγ2和Fcγ3的核酸序列以及定义人免疫球蛋白Fc区，尤其是Fcγ1、Fcγ2和Fcγ3的氨基酸序列在现有技术中已给出，如公开在(WO 00/40615，WO00/69913，WO 00/24782)或在Genbank和/或EMBL数据库中，例如，AF045536.1(食蟹猴Macaca fuscicularis)，AF045537.1(猕猴(Macacamulatta))，AB016710(Felix catus)，K00752(欧洲兔Oryctolaguscuniculus)，U03780(野猪(Sus scrofa))，248947(单峰驼Camelusdromedarius)，X62916(Bos taurins)，L07789(水貂Mustela vison)，X69797(绵羊Ovis aries)，U17 166(Cricetulus migratorius)，X07189(黑家鼠(Rattus rattus))，AF57619.1(袋鼠Trichosurus vulpecula)，或AF035195(鼠形短尾负鼠Monodelphis domestica)。
这样，早期报道的载体(Lo等人(1998)蛋白质工程(ProteinEngeneering)11：495-500)通过将人IgG1Fc序列替换为来自编码小鼠IgG2a Fc的cDNA的序列而改变(US 5,726,044)。
本发明包括在免疫球蛋白组分中的突变，该突变去除了天然免疫球蛋白中不想要的特性如Fc受体结合特性和/或导入了所希望有的特性如稳定性。例如，Angal S.，King D.J.，Bodmer M.W.，Turner A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.和Adair R.在分子免疫学(MolecularImmunology)，130，105-108页，1993中描述了将IgG4分子中的残基241(Kabat编号)从丝氨酸变为脯氨酸。该变化提高了IgG4分子的血清半衰期。Canfield S.M.和Morrison S.L.在实验医学杂志(Journal ofExperimental Medicine)173卷，1483-1491页中描述了将IgG3中的残基248(Kabat编号)从亮氨酸变为谷氨酸，以及在小鼠IgG2b中从谷氨酸变为亮氨酸。在前者中用亮氨酸替换谷氨酸可降低该免疫球蛋白分子对FcγR1受体的亲和性，在后者中用谷氨酸替换亮氨酸可升高该亲和性。EP 0307434公开了多种突变，包括在IgG的残基248(Kabat编号)处将L突变为E。这些恒定区或其片段优选地为人IgG重链恒定区的全部或相当大的一部分。此IgG组分适宜包含CH2和CH3结构域和铰链区，其中包含的半胱氨酸残基有助于形成重链间的二硫键。例如当该IgG组分来自IgG4时，它包括IgG4铰链区的半胱氨酸残基8和11(Pinck J.R.和Milstein C.，自然(Nature)，121(6)，941-942页，1967)。
本发明方法可按照常规的重组技术实施，如在Maniatis等人(分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)；Cold SpringHarbor，1982)和DNA克隆(DNA Cloning)I、II和III卷(D.M.Glover编辑，IRLPress Ltd)或Sambrook等人(1989，分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，USA)中所述。
具体而言，该方法可包括以下步骤：
(i)制备可复制的表达载体，其可在宿主细胞中表达包含编码所述化合物的核苷酸序列的DNA聚合物；
(ii)用所述载体转化宿主细胞；
(iii)在允许所述DNA聚合物表达的条件下培养所述转化宿主细胞，以产生所述化合物；以及
(iv)回收所述化合物。
本发明也提供了通过缩合合适的单体核苷酸、二聚体核苷酸、寡核苷酸单元来制备DNA聚合物的方法。制备可通过化学方法、酶促方法或组合这两种方法根据需要于体外或体内进行。这样，DNA聚合物可通过适宜DNA片段的酶促连结按常规方法制备，使用的常规方法如D.M.Roberts等人在生物化学(Biochemistry)1985，24，5090-5098中所述的常规方法。DNA片段可通过用合适的限制性酶消化含所需核苷酸序列的DNA、通过化学合成、通过在DNA或RNA模板上酶促聚合、或通过组合这些方法而获得。用限制性酶消化可在合适的缓冲液中于20-70℃消化0.1-10μgDNA。DNA的酶促聚合可使用DNA聚合酶如DNA聚合酶I(Klenow片段)在含有所需核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dITP的合适缓冲液中于10-37℃体外进行，通常的体积为50μl或更少。DNA片段的酶连可使用DNA连接酶如T4DNA连接酶在合适的缓冲液中于40℃至室温下进行，通常的体积为50μl或更少。
DNA聚合物或片段的化学合成可按照常规的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学使用固相技术进行，如在“基因片段的化学和酶促合成-实验室手册”(＂Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-ALaboratory Manual＂)(H.G.Gassen和A.Lang编辑)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)或在其它科学出版物如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat和R.C.Titmas，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，1982，10，6243；B.S.Sproat和W.Bannwarth，四面体通讯(Tetrahedron Letters)，1983，24，5771；M.D.Matteucci和M.HCaruthers，四面体通讯(Tetrahedron Letters)，1980，21，719；M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，美国化学协会杂志(Journal of the AmericanChemical Society)，1981，103，3185；S.P.Adams等人，美国化学协会杂志(Journal of the American Chemical Society)，1983，105，661；N.D.Sinha，J.Biemat，J.McMannus，和H.Koester，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)，1984，12，4539；和H.W.D.Matthes等人，EMBO Journal，1984，3，801中所述的技术。优选地使用自动的DNA合成仪。
可通过用合适的限制性酶消化含所需编码序列的载体或通过使用聚合酶链反应技术获得DNA分子。DNA分子的精确结构和获得它们的方法取决于目标产物的结构。设计合适策略构建编码化合物的DNA分子为本领域技术人员的日常工作。
编码化合物的DNA聚合物在重组宿主细胞中的表达可借助于可复制表达载体进行，该载体可在宿主细胞中表达DNA聚合物。该表达载体为新的，也构成了本发明的一部分。可复制的表达载体可按照本发明如下制备：切割可与宿主细胞相容的载体提供具有完整复制子的线性DNA片段，将所述线性片段与一种或多种DNA分子在连接条件下组合，其中所述DNA分子与所述线性片段在一起编码化合物。线性片段与一种以上DNA分子的连接可根据需要同时或依次进行。这样，DNA聚合物可根据需要预形成或在载体构建期间形成。有用的表达载体参见Lo等人(1988)蛋白质工程(Protein Engineeering)11：495中所述，其中Fc-X基因的转录使用了人巨细胞病毒(cytomegalovirus)的增强子/启动子和SV40多聚腺苷酸化信号。合适的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和衍生自如杆状病毒(baculoviruses)、痘苗病毒(vaccinia)或塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus)的重组病毒。这样，早期报道的载体(Lo等人(1998)蛋白质工程(Protein Engeneering)11：495-500)通过将人IgG1Fc序列替换为来自编码小鼠IgG2a Fc的cDNA的序列(US5,726,044)而改变。
载体的选择部分取决于宿主细胞，宿主细胞可为原核的如大肠杆菌，或为真核的如小鼠C127、小鼠骨髓瘤、中国仓鼠卵巢、COS或Hela细胞，真菌如丝状真菌或单细胞酵母或昆虫如果蝇细胞。当前用于本发明的优选宿主细胞包括永生杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HELA细胞和COS细胞。宿主细胞也可为转基因动物。
可如上所述进行聚合和连接来制备DNA聚合物。用限制性酶消化可在合适的缓冲液中于20-70℃消化0.1-10μgDNA。重组宿主细胞根据本发明如下制备，在转化条件下用本发明的可复制表达载体转化宿主细胞。合适的转化条件为常规条件，并在如Maniatis等人(引用同上)或“DNA克隆”(＂DNA Cloning＂)II卷，D.M.Glover编辑，IRLPress Ltd，1985中描述。转化条件的选择取决于宿主细胞。这样，可用CaCl2溶液(Cohen等人，美国国家科学院院报(Proc.Nat.Acad.Sci.)，1973，69，2110)或用含RbCl、MnCl2、醋酸钾和甘油的混合物的溶液，然后用3-[N-吗啉醇]-丙烷-磺酸、RbCl和甘油处理细菌宿主如大肠杆菌。培养的哺乳动物细胞可用载体DNA与钙共沉淀在细胞上来转化。本发明也延伸至用本发明的可复制表达载体转化或转染的宿主细胞。在允许DNA聚合物表达的条件下培养转化的宿主细胞可以按常规进行，这在如上面引用的Maniatis等人和“DNA克隆”(＂DNA Cloning＂)中描述。这样，优选地给细胞提供营养成分并在低于45℃下培养。按照宿主细胞利用常规方法回收表达产物。这样，当宿主细胞为细菌如大肠杆菌时，可对其进行物理、化学或酶促裂解，并从所得的裂解物中分离蛋白质产物。如果产物自细菌细胞中分泌出来，可从外周质间隙或培养基中回收产物。当宿主细胞为哺乳动物细胞时，产物通常可以分离自培养基。DNA聚合物可组装入设计用于分离表达此产物的稳定转化的哺乳动物细胞系的载体中：例如牛乳头状瘤病毒(bovinepapillomavirus)载体或中国仓鼠卵巢细胞中的扩增载体(DNA克隆(DNAcloning)11卷D.M.Glover编辑，IRL Press 1985；Kaufman，R.J.，分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)5，1750-1759，1985；PavlakisG.N.和Hamer，D.H.，Proceedings of the National Academy of Sciences(USA)80,397-401，1983；Goeddel，D.V.等人，以及EP0093619，1983)。
本发明的免疫接合物可包含接头分子。接头优选地由通过肽键连接在一起的氨基酸组成。这样，在优选的实施方案中，接头由1至20个通过肽键连接的氨基酸组成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。可糖基化这些氨基酸中的一些，这一点为本领域技术人员熟知。在一个更优选的实施方案中，该1至20个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。甚至更优选地，接头主要由无空间位阻的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸组成。这样，优选的接头为多聚甘氨酸，如
多聚Gly(尤其是(Gly)2-(Gly)7)，
多聚(Gly-Ala)，
多聚Ala。
合适接头的其它具体实例为：
(Gly)3Lys(Gly)4
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2
(Gly)3Cys(Gly)4和
GlyProAsnGlyGly
也优选Gly和Ala的组合。此处所示的接头为示例性的；在本发明范围内的接头可长得多并可包括其它残基。也可以是非肽接头。可如上述以相同方式改变肽接头以形成其衍生物。
本发明优选的接头为没有免疫原性或有较小免疫原性的。上面引用的接头肽大部分至少为具较小免疫原性的接头肽。但是，也有可能的是：在抗体或sFv、Fab、Fab′或F(ab′)2或Fc结构域与靶蛋白质之间通过如上所述的接头肽分子建立连接时，在连接区域内新产生新的免疫原性表位，导致免疫接合物与单一(去免疫的)组分的免疫原性相比具有增高的免疫原性。这种情形也可延伸至没有接头分子的融合蛋白。因此，本发明也涉及本发明融合蛋白的去免疫区域，即所谓的融合区或连接区。当第一蛋白质分子与第二蛋白质分子(其也可为接头分子)通过C-和N-末端融合时，产生了人工的序列区，因此，该序列区通常从未被免疫系统见过。该区域被认为是具有免疫原性的。根据本发明，该氨基酸残基区域包含各蛋白质末端(N-或C-末端)的约10个残基。因此，整个融合区包含约20个氨基酸残基，优选地包含2-16个，更优选地包含2-10个氨基酸残基(其相应为各融合部分的1-8个和1-5个氨基酸残基)。
本发明也包括其它Fc变体。对于此类其它Fc变体，可去除天然Fc中提供对本发明融合分子而言所不需要的结构特征或功能活性的一个或多个位点。可以通过如在所述位点处替换或删除残基、插入残基、或截去含此位点的部分而去除这些位点。插入或替换的残基也可为修饰的氨基酸，如肽模拟物或D-氨基酸。例如，可去除一个或多个糖基化位点。通常糖基化的残基(如天冬酰胺)可导致溶细胞反应。可删除或用非糖基化残基(如丙氨酸)替换此类残基。如果特别需要的话，也可去除ADCC位点及参与补体相互作用的位点如C1q结合位点。
本发明也包括本发明靶多肽(X)的衍生物。此类衍生物可进一步提高(X)的溶解度、吸收、生物半衰期等。该经改变的(X)备选地可去除或减轻任一不希望有的负作用等。示例性的衍生物也包括其中的(X)或其某部分为环状的化合物。例如，可将肽部分改变为包含2个或多个Cys残基(如在接头中)，这样其可通过形成二硫键而环化。该化合物可以为交联的或能进行分子间交联。例如，可将肽部分改变为包含一个Cys残基，这样其可与相似分子形成分子间二硫键。
在最后一个方面中，本发明涉及包含通过本发明公开的方法可获得的所述生物活性蛋白质的药物组合物，并涉及用这些改变的分子和药物组合物治疗人的方法。
本发明的治疗性组合物包含生理可接受的载体及溶解或分散于其中作为活性成分的此处所述相关药剂。如此处所用，当谈及组合物、载体、稀释剂和试剂时所用术语＂可药用的＂、＂生理可接受的＂及其语法上的变形形式可互换使用，表示可施用于哺乳动物或在施用于哺乳动物后不会引起如恶心、眩晕、胃不适等不良生理学效应的物质。其中溶解或分散有活性成分的药物组合物的制备在本领域是熟知的，不必受限于其剂型。一般，此类组合物制备为液体溶液或悬液的注射形式，但是，也可制备为在使用前适于在液体中形成溶液或悬液的固体形式。
制品也可被乳化。活性成分可以以适用于此处所述治疗性方法的量与赋形剂混合，其中所述赋形剂为可药用的并与活性成分相容的。合适的赋形剂为例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或它们的组合。此外，需要的话，组合物可包含增强活性成分作用的小量辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。
本发明的治疗性组合物中包含的组分可以为可药用盐形式。可药用盐包括与无机酸或有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的酸加成盐)，其中所述无机酸如盐酸或磷酸，所述有机酸如醋酸、酒石酸、扁桃酸等。也可衍生自无机碱和有机碱得到与游离羧基形成的盐，其中所述无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，所述有机碱如异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。当用于环状多肽αv拮抗剂制品中时尤其优选HCl盐。生理可接受载体为本领域熟知。示例性液体载体为无菌水溶液，其除了包含活性成分和水外不包含其它物质，或者其可以包含缓冲液，如在生理pH值的磷酸钠、生理盐水或两者，如磷酸盐缓冲的盐水。进一步地，含水载体可包含一种以上的缓冲盐及象氯化钠和氯化钾这样的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。
液体组合物也可包含液相并包含水或不包含水。此类额外的液相的例子为甘油、植物油如棉籽油和水-油乳剂。
一般，以本发明的经改变抗体或抗体片段形式存在的经改变免疫球蛋白的治疗有效量为这样的量，当以生理可接受组合物形式施用时其足以达到约0.01μg/ml至约100μg/ml，优选地约1μg/ml至约5μg/ml，且通常约5μg/ml的血浆浓度。换句话说，该剂量可在约0.1mg/kg至约300mg/kg之间变化，优选地约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选约0.5mg/kg至约20mg/kg，每天一次或多次施用，施用一天或几天。当免疫治疗剂为单克隆抗体片段或接合物形式时，根据片段/接合物的质量相对于全抗体的质量易于调整此剂量。以摩尔浓度表示的优选血浆浓度为约2μM至约5mM，并优选地，约100μM至1mM的抗体拮抗剂。
本发明药剂为非免疫治疗性肽或蛋白质时，其治疗有效量一般为这样一种分子的量，当其以生理可接受组合物施用时足以达到约0.1μg/ml至约200μg/ml，优选地约1μg/ml至约150μg/ml的血浆浓度。根据具有约500g/mol的质量的蛋白质，以摩尔浓度表示的优选血浆浓度为约2μM至约5mM，并优选地，约100μM至1mM的多肽拮抗剂。
本发明的药物组合物可包含减轻或避免与本发明的联合治疗(“辅助治疗”)相关的副作用的药剂，其包括但不限于如减轻抗癌药的毒性作用的药剂。所述辅助药剂可以防止或降低与化学治疗、放射治疗或手术相关的恶心和呕吐的发生率，或可以降低与施用骨髓抑制性抗癌药相关的感染的发病率。辅助药剂为本领域熟知。本发明的经改变蛋白质还可与佐剂如BCG和免疫系统刺激剂一起施用。
而且，组合物可包括免疫治疗剂、化学治疗剂和抗癌剂，其包括具细胞毒作用的放射性标记的同位素或其它细胞毒因子如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药物等。活性剂优选地为本发明的化学拮抗剂或化学治疗剂(既不是免疫治疗剂也不是非免疫治疗性肽/蛋白质)，其一般剂量为每千克体重每天10mg至1000mg，优选地约20至200mg，且更优选地50至100mg。
下列实施例更详细地描述了本发明。但是，此列举不限制本发明。
实施例1：
下列实施例详细描述了在本发明公开的融合蛋白序列中鉴定免疫原性序列区(T细胞表位)的优选方法。但是，应指出所述分子可通过其它已知方法获得。
为了获得本发明的免疫接合物而被改变的分子中T细胞表位的鉴定可通过在现有技术中描述的不同方法(WO 92/10755和WO 96/40792(NovoNordisk)，EP 0519 596(Merck & Co.)，EP 0699 755(Centro deImmunologia Moelcular)，WO 98/52976和WO 98/59244(Biovation Ltd.)或相关方法进行。
但是，如果所述表位的鉴定是通过此处详细描述的以下新方法实施的，则可获得有利的免疫接合物：在确定蛋白质、多肽或免疫球蛋白的总体结构时有许多因素起到重要的作用。首先，肽键，即在链中将氨基酸连接在一起的键，为共价键。该键在结构上是平面的，实质上是一个取代的酰胺。“酰胺”指含有基团-CONH-的一组有机化合物中的任一化合物。
连接邻近氨基酸的Cα的平面肽键可如下描述：
由于O＝C和C-N原子位于相对刚性的平面中，围绕这些轴不发生自由旋转。因此，由虚线图示性描述的平面有时称为＂酰胺＂或＂肽平面＂，其中有肽主链的氧原子(O)、碳原子(C)、氮原子(N)和氢原子(H)。Cα原子位于该酰胺平面的相对角。由于围绕肽或酰胺平面中的O＝C和C-N原子基本上没有旋转，多肽链因此包含一系列连接Cα原子的平面肽键。
在规定多肽或蛋白质的总体结构或构象时起重要作用的第二个因素是每一酰胺平面围绕共同Cα键的旋转角。术语＂旋转角＂和＂扭转角＂在后文中认为是同等术语。假定O、C、N和H原子保持在酰胺平面中(这通常为有根据的假设，虽然在一些构象中这些原子与平面存在一些轻微的偏离)，这些旋转角可以定义N和R多肽的主链构象，即存在于邻近残基间的结构。这两个角被称作为φ和Ψ。这样一组角φi和ψi角有效地定义了多肽的二级结构，其中下标i表示多肽链的特定残基。在文献中规定了用于定义φ角、Ψ角的规定，即酰胺平面为零度角时的参照点，以及对于给定多肽应定义哪个角是φ、哪个角是Ψ。参见如Ramachandran等人，Adv.Prot.Chem.23：283-437(1968)，285-94页，在此引用作为参考。
本方法可用于任一蛋白质，其部分地基于如下发现：在人类中MHC II类分子结合沟的主要口袋1锚位置对特定的氨基酸侧链具有设计好的特异性。该口袋的特异性由MHC II类分子β链86位处的氨基酸的身份确定。该位点位于口袋1的底部并决定了可被该口袋容纳的侧链的大小。Marshall，K.W.，免疫学杂志(J.Immunol.)，152：4946-4956(1994)。如果该残基为甘氨酸，则所有的疏水性脂肪族和芳族氨基酸(疏水脂肪族氨基酸为：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸，芳族氨基酸为：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)均可容纳于口袋中，优选芳族侧链。如果该口袋残基为缬氨酸，则该氨基酸的侧链伸入口袋中并限制了可容纳的肽侧链大小，以至于只能容纳疏水性脂肪族侧链。因此，在一个氨基酸残基序列中无论何处存在具有疏水性脂肪族或芳族侧链的氨基酸，在该处都有可能存在MHC II类限制的T细胞表位。但是，如果侧链为疏水性脂肪族侧链时，其与芳族侧链相比约两倍的可能性与T细胞表位相关(前提是口袋1型在世界人群中大约呈平均分布)。
将本发明具体化的计算法描绘出肽区域包含T细胞表位的可能性，见如下：
(1)扫描预定长度肽片段的一级序列，并确定存在的所有疏水性脂肪族和芳族侧链。(2)对疏水性脂肪族侧链赋予较芳族侧链大的值；优选地约是赋予芳族侧链的值的两倍，例如，给疏水性脂肪族侧链赋值为2，给芳族侧链赋值为1。(3)对肽中具预定统一长度的每一重叠氨基酸残基片段(窗口)，将经确定存在的值相加，并将特定片段(窗口)的总值赋予位于该片段(窗口)中间位置的某一单个氨基酸残基，优选地赋予大约位于该采集片段(窗口)中点的残基。对每一采集的重叠氨基酸残基片段(窗口)重复该过程。这样，肽的每一氨基酸残基都被赋予了与在该特定片段(窗口)中存在T细胞表位的可能性相关的值。(4)根据如上步骤3所述计算的并赋予的值可相对于被评定的全长氨基酸残基序列中的氨基酸坐标绘图。(5)具有预定值如值为1的各序列部分被认为可能包含T细胞表位，并且需要的话可对其进行改变。
本发明的该特定方面提供了一种通用方法，根据该方法可以描述可能包含T细胞表位的肽区域。在这些区域中进行肽修饰可能改变MHC II类结合特性。根据本发明的另一方面，通过使用考虑肽与MHC II类等位基因模型的相互作用的更复杂计算法可更精确地预测T细胞表位。
根据该特定方面，对肽中存在的T细胞表位的计算预测考虑到：基于所有已知MHC II类分子的结构构建至少42个MHC II类等位基因模型；使用这些模型计算鉴定T细胞表位的方法；对每一模型构建肽主链文库以允许在相关肽主链α碳(Cα)位置具有已知的变异性；在肽和MHC II类分子间相互作用关键的位置处，对与每一模型对接(dock)的每一主链，相对于20种氨基酸替代物中每一种构建氨基酸侧链构象文库；以及将这些主链和侧链构象文库与评分函数结合用于选择与特定MHC II类分子对接的特定肽的最佳主链和侧链构象并得出该相互作用的结合分值。
通过同源模建可以从Brookhaven蛋白质数据库(“PDB”)中的许多相似结构得出MHC II类分子的模型。这些可通过使用合并了模拟复性函数的半自动同源模建软件(Modeller，Sali A.& Blundell TL.，1993，分子生物学杂志(J.Mol Biol)234：779-815)，和用于能量最小化的CHARMm力场(可购自Molecular Simulations Inc.，San Diego，Ca.)进行。也可使用其它模建方法。
本方法明显不同于其它计算法，所述其它计算法在于使用通过实验得出的针对一小群MHC II类分子的结合沟中每一位置处每一备选氨基酸的结合数据文库(Marshall，K.W.等人，Biomed.Pept.Protiens Nucleic Acids，1(3)：157-162)(1995)；或者在于使用类似的实验性结合数据以定义结合沟中特定类型的结合口袋的结合特征(这又一次使用了相当少的MHC II类分子亚群)，然后‘混合和匹配’来自该口袋文库的口袋类型以人工产生更‘实际的’MHC II类分子(Sturniolo T.等人，自然生物技术(Nat.Biotech)，17(6)：555-561(1999))。这两种现有方法的主要不利之处在于，由于试验的复杂性并需要合成大量的肽变体，故只有少量的MHCII类分子可进行实验扫描。因此，第一种现有方法只能对少数MHC II类分子进行预测。第二种现有方法还假设在不同II类等位基因的背景下在一个分子中衬有相似氨基酸的口袋将具有相同的结合特性，这样该方法的另一不利之处在于只有那些所含口袋被包含在口袋文库中的MHC II类分子可得以‘真实’构建。使用此处描述的模建方法，可推导出任何数目和类型的MHC II类分子的结构，因此可特异性地选择出代表全球人群的等位基因。此外，可通过建立其它的模型而不需通过复杂的实验产生另外的数据来增加所扫描的MHC II类分子数。
主链文库的使用使得扫描的各种肽在结合特定的MHC II类分子时Cα原子处可进行变化。这又与上述备选的现有计算法不同，现有计算法在于使用简化的肽主链来观察在特定口袋中氨基酸的结合。这些简化的主链不可能代表在‘真实的’肽中存在的主链构象，从而导致肽结合预测的不准确性。本主链文库是通过叠加蛋白质数据库中与MHC II类分子结合的所有肽的主链并考虑到位于结合沟中的11个氨基酸的每一个的Cα原子间的均方根(RMS)差而构建的。虽然该文库可从小量合适的可获得的小鼠和人结构(目前为13种结构)推导出，但为了允许更大变异性的可能，将每一C＂-α位置的RMS数提高50％。然后确定每一氨基酸的平均Cα位置，并围绕该点绘制球，其半径等于在该位置处的RMS差加50％。该球代表所有允许的Cα位置。
自具有最小RMS差的Cα(上述口袋1中氨基酸残基的Cα，等同于结合沟中11个残基的位置2)起运作，将所述的球三维网格化，网格内的每个顶点作为该氨基酸的Cα的可能位置。将后续的酰胺平面(相应于与后续氨基酸的肽键)移动到这些Cα的每一个上面，将φ和Ψ角以设定的间隔逐步地转动以便于安置后续的Cα。如果后续的Cα落入对这一Cα而言‘可被允许的位置球’中，则此二肽的方向即可被接受，如果其落入所述球之外则所得的二肽不能被接受。对每一后续Cα位置均重复这一过程，使肽从所述的口袋1Cα‘种子’开始生长，直到全部9个后续的Cα的位置均根据之前Cα的所有可能排列确定下来。然后对口袋1前的单个Cα重复上述步骤1次以上以构建定位于结合沟内的主链Cα位置文库。
生成的主链数目取决于几种因素：‘可被允许的位置球’的大小；对口袋1位点处′最初的球′网格化的细度；用于定位后续Cα的φ和Ψ角逐步旋转的细度。利用这一程序可以构建大的主链文库。主链文库越大越可能发现对MHC II类分子结合沟内的特定肽而言的最适主链。鉴于和结合结构域的氨基酸可能存在冲突，所以不是所有的主链均适合于与所有MHC II类分子模型‘对接’(docking)，故对每个等位基因建立亚文库以包含适合被该等位基因容纳的主链。利用所述的主链文库并结合MHC II类分子模型可以构建出由与每一容许主链对接的每一MHC II类分子结合沟的每一位点中的每一氨基酸的容许侧链构象所组成的详尽数据库。可以利用简单的立体重叠函数构建这一数据组，其中，主链与MHC II类分子对接，氨基酸侧链在所需位置被嫁接到主链上。将侧链上可旋转的键以设定的间隔逐步旋转，记录下依赖于该键的原子的最终定位。将所述原子与结合沟侧链原子间的相互作用记录下来，根据下述的标准确定是否接受这些位置：如此定位的所有原子的重叠总量不能超过预定值。因此，构象搜索的严谨度是在键的逐步旋转中所用的间隔及对总重叠的预定限度的函数。如果已知特定的口袋是刚性的，则后一值可较小，但若已知口袋侧链的位置相对灵活则严谨度可放松。这样便可以模拟结合沟口袋内灵活性的变化。针对与每一MHC II类分子对接后每一主链的所有位点上的所有氨基酸重复这种构象搜索以建立详尽的侧链构象数据库。
用适当的数学表达式评价MHC II类分子模型与肽配体构象的结合能量，所述的肽配体构象需通过扫描上述的主链/侧链构象大数据库根据经验获得。这样，通过对每一长度在9-20个氨基酸范围内变化(尽管对于每一次扫描长度是一定的)的可能肽进行下述计算，可以扫描蛋白以搜索潜在的T-细胞表位：选择MHC II类分子及适合于该分子的肽主链，将相应于所需肽序列的侧链移植到其上。对于氨基酸的每一容许构象(由上述数据库获得)，收集与主链上特定位点的特定侧链相关的原子身份和原子间距数据。沿主链对每一侧链重复此过程，利用评分函数推导肽得分。保留该主链的最佳得分，对所选模型的每一容许主链重复该过程。比较所有容许主链的得分，最高的得分被认为是该MHC II类模型中所需肽的得分。对每一模型用从扫描的蛋白得到的所有可能肽重复上述过程，列出肽相对于模型的得分。
在本发明中，用于结合亲和力计算的每种配体都是选自上述肽或蛋白的氨基酸片段。因此所述配体为来自已知序列的肽、多肽或蛋白的长度为约9到20个氨基酸的选定氨基酸链。此后术语“氨基酸”和“残基”视为等同的术语。将移植到选自上述主链文库的主链上的待检测肽中的连续氨基酸形式的配体，通过肽主链上C＂-α原子坐标定位到来自MHC II类分子模型库的MHC II类分子的结合裂缝中，并从容许构象的数据库中选择每一侧链的容许构象。相关的原子身份和原子间距也可以从这一数据库获得并用于计算肽结合分数。将对MHC II类结合口袋具有高亲和力的配体作为侯选者标记出来用于定点诱变。在标记的配体中(也由此在目的蛋白中)进行氨基酸替代，然后用评分函数重新测定以确定使结合亲和力降低到预定的阈值以下的变化。这些变化即可引入到目的蛋白中以去除T-细胞表位。肽配体与MHC II类分子结合沟的结合涉及非共价键相互作用，其包括但不限于：氢键、静电相互作用、疏水(亲脂)相互作用和范德华相互作用。它们被包括在下面将详细描述的肽评分函数中。应当理解，氢键是非共价键，其可在极性或带电的基团之间形成，由被两个其他原子共享的氢原子构成。氢供体中的氢带正电荷，而氢受体带有部分负电荷。为肽/蛋白相互作用的目的，氢键供体可以是连接氢的氮，或连接在氧或氮上的氢。氢键受体原子可以是没有连接氢的氧、没有连接氢并具有一或两个连接的氮或仅有一个连接的硫。某些原子，如连接了氢的氧或亚胺氮(如C＝NH)，既可以是氢受体也可以是氢供体。氢键的能量在3-7Kcal/mol，大大强于范德化键，但弱于共价键。氢键具有高度的方向性，且当供体原子、氢原子和受体原子共线时最强。静电键是在带有相反电荷的离子对间形成的，根据库仑定律这种相互作用的强度与原子间距离的平方成反比。离子对间的最佳距离是约
Figure C02805158D00421
在肽/蛋白相互作用中，可在精氨酸、组氨酸或赖氨酸和天冬氨酸或谷氨酸之间形成静电键。该键的强度依赖于电离基团的pKa和介质的介电常数，尽管其与氢键的强度类似。
亲脂相互作用是蛋白和肽配体之间发生的有利疏水-疏水相互作用。这种相互作用通常出现在埋于结合沟口袋中的肽的疏水性氨基酸侧链间，以使它们不暴露在溶剂中。将疏水残基暴露于溶剂中是非常不利的，因为周围的溶剂分子将被迫在彼此间形成氢键而形成笼状结构。所致的熵值降低是非常不利的。亲脂性原子可以是既非极性又不是氢受体的硫和非极性的碳原子。
范德华键是相距
Figure C02805158D00422
的原子间的非特异性的力。它比氢键和静电键弱、特异性低。原子周围的电荷分布随时间变化，并且在任何瞬间电荷分布均是不对称的。这种瞬间的电荷不对称性诱导临近原子中的类似不对称性。在范德华接触距离中所导致的原子之间的吸引力达到最大，而在约
Figure C02805158D00431
到
Figure C02805158D00432
处迅速消失。相反，当原子间隔的距离小于此接触距离时，由于原子外部的电子云重叠使不断增强的斥力成为主导。尽管与静电和氢键相比，此吸引力相对较弱(约0.6Kcal/mol)，但所述斥力对于决定肽配体是否能与蛋白成功结合可能非常重要。
在一个实施方案中，利用
Figure C02805158D00433
评分函数(SCORE1方法)评估结合常数(
Figure C02805158D00434
H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8(3)：243-256(1994)，该文献在此全文引入作为参考)。在另一个实施方案中，用评分函数(SCORE2方法)评估结合亲和力作为配体含有T-细胞表位的指示物
Figure C02805158D00435
H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，12(4)：309-323(1998)，该文献在此全文引入作为参考)。但是上述文献中描述的
Figure C02805158D00436
评分函数是用于评估下述情况中配体对蛋白的结合亲和力的，即已知所述的配体可成功地与所述蛋白结合，且蛋白/配体复合物的结构已解析，这一结构已列于蛋白数据库(＂PDB＂)中。因此，利用已知的阳性结合数据对评分函数作了发展。为了区分阳性和阴性的结合体，需向方程中加入排斥项。此外，可通过以成对的方式计算亲脂相互作用，而非利用上述
Figure C02805158D00437
函数中基于面积的能量项来进行更理想的结合能量评估。因此，在一个优选实施方案中，用改进的
Figure C02805158D00438
评分函数评估结合能。在改进的
Figure C02805158D00439
评分函数中，在评估蛋白和配体之间的结合能(ΔGbind)时考虑了下述参数：由于配体的平移和转动熵的整体损失造成的结合能减低(ΔG0)；理想氢键的贡献(ΔGhb)，其中至少一个配对物是中性的；无扰离子相互作用的贡献(ΔGionic)；亲脂配体原子和亲脂受体原子之间的亲脂相互作用(ΔGlipo)；由于配体中内在自由度的冻结，即绕每一C-C键的旋转自由度降低而造成的结合能损失(ΔGrot)；蛋白和配体之间相互作用的能量(Evdw)。考虑到这些项给出等式1：
(ΔGbind)＝(ΔG0)+(ΔGhb×Nhb)+(ΔGionic×Nionic)+(ΔGlipo×Nlipo)+(ΔGrot+Nrot)+(EvdW)
其中N是对于特定项符合的相互作用的数目，在一个实施方案中，ΔG0、ΔGhb、ΔGionic、ΔGlipo和ΔGrot是常数，其值分别为：5.4、-4.7、-4.7、-0.17和1.4。
Nhb项依照等式2计算：
Nhb＝∑h-bondf(ΔR，Δα)×f(Nneighb)×fpcs
f(ΔR，Δα)是罚函数，其解决氢键自理想情况的巨大偏离，其依照等式3计算：
f(ΔR，Δ-α)＝f1(ΔR)×f2(Δα)
其中：
如果ΔR<＝TOL        则f1(ΔR)＝1，或者
如果ΔR<＝0.4+TOL    则f1(ΔR)＝1-(ΔR-TOL)/0.4，或者
如果ΔR>0.4+TOL      则f1(ΔR)＝0
并且：
如果Δα<30°         则f2(Δα)＝1，或者
如果Δα<＝80°       则f2(Δα)＝1-(Δα-30)/50，或者
如果Δα>80°         则f2(Δα)＝0
TOL是氢键键长＝
Figure C02805158D00441
中所能允许的偏差
ΔR是H-O/N氢键键长与理想值＝
Figure C02805158D00442
的偏差
Δα是氢键键角∠N/O-H..O/N与180°理想值的偏差
f(Nneighb)区分蛋白表面的凹凸部分，并因此赋予口袋中的极性相互作用比蛋白表面的极性相互作用更高的权重。这一函数根据下述等式4计算：
f(Nneighb)＝(Nneighb/Nneighb，0)α，其中α＝0.5
Nneighb为蛋白中与任意给定蛋白原子之间的距离小于的非氢原子的数量。
Nneighb，0是常数＝25
fpcs是考虑到每氢键的极性接触表面面积的函数，由此可以区分强和弱的氢键，其值由下述的标准确定：
当
Figure C02805158D0045165312QIETU
时   fpcs＝β
当
Figure C02805158D0045165325QIETU
时   fpcs＝1
Apolar是极性蛋白-配体接触面的大小
NHB是氢键的数目
β是常数＝1.2
由于假定了相同的几何相关性，在实施改进的
Figure C02805158D0022164937QIETU
评分函数时，离子相互作用的贡献ΔGionic用与上述有关氢键的类似方式计算。
Nlipo项按下述的等式5计算：
Nlipo＝∑ILf(rIL)
根据下述标准，对于所有亲脂配体原子l和所有亲脂蛋白原子L，计算f(rIL)：
当rIL<＝R1时   f(rIL)＝1
当R2<rIL>R1时  f(rIL)＝(rIL-R1)/(R2-R1)
当rIL>＝R2时   f(rIL)＝0
其中：R1＝rI vdw+rLvdw+0.5
R2＝R1+3.0
rI vdw是原子l的范德华半径
rL vdw是原子L的范德华半径
Nrot项是氨基酸侧链中可旋转的键的数目，其被视为无环的sp3-sp3及sp3-sp2键的数目。末端-CH3或-NH3的旋转未考虑进去。
最终，项Evdw依照如下等式6计算：
Evdw＝ε1ε2((r1 vdw+r2 vdw)12/r12-(r1 vdw+r2 vdw)6/r6)，
其中：ε1和ε2是取决于原子身份的常数
rI vdw+r2 vdw是范德华原子半径
r是原子对间的距离。
关于式6，在一个实施方案中，ε1和ε2常数被赋予如下原子值，分别为：C：0.245，N：0.283，O：0.316，S：0.316(即分别对于碳、氮、氧和硫原子)。对于式5和6，给予范德华半径如下原子值，分别为C：1.85，N：1.75，O：1.60，S：
应当理解上述等式中所有预定的值和给定的常数都是在现有的对蛋白配体相互作用的理解局限内具体相对于此处所用的计算类型确定的。因此，随着这种评分函数的进一步精练，这些值和常数也会因此而改变，任何能在蛋白和配体结合能的评估方面给出所需结果的适宜数值均可使用，而且，其也落入本发明的保护范围内。
如上所述，所述的评分函数应用于由上述侧链构象、原子身份和原子间距数据库中提取的数据。为本说明书的目的，该数据库中包含的MHC II类分子数是42个模型加上4个已解析的结构。从上述描述中可清楚地了解到，本发明的计算构建方法的模块性质意味着，可简单地添加新的模型，并利用肽主链文库和侧链构象搜索功能进行扫描以创建其它的可通过上述的肽评分函数处理的数据集。这使得被扫描的MHC II类分子库可以很容易地增加，或者如果可以获得相关数据，则可以替换结构和相关数据以创建现有等位基因的更精确的模型。
本发明的预测方法可以相对于包含大量已通过实验确定了其对不同MHC II类分子的亲和力的肽的数据集进行校准。将计算值与实验数据相比较，可确定一截断值，已知该值之上所有经实验确定的T-细胞表位都得以正确的预测。
应当理解，尽管上述评分函数与现有的一些复杂方法相比相对简单，但计算进行得非常迅速。还应当理解的是，其目的并不在于计算出对接到所选择的MHC II类蛋白结合沟内的每种肽的真正结合能本身。根本的目的在于获得相对的结合能数据以助于根据所选蛋白的一级结构(即氨基酸序列)预测T-细胞表位的定位。相对高的结合能或结合能高于选定的阈值意味着在配体中存在T-细胞表位。然后可以将所述配体进行至少一轮氨基酸替代，并再次计算结合能。由于计算可迅速进行，对肽序列的这些操作可在现有成本划算的计算机硬件上于程序用户界面中互动进行。由此不需要对计算机硬件进行大量投资。
本领域的技术人员应当了解，也可使用其他软件达到相同的目的。特别是可以使用能将配体对接入蛋白结合位点的更复杂的软件，并与能量最小化相结合。对接软件的例子包括：DOCK(Kuntz等，J.Mol.Biol.，161：269-288(1982))，LUDI(
Figure C02805158D00471
H.J.，J.Comput Aided Mol.Des.，8：623-632(1994))和FLEXX(Rarey M.等，ISMB，3：300-308(1995))。分子建模和操作软件的例子包括：AMBER(Tripos)和CHARMm(Molecular Simulations Inc.)。使用这些计算方法将严重限制本发明方法的信息吞吐量，这是由于进行必要的计算所需的处理时间导致的。但是可行的方式为，将这些方法作为‘二级筛选’以获得关于通过本发明的方法发现为‘阳性结合体’的肽的更精确的肽结合能计算值。用于复杂的分子机械或分子动力学计算的处理时间的限制性是由进行所述计算的软件设计和目前计算机硬件技术的限制共同确定的。可以预期在将来，随着编写更高效的代码和计算机处理器速度的不断提高，在更易控制的时间框架内进行上述计算是可行的。有关用于大分子的能量函数的其他信息和有关在折叠蛋白结构内发生的多种相互作用的考虑可参考下述文献：Brooks，B.R.，等.，J.Comput.Chem.，4：187-217(1983)，有关蛋白-配体一般相互作用的信息参见：Dauber-Osguthorpe等，Proteins 4(1)：31-47(1988)，这些文献均全文引入作为参考。其他有用的背景资料也可参见Fasman，G.D.编，Prediction of ProteinStructure and the Principles of Protein Conformation，Plenum Press，New York，ISBN：0-306 4313-9。
实施例2：Fc-Leptin的去免疫形式
Leptin为参与维持脂肪块的稳态机制的146个氨基酸残基的分泌信号传递蛋白质(例如WO 00/40615，WO 98/28427，WO 96/05309)。该蛋白质(及其拮抗剂)为糖尿病、高血压和胆固醇代谢的治疗提供了显著的治疗潜力。
Fc-leptin为融合蛋白，其血清半衰期较leptin自身显著提高(WO0040615)。但是，某些形式的Fc-leptin，例如当Fc来自人IgG1或人IgG3时，在某些情况下，例如通过皮下注射施用时，有可能显示增强的免疫原性。在I期临床试验中，发现单独的leptin至少多少具免疫原性。本发明公开了在leptin一级序列中鉴定到的具MHC II类结合潜力的潜在T细胞表位序列。本公开特异地涉及包含约146个氨基酸残基的人leptin部分。其他人已提供了改变的leptin(US，5,900,404；W096/05309)，但这些方法是针对leptin商业生产进行的改进，例如增高的体外稳定性。此类教导没有认识到T细胞表位对蛋白质免疫原性特性的重要性，也没有考虑到按照本发明方案以特异的和受控的方式直接影响所述特性。具体的Fc-leptin形式为Fcγ1-leptin、Fcγ2-leptin，这两种形式优选地具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的已改变Fc结构域。在leptin中欲改变的序列如下所示：
作为免疫原性未改变的人肥胖蛋白(leptin)序列的一部分并且具有潜在的MHC II类结合活性的氨基酸序列选自按照本发明方法鉴定的下列序列：
在人leptin中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列
VPIQKVQDDTKTL，QKVQDDTKTLIKT，KTLIKTIVTRIND，TLIKTIVTRINDI，
KTIVTRINDISHT，TIVTRINDISHTQ，TRINDISHTQSVS，NDISHTQSVSSKQ，
QSVSSKQKVTGLD，SSKQKVTGLDFIP，QKVTGLDFIPGLH，TGLDFIPGLHPIL，
LDFIPGLHPILTL，DFIPGLHPILTLS，PGLHPILTLSKMD，GLHPILTLSKMDQ，
HPILTLSKMDQTL，PILTLSKMDQTLA，LTLSKMDQTLAVY，SKMDQTLAVYQQI，
QTLAVYQQILTSM，LAVYQQILTSMPS，AVYQQILTSMPSR，QQILTSMPSRNVI，
QILTSMPSRNVIQ，TSMPSRNVIQISN，SRNVIQISNDLEN，RNVIQISNDLENL，
NVIQISNDLENLR，IQISNDLENLRDL，NDLENLRDLLHVL，LENLRDLLHVLAF，
ENLRDLLHVLAFS，RDLLHVLAFSKSC，DLLHVLAFSKSCH，LHVLAFSKSCHLP，
HVLAFSKSCHLPW，LAFSKSCHLPWAS，CHLPWASGLETLD，SGLETLDSLGGVL，
DSLGGVLEASGYS，SLGGVLEASGYST，GGVLEASGYSTEV，SGYSTEVVALSRL，
TEVVALSRLQGSL，EVVALSRLQGSLQ，VALSRLQGSLQDM，SRLQGSLQDMLWQ，
QGSLQDMLWQLDL，GSLQDMLWQLDLS，QDMLWQLDLSPGC
导致人leptin中潜在的T细胞表位消除的替换(WT＝野生型)
 
残基  WT替换#     残基
3   I A C D E G H K N P Q R S T6   V A C D E G H K N P Q R S T13  L A C D E G H K N P Q R S T14  I A C D E G H K N P Q R S T17  I A C D E G H K N P Q R S T18  V A C D E G H K N P Q R S T21  I A C D E G H K N P Q R S T24  I A C D E G H K N P Q R S T30  V A C D E G H K N P Q R S T36  V A C D E G H K N P Q R S T39  L A C D E G H K N P Q R S T41  F A C D E G H K N P Q R S T42  I A C D E G H K N P Q R S T45  L A C D E G H K N P Q R S T48  I A C D E G H K N P Q R S T49  L A C D E G H K N P Q R S TS1  L A C D E G H K N P Q R S T54  M A C D E G H K N P Q R S T58  L A C D E G H K N P Q R S T60  V A C D E G H K N P Q R S T61  Y A C D E G H K N P Q R S T64  I A C D E G H K N P Q R S T65  L A C D E G H K N P Q R S T68  M A C D E G H K N P Q R S T73  V A C D E G H K N P Q R S T74  I A C D E G H K N P Q R S T76  I A C D E G H K N P Q R S T80  L A C D E G H K N P Q R S T83  L A C D E G H K N P Q R S T86  L A C D E G H K N P Q R S T87  L A C D E G H K N P Q R S T89  V A C D E G H K N P Q R S T90  L A C D E G H K N P Q R S T92  F A C D E G H K N P Q R S T98  L A C D E G H K N P Q R S T100 W A C D E G H K N P Q R S T104 L A C D E G H K N P Q R S T107 L A C D E G H K N P Q R S T110 L A C D E G H K N P Q R S T113 V A C D E G H K N P Q R S T114 L A C D E G H K N P Q R S T119 Y A C D E G H K N P Q R S T123 V A C D E G H K N P Q R S T124 V A C D E G H K M P Q R S T126 L A C D E G H K N P Q R S T129 L A C D E G H K N P Q R S T133 L A C D E G H K N P Q R S T136 M A C D E G H K N P Q R S T
任一上面引用的肽序列都可用于通过替换一个或多个氨基酸进行改变来获得具有降低的或没有免疫原性的序列。
实施例3：Fc-IL-1Ra的去免疫形式
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-IRa)的改变形式。IL-1为一种重要的炎性和免疫调节细胞因子，其对多种组织具有多效性，但可促成与类风湿性关节炎相关的病理现象和与局部组织损伤相关的其它疾病。已纯化了可抑制IL-1作用的IL-1受体拮抗剂并克隆了该基因[Eisenburg S.P.等人(1990)自然(Nature)，343：341-346；Carter，D.B.等人(1990)自然(Nature)，344：633-637]。其它人已提供了IL-1Ra分子[例如US 5,075,222]。该蛋白质的重组形式在IL-1产生有害作用的疾病情况中具有治疗潜力。但是，仍继续需要具有增强特性的IL-IRa类似物。所需的增强包括所述治疗剂表达和纯化的备选方案和形式，以及特别是对蛋白质生物特性的改良。尤其需要的是增强当施用于人受试者时的体内特征。鉴于此，极为希望提供在人受试者体内具有降低的或没有诱导免疫反应的能力的IL-IRa。此类蛋白质预期将显示出在人受试者体内有增加的循环时间，并且可尤其有利于慢性或复发性疾病，如许多IL-Ira的适应症。本发明提供了预期可显示增强的体内特性的IL-1Ra蛋白质的改变形式。本公开尤其涉及有152个氨基酸残基的人IL-1Ra蛋白质(Eisenburg，S.P.等人(1991)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)88：5232-5236)。
具体的Fc-IL-1Ra形式有Fcγl-IL-lRa、Fcγ2-IL-lRa，这两种形式优选地具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。在人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下。
RKSSKMQAFRIWD，SKMQAFRIWDVNQ，QAFRIWDVNQKTF，FRIWDVNQKTFYL，
RIWDVNQKTFYLR，IWDVNQKTFYLRN，WDVNQKTFYLRNN，KTFYLRNNQLVAG，
TFYLRNNQLVAGY，FYLRNNQLVAGYL，LRNNQLVAGYLQG，RNNQLVAGYLQGP，
NQLVAGYLQGPNV，QLVAGYLQGPNVN，LVAGYLQGPNVNL，AGYLQGPNVNLEE，
GYLQGPNVNLEEK，PNVNLEEKIDVVP，VNLEEKIDVVPIE，EKIDVVPIEPHAL，
IDVVPIEPHALFL，DVVPIEPHALFLG，VPIEPHALFLGIH，HALFLGIHGGKMC，
ALFLGIHGGKMCL，LFLGIHGGKMCLS，LGIHGGKMCLSCV，GKMCLSCVKSGDE，
MCLSCVKSGDETR，SCVKSGDETRLQL，ETRLQLEAVNITD，TRLQLEAVNITDL，
LQLEAVNITDLSE，EAVNITDLSENRK，VNITDLSENRKQD，TDLSENRKQDKRF，
ENRKQDKRFAFIR，KRFAFIRSDSGPT，FAFIRSDSGPTTS，AFIRSDSGPTTSF，
TSFESAACPGWFL，SFESAACPGWFLC，PGWFLCTAMEADQ，WFLCTAMEADQPV，
TAMEADQPVSLTN，QPVSLTNMPDEGV，VSLTNMPDEGVMV，TNMPDEGVMVTKF，
PDEGVMVTKFYFQ，EGVMVTKFYFQED，GVMVTKFYFQEDE
导致人白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)中潜在的T细胞表位消除的替换(WT＝野生型)
 
残基 WT替换#    残基     
10   M A C D E G H K N P Q R S T13   F A C D E G H K N P Q R S T15   I A C D E G H K N P Q R S T16   W A C D E G H K N P Q R S T18   V A C D E G H K N P Q R S T23   F A C D E G H K N P Q R S T24   Y A C D E G H K N P Q R S T25   L A C D E G H K N P Q R S T30   L A C D E G H K N P Q R S T31   V A C D E G H K N P Q R S T34   Y A C D E G H K N P Q R S T35   L A C D E G H K N P Q R S T40   V A C D E G H K N P Q R S T42   L A C D E G H K N P Q R S T46   I A C D E G H K N P Q R S T48   V A C D E G H K N P Q R S T49   V A C D E G H K N P Q R S TS1   I A C D E G H K N P Q R S T56   L A C D E G H K N P Q R S T57   F A C D E G H K N P Q R S T58   L A C D E G H K N P Q R S T60   I A C D E G H K N P Q R S T65   M A C D E G H K N P Q R S T67   L A C D E G H K N P Q R S T70   V A C D E G H K N P Q R S T78   L A C D E G H K N P Q R S T80   L A C D E G H K N P Q R S T83   V A C D E G H K N P Q R S T85   I A C D E G H K N P Q R S T88   L A C D E G H K N P Q R S T98   F A C D E G H K N P Q R S T100  F A C D E G H K N P Q R S T101  I A C D E G H K N P Q R S T119  W A C D E G H K N P Q R S T120  F A C D E G H K N P Q R S T121  L A C D E G H K N P Q R S T125  M A C D E G H K N P Q R S T131  V A C D E G H K N P Q R S T133  L A C D E G H K N P Q R S T136  M A C D E G H K N P Q R S T141  V A C D E G H K N P Q R S T142  M A C D E G H K N P Q R S T
实施例4：Fc-BDNF的去免疫形式
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人脑源性神经营养因子(BDNF)的改变形式。BDNF为糖蛋白，属于神经生长因子蛋白质家族。成熟的含119个氨基酸的糖蛋白从较大的前体加工而来，产生促进神经细胞群存活的神经营养因子[Jones K.R.和Reichardt，L.F.(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：8060-8064]。其它人已提供了修饰的BDNF分子[US，5,770,577]并提供了用于重组BDNF分子商业生产的方法[US，5,986,070]。此类神经细胞均位于中枢神经系统中或直接与其相连。BDNF的重组制品使得该蛋白质的治疗性潜能可被开发用于促进神经再生和退行性疾病的治疗。
具体的Fc-BDNF形式有：Fcγl-BDNF、Fcγ2-BDNF，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。在人脑源性神经营养因子(BDNF)中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下。
GELSVCDSISEWV，LSVCDSISEWVTA，DSISEWVTAADKK，SEWVTAADKKTAV，
EWVTAADKKTAVD，WVTAADKKTAVDM，KTAVDMSGGTVTV，TAVDMSGGTVTVL，
VDMSGGTVTVLEK，GTVTVLEKVPVSK，VTVLEKVPVSKGQ，TVLEKVPVSKGQL，
EKVPVSKGQLKQY，VPVSKGQLKQYFY，GQLKQYFYETKCN，KQYFYETKCNPMG，
QYFYETKCNPMGY，YFYETKCNPMGYT，NPMGYTKEGCRGI，MGYTKEGCRGIDK，
RGIDKRHWNSQCR，RHWNSQCRTTQSY，HWNSQCRTTQSYV，QSYVRALTMDSKK，
SYVRALTMDSKKR，RALTMDSKKRIGW，LTMDSKKRIGWRF，KRIGWRFIRIDTS，
IGWRFIRIDTSCV，GWRFIRIDTSCVC，WRFIRIDTSCVCT，RFIRIDTSCVCTL，
    IRIDTSCVCTLTI，IDTSCVCTLTIKR
导致人脑源性神经营养因子(BDNF)中潜在的T细胞表位消除的替换(WT＝野生型)
 
残基 WT替换#    残基 
10   L A C D E G H K N P Q R S T16   I A C D E G H K N P Q R S T20   V A C D E G H K N P Q R S T29   V A C D E G H K N P Q R S T31   M A C D E G H K N P Q R S T36   V A C D E G H K N P Q R S T38   V A C D E G H K N P Q R S T39   L A C D E G H K N P Q R S T42   V A C D E G H K N P Q R S T44   V A C D E G H K N P Q R S T49   L A C D E G H K N P Q R S T
 
残基 WT替换#    残基 
52   Y A C D E G H K N P Q R S T53   F A C D E G H K N P Q R S TS4   Y A C D E G H K N P Q R S T61   M A C D E G H K N P Q R S T63   Y A C D E G H K N P Q R S T71   I A C D E G H K N P Q R S T76   W A C D E G H K N P Q R S T86   Y A C D E G H K N P Q R S T87   V A C D E G H K N P Q R S T90   L A C D E G H K N P Q R S T92   M A C D E G H K N P Q R S T98   I A C D E G H K N P Q R S T100  W A C D E G H K N P Q R S T102  F A C D E G H K N P Q R S T103  I A C D E G H K N P Q R S T105  I A C D E G H K N P Q R S T
实施例5：Fc-EPO的去免疫形式
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人促红细胞生成素(EPO)的改变形式。EPO为含有165个氨基酸残基的糖蛋白激素，其参与类红细胞祖先细胞成熟为红细胞。天然EPO在胎儿期由肝脏产生，在成人中由肾脏产生，并在血液中循环以刺激骨髓中红细胞的产生。肾功能衰竭一个几乎必然的后果是贫血，这是因从肾脏产生的EPO减少所致。重组EPO被用作慢性肾功能衰竭所致贫血的有效治疗剂。
具有人促红细胞生成素的1-165位氨基酸序列的重组EPO(在哺乳动物细胞中表达)[Jacobs，K.等人(1985)自然(Nature)，313：806-810；Lin，F.-K.等人(1985)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)82：7580-7585]含有三个N-连接的和一个O-连接的寡糖链，每一个均含有末端唾液酸残基。后者对于避免EPO被肝脱唾液酸糖蛋白结合蛋白从循环中快速清除是重要的。
非去免疫的Fc-EPO可从例如WO 99/58662，WO 99/02709中已知。具体的Fc-EPO形式有：Fcγ1-EPO、Fcγ2-EPO，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。EPO可为糖基化的、部分糖基化的或具有改变的糖基化模式。在人促红细胞生成素(EPO)中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下。
PRLICDSRVLERY，RLICDSRVLERYL，ICDSRVLERYLLE，CDSRVLERYLLEA，
SRVLERYLLEAKE，RVLERYLLEAKEA，LERYLLEAKEAEN，ERYLLEAKEAENI，
RYLLEAKEAENIT，YLLEAKEAENITT，LEAKEAENITTGC，KEAENITTGCAEH，
ENITTGCAEHCSL，CSLNENITVPDTK，NENITVPDTKVNF，ENITVPDTKVNFY，
NITVPDTKVNFYA，ITVPDTKVNFYAW，TKVNFYAWKRMEV，VNFYAWKRMEVGQ，
NFYAWKRMEVGQQ，YAWKRMEVGQQAV，KRMEVGQQAVEVW，RMEVGQQAVEVWQ，
MEVGQQAVEVWQG，QAVEVWQGLALLS，AVEVWQGLALLSE，VEVWQGLALLSEA，
EVWQGLALLSEAV，VWQGLALLSEAVL，WQGLALLSEAVLR，QGLALLSEAVLRG，
LALLSEAVLRGQA，ALLSEAVLRGQAL，LSEAVLRGQALLV，SEAVLRGQALLVN，
EAVLRGQALLVNS，AVLRGQALLVNSS，QALLVNSSQPWEP，ALLVNSSQPWEPL，
LLVNSSQPWEPLQ，QPWEPLQLHVDKA，EPLQLHVDKAVSG，LQLHVDKAVSGLR，
LHVDKAVSGLRSL，KAVSGLRSLTTLL，SGLRSLTTLLRAL，RSLTTLLRALGAQ，
SLTTLLRALGAQK，TTLLRALGAQKEA，TLLRALGAQKEAI，RALGAQKEAISPP，
AQKEAISPPDAAS，EAISPPDAASAAP，SPPDAASAAPLRT，ASAAPLRTITADT，
APLRTITADTFRK，RTITADTFRKLFR，TITADTFRKLFRV，DTFRKLFRVYSNF，
RKLFRVYSNFLRG，KLFRVYSNFLRGK，FRVYSNFLRGKLK，RVYSNFLRGKLKL，
YSNFLRGKLKLYT，SNFLRGKLKLYTG，NFLRGKLKLYTGE，RGKLKLYTGEACR，
GKLKLYIGEACRT，LKLYTGEACRTGD，KLYTGEACRTGDR
导致人促红细胞生成素(EPO)中潜在的T细胞表位消除的替换(WT＝野生型)
 
残基 WT替换#    残基
5    L A C D E G H K N P Q R S T6    I A C D E G H K N P Q R S T11   V A C D E G H K N P Q R S T12   L A C D E G H K N P Q R S T15   Y A C D E G H K N P Q R S T16   L A C D E G H K N P Q R S T17   L A C D E G H K N P Q R S T25   I A C D E G H K N P Q R S T35   L A C D E G H K N P Q R S T39   I A C D E G H K N P Q R S T41   V A C D E G H K N P Q R S T46   V A C D E G H K N P Q R S T48   F A C D E G K K N P Q R S T49   Y A C D E G H K N P Q R S T51   W A C D E G H K N P Q R S T54   M A C D E G H K N P Q R S T56   V A C D E G H K N P Q R S T61   V A C D E G H K N P Q R S T63   V A C D E G H K N P Q R S T64   W A C D E G H K N P Q R S T67   L A C D E G H K N P Q R S T69   L A C D E G H K N P Q R S T70   L A C D E G H K N P Q R S T74   V A C D E G H K N P Q R S T
 
残基 WT替换#    残基
75   L A C D E G H K N P Q R S T80   L A C D E G H K N P Q R S T81   L A C D E G H K N P Q R S T82   N A C D E G H K N P Q R S T88   W A C D E G H K N P Q R S T91   L A C D E G H K N P Q R S T93   L A C D E G H K N P Q R S T95   V A C D E G H K N P Q R S T99   V A C D E G H K N P Q R S T102  L A C D E G H K N P Q R S T105  L A C D E G H K N P Q R S T108  L A C D E G H K N P Q R S T109  L A C D E G H K N P Q R S T112  L A C D E G H K N P Q R S T119  I A C D E G H K N P Q R S T130  L A C D E G H K N P Q R S T133  I A C D E G H K N P Q R S T138  F A C D E G H K N P Q R S T141  L A C D E G H K N P Q R S T142  F A C D E G H K N P Q R S T144  V A C D E G H K N P Q R S T145  Y A C D E G H K N P Q R S T148  F A C D E G H K N P Q R S T149  L A C D E G H K N P Q R S T153  L A C D E G H K N P Q R S T15S  L A C D E G H K N P Q R S T156  Y A C D E G H K N P Q R S T
实施例6：G-CSF的去免疫形式
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的改变形式。G-CSF为一种目前用于治疗如下适应征的重要造血细胞因子，其中对于所述适应征，血液中嗜中性粒细胞的增加将提供益处。它们包括癌症治疗、多种感染性疾病和相关病症如脓毒症。G-CSF也可单独使用或与其它化合物和细胞因子联用，用于骨髓移植中使用的造血细胞的离体扩增。
对于该细胞因子，通常认为有两种形式的人G-CSF。一种为具177个氨基酸的蛋白质，另一种为具174个氨基酸的蛋白质[Nagata等人，(1986)，EMBO J.5：575-581]，发现具174个氨基酸的形式具有最大的特异性体内生物学活性。重组DNA技术使得可以利用真核和原核宿主细胞表达体系使G-CSF以商业规模的量产生。本公开尤其涉及具177个氨基酸和174个氨基酸的这两种被认知的人G-CSF蛋白质形式。
以前已公开了G-CSF的其它多肽类似物和肽片段，包括通过定点氨基酸替换和/或通过化学加合物修饰的改变形式。这样US4,810,643公开了特定的Cys残基用另一氨基酸替换的类似物，及在第一(N-末端)位置处具有Ala残基的G-CSF。EP 0 335 423公开了在具有G-CSF活性的多肽中对至少一个氨基的修饰。EP 0 272 703公开了在靠近N-末端处具有氨基酸替换或缺失的G-CSF衍生物。EP 0 459 630公开了Cys17和Asp27被Ser残基替换的G-CSF衍生物。EP 0 243 153公开了这样的GCSF，其通过失活至少一个酵母KEX2蛋白酶加工位点而进行修饰，用于在重组产生中增加产量，且US4,904,584公开了改变赖氨酸的蛋白质。WO 90/12874公开了进一步改变Cys的变体，且澳大利亚专利文献AU 10948/92公开了添加氨基酸至G-CSF分子的任一末端，用于在原核表达后帮助该分子折叠。另一澳大利亚文献AU 76380/91公开了在174个氨基酸形式的G-CSF的50-56位置处的G-CSF变体，以及在177个氨基酸形式的G-CSF的53-59位置处的G-CSF变体。也公开了在特定His残基处的其它变化。
非去免疫的Fc-G-CSF可以例如从WO 99/58662中已知。具体的Fc-G-CSF形式有：Fcγ1-G-CSF、Fcγ2-G-CSF，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。在人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下。
TPLGPASSLPQSF，SSLPQSFLLKCLE，QSFLLKCLEQVRK，SFLLKCLEQVRKI，
FLLKCLEQVRKIQ，KCLEQVRKIQGDG，EQVRKIQGDGAAL，RKIQGDGAALQEK，
AALQEKLVSECAT，EKLVSECATYKLC，KLVSECATYKLCH，AALQEKLCATYKL，
EKLCATYKLCHPE，ATYKLCHPEELVL，YKLCHPEELVLLG，EELVLLGHSLGIP，
ELVLLGHSLGIPW，HSLGIPWAPLSSC，IPWAPLSSCPSQA，APLSSCPSQALQL，
QALQLAGCLSQLH，GCLSQLHSGLFLY，SQLHSGLFLYQGL，SGLFLYQGLLQAL，
GLFLYQGLLQALE，LFLYQGLLQALEG，FLYQGLLQALEGI，QGLLQALEGISPE，
GLLQALEGISPEL，QALEGISPELGPT，EGISPELGPTLDT，PTLDTLQLDVADF，
DTLQLDVADFATT，LQLDVADFATTIW，LDVADFATTIWQQ，TTIWQQMEELGMA，
TIWQQMEELGMAP，QQMEELGMAPALQ，EELGMAPALQPTQ，LGMAPALQPTQGA，
PALQPTQGAMPAF，GAMPAFASAFQRR，PAFASAFQRRAGG，SAFQRRAGGVLVA，
GGVLVASHLQSFL，GVLVASHLQSFLE，VLVASHLQSFLEV，SHLQSFLEVSYRV，
QSFLEVSYRVLRH，SFLEVSYRVLRHL，LEVSYRVLRHLAQ
导致人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)中潜在的T细胞表位消除的替换(WT＝野生型)
 
残基 WT替换#    残基
3    L A C D E G H K N P O R S T9    L A C D E G H K N P Q R S T14   L A C D E G H K N P Q R S T15   L A C D E G H K N P Q R S T18   L A C D E G H K N P Q R S T21   V A C D E G H K N P Q R S T24   I A C D E G H K N P Q R S T31   L A C D E G H K N P Q R S T35   L A C D E G H K N P Q R S T39   Y A C D E G H K N P Q R S T41   L A C D E G H K N P Q R S T47   L A C D E G H K N P Q R S T48   V A C D E G H K N P Q R S T49   L A C D E G H K N P Q R S T50   L A C D E G H K N P Q R S T54   L A C D E G H K N P Q R S T56   I A C D E G H K N P Q R S T58   W A C D E G H K N P Q R S T61   L A C D E G H K N P Q R S T69   L A C D E G H K N P Q R S T71   L A C D E G H K N P Q R S T75   L A C D E G H K N P Q R S T78   L A C D E G H K N P Q R S T82   L A C D E G H K N P Q R S T83   F A C D E G H K N P Q R S T84   L A C D E G H K N P Q R S T85   Y A C D E G H K N P Q R S T88   L A C D E G H K N P Q R S T89   L A C D E G H K N P Q R S T92   L A C D E G H K N P Q R S T95   I A C D E G H K N P Q R S T99   L A C D E G H K N P Q R S T103  L A C D E G H K N P Q R S T106  L A C D E G H K N P Q R S T108  L A C D E G H K N P Q R S T110  V A C D E G H K N P Q R S T113  F A C D E G H K N P Q R S T117  I A C D E G H K N P Q R S T118  W A C D E G H K N P Q R S T121  M A C D E G H K N P Q R S T124  L A C D E G H K N P Q R S T130  L A C D E G H K N P Q R S T137  M A C D E G H K N P Q R S T140  F A C D E G H K N P Q R S T144  F A C D E G H K N P Q R S T151  V A C D E G H K N P Q R S T152  L A C D E G H K N P Q R S T153  V A C D E G H K N P Q R S T157  L A C D E G H K N P Q R S T160  F A C D E G H K N P Q R S T161  L A C D E G H K N P Q R S T163  V A C D E G H K N P Q R S T
实施例7：KGF的去免疫形式
本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人角质细胞生长因子(KGF)的改变形式。KGF为成纤维细胞生长因子(FGF)/肝素-结合生长因子蛋白质家族中的一员。它为一种主要在肺中表达的分泌糖蛋白，通过刺激角质细胞和其它上皮细胞的生长而促进伤口愈合[Finch等人(1989)，科学(Science)24：752-755；Rubin等人(1989)，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86：802-806]。该糖蛋白的成熟(已加工的)形式包含163个氨基酸残基，并且可以在培养特定细胞系后自条件培养基中分离[Rubin等人(1989)，见上]，或者可使用重组技术产生[Ron等人(1993)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)268：2984-2988]。该蛋白质具有治疗价值，可以用于在一些重要的疾病和损伤修复情况中刺激上皮细胞生长。本公开特别地涉及成熟(已加工的)形式的含163个氨基酸残基的人KGF蛋白质。其它人也已提供了KGF分子[例如US，6,008,328；W090/08771；]，包括改变的KGF[Ron等人(1993)见上；W09501434]。具体的Fc-KGF形式：Fcγ1-KGF、Fcγ2-KGF，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。在人角质细胞生长因子(KGF)中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下。
NDMTPEQMATNVN，DMTPEQMATNVNC，EQMATNVNCSSPE，TNVNCSSPERHTR，
RSYDYMEGGDIRV，YDYMEGGDIRVRR，DYMEGGDIRVRRL，GDIRVRRLFCRTQ，
IRVRRLFCRTQWY，RRLFCRTQWYLRI，RLFCRTQWYLRID，TQWYLRIDKRGKV，
QWYLRIDKRGKVK，WYLRIDKRGKVKG，LRIDKRGKVKGTQ，GKVKGTQEMKMNY，
QEMKNNYNIMEIR，NNYNIMEIRTVAV，YNIMEIRTVAVGI，NIMEIRTVAVGIV，
MEIRTVAVGIVAI，RTVAVGIVAIKGV，VAVGIVAIKGVES，VGIVAIKGVESEF，
VAIKGVESEFYLA，KGVESEFYLAMNK，SEFYLAMNKEGKL，EFYLAMNKEGKLY，
FYLAMNKEGKLYA，LAMNKEGKLYAKK，GKLYAKKECNEDC，KLYAKKECNEDCN，
CNFKELILENHYN，KELILENHYNTYA，ELILENHYNTYAS，LILENHYNTYASA，
NHYNTYASAKWTH，NTYASAKWTHNGG，AKWTHNGGEMFVA，GEMFVALNQKGIP，
EMFVALNQKGIPV，FVALNQKGIPVRG，VALNQKGIPVRGK，KGIPVRGKKTKKE，
IPVRGKKTKKEQK，KTKKEQKTAHFLP
导致人角质细胞生长因子(KGF)中潜在的T细胞表位消除的替换(WT＝野生型)
实施例8：在相应的Fc融合蛋白中去免疫的sTNF-R(I)和sTNF抑制剂
Fc-sTNF-R(I)和Fc-sTNF抑制剂为融合蛋白，其血清半衰期与sTNF-R(I)和sTNF抑制剂自身相比延长。但是，某些形式的Fc-TNF-RI，诸如当Fc来自人IgG1或人IgG3时，在某些情况下如通过皮下注射施用时有可能显示增强的免疫原性。本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNF-RI)的改变形式。sTNF-RI(可溶性肿瘤坏死因子I型受体)为以前描述的人肿瘤坏死因子受体的衍生物[Gray，P.W.等人(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：7380-7384；Loetschere，H.等人(1990)细胞(Cell)61：351-359；Schall，T.J.等人(1990)细胞(Cell)61：361-370]，其包含完整受体的胞外结构域，并显示约30KDa的分子量。也已知其他可溶性TNF抑制剂，尤其是40KDa形式[US 6,143,866]。这些可溶形式在体外可以以高亲和性结合肿瘤坏死因子α，并抑制该细胞因子的细胞毒活性。sTNF-RI的重组制品具有重要的治疗价值，可以用于治疗其中过高的肿瘤坏死因子水平引起致病效应的疾病。此类sTNF-RI治疗性制品可靶向以下适应征，如恶病质、脓毒症和自身免疫性疾病，其中所述自身免疫性疾病包括，且尤其包括类风湿性关节炎等。包括BreWer等人，US，6,143,866在内的其它人已提供了改变的sTNF-RI分子。在人30KDa sTNF-RI中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下：
DSVCPQGKYIHPQ，KYIHPQNNSICCT，NSICCTKCHKGTY，TYLYNDCPGPGQD，
YLYNDCPGPGQDT，NHLRHCLSCSKCR，HCLSCSKCRKEMG，KEMGQVEISSCTV，
GQVEISSCTVDRD，VEISSCTVDRDTV，CTVDRDTVCGCRK，DTVCGCRKNQYRH，
NQYRHYWSENLFQ，RHYWSENLFQCFN，HYWSENLFQCFNC，ENLFQCFNCSLCL，
NLFQCFNCSLCLN，QCFNCSLCLNGTV，CSLCLNGTVHLSC，LCLNGTVHLSCQE，
GTVHLSCQEKQNT，VHLSCQEKQNTVC，EKQNTVCTCHAGF，NTVCTCHAGFFLR，
GFFLREMECVSCS，FFLRENECVSCSN，ECVSCSNCKKSLE，KSLECTKLCLPQI，
TKLCLPQIENVKG，LCLPQIENVKGTE，PQIENVKGTEDSG，SGTTVLLPLVIFF
在人40KDa sTNF抑制剂中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下：
TPYAPEPGSTCRL，CRLREYYDQTAQM，REYYDQTAQMCCS，EYYDQTAQMCCSK，
AQKCCSKCSPGQH，KCSPGQHAKVFCT，AKVFCTKTSDTVC，KTFCTKTSDTVCD，
STYTQLWNWVPEC，TQLWNWVPECLSC，QLWNWVPECLSCG，NWVPECLSCGSRC，
ECLSCGSRCSSDQ，SRCSSDQEVTQAC，QEVTQACTREQNR，QMRICTCRPGWYC，
NRICTCRPGWYCA，PGWYCALSKQEGC，GWYCALSKQEGCR，CALSKQEGCRLCA，
APLRKCRPGFGVA，PGFGVARPGTETS，FGVARPGTETSDV，SDVVCKPCAPGTF，
GTFSNTTSSTDIC，TDICRPHQICNVV，KQICNVVAIPGNA，ICNVVAIPGNASR，
CNVVAIPGNASRD，NVVAIPGNASRDA，VAIPGNASRDAVC，DAVCTSTTTPTRS，
TKSMAPGAVHLPQ，RSMAPGAVHLPQP，VHLPQPVSTRSQH，QPVSTKSQHTQPT，
PEPSTAPSTSFLL，SFLLPMGPSPPAE，FLLPMGPSPPAEG
实施例9(可溶性TNF-R2)：
Fc-sTNF-R2为融合蛋白，其血清半衰期与sTNF-R2自身相比延长。但是，某些形式的Fc-TNF-R2，诸如当Fc来自人IgG1或人IgG3时，在某些情况下如通过皮下注射施用时有可能显示增强的免疫原性。可溶性肿瘤坏死因子受体2(sTNF-R2)为以前描述的人肿瘤坏死因子受体2的衍生物[Smith，C.A.等人(1990)科学(Science)248：1019-1023；Kohno，T.等人(1990)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87：8331-8335；Beltinger，C.P.等人(1996)基因组学(Genomics)35：94-100]，其包含完整受体的胞外结构域。此可溶形式在体外可以以高亲和性结合肿瘤坏死因子，并抑制该细胞因子的细胞毒活性。sTNF-R2的重组制品具有重要的治疗价值，其可以用于治疗其中过高的肿瘤坏死因子水平引起致病效应的疾病。一种称为ethanercept的特定重组制品已获得临床批准用于治疗类风湿性关节炎，该药剂和其他类似药剂在治疗其它适应征如恶病质、脓毒症和自身免疫性疾病中具有价值。Ethanercept为二聚体融合蛋白，其包含人TNFR2分子的胞外结构域和人IgG1分子的Fc结构域。该二聚体分子包含934个氨基酸[US，5,395,760；US，5,605,690；US，5,945,397]。在人TNFR2蛋白的TNF结合结构域中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下：
TPYAPEPGSTCRL，CRLREYYDQTAQM，REYYDQTAQMCCS，EYYDQTAQMCCSK，
AQMCCSKCSPGQH，KCSPGQHAKVFCT，AKVFCTKTSDTVC，KVFCTKTSDTVCD，
STYTQLWNWVPEC，TQLWNWVPECLSC，QLWNWVPECLSCG，NWVPECLSCGSRC，
ECLSCGSRCSSDQ，SRCSSDQEVTQAC，QEVTQACTREQNR，QNRICTCRPGWYC，
NRICTCRPGWYCA，PGWYCALSKQEGC，GWYCALSKQEGCR，CALSKQEGCRLCA，
APLRKCRPGFGVA，PGFGVARPGTETS，FGVARPGTETSDV，SDVVCKPCAPGTF，
GTFSNTTSSTDIC，TDICRPHQICNVV，HQICNVVAIPGNA，ICNVVAIPGNASR，
CNVVAIPGNASRD，NVVAIPGNASRDA，VAIPGNASRDAVC，DAVCTSTTTPTRS，
TRSMAPGAVHLPQ，RSMAPGAVHLPQP，VHLPQPVSTRSQH，QPVSTRSQHTQPT，
PEPSTAPSTSFLL，SFLLPMGPSPPAE，FLLPMGPSPPAEG
实施例10：β-葡糖脑苷脂酶(β-GCR)的非天然形式
Fc-β-GCR为融合蛋白，其血清半衰期与β-GCR自身相比延长。但是，某些形式的Fc-β-GCR，诸如当Fc来自人IgG1或人IgG3时，在某些情况下如通过皮下注射施用时有可能显示增强的免疫原性。本发明提供了去除一个或多个T细胞表位的人GCR，优选地Fc-β-GCR的改变形式。
β-葡糖脑苷脂酶(β-D-葡糖基-N-酰基鞘氨醇葡糖水解酶，E.C.3.2.1.45)为含497个氨基酸残基的单体糖蛋白。该酶催化糖脂葡糖脑苷脂水解为葡萄糖和神经酰胺。GCR活性不足导致称为戈谢氏病(Gaucherdisease)的溶酶体贮积疾病。该疾病的特征在于葡糖脑苷脂聚积，其充盈了在肝脏、脾、骨髓和其它器官中聚集的组织巨噬细胞。该疾病具有不同程度的严重性，从具血液病方面问题但不连累神经的1型疾病至出生后早期显现的广泛连累神经的2型疾病，其中所述2型疾病一般是进行性的且在2岁以内致死。在一些分类中也认可3型疾病，该3型疾病也显示出连累神经。以前用于Gaucher病治疗的唯一有用的疗法为施用来自人胎盘的GCR(称作阿糖苷酶)，但最近重组GCR的药物制品(＂Ceredase＂和＂Cerezyme＂)在1型疾病的治疗中已显示出有效[Niederau，C.等人(1998)Eur.J.Med.Res.3：25-30]。
根据本发明，对预计具有显著免疫原性的葡糖脑苷脂酶的特定商品形式进行了检查，具高免疫原性是因为这些形式经改造后具有高甘露糖寡糖。施用此类蛋白质如Ceredase或Cerezyme后，该非天然蛋白质优先与抗原呈递细胞如巨噬细胞或树突状细胞上的甘露糖受体结合。然后该非天然蛋白质被摄入，一部分降解为肽，之后这些肽通过MHC II类呈递给T细胞受体。通过突变葡糖脑苷脂酶序列使所得的肽不能结合MHC II类，从而降低免疫原性。
其他人已提供了GCR分子，包括修饰的GCR[US，5,236,838]，但该教导没有认识到T细胞表位对蛋白质免疫原特性的重要性。
在人β-GCR中具有潜在的人MHC II类结合活性的肽序列如下：
PCIPKSFGYSSVV，KSFGYSSVVCVCN，FGYSSVVCVCNAT，SSVVCVCNATYCD，SVVCVCNATYCDS，
VCVCNATYCDSFD，ATYCDSFDPPTFP，DSFDPPTFPALGT，PTFPALGTFSRYE，PALGTFSRYESTR，
GTFSRYESTRSGR，SRYESTRSGRRME，GRRMELSMGPIQA，RRMELSMGPIQAN，RMELSMGPIQANH，
MELSMGPIQANHT，LSMGPIQANHTGT，MGPIQANHTGTGL，GPIQANHTGTGLL，TGLLLTLQPEQKF，
GLLLTLQPEQKFQ，LLLTLQPEQKFQK，LTLQPEQKFQKVK，TLQPEQKFQKVKG，PEQKFQKVKGFGG，
QKFQKVKGFGGAM，QKVKGFGGAMTDA，KGFGGAMTDAAAL，GFGGAMTDAAALN，GAMTDAAALNILA，
AMTDAAALNILAL，MTDAAALNILALS，AALNILALSPPAQ，ALNILALSPPAQN，LNILALSPPAQNL，
NILALSPPAQNLL，LALSPPAQNLLLK，ALSPPAQNLLLKS，PAQNLLLKSYFSE，AQNLLLKSYFSEE，
QNLLLKSYFSEEG，NLLLKSYFSEEGI，LLLKSYFSEEGIG，KSYFSEEGIGYNI，SYFSEEGIGYNII，
FSEEGIGYNIIRV，EGIGYNIIRVPMA，GIGYNIIRVPMAS，IGYNIIRVPMASC，YNIIRVPMASCDF，
NIIRVPMASCDFS，IIRVPMASCDFSI，IRVPMASCDFSIR，VPMASCDFSIRTY，PMASCDFSIRTYT，
SCDFSIRTYTYAD，CDFSIRTYTYADT，FSIRTYTYADTPD，RTYTYADTPDDFQ，TYTYADTPDDFQL，
YTYADTPDDFQLH，ADTPDDFQLHNFS，PDDFQLHNFSLPE，DDFQLHNFSLPEE，FQLHNFSLPEEDT，
HNFSLPEEDTKLK，FSLPEEDTKLKIP，SLPEEDTKLKIPL，EEDTKLKIPLIHR，TKLKIPLIHRALQ，
KLKIPLIHRALQL，LKIPLIHRALQLA，IPLIHRALQLAQR，PLIHRALQLAQRP，HRALQLAQRPVSL，
RALQLAQRPVSLL，ALQLAQRPVSLLA，LQLAQRPVSLLAS，RPVSLLASPWTSP，PVSLLASPWTSPT，
VSLLASPWTSPTW，SLLASPWTSPTWL，SPWTSPTWLKTNG，TSPTWLKTNGAVN，PTWLKTNGAVNGK，
TWLKTNGAVNGKG，GAVNGKGSLKGQP，GSLKKGQPGDIYHQ，GDIYHQTWARYFV，DIYHQTWARYFVK，
QTWARYFVKFLDA，WARYFVKFLDAYA，ARYFVKFLDAYAE，RYFVKFLDAYAEH，YFVKFLDAYAEHK，
FVKFLDAYAEHKL，VKFLDAYAEHKLQ，KFLDAYAEHKLQF，DAYAEHKLQFWAV，YAEHKLQFWAVTA，
HKLQFWAVTAENE，LQFWAVTAENEPS，QFWAVTAENEPSA，FWAVTAENEPSAG，WAVTAENEPSAGL，
VTAENEPSAGLLS，PSAGLLSGYPFQC，AGLLSGYPFQCLG，GLLSGYPFQCLGF，SGYPFQCLGFTPE，
YPFQCLGFTPEHQ，QCLGFTPEHQRDF，LGFTPEHQRDFIA，FTPEHQRDFIARD，RDFIARDLGPTLA，
DFIARDLGPTLAN，RDLGPTLANSTHH，LGPTLANSTHHNV，PTLANSTHHNVRL，HNVRLLMLDDQRL，
VRLLMLDDQRLLL，RLLMLDDQRLLLP，LLHLDDQRLLLPH，LMLDDQRLLLPHW，DDQRLLLPHWAKV，
DQRLLLPHWAKVV，QRLLLPHWAKVVL，RLLLPHWAKVVLT，LLLPHWAKVVLTD，PHWAKVVLTDPEA，
WAKVVLTDPEAAK，AKVVLTDPEAAKY，KVVLTDPEAAKYV，VVLTDPEALAKYVH，EAAKYVHGIAVHW，
AKYVHGIAVHWYL，KYVHGIAVHWYLD，YVHGIAVHWYLDF，HGIAVHWYLDFLA，IAVHWYLDFLAPA，
VHWYLDFLAPAKA，HWYLDFLAPAKAT，WYLDFLAPAKATL，LDFLAPAKATLGE，DFLAPAKATLGET，
AKATLGETHRLFP，ATLGETHRLFPNT，GETHRLFPNTMLF，ETHRLFPNTMLFA，THRLFPNTMLFAS，
HRLFPNTMLFASE，RLFPNTMLFASEA，FPNTMLFASEACV，NTMLFASEACVGS，TMLFASEACVGSK，
MLFASEACVGSKF，ACVGSKFWEQSVR，GSKFWEQSVRLGS，SKFWEQSVRLGSW，KFWEQSVRLGSWD，
QSVRLGSWDRGMQ，VRLGSWDRGMQYS，RLGSWDRGMQYSH，GSWDRGMQYSHSI，WDRGMQYSHSIIT，
RGMQYSHSIITNL，MQYSHSIITNLLY，QYSHSIITNLLYH，YSHSIITNLLYHV，HSIITNLLYHVVG，
SIITNLLYHVVGW，TNLLYHVVGWTDW，NLLYHVVGWTDWN，LLYHVVGWTDWNL，YHVVGWTDWNLAL，
HVVGWTDWNLALN，VVGWTDWNLALNP，VGWTDWNLALNPE，TDWNLALNPEGGP，WNLALNPEGGPNW，
LALNPEGGPNWVR，PNWVRNFVDSPII，NWVRNFVDSPIIV，RNFVDSPIIVDIT，NFVDSPIIVDITK，
SPIIVDITKDTFY，PIIVDITKDTFYK，IIVDITKDTFYKQ，VDITKDTFYKQPM，DTFYKQPMFYHLG，
TFYKQPMFYHLGH，QPMFYHLGHFSKF，PMFYHLGHFSKFI，MFYHLGHFSKFIP，YHLGHFSKFIPEG，
GHFSKFIPEGSQR，SKFIPEGSQRVGL，KFIPEGSQRVGLV，IPEGSQHVGLVAS，QKVGLVASQKNDL，
VGLVASQKNDLDA，GLVASQKNDLDAV，SQKNDLDAVALMH，NDLDAVALMHPDG，DAVALMHPDGSAV，
VALMHPDGSAVVV，ALMHPDGSAVVVV，SAVVVVLNRSSKD，AVVVVLNRSSKDV，VVVVLNRSSKDVP，
VVVLNRSSKDVPL，VVLNRSSKDVPLT，KDVPLTIKDPAVG，VPLTIKDPAVGFL，PLTIKDPAVGFLE，
LTIKDPAVGFLET，PAVGFLETISPGY，VGFLETISPGYSI，GFLETISPGYSIH，FLETISPGYSIHT，
ETISPGYSIHTYL，PGYSIHTYLWHRQ，PGYSIHTYLWRRQ
实施例11：Fc-IL2的去免疫形式
在例如WO 96/08570中描述了非去免疫的Fc-IL2。具体的Fc-IL2去免疫形式有：Fcγ1-IL2、Fcγ2-IL2，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例12：Fc-IL12的去免疫形式
在例如WO 99/29732中描述了非去免疫的Fc-IL12。具体的Fc-IL12去免疫形式有：Fcγ1-IL12、Fcγ2-IL12，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例13：Fc-TNFα的去免疫形式
在例如WO 99/43713中描述了非去免疫的Fc-TNFα。具体的Fc-TNFα去免疫形式有：Fcγ1-TNFα、Fcγ2-TNFα，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例14：Fc-GM-CSF的去免疫形式
在例如WO 99/43713和WO 01/07081中描述了非去免疫的Fc-GM-CSF。具体的Fc-GM-CSF去免疫形式有：Fcγ1-GM-CSF、Fcγ2-GM-CSF，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例15：Fc-枯草杆菌蛋白酶的去免疫形式
具体的Fc-枯草杆菌蛋白酶去免疫形式有：Fcγ1-枯草杆菌蛋白酶、Fcγ2-枯草杆菌蛋白酶，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例16：Fc-胰岛素的去免疫形式
具体的Fc-胰岛素去免疫形式有：Fcγ1-胰岛素、Fcγ2-胰岛素，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例17：Fc-PSMA的去免疫形式
在例如WO 96/08570和WO 01/0708中描述了非去免疫的Fc-PSMA。具体的Fc-PSMA去免疫形式有：Fcγ1-PSMA、Fcγ2-PSMA，这两种形式优选具有接头肽，且任选地具有对Fc-受体的亲和性降低的经改变Fc结构域。
实施例18：包含与细胞因子融合的抗EGFR抗体的去免疫融合蛋白
人源化的和鼠的单克隆抗体425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531472)、鼠的和嵌合的单克隆抗体225(cMAb 225，US 4,943,533和EP 0359282)以及鼠的和人源化的MAb4D5(hMab4D5＝
Figure C02805158D0065173648QIETU
)已经根据本发明去免疫，并融合至去免疫的IL2上或融合至未修饰的IL-2上。
抗体与细胞因子的融合蛋白代表了一种特别需要降低免疫原性的情形。通常，治疗性抗体可诱导能中和治疗性抗体效力的抗独特型抗体。当治疗性抗体以低或中等水平施用时尤其如此，相反地以非常高水平施用时可诱导耐受。例如，治疗性抗体Herceptin和Rituxan通常以几百毫克的高剂量施与。相反，抗体-细胞因子融合蛋白通常以几毫克的较低剂量施与。这样，抗体-细胞因子融合蛋白的剂量就处在倾向于促进抗独特型抗体形成的范围内。连接的细胞因子的存在趋向于扩大已具免疫原性的抗体的免疫原性。
抗体425为非人抗体，其针对抗原EGF-R并与结肠癌细胞反应。该抗体如实施例13中所述已与IL-2融合。IL-2或其它细胞因子的存在增强了抗体，特别是V区的免疫原性。
在接下来的段落中，本发明较详细描述了显示出具有高治疗价值的单克隆抗EGFR抗体425-IL2构建体。但是，本发明不限于该抗体及所述构建体和一些现有形式，本发明可延伸至其它抗EGFR抗体和它们的融合构建体，优选地细胞因子融合免疫球蛋白，尤其是具有非常相似特性的嵌合抗体225(c225-Il-2)。原则上，抗EGFR抗体的非人、嵌合或人源化形式可用于合成所述IL-2融合分子。除非另外指出，在重链和轻链可变区中的所有氨基酸按在Kabat等人，1991(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，US Department of Health and Human Services)中所述编号。潜在的T细胞表位用表位的第一个氨基酸的线性编号来编号，其中所述表位的第一个氨基酸的线性编号通过从重链和轻链的第一个氨基酸开始计数得到。
1.与小鼠亚组构架比较
将鼠425VH(重链)和VK(轻链)的氨基酸序列与Kabat鼠重链和轻链亚组的共有序列比较。425VH可以被归于小鼠重链亚组IIB。与该亚组的共有序列比较显示在425VH中94位的丝氨酸非同寻常。在该位置的最常见残基为精氨酸。425VK可以被归于小鼠κ链亚组Vl。与该亚组的共有序列比较显示在425VK中45-47、60和100位的残基对该亚组而言非同寻常。氨基酸残基编号按Kabat进行。
2.与人构架比较
将鼠425VH(重链可变区)和VK(κ轻链可变区)氨基酸序列与人胚系VH(Tomlinson，I.M等人，(1992)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：776-798)和VK(Cox，J.P.L.等人，(1994)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24：827-836)序列目录中的序列比较，并与人胚系J区序列(在“用于人的预防性和治疗性应用中的抗体分子的蛋白质工程”(ProteinEngineering of Antibody Molecules for Prophylactic and TherapeuticApplications in Man)，Clark，M.编辑，Academic Titles，Nottingham，UK一书中的l3-44页，Routledge，E.G.等人，1991)比较。鼠425的重链和轻链序列可例如取自EP 0531 472。
所选的用于425VH的参照人构架为具有人JH6的VH1GRR。在目录中VH1GRR序列终止于残基88位。因此对于鼠序列94位的不寻常丝氨酸没有相应的残基。该胚系序列已在具有4个氨基酸变化的已重排成熟抗体基因中找到。所选的用于425VK的参照人构架为具有人JK2的L6/vg。该胚系序列已在没有氨基酸变化的已重排成熟抗体重链中找到。
3.＂贴面化＂序列的设计
确定参照人构架序列后，将425VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照构架序列中的相应氨基酸。被认为对抗体结构和结合关键的残基不包括在该过程中，且不进行改变。在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基，以及例如在最后的抗体中靠近CDR的N-末端残基(1-8个，优选地1-5个氨基酸残基)。该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体(veneered antibody)，因为表面残基主要是人的，而隐蔽残基为原来的鼠序列。
4.肽的穿线分析(threading analysis)
使用本发明方法分析鼠425VH和VK序列和贴面化425VH和VK序列。将氨基酸序列分成所有可能的13聚体(mer)。将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型，并且相对于每一等位基因将结合分值赋予每一个肽。针对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值。该分值基于立体重叠、肽和结合沟中的残基间的潜在氢键、静电相互作用以及肽和口袋残基间的有利接触。然后改变每一侧链的构象并再次计算分值。确定了最高的构象分值后，基于与沟结合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值。已知结合人MHC II类的肽得到高的结合分值，几乎没有假阴性。这样，在当前的分析中得到显著结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位。对425VH和425VK的肽穿线分析结果在表1中给出。潜在的T细胞表位通过13mer中第一个残基所在的线性编号提及。
表1：在鼠和贴面化425序列中潜在的T细胞表位
 
序列 潜在的T细胞表位数 13mer中第一个残基的编号及括号中为所结合的等位基因的数   
鼠425VH 8 31(7)，35(17)，43(7)，46(8)，58(10)，62(12)，81(11)，84(16)               
贴面化425VH 7 31(7)，43(7)，46(8)，58(10)，62(11)，81(11)，84(16)                       
鼠425VK 9 1(8)，2(5)，17(5)，27(5)，43(16)，72(18)，75(10)，92(10)，93(17)    
贴面化425VK 4 27(5)，43(16)，92(8)，93(17)
5.潜在T细胞表位的去除
进行替换的氨基酸残基的编号同前述的Kabat。通过13mer中第一个残基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位。
从贴面化425重链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
●在残基41处(Kabat编号41)用脯氨酸替换丙氨酸去除残基31位的潜在表位。
●在残基45处(Kabat编号45)用脯氨酸替换亮氨酸去除残基43位的潜在表位。位置45处的脯氨酸发现存在于人胚系VH序列DP52中。
●在残基48处(Kabat编号48)用丙氨酸替换异亮氨酸去除残基46位的潜在表位。
●在残基68处(Kabat编号67)用缬氨酸替换丙氨酸去除残基58位的潜在表位。
●在残基70处(Kabat编号69)用异亮氨酸替换亮氨酸去除残基62位的潜在表位。
●在残基91处(Kabat编号87)用苏氨酸替换丝氨酸去除残基81位和84位的潜在表位。
从贴面化425轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
●在残基35处(Kabat编号36)用组氨酸替换酪氨酸去除残基27位的潜在表位。
●在残基50处(Kabat编号51)用丙氨酸替换苏氨酸去除残基43位的潜在表位。该残基在CDR2中。在人和鼠抗体中丙氨酸通常出现在该位置。消除该表位的备选替换为在位置45处(Kabat编号46)用丙氨酸替换亮氨酸。保守替换将不能消除该潜在表位。在一些抗体中发现丙氨酸位于该位置。
●在残基94处(Kabat编号95)用脯氨酸替换异亮氨酸去除残基92位的潜在表位。Kabat残基95在CDRL3中。在小鼠抗体序列中该位置处脯氨酸是常见的，并且在该CDR外的变化不能消除此潜在表位。
●在残基103处(Kabat编号104)用缬氨酸替换亮氨酸去除残基93位的潜在表位。
6.去免疫序列的设计
参考去除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重链和轻链可变区序列。除了基于贴面化序列的去免疫序列外，还对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列，称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded)(Mo PT)。对该形式而言，直接在鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，但仅在CDR外进行被认为无害于结合的改变。在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。
最初的去免疫VH包括上面第5节中的1至6替换并且不包括潜在的T细胞表位。设计了另外4个去免疫的VH序列，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。对最初的去免疫序列(425VH1GRR-VH-v1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。包括小鼠的穿线形式用于比较。
表2：在去免疫的425VH中氨基酸的改变和潜在的表位
 
变体 累积的残基改变 潜在的T细胞表位
425VH1GRR-VH-v1 没有 没有
425VH1GRR-VH-v2 48A→I 46(8)
425VH1GRR-VH-v3 45P→L 43(7)，46(8)
425VH1GRR-VH-v4 67V→A，69I→L 43(7)，46(8)，58(10)，62(11)                
425VH1GRR-VH-v5 41P→A 31(7)，43(7)，46(8)，58(10)，62(11)       
425VH-MoPT NA 43(7)，46(8)
最初的去免疫VK包括上面第5节中的替换1至4并且不包括潜在的T细胞表位。另设计了4个去免疫的VK序列，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。版本2是版本1的备选物，其中使用了备选的替换以去除相同的潜在T细胞表位。对最初的去免疫序列(425L6-vg-VK-vl)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。包括小鼠的穿线形式用于比较。
表3：在去免疫的425VK中氨基酸的改变和潜在的表位
 
变体 累积的残基改变 潜在的T细胞表位
425L6-vg-VK-vl 没有 没有
425L6-vg-VK-v1 51A→T，46L→A 没有
425L6-vg-VK-vl 46A→L 43(16)
425L6-vg-VK-vl 95P→I 43(16)，92(8)
425L6-vg-VK-vl 36H→Y 27(5)，43(16)，92(8)
425VK-MoPT NA 27(5)，43(16)，92(8)
表4：鼠MAb425的VH和VK的最初序列和＂贴面化＂序列
425VH小鼠
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQRAGQGLEWIGEFNPSNGRTNYNEKFKSKAT
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425VK小鼠
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425VH贴面化：
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425VK贴面化：
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWYQQKPGQSPRLLIYDTSNLASGVPARFSGSGSGTS
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表5：MAb425的重链和轻链可变区的去免疫序列
425去免疫的VH1
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ITVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
425去免疫的VK1
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YTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSHPFTFGQGTKVEIK
425去免疫的VH2
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAPGQGPEWIGEFNPSNGRTNYNEKFKSRVT
ITVDKSTSTAYMQLSSLTSEDTAVYYCASRDYDYDGRYFDYWGQGTTLTVSS
425去免疫的VK2
QIVLTQSPATLSASPGERATMSCSASSSVTYMYWHQQKPGQSPRALIYDISNLASGVPARFSGSGSGTS
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425去免疫的VH3
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425去免疫的VK3
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425去免疫的VH4
QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQAPGQGLEWIGEFNPSNGRTNYNEKFKSRAT
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425去免疫的VK4
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425去免疫的VH5
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425去免疫的VK5
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425VH小鼠，穿线肽(Mo PT)
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425VK小鼠，穿线肽(Mo PT)
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如已提及的那样，本发明的改变的抗EGFR抗体-细胞因子构建体，优选地MAb425-Il2，可用在药物组合物和药物药剂盒中，优选地用于治疗癌症。＂癌＂和＂肿瘤＂是指或描述的是哺乳动物的生理疾病，其典型特征在于不受调节的细胞生长。通过本发明的药物组合物，可治疗如胸部、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头和颈、卵巢、前列腺、脑、胰脏、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸、子宫颈和肝脏的肿瘤。
类似于抗体425，使用鼠的、嵌合的或人源化形式的单克隆抗体225可获得类似的融合构建物。
实施例19：14.18抗体-IL2和KS-1/4-IL2的去免疫形式
细胞因子白细胞介素2(IL-2)已融合至分别针对肿瘤相关抗原上皮细胞粘附分子(Ep-CAM，KSA，KS1/4抗原)和二唾液酸神经节苷酯GD的特异性单克隆抗体KS-1/4和ch14.18上，分别形成融合蛋白ch14.18-IL-2和KS1/4-IL-2(US 5,650,150，EP 0 338 767)。这些抗体已根据本发明去免疫并融合至免疫原性改变的IL2或未改变的IL-2上。
抗EpCAM抗体KS1/4
单克隆抗体KS1/4为鼠抗体，其特异结合以高密度存在于腺癌细胞上且以低许多的水平存在于某些正常上皮细胞上的40,000道尔顿细胞表面抗原EpCAM(上皮细胞粘附分子)。该抗体显示出可以有效地用于检测疾病。
已描述了KS-1/4与单一和组合的细胞因子如IL-2和IL-12的多种融合蛋白(W098/25978，WO01/58957A和WO01/10912)。这些融合蛋白在动物肿瘤模型中是有效的。但是，由于细胞因子的存在，这些融合蛋白具有显著免疫原性。施用于人宿主时，需要具有降低的引发免疫反应的倾向的已改变KS抗体分子。如下所示为改变的Mab KS1/4序列，其提供了本发明的修饰KS抗体。在哺乳动物细胞中有效表达了KS-1/4的突变形式，根据上述计算机算法一节给出的标准定义，该突变形式中V区的T细胞表位通过突变完全被去除，并且该突变形式以降低了8-倍的亲和性结合EpCAM抗原。该分子称为VHv1/VKv1。第二抗体VHv2/VKv1的亲和性降低了约3倍并且其与VHv1/VKv1由于单氨基酸替换而不同。这两种抗体已在哺乳动物细胞中以KS-IL2融合蛋白形式表达。在通过免疫疗法进行人癌症的广谱治疗中KS(VHv1/VKv1)-IL2和KS(VHv2/VKv1)为本发明最优选的实施方案。
1与小鼠亚组构架的比较
将鼠KS VH和VK的氨基酸序列与Kabat鼠重链和轻链亚组(Kabat等人，1991)的共有序列比较。鼠KSVH不属于任一亚组，但最接近于亚组II(A)和V(A)。在通常为缬氨酸的位置2处发现了不寻常残基，在通常为谷氨酸的位置46处发现了不寻常残基，并且在通常为苏氨酸的位置68处发现了不寻常残基。残基69较常见地为亮氨酸或异亮氨酸。在82b处最经常见到的是丝氨酸。鼠KS VK可以被归于亚组VI(′图2)。在46和47位见到了不寻常残基，在这两位置处通常均为亮氨酸。残基58为不寻常的，在该位置处通常为亮氨酸或缬氨酸。
2与人构架进行比较
将鼠KS VH和VK的氨基酸序列与人胚系VH(Tomlinson，I.M等人，1992)和VK(Cox等人，1994)序列目录中的序列比较，并与人胚系J区序列(Routledge等人，1993)比较。所选的用于KSVH的参照人构架为具有人JH6的DP10。已发现该胚系序列存在于没有氨基酸变化的重排成熟抗体基因中。所选的用于KS VK的参照人构架为B1。对于构架-2，使用成熟人抗体IMEV的序列(Kabat等人1991)。该序列与紧靠CDR2的鼠序列相同。J区序列为人JK4。还未发现该胚系序列作为重排的成熟抗体轻链形式存在。
3.贴面化序列的设计
确定参照人构架序列后，将425VH和VK构架中某些不一致的氨基酸残基改变为人参照序列中的相应氨基酸。被认为对抗体结构和结合关键的残基不包括在该过程中，且不进行改变。在此阶段仍保留的鼠残基主要是不位于表面的隐蔽残基，及例如在最后的抗体中靠近CDR的N-末端残基。该方法产生的序列大致类似于“贴面化”抗体，因为表面残基主要是人的，而隐蔽残基为原来的鼠序列。
4.肽穿线分析(threading analysis)
使用本发明方法分析鼠KSVH和VK序列和贴面化KSVH和VK序列。将氨基酸序列分成所有可能的13mer。将这些13mer的肽依次呈递给HLA-DR同种异型的结合沟模型，并且相对于每一等位基因将结合分值赋予每一个肽。对肽的每一口袋结合侧链计算构象分值。该分值基于立体重叠、肽和结合沟中的残基间的潜在氢键、静电相互作用以及肽和口袋残基间的有利接触。然后改变每一侧链的构象并再次计算分值。确定了最高的构象分值后，基于与沟结合的疏水残基、非沟的亲水残基和适合进入结合沟的残基数目计算结合分值。MHC II类的已知结合者得到显著的结合分值，几乎没有假阴性。这样，在当前的分析中达到显著结合分值的肽被认为是潜在的T细胞表位。对鼠和贴面化序列的肽穿线分析结果在表1中给出。
表1：在鼠和贴面化KS序列中潜在的T细胞表位
 
序列 潜在的T细胞表位数 潜在表位的位置(潜在的MHC结合者的数目)           
鼠KS VH 6 35(11)，62(17)，78(12)，81(12)，89(6)，98(15)                   
鼠KS VH 5 30(7)，62(15)，78(11)，89(6)，98(15)                        
鼠KS VK 6 1(14)，2(5)，17(5)，27(5)，51(13)，72(18)                 
贴面化KS VK 3 1(17)，27(5)，51(13)
5.潜在T细胞表位的去除
在构成表位的特定肽中对氨基酸进行替换而去除潜在的T细胞表位。如果可能的话通过插入具有类似物理化学特性的氨基酸进行替换。但是为了去除一些潜在的表位，可能需要替换为具有不同大小、电荷或疏水性的氨基酸。如果在CDR中进行可能对结合产生影响的改变，则需要产生有和没有此特定氨基酸替换的变体。用于替换的氨基酸残基的编号按Kabat进行。通过13mer中第一个残基所在的线性编号谈及潜在的T细胞表位。
从贴面化KS重链可变区去除T细胞表位所需的氨基酸改变如下：
1.在残基38处(Kabat编号38)用精氨酸替换赖氨酸去除残基30位的潜在表位。
2.在残基72处(Kabat编号71)用丙氨酸替换亮氨酸并在残基70处(Kabat编号69)用异亮氨酸替换苯丙氨酸去除残基62位的潜在表位。在人胚系VH序列DP10中发现Kabat编号69位为异亮氨酸而Kabat编号71位为丙氨酸。
3.在残基79处(Kabat编号78)用亮氨酸替换丙氨酸去除残基78位的潜在表位。
4.在残基91处(Kabat编号87)用苏氨酸替换甲硫氨酸去除残基89位的潜在表位。
5.在CDRH3中残基100处(Kabat编号96)用甲硫氨酸替换异亮氨酸去除残基98位的潜在表位。在CDRH3外的变化没有能消除该潜在表位的。
从贴面化KS轻链可变区去除潜在T细胞表位所需的氨基酸替换如下：
1.在残基32处(Kabat编号33)用异亮氨酸替换甲硫氨酸去除残基27位的潜在表位。该残基在CDR2中。在人抗体的该位置处常见异亮氨酸。
2.在残基处(Kabat编号3)用缬氨酸替换亮氨酸去除位置1处的潜在表位。
3.在残基59处(Kabat编号60)用丝氨酸替换丙氨酸去除残基51位的潜在表位。
6去免疫序列的设计
参考去除潜在的T细胞表位所需的变化并考虑对抗体结构和结合可能关键的构架残基，设计去免疫的重链和轻链序列。除了基于贴面化序列的去免疫序列外，对基于鼠序列的VH和VK各设计了另一序列，称为小鼠穿线肽形式(Mouse Peptide Threaded version)(Mo PT)。对该形式而言，直接在鼠序列中进行改变以去除T细胞表位，但仅在CDR外被认为无害于结合的位置进行改变。在此形式的去免疫序列中没有尝试去除表面(B细胞)表位。
最初的去免疫VH包括上面第5节中的1至5替换和在残基43处(Kabat编号43)的一个额外变化。用在鼠序列中存在的赖氨酸替换来自人构架的谷氨酰胺。赖氨酸带正电荷，因此明显不同于谷氨酰胺；该区域可能参与VH/VL接触。该最初的去免疫VH不包括潜在的T细胞表位。另设计了4个去免疫的VH，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。对此最初的去免疫序列(KSDIVHv1)进行的累积改变和仍然保留的潜在T细胞表位详见表2。
表2：在去免疫的KS VH中氨基酸的改变和潜在的表位
 
变体 累积的残基改变 潜在的表位(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)        
KSDIVHv1 没有 没有
KSDIVHv2 96M→I 98(15)
KSDIVHv3 71A→L，78L→A 62(16)，78(11)，98(15)
KSDIVHv4 38R→K 30(7)，62(16)，78(11)，98(15)                 
KSDIVHv5 68T→A，69I→F 30(7)，62(17)，78(11)，98(15)                 
KSMoPTVH NA 98(15)，78(12)
最初的去免疫VK包括上面第5节中的替换1至3。另设计了3个去免疫的VK，以检验所需的不同替换对抗体结合的影响。对最初的去免疫序列(KSDIVKv1)进行的累积替换和仍然保留的潜在T细胞表位详见表3。
表3：在去免疫的KS VK中氨基酸的改变和潜在的表位
 
变体 累积的残基改变 潜在的表位(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)        
KSDIVKv1 没有 没有
KSDIVKv2 33I→M 27(5)
KSDIVKv3 3V→L 1(17)，27(5)
KSDIVKv4 60S→A 1(17)，27(5)，5(13)
KSMoPTVK NA 没有
已改变的表位的序列：
KS VH贴面化：
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fTlETSTSTAYLQLNNLRsEDmATYfCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS VK贴面化：
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KS 去免疫的VH1
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KS 去免疫的VK1
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YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS 去免疫的VH2
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
ITAEISTSTLYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS 去免疫的VK2
QIVLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPSRFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS 去免疫的VH3
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFT
ITLETSTSTAYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS 去免疫的VK3
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YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS 去免疫的VH4
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ITLETSTSTAYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS 去免疫的VK4
QILLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGQPPKPWIFDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS 去免疫的VH5
QIQLVQSGPELKKPGSSVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFA
FTLETSTSTAYLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTTVTVSS
KS去免疫的VK5
QILLTQSPASLAVSPGQRATITCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIYDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YTLTINSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKVEIK
KS VH小鼠，穿线肽(Mo PT)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFV
FSLETSASTAFLQLNNLRSEDTATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS
KS VK小鼠，穿线肽(Mo PT)
QIVLTQSPATLSASPGERVTITCSASSSVSYMLWYLQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPSRFSGSGSGTT
YSLIISSLEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
KS VH小鼠
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQTPGKGLKWMGWINIYTGEPTYADDFKGRFA
FSLETSASTAFLQINNLRNEDMATYFCVRFISKGDYWGQGTSVTVSS
KS VK小鼠
QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMLWYQQKPGSSPKPWIFDTSNLASGFPARFSGSGSGTS
YSLIISSMEAEDAATYYCHQRSGYPYTFGGGTKLEIK
MAb14.18-IL-2
类似地，将单克隆抗体14.18与IL-2融合并根据本发明去免疫。
在鼠和贴面化的14.18序列中潜在的T细胞表位为：
 
序列 潜在的T细胞表位数 潜在表位的位置
鼠14.18VH 11 3(17)，9(15)，30(5)，35(17)，39(15)，43(9)，58(12)，62(11)，81(11)，84(16)，101(7) 
贴面化14.18VH 5 43(9)，58(12)，62(11)，81(11)，84(16)             
鼠14.18VK 7 7(7)，13(11)，27(15)，49(11)，86(17)，97(11)，100(4)
贴面化14.18VK 5 27(15)，49(11)，86(17)，97(11)，100(17)             
在去免疫的14.18VH中氨基酸的改变和潜在的表位为：
 
变体 累积的残基改变 潜在的表位(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)
14.18DIVH1 没有 没有
14.18DIVH2 41I→P，45L→T，50L→A           没有
14.18DIVH3 65S→G 58(8)
14.18DIVH4 71A→V 58(8)，62(4)
14.18DIVH5 45T→L，41P→I 43(9)，58(8)，62(4)
14.18MoPTVH NA 43(9)，58(12)，62(11)
在去免疫的14.18VK中氨基酸的改变和潜在的表位为：
 
变体 累积的残基改变<sup>＊</sup> 潜在的表位′(18个受检对象中，潜在MHC结合者的数目)          
14.18DIVKI 没有 没有
14.18DIVK2 46L→M，49Y→H 没有
14.18DIVK3 96P→T，100Q→G 97(5)
14.18DIVK4 96T→L 97(11)
14.18DIVK5 27e S→R 27(15)，97(11)
14.18DIVK6 46M→L 27(15)，49(11)，97(11)
14.18MoPTVK NA 27(15)，49(11)，97(11)，100(4)      
已改变表位的序列为：
14.18 VH贴面化：
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT
LSVDKSSSQAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTTVIVSS
14.18 VK贴面化：
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDLAVYFCSQSTHVPPLTFGQGTKLEIK
14.18 去免疫的VH1
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAIGQRLEWIGLIDPYYGGTSYNQKFKSRVT
ITADKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18 去免疫的VK1
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPPTFGQGTKVEIK
14.18 去免疫的VH2
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRTEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKSRVT
ITADKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18 去免疫的VK2
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPPTFGQGTKVEIK
14.18 去免疫的VH3
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRTEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRVT
ITADKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18 去免疫的VK3
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPTTFGGGTKVEIK
14.18 去免疫的VH4
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAPGQRTEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRVT
ITVDKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVIVSS
14.18 去免疫的VK4
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKHLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPLTFGGGTKVEIK
14.18 去免疫的VH5
EVQLLQSGPELKKPGASVKISCKASGSSFTGYNMNMVRQAIGQRLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRVT
ITVDKSSSQAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18 去免疫的VK5
DVVMTQSPGTLPVSLGERATISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKMLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLTISRLEAEDMAVYFCSQSTHVPPLTFGGGTKVEIK
14.18 VH小鼠，穿线肽(Mo PT)
EVQLVQSGPEVEKPSASVKISCKASGSSFTGYNMNWVRQAIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT
LTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDTAVYYCVSGMEYWGQGTTVTVSS
14.18 VK小鼠，穿线肽(Mo PT)
DVVMTQTPGSLPVSAGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLKISRVEAEDSGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
14.18 VH小鼠
EVQLLQSGPELEKPSASVMISCKASGSSFTGYNMNWVRQNIGKSLEWIGAIDPYYGGTSYNQKFKGRAT
LTVDKSSSTAYMHLKSLTSEDSAVYYCVSGMEYWGQGTSVTVSS
14.18 VK小鼠
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHRNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIHKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPPLTFGAGTKLELK
以上描述和实施例用于举例阐述，不用作限制。再者，在本发明精神和范围内的其它修饰形式是可能的，并易于为本领域技术人员明了。

Claims (8)

1.用于制备下式所示的免疫原性改变的人工蛋白质的方法
A-(L)n-X
其中
A为完整抗体或其sFv、Fab、Fab′、F(ab′)2片段，
X为非免疫球蛋白靶多肽，
L为接头肽，
n＝0或1，
所述免疫原性改变的人工蛋白质衍生自亲本人工蛋白质，具有不同于所述亲本人工蛋白质的氨基酸序列，并且相对于亲本融合蛋白而言，当暴露于给定物种的免疫系统时由于其T细胞表位数目的减少而显示出降低的免疫原性，其中所述T细胞表位为可结合MCH II类分子结合基团的肽序列；
所述方法包括以下步骤：
(i)确定亲本融合蛋白或其部分的氨基酸序列；
(ii)用任一方法鉴定出融合蛋白氨基酸序列中的一个或多个潜在的T细胞表位，所述方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合，
(iii)通过在最初鉴定的T细胞表位序列中改变至少一个氨基酸残基设计新的序列变体，其中通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合或通过肽-MHC复合体与T细胞的结合而确定，所述变体以实质上减少或消除T细胞表位序列的活性或数量和/或以实质上减少或消除可结合来自所述生物分子的肽的MHC同种异型的数量的方式而改变，
(iv)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并测试所述变体以确定一个或多个具有所希望的特性的变体，以及
(v)任选地重复步骤(ii)-(iv)，
所述方法的特征在于步骤(ii)对T细胞表位序列的鉴定按如下进行：
(a)选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；(b)依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；(c)对每一所述采集片段计算MHC II类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及(d)基于所计算的片段的MHC II类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总MHC II类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途；
其中步骤(c)通过应用改进的
Figure C02805158C0003171530QIETU
评分函数及如下方式实施，其中所述
Figure C02805158C0003171530QIETU
评分函数的改进为在其中包括12-6范德华配体-蛋白质能量排斥项和配体构象能量项，而所述方式为(1)提供MHC II类分子模型第一数据库；(2)针对所述MHC II类分子模型提供所容许的肽主链的第二数据库；(3)从所述第一数据库选择一个模型；(4)从所述第二数据库选择一个容许的肽主链；(5)鉴定在每一采集片段中存在的氨基酸残基侧链；(6)确定每一采集片段中存在的所有侧链的结合亲和性值；以及任选地(7)对每一所述模型和每一所述主链重复步骤(1)至(5)。
2.权利要求1的方法，其中采集的氨基酸残基片段由13个氨基酸残基组成，并且有一至五个氨基酸残基的重叠。
3.权利要求1或2的方法，其中在任一最初存在的T细胞表位序列中改变1-9个氨基酸残基。
4.权利要求1的方法，其中A选自：
抗EGF受体(HER1)抗体，
抗HER2抗体，
抗CDx抗体，
抗17-1A抗体，
抗KSA抗体，
抗GP IIb/IIIa抗体，
抗整合素受体抗体，
抗VEGF受体抗体。
5.权利要求4的方法，其中抗体选自：
单克隆抗体225及其衍生物，
单克隆抗体425及其衍生物，
单克隆抗体KS1/4及其衍生物，
单克隆抗体14.18及其衍生物，
单克隆抗体4D5/HER2(
Figure C02805158C0004171549QIETU
及其衍生物，
单克隆抗体17-1A及其衍生物，
单克隆抗体7E3及其衍生物，
单克隆抗体LM609、P1F6和14D9.F8及其衍生物，
单克隆抗体DC-101及其衍生物，
单克隆抗I1-2R抗体(
Figure C02805158C0004171558QIETU
)及其衍生物。
6.权利要求1的方法，其中靶多肽X选自：
细胞因子、整合素抑制剂、生长激素、生长因子、抗血友病因子、抗原、细胞因子受体拮抗剂。
7.根据权利要求6的方法，其中靶多肽X选自：
IL-2、G-CSF、GM-CSF、EPO、TPO、TNFα、可溶性TNF受体、IL-12、IL-8、FGF、TGF、EGF、VEGF、PMSA、IGF、胰岛素、hGH、RGD-肽、内皮抑素、制管张素、BDNF、CNTF、蛋白质c、因子IX，及它们的生物活性片段。
8.权利要求1的方法，其中所述的改变的融合蛋白选自：
MAb KS 1/4-IL2、MAb 14.18-IL2、
MAb 425-IL2、MAb c425-IL2、MAb h425-IL2、MAb 425-TNFα、
MAb 225-IL2、MAb c225-IL2。
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