PT1966244E - Anticorpos anti-il-6 impedindo a ligação da il-6 complexada com il-6ralfa a gp130 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO ANTICORPOS ΑΝΤΙ—IL—6 IMPEDINDO A LIGAÇÃO DA IL-6 COMPLEXADA COM IL-6RALFA A GP130" está cancros segregada tais como cancro e pensa-se ser um fator de crescimento para esses Adicionalmente, pensa-se que a secreção de IL-6 cancerígenas causa caquexia, o síndroma de característico dos cancros em estado avançado, a inibição da ação da IL-6 deve ser útil no de tais cancros.

ÂMBITO DA INVENÇÃO

Esta invenção relaciona-se compreendendo uma porção Fc IL6. Em particular a invenção anti IL6 para tratamento de desencadeadas por IL6, em que imunização de um mamífero com

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A interleucina-6 (IL-6) incluindo muitos interleucina-6 é avançado, hormona, cancros. por células maciação Portanto, tratamento com uma proteína de fusão de um anticorpo, IL6Ralfa e relaciona-se com um anticorpo cancro e doenças autoimunes este anticorpo foi obtido por a referida proteína de fusão. envolvida em várias doenças, e doenças autoimunes. A or muitos cancros em estado da próstata independente de A IL-6 desempenha também um papel chave no desenvolvimento da célula B. As doenças autoimunes com um significativo componente anticorpo, tal como arterite reumatóide, podem ser tratadas através da inibição da IL-6. Distúrbios envolvendo proliferação de células B, tais como mieloma múltiplo e linfoma da célula B, podem também ser tratados através da inibição da atividade da IL-6. 2

Adicionalmente, a IL-6 desempenha um papel importante na remodelação óssea por promover a resorção óssea. Os inibidores da atividade da IL-β devem ter o efeito de reduzir a resorção óssea e podem ser usados para tratar a osteoporose.

Quando a IL-6 é produzida como parte de uma doença ou distúrbio, ela está muitas vezes complexada com uma subunidade IL-6Ralfa solúvel e é muitas vezes segregada das células na forma de um tal complexo. Como resultado, muitas vezes não é útil tratar um doente com um anticorpo ou outro inibidor que bloqueia a interação entre a IL-6 e IL-6Ralfa, porque um tal anticorpo ou inibidor pode não ter efeito num complexo préformado. A WO 2004/039826 divulga anticorpo anti-IL6 com propriedades especificas produzidas por formação, identificação e seleção de anticorpos por imunização de ratos com IL-6 recombinante (rIL-6). Estes anticorpos revelam propriedades que são dependentes das condições iniciadas pelo sistema biológico usado e pelo cientista e médico envolvidos.

Peters et-al (J. Immunol. 1998, V.161, 3575-3581) descrevem uma proteína de fusão composta por IL6 e sIL6R ligadas por uma sequência de péptidos (chamada "hiper IL6"). Esta hiper IL6 é muito mais ativa em células expressando gp 130 como comparado com IL6 e sIL6R não ligadas, e mostra uma meia vida mais longa em soro que a IL6 não ligada. O péptido foi feito como um fármaco alternativo à IL6. O artigo é completamente omisso quanto ao uso da proteína de fusão para imunização com vista a formar anticorpos dirigidos contra IL6 assim como a sIL6R. 3

Portanto, há uma necessidade na técnica de tratamento melhorado de doenças mediadas por IL6 fornecendo as respetivas proteínas de fusão e os anticorpos obtidos pelas referidas proteínas de fusão via imunização.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições e métodos melhorados para o tratamento de doenças mediadas por IL-6, em particular, cancros e doenças autoimunes que envolvem a sobre ativação de IL-6. Especificamente, a presente invenção fornece um novo anticorpo IL-6 que efetivamente bloqueia a interação entre IL-6 e gpl30, em particular, um anticorpo IL-6 que impede o complexo IL-6 e IL-6Ralfa préformado de se ligar a gpl30. Adicionalmente, a presente invenção fornece métodos para produzir o novo anticorpo IL-6 por imunização de um mamífero com uma proteína de fusão compreendendo uma porção Fc de um anticorpo, IL6Ralfa e IL-6.

Portanto, num aspeto, a presente invenção fornece um antagonista de IL-6 isolado que impede a IL-6 complexada com IL-6Ralfa de se ligar a gpl30. Numa outra forma de realização, o antagonista IL-6 isolado contém uma região variável do anticorpo e uma região Fc derivada de um anticorpo humano. Em formas de realização alternativas, a região Fc adequada para a invenção pode derivar de um anticorpo obtido a partir de um rato, uma ratazana, uma vaca, um cão, uma galinha, um cavalo, um peixe, um macaco, ou outras espécies não humanas. Numa forma de realização preferida, a região variável do anticorpo liga-se a uma região na IL-6 de modo a que a ligação estericamente bloqueie a interação entre IL-6 e gpl30. 4

Em algumas formas de realização, o anticorpo inclui uma cadeia leve contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID N0:31 , ou SEQ ID NO:32.

Noutras formas de realização, o anticorpo inclui uma cadeia pesada contendo uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, ou SEQ ID NO:36. A presente invenção fornece também ácidos nucleicos que codificam o antagonista IL-6 como descrito nas várias formas de realização acima. Em particular, a presente invenção fornece ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e/ou a cadeia pesada dos anticorpos anti-IL-6 descritos acima.

Tipicamente, o antagonista IL-6 inclui uma porção Fc. Preferencialmente, a porção Fc é derivada de um anticorpo humano. Numa forma de realização preferida, todas as regiões constantes no anticorpo IL-6 da invenção são derivadas de um anticorpo humano. Em formas de realização alternativas, a região Fc adequada para a invenção pode ser derivada de um anticorpo obtido de um rato, uma ratazana, uma vaca, um cão, uma galinha, um cavalo, um peixe, um macaco, ou outras espécies não humanas.

Num outro aspeto, a presente invenção fornece um método para tratar uma doença num indivíduo através da administração ao individuo do anticorpo IL-β isolado da invenção como descrito acima. 0 método da presente invenção é particularmente útil no tratamento de doenças, distúrbios, e efeitos secundários que envolvem IL-6, tais como, por exemplo, doenças autoimunes incluindo, mas não 5 limitado a, arterite reumatóide, Sindrome de Sjogren, esclerose múltipla, lupus sistémico eritematoso, doença de Graves, doença de Hashimoto, e doença de Castleman, inflamação aguda e crónica, e osteoporose e outros distúrbios envolvendo perda de massa óssea, e cancros incluindo, mas não limitado a, cancro da próstata independente de hormona, doenças proliferativas da célula B tais como linfoma da célula B não-Hodgkin, e cancros em estado avançado do rim, da mama, colon, pulmão, cérebro, e outros tecidos.

Ainda num outro aspeto, a presente invenção fornece um método de gerar um anticorpo de IL-6 descrito em várias formas de realização acima. Em particular, a presente invenção fornece um método para formação de um anticorpo IL-6 por (a) primeiro formar anticorpos contra um complexo de IL-6 e IL-6Ralfa por imunização de um animal com uma composição incluindo IL-6 e IL-6Ralfa, e (b) identificar um anticorpo que inibe a interação entre gpl30 e IL-6. As IL-6 e IL-6Ralfa podem ser na configuração de proteína de fusão para facilitar a formação do complexo IL-6/IL-6Ralfa. Numa forma de realização preferida, a composição inclui também uma porção adicional que facilita a apresentação do antigénio, tal como uma porção Fc.

Ainda num outro aspeto, a presente invenção fornece um anticorpo específico para um complexo de IL-6 e IL-6Ralfa e capaz de impedir a IL-6 de se ligar a gpl30.

Outras características, objetos, e vantagens da presente invenção são evidentes na descrição pormenorizada que se segue. Deve entender-se, porém, que a descrição pormenorizada, enquanto indicando formas de realização da presente invenção, é dada somente como meio ilustrativo, 6 não de limitação. Várias mudanças e modificações no âmbito da invenção podem ser evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição pormenorizada.

Em resumo a invenção relaciona-se com: • Uma proteina de fusão compreendendo (i) uma porção Fc de um anticorpo, (ii) IL6Ralfa e (iii) IL6. • Uma proteina de fusão da reivindicação 1, em que IL6Ralfa é fundida ao C terminal da porção Fc, e IL6 é fundida com o C terminal de IL6Ralfa. • Uma proteina de fusão da reivindicação 1 ou 2, em que a porção Fc é de murino e IL6Ralfa e IL6 são humanos. • Uso de uma proteina de fusão de qualquer das reivindicações 1-3 para o fabrico de um anticorpo anti-IL-6 para tratamento de cancro e doenças autoimunes desencadeadas por IL6, em que o anticorpo foi obtido por imunização de um mamifero com a referida proteina de fusão, e tem as seguintes propriedades: (i) a região variável do referido anticorpo liga-se a um epitopo na IL-6, (ii) bloqueia estericamente a interação entre IL-β e gpl30 na superficie de uma célula doente, e (ii) impede que a IL-6 complexada com IL-6Ralfa se ligue a gpl30, mas não bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa. • Uso da reivindicação 4, em que o anticorpo rastreado é um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada e (b) uma cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em (i) (a) SEQ ID NO:35 e (b) SEQ ID N0:31, (ii) (a) SEQ ID NO:34 e (b) SEQ ID NO:30 (iii) (a) SEQ ID NO:36 e (b) SEQ ID NO:32, e (iv) (a) SEQ ID NO:33 e (b) SEQ ID NO:29. 7 • Um anticorpo anti-IL6 correspondente compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:35 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:31. • Um anticorpo anti-IL6 correspondente compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:34 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:30. • Um anticorpo anti-IL6 correspondente compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:32. • Um anticorpo anti-IL6 correspondente compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:33 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 9.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura IA retrata a ativação indesejada de gpl30 nas células doentes ou outras células alvo resultante da sobreprodução de IL-6 . A Figura 1 B retrata um antagonista de IL-6 que bloqueia estericamente a interação entre IL-β e gpl30 e cuja ligação a IL-6 não é afetada pela pré-ligação a sIL-6Ralfa. A Figura 2 mostra um alinhamento de sequências da região V de anticorpos exemplificativas da presente invenção. As 8 posições de variação entre as sequências são indicadas com setas. Os CDRs estão dentro de caixas. A Figura 3 é uma representação esquemática de proteinas exemplificativas das formas de realização usadas na presente invenção. A Figura 4 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplificativos da invenção a Fc-IL6Ralfa-IL6. A Figura 5 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplificativos da invenção a IL-6. A Figura 6 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplificativos da invenção a IL-6 e IL-6Ralfa não covalentemente complexado. A Figura 7 mostra um resultado experimental refletindo a ligação de anticorpos exemplificativos da invenção a IL-6Ralfa sozinho. A Figura 8 mostra um resultado experimental ilustrando que os anticorpos exemplificativos da invenção inibem a interação entre Fc-IL6Ralfa-IL6 e gpl30. A Figura 9 mostra um resultado experimental ilustrando a capacidade para bloquear a libertação de haptoglobina a partir das células HepG2 estimulada com um complexo Fc-IL6Ralfa-IL6 pelos anticorpos exemplificativos da invenção. A Figura 10A retrata resultados experimentais refletindo que a proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6 estimula a proliferação de célula epiteliais humanas A431. 9

As Figuras 10B-1 e 10B-2 retratam resultados experimentais refletindo que os anticorpos exemplificativos da invenção inibem a proliferação de células A431 do carcinoma epitelial humano estimulada pela proteina de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6. A Figura 11 ilustra as propriedades farmacocinéticas dos anticorpos exemplificativos da invenção. A Figura 12 mostra um resultado experimental refletindo a inibição in vivo da secreção de haptoglobina pelos anticorpos exemplificativos da invenção, usando os procedimentos descritos no Exemplo 6. A Figura 13 mostra um resultado experimental refletindo a inibição de metástases pulmonares pelos anticorpos exemplificativos da invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção fornece uma proteina de fusão compreendendo uma porção Fc de um anticorpo, IL6Ralfa e IL-6. Em particular, a invenção fornece um novo anticorpo IL-6 obtido a partir da referida proteina de fusão que efetivamente bloqueia a interação entre IL-β e gpl30, suprimindo assim a sinalização de IL-6 na presença dos complexos IL-6/IL-6Ralfa préformados. Como discutido acima, dado que IL-6 é tipicamente complexado com IL-6Ralfa quando produzido como parte de uma doença ou um distúrbio, a presente invenção atinge portanto melhores efeitos terapêuticos em comparação com os anticorpos existentes que bloqueiam a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa (van Zaanen et al., (1996) J. Clin. Invest, 98(6): 1441 -8). 10

Numa forma de realização particular, a presente invenção fornece um anticorpo IL-6 contendo uma região variável do anticorpo que se liga a uma região na IL-6 de modo a que a ligação bloqueie estericamente a interação entre IL-6 e gpl30. Por "bloquear estericamente" entende-se os meios de bloqueio de uma interação entre a primeira e a segunda proteínas por ligação de uma terceira proteína à primeira proteína. A ligação entre a primeira e a terceira proteínas impede a segunda proteína de se ligar à primeira proteína devido às interações desfavoráveis de van der Waals ou interações eletroestáticas entre a segunda e a terceira proteínas. A presente invenção fornece também composições e métodos para tratamento de doenças, distúrbios e efeitos secundários envolvendo a IL-6 com base no antagonista IL-6 da invenção. Vários aspetos da invenção são descritos com mais pormenor nas subsecções seguintes. O uso de subsecções não é entendido para limitar a invenção. Cada subsecção pode aplicar qualquer aspeto da invenção. Nesta aplicação, o uso de "ou" significa "e/ou" a menos que estabelecido de outro modo. Como usado nesta divulgação, o termo "compreende" e variações do termo, tais como "compreendendo" e "compreendido, " não são entendidos para excluir outros aditivos, componentes, dígitos ou passos. IL-6 e sua Interação com IL-6Ralfa e gp!30 A sinalização IL-6 é entendida para ocorrer pela sua interação com a subunidade alfa recetora IL-6 (IL-6Ralfa) e gpl30, uma proteína recetora transmembranar que transduz os sinais da IL-6 para STAT3, que depois ativa a transcrição dos vários genes. A estrutura de uma porção extracelular do 11 complexo de sinalização foi determinada (Boulanger et al., (2003), Science. 300:2101. Esta estrutura indica que o

complexo de sinalização contém duas cópias da IL-6, duas cópias da subunidade IL-6Ralfa, e duas cópias do gpl30. A análise da estrutura indica também que a IL-β se liga ao recetor gpl30 através de três epitopos conservados conhecidos como sitios I, II, e III. A IL-6 deve primeiro formar um complexo com IL-6Ralfa através do sitio I. O Sitio II é um epitopo composto formado pelo complexo binário de IL-6 e IL-6Ralfa, o qual interage com a região CHR de ligação da citocina e D2D3 do gpl30. Subsequentemente, o sitio III interage com o domínio de ativação gpl30 do tipo imunoglobulina (Dl ou IGD) para formar o competente complexo hexâmero de sinalização (Boulanger et al., (2003) Science. 300:2101. O sítio I ligado ao epitopo da IL-6 está localizado nas hélices A e D e interage com IL-6Ralfa. As restantes quatro únicas interfaces proteína-proteína no hexâmero podem ser separadas em dois sítios compostos, sítios II e III. Estudos da estrutura tridimensional do complexo hexâmero revelaram vários dos resíduos da IL-6 participam em e são importantes para a interação entre IL-6 e gpl30. Tais resíduos incluem, mas não são limitados a, Leul9, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31 , Asp34 e Trpl57.

Assim, o efeito de formação do complexo hexâmero é dimerizar o gpl30 e justapor o seu domínio celular, de modo a que continue a sinalização ao nível intracelular. A subunidade IL-6Ralfa não tem um domínio intracelular, e serve somente para estabilizar o complexo. A IL-6 de mamífero não é capaz de se ligar ao gpl30 na ausência de IL-6Ralfa. A subunidade canónica IL-6Ralfa tem três domínios extracelulares e uma região de transmembrana que ancoram a subunidade IL-6Ralfa à membrana da célula de 12 expressão. "IL-6Ralfa Solúvel" ou "sIL-6Ralfa" significa uma proteína com a porção extracelular da subunidade IL-6Ralfa mas sem o segmento da transmembrana. A proteína variante sIL-6Ralfa, sem o segmento transmembranar, pode ser formada pela translação de um mRNA alternativamente emendado que codifica IL-6Ralfa, ou por clivagem proteolítica da forma ligada a membrana da IL-6Ralfa. A sIL-6Ralfa está presente no soro e pode ser segregada pela mesma célula que expressa IL-6. A IL-6 forma um complexo com sIL-6Ralfa. Uma vez formado o complexo IL-6/sIL-6Ralfa, é razoavelmente estável e não pode ser ligado por um anticorpo que compete com a interação IL-6/sIL-6Ralfa. 0 complexo IL-6/sIL-6Ralfa tem uma meia vida sérica relativamente prolongada em comparação com a da IL-6 sozinha. Somente determinadas células do organismo, como as células B, têm IL-6Ralfa e gpl30, enquanto que muitas células adicionais têm somente o gpl30. 0 complexo IL-6/sIL-6Ralfa pode ligar-se a células somente com gpl30 e estimular a transdução de sinal. Consequentemente, a ativação indesejada de gpl30 em muitas células pode resultar da sobreprodução de IL-6 (Figura IA) . Portanto, anticorpos ou outras moléculas que bloqueiam estericamente a interação entre IL-6 e gpl30 podem ser particularmente úteis na supressão da sinalização indesejada da IL-6 (ver Figura 1B).

Antagonistas de IL-6 Bloqueando Estericamente a Interação com QD130

Assim, como mostrado na Figura 1B, a presente invenção contempla um antagonista de IL-6 que bloqueia estericamente a interação com gpl30 e cuja ligação a IL-6 não é afetada pela sIL-6Ralfa pré-ligada. Os "antagonistas de IL-6" da presente invenção incluem anticorpos ou fragmentos destes; 13 equivalentes funcionais de anticorpos; anticorpos modificados, tais como, anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos; ou outras proteínas ou moléculas capazes de se ligarem a ou de se associarem com IL-6 ou com o complexo IL-6/IL-6Ralfa para impedirem estericamente a ligação a gpl30.

Numa forma de realização preferida, o antagonista IL-6 da invenção contém uma região variável do anticorpo que se liga a uma região ou um epitopo na IL-6 ou no complexo IL-6/IL-6Ralfa de modo que a ligação bloqueia estritamente a interação entre IL-6 e gpl30. Mais preferencialmente, o antagonista IL-6 da invenção é um anticorpo. Por exemplo, a ligação da região variável do anticorpo a quaisquer regiões ou epitopos participando diretamente na interação entre o complexo IL-6/IL-6Ralfa e o gpl30 é suficiente para interferir estericamente com a ligação a gpl30. Adicionalmente, a ligação a quaisquer regiões ou epitopos adjacentes àqueles participando diretamente na interação pode ser suficiente para bloquear estericamente a interação entre IL-6/IL-6Ralfa e gpl30. Tais regiões ou epitopos podem existir na IL-6, IL-6Ralfa, ou como sítios compostos formados somente pelo complexo de IL-6 e IL-6Ralfa. Em particular, epitopos adequados cuja ligação pode bloquear estericamente a interação entre IL-6 e gpl30 incluem, mas não são limitados a, quaisquer epitopos incluindo pelo menos um dos seguintes aminoácidos: Leul9, Arg24, Lys27, Arg30, Tyr31 , Asp34 e Trpl57 de IL-6 humana.

Formação de Anticorpos que Bloqueiam Estericamente a Interação entre IL-6 e gp!30

Assim, uma importante característica da invenção é o isolamento de anticorpos que se ligam ao complexo IL-6/IL-6Ralfa e bloqueiam estericamente a interação IL-6/gpl30. Tais anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais. De 14 acordo com a invenção, tais anticorpos podem ser formados pelo método seguinte. Num primeiro passo, um rato, ratazana, coelho, ou outro mamifero é imunizado com uma composição de proteína compreendendo IL-6 e IL-6Ralfa. É preferível ter a IL-6 e IL-6Ralfa formando um complexo. Para facilitar a formação do complexo, IL-6 e IL-6Ralfa devem ser ligadas covalentemente por, por exemplo, reticulação química ou por conexão através de um ligante polipeptídico. Sem querer ser limitado pela teoria, o objetivo de uma tal imunização é que somente as superfícies expostas da IL-6 sejam ou superfícies ligadas pelo gpl30 ou sejam superfícies não neutralizantes. Anticorpos que são estericamente bloqueados pela IL-6Ralfa não devem surgir. Imunogénios particularmente preferidos incluem IL-6 ligada covalentemente e IL-6Ralfa solúvel, que podem ser formadas ligando IL-6 e IL-6Ralfa in vitro e depois tratando com um agente de reticulação química de acordo com procedimentos padrão, ou por expressão da IL-6 e IL-6Ralfa solúvel como uma proteína de fusão, preferencialmente anexada por um ligando, por exemplo como descrito por Peters et al. (J. Immunol., (1998) 161:3575-81. De acordo com a invenção, tipicamente, uma proteína de fusão imunogénica incluindo IL-6 e IL-6Ralfa inclui também uma porção adicional que facilita a apresentação do antigénio, tal como uma região Fc. A composição da proteína pode ser administrada a um mamífero com ou sem adjuvante de acordo com qualquer de uma diversidade de métodos. A composição pode ser administrada somente de uma vez, mas é preferencialmente administrada mais do que uma vez de acordo com calendário de doseamento padrão.

Como segundo passo, o antisoro policlonal é colhido do mamífero imunizado. 0 soro policlonal pode ser usado diretamente, ou pode ser purificado por afinidade de acordo 15 com métodos padrão. Alternativamente, o processo de formação de anticorpos monoclonais é iniciado. Aa células produtoras de anticorpos são removidas do animal imunizado, por exemplo por remoção cirúrgica do baço ou retirada por PBMCs e triagem subsequente. As células potenciais produtoras de anticorpos são depois imortalizadas por fusão com uma linha de células imortalizada de acordo com procedimentos padrão, clonadas em poços de microtitulação, e rastreadas quanto à produção de anticorpos que se ligam a imunogénio.

Numa outra forma de realização, como segundo passo, é gerada uma biblioteca de visualização por isolamento das células apropriadas de animais não imunizados ou imunizados seguida pelo isolamento dos ácidos nucleicos que codificam as regiões de anticorpo V, inserção dos ácidos nucleicos da região de codificação V nos fagos, leveduras, bactérias, ou outros sistemas genéticos de visualização replicáveis. Os membros da biblioteca são depois rastreados quanto a sua capacidade para se ligarem a complexos IL-6/IL-6Ralfa.

Em algumas formas de realização, como terceiro passo, os anticorpos produzidos por linhas de células monoclonais ou as regiões V do anticorpo anticorpo selecionadas a partir da biblioteca são opcionalmente sujeitas a rastreios secundários como se segue. Especificamente, os clones de anticorpo ou as regiões de anticorpo V são testados quanto à sua capacidade para se ligarem a IL-6 sozinha, para se ligarem a IL-6Ralfa sozinha, para se ligarem ao complexo IL-6/IL-6Ralfa, e quanto à sua capacidade para inibirem a interação entre um complexo IL-6/IL-6Ralfa e gpl30. A partir dos resultados destes testes, os anticorpos ou regiões de anticorpo V podem ser classificados em vários grupos: anticorpos neutralizantes que se ligam a IL-6 e 16 bloqueiam a interação com gpl30, anticorpos se ligam a IL-6Ralfa, anticorpos não neutralizantes que se ligam a IL-6, anticorpos neutralizantes que se ligam ao complexo IL-6/IL-6Ralfa mas não a IL-6 ou a IL-6Ralfa sozinhas e bloqueiam a interação com gpl30, e anticorpos neutralizantes que se ligam a IL-6 e bloqueiam a interação com IL-6Ralfa. Os anticorpos de cada classe exceto do último são esperados. Esses ensaios de ligação e sinalização são bem conhecidos na técnica da bioquimica das proteinas e transdução de sinal, e formas de realização especificas são pormenorizadas adicionalmente nos Exemplos.

Identificação de Anticorpos com Meia Vida Sérica de IL-6 não significativamente prolongada

Um efeito não desejado de anticorpos anti-IL-6 é que frequentemente prolongam a meia vida sérica de IL-6. 0 peso molecular de IL-6 é cerca de 25.000 Daltons, o que é bastante abaixo do limiar de depuração renal de 50.000 Daltons, enquanto que o peso molecular de um complexo anticorpo-IL-6 é mais de 150.000 Daltons. A formação de complexos anticorpo anti-IL-6 /antigénio geralmente tem o efeito de aumentar a meia vida sérica da IL-6 porque o peso molecular do complexo é maior que o limiar de depuração renal. Assim, a presente invenção fornece também métodos para identificar anticorpos que se ligam a IL-6 ou ao complexo IL-6/IL-6Ralfa mas não aumentam significativamente a meia vida sérica deIL-6. O método envolve, como primeiro passo, o isolamento de um painel de anticorpos anti-IL-6. Como segundo passo, os anticorpos são depois testados quanto ao seu efeito sobre a meia vida sérica de IL-6, por exemplo como se segue. A IL-6 é administrada a um animal como um roedor. É conveniente usar uma forma marcada de IL-6, como IL-6 radioativa. Um 17 anticorpo a ser testado é também administrado ao mesmo animal, preferencialmente por uma via diferente de administração. Como controlo negativo, é administrado PBS em vez do anticorpo ou da IL-6. Amostras de soro são obtidas a vários tempos após administração das proteínas, e testadas quanto aos níveis de IL-β e de anticorpo de acordo com técnicas padrão. Por exemplo, a IL-6 radiomarcada, iodada pode ser quantificada usando um contador de radiação, e o anticorpo pode ser detetado por um método de ELISA baseado na captura de IL-6.

Está contemplado que alguns anticorpos têm um perfile farmacocinético alargado em comparação com outros, e alguns anticorpos causam um aumento das farmacocinéticas da IL-6 enquanto que outros anticorpos causam somente uma extensão moderada ou mesmo nenhuma. Dependendo da aplicação específica, uma classe de anticorpos preferidos da invenção são aqueles que eles mesmos têm um perfile farmacocinético favorável, mas que não alargam significativamente o perfile farmacocinético da IL-6.

Sequências das Regiões Variáveis do Anticorpo As sequências das regiões de anticorpo V identificadas de acordo com os métodos descritos acima são caracterizadas usando métodos de sequenciação padrão conhecidos na técnica. Um método exemplificativo é descrito em pormenor no Exemplo 4. Sequências exemplificativas de anticorpos de cadeia pesada e de cadeia leve das regiões V que se ligam a IL-6 e bloqueiam a sua interação com gpl30 são mostradas na Figura 2. A Figura 2 ilustra também um alinhamento de sequências da região V do anticorpo identificadas de acordo com a presente invenção. A variação de posição entre as sequências é indicada com setas. As regiões CDR estão em carxas. 18

As regiões V da invenção podem ser configuradas com regiões contantes humanas para formar um anticorpo quimérico. Um anticorpo quimérico exemplificativo pode incluir as regiões VH e VL descritas na Figura 2 e as regiões constantes derivadas de IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl IgD, ou IgM. Alternativamente, os anticorpos da invenção podem ser expressos com regiões constantes de isotipos hibridos, como descrito na publicação PCT da WO 02/072605. As regiões V da invenção podem também ser configuradas como porções Fab, "minicorpos" sem o domínio de CH2, ou como porções Fv de cadeia simples. Estas últimas configurações são menores que os anticorpos inteiros e têm características de difusão aumentadas, que podem ser úteis em situações que requeiram eficiente penetração tecidual, tais como no tratamento de tumores que segregam IL-6.

Expressão

Os anticorpos e proteínas contendo as regiões variáveis de anticorpos da invenção são preferencialmente expressas em células de mamífero, tais como células NS/O, células CHO, células SP2/0, células BHK, ou outras células de mamífero. A expressão de anticorpos em células de mamífero é bem conhecida na técnica da engenharia de proteínas. Os anticorpos podem também ser expressos em células vegetais tais como milho ou tabaco, células de inseto tal como via de um vetor de baculovirus, células de fungos tais como S. cerevisiae ou Pichia pastoris, ou em células bacterianas, as quais são as mais úteis na expressão de configurações mais pequenas tais como moléculas Fv de cadeia simples.

Administração

Os antagonistas de IL-6 da invenção são usados no tratamento de uma variedade de doenças e distúrbios envolvendo a expressão de IL-6. Tais doenças e distúrbios 19 incluem, mas não são limitadas a, cancros tais como cancro da próstata independente de hormona, doença proliferativa da célula B tal como linfoma da célula B não-Hodgkin, e cancros em estado avançado do rim, mama, colon, pulmão, cérebro, e outros tecidos; doenças autoimunes mediadas por anticorpo tais como arterite reumatóide, miastenia grave, lupus sistémico eritematoso, e outras doenças autoimunes; ou osteoporose. As moléculas da invenção podem também ser usadas para tratar caquexia em doentes de cancro, que muitas vezes resulta da sobreprodução de IL-6 e IL-6Ralfa pelos tumores.

Os antagonistas da invenção podem causar um efeito secundário de imunossupressão relacionado com o alvo, particularmente a inibição da formação de anticorpo. Quando um doente está a receber um anticorpo da invenção, é muitas vezes útil suplementar o tratamento com um agente antiinfecioso profilático. Esses tratamentos profiláticos são bem conhecidos na técnica do tratamento de doentes imunosuprimidos.

Um antagonista da invenção é tipicamente administrado por infusão, mas pode também ser administrado por injeção subcutânea, intradérmica, intramuscular, ou intraperitonial, inalação, ou administração oral. Para um adulto humano de 70 quilos, uma dose numa gama de cerca de 50 até 2000 miligramas é preferida, com uma dose na gama de 100-800 miligramas é mais preferido, e uma dose de cerca de 300-600 miligramas é o mais preferido. A dose precisa deve ser ajustada numa base doente a doente. Por exemplo, quando se trata um tumor sólido num doente, a eficácia de uma dada dose pode ser avaliada como se segue. A vários pontos após administração de um anticorpo da invenção, as biópsias do tumor são retiradas e testadas 20 quanto à ativação de gpl30, por exemplo por imunocoloração com um anticorpo anti-fosfotirosina apropriado. O objetivo é ter inibição continua, essencialmente completa da ativação de gpl30 no tumor. Se a inibição da ativação de gpl30 não for completa, a dose deve de ser aumentada ou a frequência da dosaqem deve ser aumentada.

Deve entender-se que as formas de realização acima descritas e os exemplos seguintes são dados como modo de ilustração, não de limitação. Várias mudanças e modificações no âmbito da presente invenção será obvia para os especialistas na técnica a partir da presente descrição. EXEMPLOS

Alguns dos seguintes exemplos ilustram o ambiente técnico da invenção como reivindicado.

Exemplo 1. Expressão de um complexo IL-6/IL-6Ralfa para uso como um antigénio

Os anticorpos formados que se ligam a uma superfície da IL-6 que interferem com a sua ligação ao gpl30 e estão acessíveis num complexo IL-6/IL-6Ralfa, uma proteína de fusão compreendendo um domínio Fc, os domínios extracelulares de IL-6Ralfa, e IL-6 são expressos a partir de um plasmídeo denominado pdCs-Fc-IL6Ralfa-IL6. A proteína de fusão é referida aqui como Fc-IL6Ralfa-IL6. O domínio Fc foi derivado de lgGY2a de rato, e IL-6Ralfa e IL-β são baseadas nas sequências humanas. A sequência desta proteína e o DNA que codifica esta proteína são mostrados a seguir.

Sequência da proteína de Fc-IL6Ralfa-IL6 (SEQ ID NO:37): 21

EPRGgTIKPÇggÇKÇPAgNLLGGPSVfXFgPKIKDVLMISLSglVTCVWPVSEDPPPVQ XSWrWMVEVHmqTQYfiREPY^STLRWSÃLFXQHQPWHSGKEFKCKVHNKDLPAPIER TXSKgKGSVRAPOVYVLPRPEESHYKKQVTLTCMVTDFMPEDXYVE^THÍjGKTELNYKNT εPVLSSDGSYrMYSKL·RVÊKKNWVERMSYSCSWRεGLBNHHTTK$rSRfPGSgdddddk 1PPEEPÇLSCFRKS PIjSNVVCEWGPRSTPSLTI^KAVLLVRKS^KS paejdeqepcqysqes QI^SCqXAVPEí^SSFYWSMCVJ^SVGSKFSiaJÕTFqSCGI^QPDBPABITVTAVAimP RWLSVTWQDPHSWHSSFYRLIdPELItYRAERSKTFYTWHVKDtqHHCVIHDAWSGLRHVVQ LRAgESFGqGEWSEWSPRftMGTFWTESRSPPArqqqqsqqqqsvepvppQEPSKPy^Ptf RQPL TSSERIDKQIR YILDGI SALRKETCNKSmCESSKEALAEmtNhFKMAZKDGCFQ SGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDA ITTFDPT tmãslltklqãqnqwlqdmt tblxlrs fkeflqsslralrqm

Sequência sublinhada: Fc IgGy de murino

Sequências em letra minúscula: ligante contendo local de clivagem de enteroquinase

Sequências a negrito: IL6Ralfa humana

Sequências em letra minúscula sublinhadas: ligante

Sequência a itálico: IL6 humana

Sequência de DNA que codifica Fc-IL6Ralfa-IL6 maduro (SEQ ID NO:38): 22

GAGGCCAGÃSGSGeCÃCimTCÃÃGCCCTeTCCÍCeÃTGCMA^GCCCãGCÃCeTMCCTG TTGGGTGGÃCCftTCCGTCTTCATCTTCCCTCCA^AGATCAAGGATGTAGTCATGATCTCC 5 CTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAG atcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagãg

GATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCECCCCATCCAGCAC-CAGGACTGGATG AGTGGCAAGGAGTTCAAATGCSAGGTCAACAACAAAGAGCTGCGAGGGCGCAtPCGAGAGA ACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCeACAGGJAfÃfGTCTfGCGTGCACGA 10 GAAGAAGAGiATGACTAAGAAACAGGTaftCTCTGàCCTGCA^GGTGACAGAeTTCAfGCCT GAAGAÇAfTTACGTGGAGTGGACCAACAAGGGGAAAACAGAGCTAAACfACÂAGAÁ:CACy GAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCMGCTGAGAGTGGAAAAG AAGMCTGGGTGGAMGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGSTCCACGAGGGTCTGCACAAT CACC.ACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACCCCGGGTTCAGGGGATGACGATGACGATAAG !'S GTtCCGCÇGGAGGAGGCGCAGCfGTGGTGCtTeCGGAAGAGCCCCCTCAGCAATGTTGTT TGTGAGTGGGGfCCtCGÔAGCACCCGAtGGCfGACGACAAAGGCTGTGCTCTXGGXGAGG AAGTTTCAGAACAGTCCGGCCGAAGACTfCCAGGAGCCGTGCCAGTATTCCCAGGAGTCC

ATGTGCGTCGCCAGTAGTGTCGGGAGCAAGTTCAGCAAAACTCAAACCTTTCAGGGTTGT 20 GGAATCTTGCAGCCfGATCCGCCTGCCAACATCACAGTCACTGCGGTGGGCAGAAAGeCC cgctggctcagtgtcacctggcaagacccccactcctggaactcatctttctãcagacta eGGTGTGAGCfCAGATAfCGGGCTGÀAÇGGTCAAAGACATTGAÇAAÇATGGATGGfCAAG GACCTCCAGCATCACTGTGTCATCCACGAC.GCCTGGAGCGGCCTGAGGCACGTGGTGCAG CTTCGTGCCCAGGAGGAGTTCGGGCAAGGCGAGTGGAGCGAGTGGAGCCCGGAGGCCATG 25 ggcacgccttggagagaatccaggagtcctccagctagagggggcgggggcagtgggggc gggggcagtgtagaaccggtacgcccaggagaagattccaaagatgtagctgccccacac

AGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGC ATCTCAGCGCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAG GCACTGGCAGAÃAACAACCTCAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGAXGCTTCCAA 30 TCTGGATTCAATGAGGAGACtTGGCTGGTGAAAATCATC&CTGGTCTTTTGGAGTTTGAG GTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTG CAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCA ATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAAC

CAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCtCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAG

TCCAGCCTGAGGGCTCffCGGCAAATGTAG 23

Para análise rápida da expressão da proteína para caracterizar o produto da proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6, o plasmídeo pdCs-Fc-IL6Ralfa-IL6 foi introduzido em células embrionárias de rim humano HEK 293 (ATCC# CRL-1573) por transfeção transiente usando lipofectamina (Invitrogen).

Para obter clones estavelmente transfetados os quais expressam Fc-IL6Ralfa-IL6, o DNA de plasmídeo apropriado foi introduzido nas células do mieloma de rato NS/0 por eletroporação. As células NS/0 foram crescidas em meio de Eagle modificado da Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor, 2 mM de glutamina e penicilina/estreptomicina. Cerca de 5xl06 células foram lavadas uma vez com PBS e resuspendidas em 0,5 mL de PBS. 10 pg de DNA de plasmídeo linearizado foram depois incubados com as células numa Cuvete Gene Pulser® (0,4 cm de distância entre os elétrodos, BioRad) sobre gelo durante 10 min. A eletroporação foi realizada usando um Gene Pulser® (BioRad, Hercules, CA) com definições a 0,25 V e 500 pF. As células foram deixadas a recuperar durante 10 min sobre gelo, após os quais foram resuspendidas em meio de crescimento e plaqueadas para duas placas de 96 poços. Os clones estavelmente transfetados foram selecionados pelo seu crescimento na presença de 100 nM de metotrexato (MTX), o qual foi adicionado ao meio de crescimento dois dias após a transfeção. As células foram alimentadas todos os 3 dias por mais duas ou três vezes, e os clones resistentes a MTX apareceram em 2 até 3 semanas. O sobrenadante dos clones foi analisado por ELISA anti-Fc para identificar os altamente produtores. Os clones altamente produtores foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo 100 24 nM de ΜΤΧ. Ο meio de crescimento tipicamente usado foi H-SFM ou meio CD (Life Technologies). A proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6 foi subsequentemente capturada do meio para análise adicional. Para caracterização de rotina por gel de eletroforese, a proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6s segregada para o meio foi capturada em grânulos de Proteína A Sepharose® (Repligen, Cambridge, MA) e depois eluída por fervura da amostra num tampão de amostra de proteína, com ou sem um agente de redução tal como β-mercaptoetanol. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e as bandas de proteína foram visualizadas por coloração de Coomassie.

Será reconhecido pelos especialistas na técnica que qualquer de uma variedade de proteínas pode ser usada como alternativas à proteína Fc-IL6Ralfa-IL6 descrita acima. Por exemplo, outras configurações de IL-6Ralfa e IL-6 podem ser usadas, tais como IL-6Ralfa-IL-6-Fc, albumina-IL-6Ralfa-IL-6, citocina-IL-6Ralfa-IL-6, em que é escolhida a citocina para estimular uma resposta imune contra o complexo IL-6/IL-6Ralfa. Proteínas compreendendo uma citocina, uma porção Fc, e um complexo IL-6Ralfa/IL-6 podem também ser usadas, por exemplo, de acordo com os métodos de Gillies et al. (WO01/07081). Finalmente, as IL-6 e IL-6Ralfa podem ser produzidas separadamente, quimicamente reticuladas, e usadas como um antigénio. Quando a porção Fc e/ou uma porção citocina secundária são usadas, é geralmente vantajoso que estas porções sejam do animal que está a ser imunizado, por exemplo um rato.

Na preparação para a caracterização dos anticorpos descritos a seguir, DNAs que codificam Fc-IL6 e Fc-IL6Ralfa foram construídos de modo semelhante como descrito acima. 25

As proteínas correspondentes foram purificadas de modo semelhante ao descrito acima. Adicionalmente, IL-6 humana, IL-6Ralfa humana, e gpl30-Fc humano foram comprados na R&D Systems, Inc. para uso em determinadas experiências a seguir. As representações esquemáticas destas proteínas usadas nas experiência são mostradas na Figura 3. A proteína e as sequências de DNA das construções relevantes são fornecidas como a seguir.

Fc-IL6Ralfa Matura (SEQ ID NO:39)

EPVLDSOGSXFM^SKLRVEKKNWVERÍÍSVSCSVVHEGLHiíHHTTKSFSRTPGSGDDODDK

LRAQBE FGQGEWSEWS PEAMGT PWTESRS PPA 26 DNA codificando Fc-IL6Ralfa matura (SEQ ID NO:40)

GAGCCCAGAGGGCCCACAATCftAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCftGCACCTAACCTC

TTGGGTGGACCATCCGTCTTCATOTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCC

CTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAG

ATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAG

GATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATG

AGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGA

ACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCAOCA gaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcct gaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacact gaacgagtcctggactctgatggttcttacttcatgtagagcaagctgagagtggaaaag

AAGAÃCTGGGTGGÁAAGAÃATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCrGCAGAAT

CACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACOCCGGGTTCAGGGGATGACGATGACGATAAG

CTTCeCCCCGAGGAGCCCCAGCTCTCCfGCTTCCGGAAGAGCCCCCTCAGCAATGTTGTT

TGTGAGTGGGGTCCTCGGAGCACCCCATCCCTGACGACAAAGGCTGTGCTGTTGGTGAGG

AAGTTTCAGAACAGTCCGGCCGAAGACTTCCAGGAGCCGTGCCAGTATTCCCAGGAGTCC

CÀGAAGTTCTCCTGCCAGTTAGCAGTCCCGGAGGGAGACAGCTCTTTCTACATAGTGTCC

ATGTGCGTCGCCAGTAGTGTCGGGAGCAAGTTCAGCAAAACTCAAACCTTTCAGGGTTGT

GGAATCTTGCAGCCTGATCCGCCTGCCAACATCACAGTCACTGCCGTGGCCAGAAACCCC

CGCTGGCTCAGTGTCACCTGGCAAGACCCCCACTCCTGGAACTCATCTTTCTACAGACTA

CGGTTTGAGCTCAGATATCGGGCTGAACGGTCAAAGACATTCACAACATGGATGGTCAAG

GACCTCCAGCATCACTGTGTCATCCACGACGCCTGGAGCGGCCTGAGGCACGTGGTGGAG

CTTCGTGCCCAGGAGGAGTTCGGGCAAGGCGAGTGGAGCGAGTGGAGCCCGGAGGCCATG

GGCACGCCTTGGACAGAATCGAGGAGTCCTCCAGCTTAG

Fc-IL6 Matura (SEQ ID NO:41)

EPRGPTIKPCPPGKCPAPNU^PSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQ

ISWFVNNVBVHTAQTQTHREDlfNSTLRWSAI,PIQHQDÍÍMSGKEFKCKVNNKDl,PAPIER

TISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVrDFMPEOIYVEWTNNGKTELííYKNT E PVLDS DGS Y FMY S KLRVEKKN WVERKSY SCS WHEGLHNHHTT KS FSRTPGKEDS KDVA APHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALABNNLNLPKMAEKDG 27

CPQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQHRFESSEBQARAVQMSTKVLIQríMlKíiaKN LDA ITTPDPTTMASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM DNA codificando Fc-I6 matura (SEQ ID NO:42)

GAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTA.ACCTC

TTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCGCTCCAAftJSATCAAGGATGTACTCATGATCTCC ctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccag

ATCAGCTGGTTTGTGAACARCGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATRGAGAG

GATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATG

AGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGA

ACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCA

GAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCT

GAAGACRTTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACfACAAGAACACT

GAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAG

AAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAAT

CACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACCCCGGGTAAAGAAGATTCCAAAGATGTAGCT

GCCCCACACAGACAGCCA.CTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATC

CTCGACGGCATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGC agcaaagaggcactggcagaaaacaacctgaaccttccaaagatggctgaaaaagatgga

TGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTGAAAATCATCACTGGTCTTTTG

GAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCC

AGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAAT

CTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGAÇGAAGCTGCAG

GCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAG

TTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAG

Exemplo 2. Imunização com um complexo IL-6/IL-6Ralfa.

Vinte ratos (Balb/C) foram imunizados com a proteína Fc-IL6Ralfa-IL6 produzida como descrito no Exemplo 1, e os anticorpos monoclonais desta proteína foram produzidos de acordo com uma modificação do método de Kohler e Milstein (1975) (Nature. 256:495-7). Especificamente, 1 micrograma de Fc-IL6Ralfa-IL6 foi injetado subcutaneamente com 100 28 microlitros de adjuvante de Freund completo. As injeções foram repetidas 14 dias mais tarde, usando 1 micrograma de proteína injetada intraperitonealmente com 100 microlitros de adjuvante de Freund incompleto. 24 dias após a primeira injeção, os ratos foram reforçados com 1 micrograma de proteína Fc-IL6Ralfa-IL6 em 100 microlitros de PBS intravenosamente. Três dias mais tarde os ratos foram sacrificados e os baços excisados, e as células do baço cultivadas de acordo com procedimentos padrão. 435 milhões de células de baço de dois ratos com muito fortes respostas anti-IL6Ralfa/IL6 policlonais foram fundidas com 175 milhões de células NS/0 a uma taxa de 2,4 células de baço para 1 célula NS/0. Células híbridas imortalizadas de célula B/NS/0 foram produzidas de acordo com procedimentos padrão, e os hibridomas foram depois rastreados quanto à produção de anticorpos contra a proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6 usando Tecnologia ELISA.

Exemplo 3. Rastreio de anticorpos que bloqueiam a interação entre o complexo IL-6/IL-6Ralfa e gp!30

Ligação

Clones positivos do Exemplo 2 foram adicionalmente testados como se segue. Os isotipos do anticorpo foram determinados, e os clones de base IgM não foram caracterizados adicionalmente. Os anticorpos monoclonais de base IgG foram testados quanto à sua capacidade para se ligarem tanto a IL-6 como a IL-6Ralfa usando Fc-IL6 imobilizada e Fc-IL6Ralfa de acordo com procedimentos padrão. Alguns clones ligados a IL-6, alguns ligados a IL-6Ralfa, e alguns ligados a nenhumas proteínas, sugerindo que estes monoclonais devem reconhecer alguma porção do ligante ou devem reconhecer epitopos compostos consistindo de ambas as porções IL-6 e IL-6Ralfa. 29

Resultados exemplificativos das caracteristicas de ligação dos anticorpos típicos da invenção são mostrados na Figura 4 (ligação a Fc-IL6Ralfa-IL6), Figura 5 (ligação a IL-6), Figura 6 (ligação a IL-β e IL-6Ralfa não covalentemente complexada), e Figura 7 (IL-6Ralfa sozinha). Os resultados indicam que, para este conjunto de anticorpos, a ligação a IL-6 e a ligação covalente a IL-β e IL-6Ralfa foi semelhante, a ligação a um complexo IL-6/IL-6Ralfa não covalente deu um sinal menos forte (possivelmente devido a dissociação de IL-6 de IL-6R durante os passos de lavagem), e a ligação a IL-6Ralfa sozinha não pôde ser detetada.

Testes de Competição

Para caracterizar adicionalmente os anticorpos que reconhecem IL-6, os seguintes testes de competição foram realizados. Primeiro, a capacidade de anticorpos monoclonais para inibirem a interação entre Fc-IL6Ralfa-IL6 e gpl30-Fc foi testada. Os ensaios de inibição foram realizados com base nos métodos descritos por Scheller et al. J. Immuno. Methods. 291:93-100 (2004). Foram identificados quatro anticorpos, chamados Mab#195, Mab#309, Mab#471, e Mab#476 que bloqueiam esta interação. Segundo, a inibição da interação entre Fc-IL6 e Fc-IL6Ralfa pelos anticorpos foi testada. Em nenhum dos anticorpos foi verificada inibição desta interação, o que era esperado com base no fato de os anticorpos derivados de uma imunização com Fc-IL6Ralfa-IL6 e submetidos a um rastreio inicial quanto à ligação a Fc-IL6Ralfa-IL6.

Resultados tipicamente ilustrativos da inibição da interação entre Fc-IL6Ralfa-IL6 e gpl30-Fc são mostrados na Figura 8. 30

Ensaio com base em células

Os anticorpos Mab#195, Mab#309, Mab#471, e Mab#476 foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a libertação de haptoglobina pelas células HepG2 estimuladas com um complexo Fc-IL6Ralfa-IL6. A haptoglobina é uma proteina segregada pelas células do figado durante estádios inflamatórios. As células HepG2 são uma linha de células de figado. A libertação de haptoglobina pelas células HepG2 fornece um ensaio conveniente para a atividade dos complexos IL-6Ralfa/IL-6. O ensaio foi realizado como se segue. Células HepG2 foram plaqueadas a 0,1 x 106 células por poço numa placa de 96 poços, e deixadas crescer em DMEM suplementado com 10% de meio de Soro Bovino Fetal (FBS) durante a noite. As células foram depois lavadas com PBS, e incubadas em meio de subalimentação, DMEM sem FBS, durante 1 hora a 37°C. As células foram depois incubadas em meio de estimulação, DMEM (sem FBS) na presença de 8 ng/mL de complexo Fc-IL6Ralfa-IL6, e suplementado com várias concentrações de anticorpo de teste durante 22 horas. Os sobrenadantes foram retirados e os níveis de haptoglobina foram determinados por um ELISA para deteção de haptoglobina. Um procedimento padrão de ELISA foi seguido, usando um anticorpo haptoglobina anti-humano de caprino (Sigma #H5015) para captura, um anticorpo de haptoglobina anti-humano de rato (US Biological #H1820-05) como um anticorpo primário e um anticorpo IgG-HRP anti-rato (Promega #W402B) como um anticorpo secundário. Resultados típicos são mostrados na Figura 9.

Análise Biacore A ligação dos anticorpos Mab#195, Mab#309, Mab#471, e

Mab#476 ao IL-6 foi quantitativamente caracterizada usando uma máquina Biacore. Os anticorpos foram imobilizados num 31 chip; a proteína IL-6 foi passada por um chip, e foram medidas as taxas de entrada e de saída. Os seguintes resultados foram obtidos.

Parâmetros Mab#l95 Mab#30 9 Mab#471 Mab#4 7 6 ka (1/Ms) 2,4 x 10° n O \—1 X OO 1,8 x 10b 2,5-2,6x10b Kd (1/s) Ό O \—1 X 00 ^r1 1 O \—1 X \—1 V \—1 -O O \—1 X \—^ 1,2-2, 6x10”4 KD (pM) 2000 135 7,5 47-10b

Inibição de proliferação de linhas de células cancerígenas Os anticorpos da invenção foram testados quanto à sua capacidade para inibir a proliferação de células A431 e células LP-1. A inibição da proliferação de células LP-1 é descrita no Exemplo 8. A inibição da proliferação de A431 foi medida como se segue. No dia 1, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 25.000 células/poço em DMEM contendo 10% de FBS, com 200 microlitros por poço. No dia 3, as células foram lavadas uma vez com 200 microlitros de PBS. As células foram subalimentadas durante uma hora a 37°C em 100 microlitros de DMEM.

No dia 3, foram preparadas diluições dos anticorpos anti-IL-6 em placas 96 de fundo em U em DMEM contendo IL6Ralfa-IL6-His6 (33 ng/mL), com todas as proteínas preparadas com diluição de 2X dado que foram mais tarde transferidas para placas contendo as células. Os controlos incluíram DMEM, DMEM-1% de FBS, e IL6Ralfa-IL6-His6 em 0% de FBS. As placas foram incubadas com as diluições das proteínas durante 1 h a 37°C, após o que 100 microlitros de misturas de proteína foram transferidos para as células não alimentadas.

No dia 5, as células em cada poço foram lavadas duas vezes com 200 microlitros de PBS, e depois 100 microlitros de uma 32 solução para medir a fosfatase ácida. A solução foi acetato de sódio 0,1 M a pH 5,5, 0,1 % de Triton X-100, 2,5 mg/mL de paranitrofenilfosfato. As placas foram incubadas a 37°C durante 1 hora, após o que a reação foi parada com 100 microlitros de NaOH 0,1 N, e a placa foi lida a 410 nm.

Resultados típicos estão ilustrados nas Figuras 10A1 10B-1 e 10B-2. Como mostrado nas Figuras 10B-1 e 10B-2, os anticorpos da invenção inibem a proliferação de células de carcinoma epitelial humano A431 vistas com estimulação pela proteína de fusão IL-6/IL-6Ralfa. Um resultado típico de proliferação das células A431 estimulada pela proteína de fusão IL-6/IL-6Ralfa é mostrada na Figura 10A.

Exemplo 4. Sequências da região V de anticorpos que se ligam a IL-6 e bloqueiam a interação com gpl30.

As sequências da região V dos anticorpos monoclonais Mab#195, Mab#309, Mab#471, e Mab#476 foram determinadas de acordo com procedimentos padrão. O mRNA de cada clone de hibridoma foi purificado usando o kit Dynabeads Direct mRNA (Dynal) seguindo as instruções do fabricante. Realizou-se o PCR de Transcrição Reversa (RT-PCR) para obter cDNA usando o kit de síntese de cDNA BD SMART (BD Clontech) de acordo com o manual do fabricante. Dois PCRs sucessivos foram realizados usando o cDNA como modelo, oligonucleótidos com iniciadores internos e a KOD polimerase (EMD Biosciences) conforme indicado pelo fabricante. Os oligonucleótidos 3' eram específicos para amplificar VH e Vk de um anticorpo IgGyl de rato enquanto os oligonucleótidos 5' eram oligonucleótidos com iniciadores internos do kit de síntese de cDNA BD SMART(TM) (sequências adicionadas a 5' durante o RT-PCR). 33

Por exemplo, as regiões V de cadeia pesada e de cadeia leve foram obtidas por amplificação por PCR usando um primer de região constante e um primer da região V com as sequências de oligonucleótidos e as condições indicadas a seguir.

Amplificação VH: PCR# 1 5' Oligonucleoti.de #1: 5" ACAACGCAGAGTACGCGG 3' {SEQ ID NO; 4 3} 3' 01igonucleótide #1: 5' AGGAGAGCTGGGAAGGTGTG 3' {SEQ ID NO;44) PCR#2 5' 01igonucleotide#2: 5' ACAACGCAGAGTACGCGG 3' (SEQ ID NO:45) 3' Oligonucleotide 12: 5' TAGCCCTTGACCAGGCATCCC 3' (SEQ ID NO:46}

Amplificação Vk: PCR#1 5' Oligonucleotide *1: 5' ACAACGCAGAGTACGCGG 3' (SEQ ID NO:47)

3' Oligonucleotide #1: 5' CTGCCATCAATCTTCCACTTGAC 3* (SEQ IS »0:48} PCR#2 S* 01igonucleotide#2: 5' CATCCTCTCTTCCAGCTCTC 3* (SEQ ID NO:49} 3' Oligonucleotide #2: 5' CTGAGGCACCTCCAGATG 3' (SEQ ID NO:50)

PCR #1 2min 94°C

PCR#2 2min 94°C

30 seg 90°C 30 seg 65°C x 30 30 seg 72°C

30 seg 90°C 30 seg 65°C x 40 30 seg 72°C

72 °C

72 °C 34

Os produtos de PCR foram purificados a partir do gel de agarose usando o kit de extração de gel QIAguick (QIAGEN) e subclonados no vetor pCR4 TOPO rombo (Invitrogen) para sequenciação. As sequências foram obtidas usando primers T7 e T3 e procedimentos de sequenciação padrão.

As sequências de cadeia leve e cadeia pesada incluindo as sequências da região V de Mab#195, Mab#309, Mab#471, e

Mab#476 são mostradas a seguir.

MAb #195 região madura VH (SEQ ID NO:33) BVKLBESGGGLVQPGGSMKLSCVASG FT FSN YWMHWVRQS PEKGLEWVAEIRLKSNNYAT t HYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMHNLRAEDTGnnfCTREDYYGYPDYWGQGTTLTVSS MAb #195 região madura VK (SEQ ID NO:29)

DIVLTQS PASIAVSLGQRATISCRASESVDSFGIS FMNWFQQKPGQPPKLLIYVASHQG GVPARFSGSGSGTDFSLNIHmEEDDTAMYFCQQSKBVPWTFGGGTKLEIK MAb #309 região madura VH (SEQ ID NO:34)

EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSim$MNWVRQSPEKGLEWVA£IRLKSNKGAT

HYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNMLRAEDTGIYYCâSLLYDGYIíHWGQGTLVTVSA

MAb #309 região madura VK (SEQ ID NO:30) DIVLTQSPASIAVSLGQRATISCRASESVGNFGISFMHWfFCMKPGQPPKLLIYTASNQGS

GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMYFCQQSKEVPWTFGGGfKLEIK MAb #471 região madura VH (SEQ ID NO:35)

EVKFEESGGGLVQPGGSMKLSCVASG FS FSHY WMN&JVRQS PEKGLEWVAEIRLT SNKQAI YYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMflNLRAEDTGIYYCASLFYDGYLHWGQGTLVTVSA MAb #471 região madura VK (SEQ ID NO:31) 35 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVGNFGXSFMKWPQQKPGQPPKLl.iyTASNQGS GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDSAMYPCQQSKEIPWT PGGGTKLEIK MAb #476 região madura VH (SEQ ID NO:36)

EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAMMDHVRQSPEKGLEiWAElRSKANNHAT

YYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLSAEDTGIYYCTTPTLYGAMDYWeQGTSVTVSA MAb #476 região madura VK em (SEQ ID NO:32)

DIVLTQSPASIAVSLGQRATISCRASESVHNPGJSFMSWFQQKPGQPPKLLIYTASNQGS

GVPARFSGSGSGTOFSLNIHPVEEDDTAMYFCQQGKEVPWTP6GGTKLEXK

Codificação de DNA mAb #195 da região madura VH (SEQ ID NO:51)

GAÂGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTC TCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCT CCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAACA CATTAT G C GGAG T C T G T GAAAGGGAGGTTCACC ATCTC AAGAG ATG ATTCCAAAAGTAGT GTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGG GAGGACTACTACGGCTACCCTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

Codificação de DNA mAb #195 da região madura VK (SEQ ID NO:52)

GACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGTCAGAGGGCCACC

ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATAATTtTGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTC

CAACAGAAACCTGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGTTGCATCCAACCAAGGATCC

GGGGfCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT

CCTATGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGGTTCCGTGG

ACGTYCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA 36

Codificação de DNA mAb #309 da região madura VH (SEQ ID NO:53)

GAAGTGAAACTTGAGG&GTCTGGAGGAGGCTTGGTTCAACCTGGAGGATCCATGAAACTC

TCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTARCTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCT

CCAGAGAAGGGGCTXGAGTGGGTTGCTGAAATTAGACTGAAATCTAATAAGGGTGCAACA

CATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCXCAAGGGATGATTCCAAAAGTAGT

GTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTGCCAGC

CTTTTGTAfGATGGTTACTTACATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

Codificação de mAb #309 da região madura VK (SEQ ID NO:54) gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc atctccxgcagagccagcgaaagtgttggtaattttggcattagttttatgaattggttc

CAACAGAAACCAGGACA6CCACCCAAACTCCTCATCTATACTGCATCCAACCAAGGATCC

GGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCMCATCCAT

CCTATGGAGGAGGATGATTCTGCAAXGTATTTCTGTCAGCAAAGTAÃGGAGGTTCCGTGG

ACGTTCGGTGGAGGCACCAAACXGGAAATCAAA

Codificação de DNA mAb #471 da região madura VH (SEQ ID NO:55)

GAAGTGAAGTTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCGGGAGGATCCATGAAACTC

TCCTGTGTTGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCT

CCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATT6ACATCTAATAAGCAGGCAATA

TATTATGCGGAGTCTGTGAAAGGGAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGT

GTCTACCTGCAAATGAACAACCTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTGCCAGC

CTTTTCTATGATGGTTACTTACATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA 37

Codificação de DNA mAb #471 da região madura VK (SEQ ID NO:56)

GACATTGTGeTGACCCAATeTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACC

ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGGTAATTTTGGCATTAGTTTTATGAACTGGTTC

CAACftGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATACTGCATCCAACCAAGGATCC

GGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT

CCTATGGAGGAGGATGATTCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAGGAGATTCCGTGG

ACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAA

Codificação de DNA mAb #476 da região madura VH (SEQ ID NO:57)

GAAGTGAAGCTTGAGGAGXCTGGAGGASGCTTGGTGCAACCTGGAGGAtCCATGAAACTC

TCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCT

CCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGTAAAGCTAATAATCATGCAACA

TACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTÇCAAAAGTAGT GTCTACCTGCAAATGAACAGCCTAAGAGCTGAASACACTGGCATTTATTACTGTACGACÇ

CGTACTCTCTATGGCGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCTGCA

Codificação de DNA mAb #476 da região madura VK (SEQ ID NO:58)

GACATTGTGCTGAGCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTTGGGCAGAiGGGCCACC

ATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTCATAATTTTGGCATTAGCTTTATGAACTGGTTC

CAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTÇATCTATACTGCATCCAACCAAGGATCC

GGGGTCCCTGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT

CCTGTGGAAGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAACAAGGTAAGGAGGTTCCGTGG

ACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC

As sequências das regiões V foram alinhadas como mostrado na Figura 2. As variações de posição entre as sequências são indicadas por setas. As regiões CDR estão em caixas. Com base no alinhamento, é evidente que cada anticorpo representa um isolado independente, e que os anticorpos são semelhantes uns aos outros. Os anticorpos 309 e 471 são estreitamente relacionados, com somente uma substituição na 38 cadeia leve, uma substituição Ile/Val na posição 98/ e somente seis substituições na cadeia pesada. Estes anticorpos podem derivar de um clone original IgM que se diversifica através de mutação somática e assim não devem ser verdadeiramente independentes.

Os anticorpos 195 e 476 são mais semelhantes uns aos outros do que os anticorpos 309 e 471. Os anticorpos 195 e 476 diferem nas posições 5 na cadeia leve e nas posições 18 na cadeia pesada. A análise da CDR3 na cadeia pesada dos anticorpos 195 e 476 sugerem que estas cadeias foram formadas por eventos de junção de V-D-J independentes e assim representam anticorpos que derivam de parentes IgM independentes. Portanto, as sequências de anticorpos na Figura 2 representam pelo menos 3 seleções independentes de anticorpos que ligam a IL-6 humana e bloqueiam a interação com gpl30.

Exemplo 5. Propriedades farmacocinéticas dos anticorpos que se ligam a IL-6 e bloqueiam a interação com gp!30. A meia vida sérica dos anticorpos 195 e 476 em ratos foi determinada. Os anticorpos 195 e 476 foram marcados com 125I de acordo com procedimentos padrão. Cerca de 25 microgramas de proteina de anticorpo marcado foram injetados intravenosamente em ratos Balb/C, e foram retiradas amostras de sangue em vários tempos incluindo 12, 24, 48, e 72 horas após injeção. Os níveis de radioatividade em todas as amostras de sangue foram determinados. Com base nesta análise, a eliminação da meia vida foi cerca de 5 dias para cada anticorpo. Dados exemplificativos são mostrados na Figura 11. 39

Exemplo 6. Inibição in vivo da secreção de haptoglobina Os anticorpos da invenção foram selecionados especificamente quanto à sua capacidade para inibir a ligação de IL-6 à subunidade recetora gpl30. Nesta experiência, usando um ensaio de medida de secreção de haptoglobina induzida pela administração de um complexo IL-6Ralfa/IL-6 solúvel, a capacidade do anticorpo Mab#471 e um anticorpo anti IL-6 comercial para bloquearem a ativação de um passo dependente de gpl30 in vivo foi comparada.

No dia 0, fêmeas de ratos Balb/C com nove semana (n=3 por grupo de tratamento) foram injetadas intraperitonealmente com 100 μρ do anticorpo Mab#471 ou de um anticorpo anti-IL-6 comercial da R&D Systems (R&D Systems MAb #206) num volume de 200 μΐ. Os ratos nos grupos de controlo positivo e negativo receberam 200 μύ de PBS. Após 24 horas, aos ratos nos grupos experimental e de controlo positivo foram administrados 4 μρ de muFc-IL6Ralfa-IL6 intraperitonealmente num volume de 200 μύ para induzir a secreção de haptoglobina, e aos ratos no grupo de controlo negativo foram administrados 200 μύ de PBS. Às 0, 8, e 24 horas após tratamento, aproximadamente 100 μύ de sangue foram obtidos de cada rato por hemorragia retro-orbital, e a fração de plasma foi isolada. A concentração de haptoglobina na fração de plasma foi determinada usando um kit ELISA de haptoglobina de murino (Immunology Consultants Laboratory, Inc., Newberg, OR, Cat # E90HPT), seguindo as instruções do fabricante.

Como mostrado na Figura 12, os niveis de haptoglobina em ratos tratados com anticorpo Mab#471 foram significativamente menos, cerca de 30% do nivel visto no grupo de controlo positivo às 24 horas, e também 40 significativamente menores que em ratos tratados com o anticorpo comercial MAb #206. Os niveis de haptoglobina aumentados vistos em ratos do grupo de controlo negativo foram igualmente devidos à irritação causada pelo procedimento de sangramento retro-orbital repetido. Portanto, a atual inibição da secreção de haptoglobina causada especificamente por Fc-IL6Ralfa-IL6 é ainda maior que 70%, quando a base da secreção de haptoglobina vista nos ratos de controlo é subtraída. Estes resultados demonstram que o anticorpo da invenção, por exemplo, anticorpo #471, que se liga a IL-6 e bloqueia a sua interação com a subunidade do recetor gpl30, é eficaz na inibição dos passos de sinalização dependente de gpl30 que pode ser ativada por um complexo IL-6Ralfa/IL-6 préformado.

Exemplo 7. Atividade antitumor in vivo

Os anticorpos Mab#195, Mab#309, Mab#471 e Mab#476 foram testados quanto à atividade antitumoral in vivo. Um modelo de metástase pulmonar foi implementado em ratos SCID usando células PC3-MM2 as quais segregam IL-β e para as quais IL-6 é um fator de crescimento. Cerca de 2,0 x 106 células PC3-MM2 foram injetadas i.v. em cada rato. Após 11 dias os ratos foram tratados com cinco doses diárias de 5 μρ/ιηΕ dos anticorpos monoclonais Mab#195, Mab#309, Mab#471 e Mab#476. Os resultados típicos são mostrados na Figura 13. Como ilustrado na Figura 13, os anticorpos Mab#195, Mab#309, Mab#471 e Mab#476 inibem as metástases pulmonares em ratos.

Outra experiência foi feita usando tratamento de anticorpo somente 5 dias após injeção das células, em vez dos usuais 10 dias. Resultados semelhantes foram obtidos. 41

Exemplo 8. Construção de anticorpos anti-IL-6 com regiões constantes humanas.

Um anticorpo quimérico contra IL-6 que inclui as regiões V do anticorpo Mab#471 e as regiões constantes humanas foi construido por técnicas como descrito na Patente U.S. No. 6, 969, 517, para Gillies et al. . As sequências de DNA que codificam as regiões V de Mab#471 foram obtidas por amplificação de PCR usando os seguintes oligonucleótidos. As regiões em minúsculas são para adaptadores a as regiões a maiusculas são a região V especifica. VL direto (com sitio Afl II): cttaagcGACATTGTGCTGACCCAATC (SEQ ID NO:59) VL reverso (com sitio Bgl II site): agatctacttacgTTTGATTTCCAGTTTGGTGCC (SEQ ID NO: 60) VH direto (com sitio Afl II) : cttaagcGAAGTGAAGTTTGAGGAGTC (SEQ ID NO: 61) VH reverso (com sitio Hind III): aagcttacttaccTGCAGAGACAGTGACCAG (SEQ ID NO: 62)

As sequências derivadas de rato resultantes foram inseridas num vetor de expressão de anticorpo como descrito na Patente U.S. No. 6,969,517, Exemplo 3, para gerar um plasmídeo de expressão codificando um anticorpo quimérico com uma cadeia leve de kappa humano e cadeia pesada de IgGI humano.

Com vista a obter clones de células humanas transfetadas estavelmente, o DNA de plasmideo foi introduzido nas 42 células NS/O de mieloma de rato por eletroporação como descrito a seguir. As células NS/O foram crescidas em meio de Eagle modificado da Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de bovino. Cerca de 5xl06 células foram lavadas uma vez com PBS e resuspendidas em 0,5 mL de solução de tampão fosfato (PBS) . Dez μρ de DNA de plasmideo linearizado foram depois incubados com as células numa

Cuvete Gene Pulser® (0,4 cm de distância entre os elétrodos, BioRad) durante 10 minutos em gelo. A eletroporação foi realizada usando um Gene Pulser® (BioRad) com as configurações de 0,25 V e 500 pF As células foram deixadas recuperar durante 10 minutos em gelo, após os quais foram resuspendidas em meio de cultura e depois plaqueadas para duas placas de 96 poços. Os clones transfetados estavelmente foram selecionados quanto ao crescimento na presença de 100 nM de metotrexato (MTX) , os quais foram introduzidos dois dias após transfeção. As células foram alimentadas todos os 3 dias por mais duas até três vezes, e os clones resistentes a MTX apareceram em 2 até 3 semanas. Os sobrenadantes dos clones foram analisados por Fc ELISA anti-humano para identificar os altos produtores (Gillies et al. (1989) J. Immunol. Methods. 125:191 ). Os clones de alta produção foram isolados e propagados em meio de crescimento contendo 100 nM de MTX.

Para confirmar que o anticorpo 471 quimérico retinha as propriedades desejadas, esta molécula foi testada quanto à inibição da produção de haptoglobina in vitro, como descrito no Exemplo 6 acima; para a inibição da proliferação das células de mieloma LP-1; e para inibição da produção de haptoglobina in vivo, como descrito no Exemplo 6 acima. Como controlos, os anticorpos anti-IL-6 Mab 206 (R&D Systems; Minneapolis, Minnesota) e CNTO-328 43 (Zaki Μ. H. et al., Int. J. Câncer. (2004) 111 :592-5) foram usados.

Os efeitos do anticorpo 471 quimérico (Ch anti IL-6 #471) produzido a partir de uma linha de células transfetadas estavelmente na secreção de haptoglobina são indicados na tabela a seguir. Foram obtidos resultados semelhantes a partir do anticorpo 471 quimérico produzido a partir de células trasfetadas transientemente.

Inibição de Haptoglobina IC50 (ng/mL) AVG SD Repetições Ch anti IL-6#471 + IL-6 1,89 0,42 2 Mab 206 + IL-6 16, 08 12,48 2 Ch anti IL-6CNTO-328 + IL-6 5,19 0, 88 2 Ch anti IL-6#471 +IL-6Ra-IL-6 i, il 0,57 3 Mab 206+IL-6Ra-IL-6 2,64 3 Ch antiIL-6CNTO-328 +6Ra-IL-6 >333 0, 00 3

Os resultados indicam que o anticorpo quimérico 471 é eficiente na inibição da função tanto da IL-6 como da proteina de fusão IL-6/IL-6Ralfa. Em contraste, o Mab#206 é relativamente ineficiente na inibição da secreção de haptoglobina estimulada tanto pela IL-6 como pela proteina de fusão IL-6/IL-6Ralfa, e CNTO-328 mostra uma profunda incapacidade na inibição da secreção de haptoglobina estimulada pela proteina de fusão IL-6/IL-6Ralfa. O anticorpo 471 quimérico foi também testado quanto à sua capacidade de inibir a proliferação de células LP-1 de mieloma. As LP-1 são uma linha de células de mieloma humano cuja proliferação pode ser estimulada pela IL-6. O ensaio de proliferação de células LP-1 foi realizado como a seguir. As células LP-1 foram compradas à DSMZ (cat # ACC 41) (Georgii-Hemming P. et al. Blood (1996) 88:2250). As 44 células foram cultivadas em FBS a 20% e depois deixadas sem alimentação durante 3 dias em meio FBS a 1% antes do ensaio de proliferação. Após a carência alimentar, as células foram lavadas três vezes e diluidas em meios contendo 0,5% de FBS. Os anticorpos anti-IL-6 foram diluídos e incubados em placa com estimulação ou com 0,005 ng/mL de IL-6 ou com 0,05 ng/mL de proteína de fusão Fc-IL6Ralfa-IL6 durante uma hora a 37°C 5% de CO2. Depois cerca de 100.000 células em 100 μΒ foram adicionadas à placa de 96 poços com 100 μΒ de proteínas diluídas com estimulação, incubadas durante 56 horas, e depois foi adicionada 3H Timidina durante as últimas 16 horas. As células foram depois recolhidas dos poços com água para placas de filtro de fibra de vidro e foi medida a radioatividade por contagem de cintilação líquida. A tabela a seguir mostra os resultados típicos com o anticorpo 471 quimérico produzido a partir de uma linha de células transfetadas estavelmente. Foram obtidos resultados semelhantes a partir do anticorpo 471 quimérico produzido a partir de células trasfetadas transientemente.

Proliferação LP-1 IC50 (ng/mL) AVG SD Repetições Ch anti IL-6#471 + IL-6 5, 15 2,27 3 Mab 206 + IL-6 341,87 234,58 3 Ch anti IL-6 CNT0-328 + IL-6 10, 07 1,42 3 Ch anti IL-6#471 + IL-6Ra-IL-6 th 39 0,36 3 Mab 206+IL-6Ra-IL-6 8, 08 3 Ch anti IL-6 CNT0-328 + IL-6Ra-IL—6 Í60Í 539 3

Os resultados indicam que o anticorpo 471 quimérico é eficiente na inibição da proliferação de LP-1 estimulada tanto pela IL-6 como pela proteína de fusão IL-6/IL-6Ralfa. 45

Em contrate, Mab#206 é ineficiente na inibição da proliferação de LP-1 estimulada por IL-6, e CNTO-328 mostra profunda incapacidade na inibição da proliferação de LP-1 estimulada pela proteina de fusão IL-6/IL-6Ralfa.

Os efeitos inibidores do anticorpo 471 quimérico e vários anticorpos controlo na secreção de haptoglobina in vivo foram também testados como descrito no Exemplo 6.

Foram obtidos os resultados seguintes. 0 horas 8 horas 24 horas 8 24 TESTET VS μg/mL de μg/mL de μg/mL de horas horas PBS Haptoglobina Haptoglobina Haptoglobina % de inibi % de inibi 8 24 AVG SD AVG SD AVG SD ção ção horas horas San tratamento 0,8 0,1 0,8 0,9 4,2 4,7 PBS 0, 6 0,1 24 17 113 170 FC-IL6Ra- IL6 0,8 0,1 463 128 994 125 Ch 471 1,0 0,2 83 61 214 176 82 78 0,01 0,00 CNTO 328 0,8 0,2 406 58 1057 91 12 -3 0,52 0,73 R&O MAB206 0, 6 0, 3 297 71 672 58 36 32 0,12 0,02 Anti-CD19 chB4 0,8 0,1 487 138 1335 346 -5 -34 0, 86 0,18

Estes resultados indicam que o anticorpo 471 quimérico (referido como Ch 471 na tabela acima) bloqueia fortemente a secreção de haptoglobina estimulada por um complexo IL-6/IL-Ralfa, enquanto que os anticorpos controlo tais como Mab#206 e CNTO-328 são menos eficientes ou ineficazes na inibição da secreção da haptoglobina.

Exemplo 9. Tratamento de um doente humano com anticorpos e métodos da invenção.

Os anticorpos anti-IL-6 da invenção são usados para tratar doenças e distúrbios humanos como se segue. Em geral, o método preferido de administração é por infusão iv. ou injeção iv., embora a injeção subcutânea, inalação, administração oral, e outros métodos sejam também possiveis. A administração cerca de uma vez todas as 2, 3 46 ou 4 semanas é usada, embora a frequência de administração possa variar dependendo das necessidades do doente. A dose tipica é cerca de 100 até 800 mgs para um adulto humano. Os doentes tratados foram monitorizados quanto aos sinais de infeção que podem resultar da imunossupressão.

Por exemplo, um doente com doença de Castleman é tratado com o anticorpo 471 quimérico da invenção cerca de uma vez cada duas semanas a uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão gota a gota.

Um doente com arterite reumatóide é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez cada quatro semanas a uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão gota a gota. Progressão de destruição articular verificou-se ser significativamente inibida por monoterapia, mesmo quando comparada com fármacos antireumáticos modificadores de doença.

Um doente com doenças de Crohn é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez a cada quatro semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão gota a gota.

Um doente com mieloma múltiplo é tratado com anticorpo 471 quimérico acerca de uma vez a cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão gota a gota. O tratamento com 471 quimérico é combinado com um padrão de cuidados de tratamento para mieloma múltiplo como determinado por um médico como apropriado para o doente.

Um doente com cancro da próstata avançado metastizado, com uma história de tratamento por quimioterapia convencional, 47 é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez a cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, com administração por infusão gota a gota. 0 tratamento com anticorpo 471 quimérico é combinado com um tratamento de cuidados padrão para cancro da próstata como determinado por um médico como apropriado para o doente. Fármacos anti-inflamatórios não esteróides, por exemplo Naproxen™ são também prescritos. Como resultado de quimioterapia anterior, o doente tem glóbulos brancos deprimidos e baixos niveis de células T naturais. 0 doente é monitorizado particularmente rigorosamente quanto a infeção resultante da imunossupressão e são lhe dados antibióticos profiláticos. Verificou-se que o tratamento tem um efeito positivo nos sintomas tipo caquexia, tais como perda de osso.

Um doente com cancro da mama hormono-refratário é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez a cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg por infusão gota a gota. 0 tratamento com anticorpo 471 quimérico é combinado com um tratamento de cuidados padrão para cancro da mama avançado como determinado por um médico como apropriado para o doente. Fármacos anti-inflamatórios não esteróides, por exemplo Naproxeno™ são também prescritos.

Num estratégia de tratametno alternativo, um doente com cancro da próstata hormono-refratário avançado ou com cancro da mama hormono-refratário avançado é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez a cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, em combinação com uma imunocitocina tal como KS-IL2. Estes dois agentes podem ser co-administrados por infusão gota a gota. Antes do tratamento, o doente é doseado com uma quantidade imunoestimuladora de ciclofosfamida. Fármacos anti- 48 inflamatórios não esteróides, por exemplo Naproxen™ são também prescritos. Sem desejar ser limitado pela teoria, a combinação de um anticorpo anti-IL6 da invenção e uma imunocitocina tal como KS-I L2 é particularmente eficiente, em parte porque a IL-6 causa uma supressão da sinalização IL-12 e respostas TH1, e os anticorpos da invenção revertem esta inibição.

Um doente com um linfoma da célula B é tratado com anticorpo 471 quimérico cerca de uma vez a cada três semanas com uma dose de cerca de 8 mg/kg, opcionalmente em combinação com um anticorpo tal como Rituxan™ a cerca de 375 miligramas por metro quadrado de área de superficie corporal, a qual é administrada todas as semanas. Alternativamente, no caso de um doente com linfoma refratário, o tratamento com anticorpo 471 quimérico é combinado com um radioimunoconjugado tal como Bexxar™ ou Zevalin™.

Lisboa, 4 de Maio de 2012

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de fusão compreendendo (i) Uma porção Fc de um anticorpo, (ii) IL6Ralfa e (iii) IL6.

2. Proteína de fusão da reivindicação 1, em que IL6Ralfa é fundida com o C terminal da porção Fc, e IL6 é fundida com o C terminal de IL6Ralfa.

3. Proteína de fusão da reivindicação 1 ou 2, em que a porção Fc é murino e IL6Ralfa e IL6 é humana.

4. Uso de uma proteína de fusão de qualquer das reivindicações 1-3 para fabrico de um anticorpo anti-IL-6 para tratamento de cancro e doenças autoimunes desencadeados por IL6, em que o anticorpo foi obtido por imunização de um mamífero com a referida proteína de fusão, e tem as seguintes propriedades: (i) a região variável do referido anticorpo liga-se a um epitopo na IL-6, (ii) bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e gpl30 na superfície da célula doente, e (iii) evita que a IL-6 complexada com IL-6Ralfa se ligue a gpl30, mas não bloqueia estericamente a interação entre IL-6 e IL-6Ralfa.

5. Uso da reivindicação 4, em que o anticorpo rastreado é um anticorpo compreendendo (a) uma cadeia pesada e (b) uma cadeia leve compreendendo as sequências de 2 aminoácidos selecionados consiste em (i) (a) SEQ ID NO:35, e (ii) (a) SEQ ID NO:34, e (iii) (a) SEQ ID NO:36, e (iv) (a) SEQ ID NO:33, e a parti: r do grupo (b) SEQ ID NO : 31 (b) SEQ ID NO : 30 (b) SEQ ID NO : 32 e (b) SEQ ID NO : 2 9 que Lisboa, 4 de Maio de 2012