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CN113912729B - 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用 - Google Patents

针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫学领域，涉及针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用。所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ ID NO:41‑SEQ ID NO:59所示的重链CDR1、SEQ ID NO:60‑SEQ ID NO:79所示的重链CDR2和SEQ ID NO:80‑SEQ ID NO:99所示的重链CDR3；单域抗体作为sST2蛋白检测抗体与传统单克隆抗体其亲和力更高，与现有检测试剂盒中多克隆抗体相比，其成分更加单一，批间稳定性更好，从而使实际的sST2蛋白含量检测结果可信度更高；还可检测sST2融合蛋白，并进一步对细胞或培养基中的目的蛋白进行纯化，从而获得高纯度的sST2融合蛋白。

Description

针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
技术领域
本发明涉及生物技术或免疫学技术领域，涉及针对可溶性生长刺激表达基因2蛋白（sST2）的单域抗体及其衍生蛋白。
背景技术
抗体（Antibody,Ab）即免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）是血液和组织液中的一类糖蛋白，由B细胞接收抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，主要存在与血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，是介导体液免疫的重要效应分子。抗体除了因其作为重要效应分子介导特异性体液免疫应答外，抗体在疾病的防治特别是感染性疾病的防治方面扮演者重要角色，Behring创立血清疗法因此获得医学与生理学诺贝尔奖。此后，以多克隆、单克隆及基因工程抗体技术人工制备的抗体逐步应用于临床。
抗体作为可以特异性识别某一个蛋白（抗原）的分子，除了在疾病预防和治疗方面的作用强大之外，其作为检测工具在检验、科学研究方面的用途也不言而喻。酶联免疫吸附实验（ELISA）正是利用抗体/抗原结合以实现检测目的一个重要方法。目前常用的ELISA检测方法有双抗体夹心法、间接法、竞争法和免疫抑制法等，其基本原理均为抗原抗体结合反应。以此方法为基础ELISA试剂盒在检验检疫等场合的用途也十分广泛。部分检验检疫方法对于抗体的亲和力和稳定性要求非常苛刻，这就要求所使用的抗体在与其特异性结合的抗原亲和力要非常高，稳定性要非常好，并且这些抗体的使用和储存环境要更为广泛才更有利于检测方法的推广。传统单抗在抗原亲和力方面表现良好，并且虽然现在可以通过添加保护剂或改变缓冲液的方法提升其稳定性，但是其储存条件要求依然相对苛刻，一般应在低温运输或保存。而单域抗体在亲和力和稳定性方面就表现的更为优秀，单域抗体在未进行亲和力成熟之前，其与抗原的亲和力可达到pM级别，并且其室温稳定性良好，可以降低运输和储存成本。此外，单域抗体可以在原核表达系统中可以大量可溶性表达，降低生产成本，并且提高抗体批件稳定性。
生长刺激表达基因2蛋白（ST2）是特异性细胞标志物，属于白介素1受体（IL-1R）家族，其与炎症性肠病、糖尿病、心力衰竭、冠心病等有关，并参与炎性反应、促进肥大细胞活化。ST2主要类型有可溶性ST2（sST2）和跨膜型ST2（ST2L），均与心血管有关。sST2是一种诱骗受体，与白介素33（IL-33）结合后阻断IL-33/ST2信号传导，进而抑制核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活，减弱心肌保护作用，促进心脏损伤和重塑。sST2与心力衰竭：据统计， 我国心力衰竭发病率为0.7‰~0.9‰， 每年新发心力衰竭患者约50万例。心力衰竭的临床症状不典型，病情变化多端， 其诊断易受医师经验等影响。目前， 对于心力衰竭并没有独立的诊断试验， 其主要诊断依据为患者病史和体征。而随着心力衰竭发病率上升， 生物标志物逐渐应用于心力衰竭的早期诊断、治疗和预后评估。sST2作为心力衰竭的新型生物标志物在炎性反应、 纤维化和心脏应激中的作用引起广泛关注GAGGIN H K等，Circ Heart Fail，2013，6（6）：1206-1213.DOI：10.1161/CIRCHEARTFAILURE.113.00045。WU等，研究发现， 健康受试者sST2具有较低的生物变异性， 故相比其他生物标志物（ 如氨基末端脑钠肽前体，NT-proBNP）其更适用于监测心力衰竭的病情变化。一项纳入167例心功能I~III级且左心室射血分数<45％的慢性收缩性心力衰竭患者的研究结果显示，sST2水平与心功能分级、慢性心力衰竭恶化住院、死亡等呈正相关。sST2与急性心肌梗死(AMI）：在患有AMI的患者中，sST2的浓度提前升高并且与心脏重塑不良相关。Weir等人发现sST2与左心室(LV)射血分数呈负相关，与基线和AMI后24周的梗死体积指数呈正相关。在AMI实验模型中，Pascual-Figal等人的研究也支持sST2与AMI后不良重塑之间的关系，其中sST2的心肌表达在前4周内迅速上升，并与正在进行的纤维化和炎症过程相关。在长期的随访中，sST2浓度较高者患有HF的几率更高。sST2血浆水平升高也与急性HF呼吸困难患者的心脏结构，功能和血流动力学受损参数显着相关。sST2还与炎症相关：在急性HF患者中，Rehman等研究显示sST2与炎症之间的关联，如温度，白细胞数和C反应蛋白(CRP)。此外，HF患者伴有炎性肺病的sST2水平较高。事实上，sST2是通过调节T辅助细胞2型反应被确定为参与自身免疫和炎症性疾病。因此，急性心脏病患者的报告中sST2增加代表了一种不良反应，它消除了LL-33/ST2L系统的相互作用，并导致不良表型，与心肌牵张，纤维化，不良重塑，炎症和更糟的血液动力学受损有关。基于近年发表的许多临床研究，sST2在几种急性和慢性心血管疾病中具有重要的预后价值。预测HF患者死亡率:在急性呼吸困难患者中，血清sST2浓度可以强烈预测急性心衰患者和无心衰患者1年内的死亡率。HF患者的sST2浓度显着高于非HF呼吸困难患者，但急性HF诊断的sST2表现明显低于NT-proBNP。在急性心力衰竭患者的研究中，sST2再次成为预测1个月和1年死亡率预测的首选；并且表现出比其他生物标志物更高的预测价值，如NT-proBNP，BNP，CRP或肌钙蛋白。sST2浓度的检测改善了死亡率，心血管死亡和HF住院治疗的风险分层，并增加了其他生物标志物的预后信息。此外，sST2值升高的患者出现不良后果的风险要比sST2降低患者高得多。在急性HF中，ST2水平与年龄、体重等因素不相关，其预测价值与与利尿钠肽互补；ST2和NTproBNP的组合显着改善了危险分层。对于非ST段抬高的ACS患者，sST2也可预测30天和1年的心血管死亡和心衰。在稳定的冠状动脉疾病中，sST2还可预测死亡率和心血管死亡。2013年的ACCF /AHA指南已将sST2纳入心肌纤维化的标志物，并建议将其作为Ⅱb类用于急性失代偿性HF(证据水平A）或慢性HF(证据水平B）患者的风险分层。
目前，对于sST2的检测方法多为双抗体夹心法，应用的固相抗体为单克隆抗体。单克隆抗体存在制备周期长，成本高的问题，无疑增加了sST2检测试剂盒的成本。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用，在获得高特异性的单域抗体后通过原核表达或者酵母表达便可以获得，产量和纯化效率高并且批间质量稳定，其次，单域抗体的亲和力比传统抗体有一定优势，可以提升抗原捕获能力和检测效果，提高检测的灵敏度，此外，单域抗体属于单克隆抗体，这就能保证检测试剂的单一性和可控性，更好的控制检测试剂盒的检测标准。
单域抗体作为单克隆抗体的一类，其比传统单抗的亲和力普遍更高，稳定性更好，并且它也具备传统单抗的优点。因此，本发明利用上述优势，获得针对sST2的单域抗体，并通过竞争ELISA筛选出无竞争抑制的4对单域抗体（2B4-1A7、1A9-1A7、 2B4-2B10和1A9-2B10），每对单域抗体分别在sST2检测试剂盒中用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测，缩短检测时间。
本发明的第一方面，提供了针对sST2的单域抗体，所述的单域抗体由重链构成，重链包括SEQ ID NO:41-SEQ ID NO:59任意一条所示的重链CDR1、SEQ ID NO:60-SEQ ID NO:79任意一条所示的重链CDR2和SEQ ID NO:80-SEQ ID NO:99任意一条所示的重链CDR3。
具体地，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述（1）-（20）的一种：
（1）SEQ ID NO:41所示的CDR1，SEQ ID NO:60所示的CDR2，SEQ ID NO:80所示的CDR3；
（2）SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:61所示的CDR2，SEQ ID NO:81所示的CDR3；
（3）SEQ ID NO:43所示的CDR1，SEQ ID NO:62所示的CDR2，SEQ ID NO:82所示的CDR3；
（4）SEQ ID NO:44所示的CDR1，SEQ ID NO:63所示的CDR2，SEQ ID NO:83所示的CDR3；
（5）SEQ ID NO:45所示的CDR1，SEQ ID NO:64所示的CDR2，SEQ ID NO:84所示的CDR3；
（6）SEQ ID NO:46所示的CDR1，SEQ ID NO:65所示的CDR2，SEQ ID NO:85所示的CDR3；
（7）SEQ ID NO:47所示的CDR1，SEQ ID NO:66所示的CDR2，SEQ ID NO:86所示的CDR3；
（8）SEQ ID NO:48所示的CDR1，SEQ ID NO:67所示的CDR2，SEQ ID NO:87所示的CDR3；
（9）SEQ ID NO:49所示的CDR1，SEQ ID NO:68所示的CDR2，SEQ ID NO:88所示的CDR3；
（10）SEQ ID NO:50所示的CDR1，SEQ ID NO:69所示的CDR2，SEQ ID NO:89所示的CDR3；
（11）SEQ ID NO:51所示的CDR1，SEQ ID NO:70所示的CDR2，SEQ ID NO:90所示的CDR3；
（12）SEQ ID NO:52所示的CDR1，SEQ ID NO:71所示的CDR2，SEQ ID NO:91所示的CDR3；
（13）SEQ ID NO:53所示的CDR1，SEQ ID NO:72所示的CDR2，SEQ ID NO:92所示的CDR3；
（14）SEQ ID NO:54所示的CDR1，SEQ ID NO:73所示的CDR2，SEQ ID NO:93所示的CDR3；
（15）SEQ ID NO:55所示的CDR1，SEQ ID NO:74所示的CDR2，SEQ ID NO:94所示的CDR3；
（16）SEQ ID NO:56所示的CDR1，SEQ ID NO:75所示的CDR2，SEQ ID NO:95所示的CDR3；
（17）SEQ ID NO:57所示的CDR1，SEQ ID NO:76所示的CDR2，SEQ ID NO:96所示的CDR3；
（18）SEQ ID NO:58所示的CDR1，SEQ ID NO:77所示的CDR2，SEQ ID NO:97所示的CDR3；
（19）SEQ ID NO:54所示的CDR1，SEQ ID NO:78所示的CDR2，SEQ ID NO:98所示的CDR3；
（20）SEQ ID NO:59所示的CDR1，SEQ ID NO:79所示的CDR2，SEQ ID NO:99所示的CDR3。
以上（1）-（20）的CDR组合依次与SEQ ID NO.1-20分别对应。
上述所有序列，可以替换为与该序列具有“至少80%同源性”的序列或仅一个或少数几个氨基酸替换的序列；优选为“至少85%同源性”，更优选为“至少90%同源性”，更优选为“至少95%同源性”，最优选为“至少98%同源性”。
在优选实施例中，所述的单域抗体的序列还包括框架区FR；所述框架区FR包括FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列；
框架区FR的氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO:100-109中的任意一条所示的FR1或FR1的变体，所述FR1的变体在所述FR1中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:110-126中的任意一条所示的FR2或FR2的变体，所述FR2的变体在所述FR2中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:127-146中的任意一条所示的FR3或FR3的变体，所述FR3的变体在所述FR3中包含至多3个氨基酸的替换；
SEQ ID NO:147-152中的任意一条所示的FR4或FR4的变体，所述FR4的变体在所述FR4中包含至多3个氨基酸的替换。
在一个实施方案中，所述针对sST2的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-20中的任意一条所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性，并且能够特异性结合sST2蛋白。
在另一个优选实施例中，所述针对sST2的单域抗体与选自SEQ ID NO：1-20中的任意一条所示的氨基酸序列具有至少95％序列同源性，并且能够特异性结合sST2蛋白。
本发明的第二方面是提供针对sST2的单域抗体，所述单域抗体分别如SEQ IDNO.1-20中的任意一条所示，或者所述单域抗体与SEQ ID NO.1-20中的任意一条所示的氨基酸序列具有至少95％序列同源性。
在一个实施方案中，编码所述针对sST2的单域抗体的核酸分子与选自SEQ ID NO：21-40中的任意一条的核苷酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%序列同源性，并且其编码的针对sST2单域抗体能够特异性结合sST2蛋白。
优选的，所述单域抗体的编码序列分别如SEQ ID NO.21-40中的任意一条所示，或者与SEQ ID NO.21-40中的任意一条具有至少95％序列同源性。
本发明的第三方面是提供前述的针对sST2的单域抗体的Fc融合抗体。
本发明的第四个方面是提供编码前述的针对sST2单域抗体的核苷酸分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：21-40中的任意一条所示，或者与SEQ ID NO.21-40中的任意一条具有至少95％序列同源性。
本发明的第五个方面是提供一种表达载体，其包含编码前述的单域抗体或者前述的Fc融合抗体的核苷酸分子或者前述的核苷酸分子。
本发明的第六个方面是提供一种宿主细胞或非人生物体，其可以表达出前述的针对sST2的单域抗体，或其包含前述的表达载体。
本发明还提供一种产生针对sST2的单域抗体或其Fc融合抗体的方法，包括步骤：(a)在适合产生单域抗体或其Fc融合抗体的条件下，培养前述的宿主细胞，从而获得含所述针对sST2单域抗体或其Fc融合抗体的培养物； (b)从所述培养物中分离或回收所述的针对sST2单域抗体或其Fc融合抗体；以及 (c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的针对sST2单域抗体或其Fc融合抗体。
本发明的第七个方面是提供包括前述的针对sST2的单域抗体的sST2-ELISA检测试剂盒。
本发明的第八个方面是提供前述的针对sST2的单域抗体在制备sST2-ELISA检测试剂盒中的应用，或前述的针对sST2蛋白的单域抗体在制备用于检测人体中sST2蛋白的试剂盒中的应用（或者利用针对sST2的单域抗体检测人体中sST2蛋白的检测方法），或前述的针对sST2的单域抗体在分离纯化sST2蛋白融合蛋白中的应用。
所述的单域抗体为VHH，其仅包含抗体重链，不包含抗体轻链。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：单域抗体作为sST2蛋白检测抗体与传统单克隆抗体其亲和力更高，与现有检测试剂盒中多克隆抗体相比，其成分更加单一，批间稳定性更好，质量控制更容易实施。从而使实际的sST2蛋白含量检测结果可信度更高。
在后续的研究当中，研究者还可以通过基因工程的方法将目的蛋白和sST2标签蛋白融合，然后让该融合蛋白在细胞内表达或者分泌表达，利用本发明中的特异性针对sST2蛋白的单域抗体检测sST2融合蛋白，并进一步对细胞或培养基中的目的蛋白进行纯化，从而获得高纯度的sST2融合蛋白。
附图说明
图1是对所构建的单域抗体噬菌体展示文库进行目的片段插入率检测的PCR产物电泳图，编号M是 DNA分子marker，编号1-15是从构建的针对sST2蛋白单域抗体文库中随机挑取的不同克隆的PCR产物；
图2是对所构建的单域抗体文库进行生物淘选的具体结果，其中P/N=生物淘选中阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数/阳性孔洗脱下的噬菌体感染TG1细菌后生长的单克隆细菌数，该参数在富集发生后会逐渐增大；I/E=生物淘选中每轮加入阳性孔的噬菌体总量/生物淘选中每轮从阳性孔洗脱出的噬菌体总量，该参数在富集发生后会逐渐趋近于1；
图3是表达的针对sST2蛋白的单域抗体，蛋白粗液经镍柱树脂亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳图；
图4是哺乳动物表达系统表达的人源Fc融合的sST2单域抗体经Protein A亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳图, 编号M是Protein marker；
图5是原核表达系统表达的针对sST2蛋白的单域抗体的ELISA实验结果，所有单域抗体均按照实施例4进行表达、纯化；
图6是竞争ELISA针对sST2蛋白的竞争浓度（EC80）的检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
单域抗体(sdAb，也被研发者Ablynx称为纳米抗体或VHH)是本领域技术人员公知的。单域抗体为其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。因此，单域抗体包含单个互补决定区（单个CDR1、单个CDR2和单个CDR3）。单域抗体的实例为仅有重链的抗体(该抗体天然不包含轻链)、衍生自常规抗体的单域抗体和工程化抗体。
单域抗体可以衍生自任何物种，包括小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔和牛。例如，天然存在的VHH分子可以衍生自骆驼科物种(例如骆驼、单峰骆驼、美洲驼和原驼)提供的抗体。像完整的抗体一样，单域抗体能够选择性地结合特定抗原。单域抗体可以仅含有免疫球蛋白链的可变结构域，该结构域具有CDR1、CDR2和CDR3以及框架区。
如本文所用，术语“序列同源性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同源性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同源性。
本发明中，与本发明公开的CDR1-3的序列同源性高的序列，也可以得到针对sST2的纳米抗体。在一些实施例中，与（1）-（20）中的序列具有“至少80%同源性”的序列，或者“至少85%同源性”、“至少90%同源性”、“至少95%同源性”、“至少98%同源性”的序列都可以实现发明目的（即衍生蛋白）。
在一些实施例中，与SEQ ID NO：1-20中的序列相比仅仅替换一个或少数几个氨基酸的序列，例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代，也可以实现发明目的。实际上，在确定两个氨基酸序列之间的序列同源性程度或在确定单域抗体中的CDR1、CDR2和CDR3组合时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，在取代情况下，所述取代将优选为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸，其通常可以被描述为氨基酸残基被具有相似化学结构的另一个氨基酸残基替代的氨基酸取代，并且该取代对多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或基本上没有影响。所述保守氨基酸取代在本领域是通用的，例如保守氨基酸取代是以下（a）-（d）组内的一个或少数几个氨基酸被同一组内另一个或少数几个氨基酸所取代：（a）极性带负电残基及其不带电酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；（b）极性带正电残基：His、Arg、Lys；（c）芳香族残基：Phe、Trp、Tyr；（d）脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Gly、Pro、Met、Leu、Ile、Val、Cys。特别优选的保守氨基酸取代如下：Asp被Glu取代；Asn被Gln或His取代；Glu被Asp取代；Gln被Asn取代；His被Asn或Gln取代；Arg被Lys取代；Lys被Arg、Gln取代；Phe被Met、Leu、Tyr取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Phe、Trp取代；Ala被Gly或Ser取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Gly被Ala或Pro取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Leu被Ile或Val取代；Ile被Leu或Val取代；Val被Ile或Leu取代；Cys被Ser取代。另外，本领域技术人员知晓，单域抗体的创造性体现在CDR1-3区，而框架区序列FR1-4并非是不可改变的，FR1-4的序列可以采取本发明公开的序列的保守序列变体。
本发明的优选宿主细胞为细菌细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明采用购自Novoprotein公司纯度为95%的sST2蛋白来免疫阿拉善双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立sST2蛋白的单域抗体文库。在抗体筛选过程中，将sST2多肽偶联生物素（sST2-Biotin），将中性亲和素蛋白偶联在酶标板上，利用生物素和中性亲和素结合的特性，使sST2多肽间接展示在酶标板表面，使其抗原表位得以暴露，然后利用噬菌体展示技术筛选sST2蛋白免疫后的单域抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），获得了能在大肠杆菌中高效表达的单域抗体株。
将筛选获得的单域抗体在大肠杆菌中表达后通过镍离子偶联的琼脂糖进行纯化，将纯化后的纳米抗体进行分析。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对sST2蛋白的单域抗体文库的构建：
(1)将1mg sST2抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫7次，免疫过程中刺激B细胞表达特异性的纳米抗体；(2)免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶Pst I及Not I酶切20μg pMECS噬菌体展示载体及10μg VHH并连接两种片段；(5) 将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建sST2蛋白噬菌体展示文库并测定库容，文库库容的大小约为2×109；同时，通过菌落PCR检测所建文库中目的片段的正确插入率，图1显示菌落PCR结果，随机的选取34个克隆做菌落PCR，结果显示插入率达到90%。
实施例2：针对sST2蛋白单域抗体的筛选：
(1)取200μL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40μL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2) 将稀释在100mM pH 8.3的 NaHCO3中的中性亲和素蛋白500ug偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立阴性对照孔；（3）第二天加入100μL生物素标记的sST2蛋白（sST2-Biotin），室温孵育2小时，阴性对照孔加入100μL PBS；(4)2小时后，加入100μL的3%的脱脂乳，室温封闭2h；(5)封闭结束后，加入100μl扩增后噬菌体文库（大约2×1011个噬菌体颗粒），室温作用1h；(6)作用1小时后，用PBS+0.05%Tween-20洗5遍，以洗掉未结合的噬菌体；(7)用终浓度为25mg/mL的胰蛋白酶将与sST2蛋白特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步得到富集，富集效果如图2所示，P/N值从第一轮的2.2到第三轮约为10000，I/E质从第一轮的13605到第三轮约为13，证明文库针对sST2具有非常明显的富集。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性阳性克隆:
(1)根据上述单域抗体筛选方法对sST2蛋白进行3轮筛选，筛选结束后，针对sST2蛋白的噬菌体富集因子达到10以上（约为10000），从筛选获得的阳性克隆中挑选400个单菌落分别接种于含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；(2)利用渗透涨破法获得粗提抗体；将中性亲和素蛋白稀释至100mM pH 8.3的 NaHCO3中并将100μg中性亲和素蛋白在酶标板中4℃包被过夜，次日向酶标板内加入100ug sST2-Biotin蛋白；（3）将上述步骤中获得的抗体粗提液取100uL转移至加入抗原的ELISA板上，室温孵育1h；(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody（鼠抗HA抗体，ThermoFisher），在室温孵育1h；(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:20000稀释后的Anti-Rabbit HRP conjugate （山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体，购自于ThermoFisher），在室温孵育1h；(6) 用PBST洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃下反应15min后，加入中止液，于酶标仪上450nm波长处，读取吸收值；(7)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；(8)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/ul氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI 分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得特异性针对sST2蛋白的单域抗体（SEQ ID NO.1-20）。其抗体的氨基酸序列为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4结构，构成整个VHH。获得的单域抗体重组质粒可以在原核系统中进行表达，最终获得单域抗体蛋白。
20种单域抗体的CDR、FR序列如表1-6所示。
表1 20种单域抗体的FR4序列
Figure 852398DEST_PATH_IMAGE001
表2 20种单域抗体的CDR1序列
Figure 35118DEST_PATH_IMAGE002
表3 20种单域抗体的CDR2序列
Figure 408330DEST_PATH_IMAGE003
表4 20种单域抗体的CDR3序列
Figure 6802DEST_PATH_IMAGE005
表5 20种单域抗体的FR1序列
Figure 165382DEST_PATH_IMAGE006
表6 20种单域抗体的FR2序列
Figure 456686DEST_PATH_IMAGE007
FR3序列（SEQ ID NO.127-146）依次与单域抗体1A10、1A7、1A9、1B2、1B5、2A2、2B10、2B4、2C2、2E8、2F1、2F4、2F9、3A10、3B1、3B7、3C5、3C8、4A1、4D2一一对应。
单域抗体的氨基酸序列SEQ ID NO.1-20依次与单域抗体1A10、1A7、1A9、1B2、1B5、2A2、2B10、2B4、2C2、2E8、2F1、2F4、2F9、3A10、3B1、3B7、3C5、3C8、4A1、4D2一一对应。
实施例4：sST2蛋白的特异性单域抗体在宿主菌大肠杆菌中的纯化及表达
（1）将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒（pMECS-VHH）电转化到大肠杆菌HB2151中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5mL含有岸边青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1mL的过夜培养菌种至330mL TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1M IPTG，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，纯化后的单域抗体，如图3所示。图3中，3-1里面的VHH1-8分别对应于单域抗体1A10、1A7、1A9、1B2、1B5、2A2、2B10、2B4；3-2里面的VHH9-17分别对应单域抗体2C2、2E8、2F1、2F4、2F9、3A10、3B1、3B7、3C5；3-3里面的VHH18-20分别对应单域抗体3C8、4A1、4D2。
实施例5：sST2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体真核表达载体的构建
将实施例3中获得的目标序列亚克隆至真核表达载体中：（1）将实施例3中筛选出来的抗体经Sanger测序得到其核苷酸序列；（2）通过序列合成的方式将密码子优化后的上述核苷酸序列（SEQ ID NO.21-40）合成至本公司设计改造的载体RJK-V4-hFC中，载体RJK-V4-hFC的制备过程如实施例14所述；（3）将公司构建好的重组真核表达载体转化至DH5α大肠杆菌中，培养进行质粒大提，去除内毒素；（4）将大提后的质粒再进行序列测序鉴定；（5）将确定无误后的重组载体准备后续真核细胞转染表达。
实施例6：sST2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮ExpiCHO-S细胞中表达
（1）转染前3天以2.5×105/ml细胞传代和扩大培养ExpiCHO-S™细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml（终体积）的ExpiCHO™表达培养基的500ml摇瓶中；使细胞浓度达到约4×10 6 -6×106活细胞/ mL；（2）在转染前一天，将ExpiCHO-S™细胞稀释浓度至3.5×10 6活细胞/ mL，使细胞过夜培养；（3）转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约7×106 -10×106活细胞/ mL；（4）用预热至37℃新鲜的ExpiCHO™表达培养基将细胞稀释至6×106个活细胞/ mL。计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml（终体积）的ExpiCHO™表达培养基的500ml摇瓶中；（5）使轻轻颠倒混匀ExpiFectamine™CHO试剂，用3.7ml OptiPRO™培养基稀释ExpiFectamine™CHO试剂，回荡或混匀；（6）用冷藏的4ml OptiPRO™培养基稀释质粒DNA，回荡混匀；（7）将ExpiFectamine CHO /质粒DNA复合物室温孵育1-5分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶；（8）将细胞在37°C、 8％CO 2、加湿的空气中震荡培养；（9）转染后第1天（18-22小时后）添加600ul ExpiFectamine™CHO Enhancer和24ml ExpiCHO feed。（10）在转染后约8天（细胞活率低于70%）收集上清。
实施例7：sST2蛋白的特异性单域抗体的Fc融合抗体在悬浮293F细胞中的表达
重组单域抗体表达实验流程(以500ml摇瓶为例)：
（1）转染前3天以2.5×105/ml细胞传代和扩大培养293F细胞，计算出的所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的120ml（终体积）的OPM-293 CD05 Medium培养基的500ml摇瓶中。使细胞浓度达到约2×106-3×106活细胞/ mL。
（2）转染当天，测定细胞密度和活细胞百分比。转染之前细胞密度应达到约2×106-3×106活细胞/ mL。
（3）用预热的OPM-293 CD05 Medium将细胞稀释至1×106个活细胞/ mL。计算出所需的细胞体积转移至装有新鲜的已预热的100ml（终体积）的培养基的500ml摇瓶中。
（4）用4ml Opti-MEM培养基稀释PEI（1mg/ml）试剂，回荡或吹打混匀；用4ml Opt-MEM培养基稀释质粒DNA，回荡混匀，并用0.22um的滤头过滤。室温孵育5min。
（5）将稀释的PEI试剂加入稀释的DNA中，颠倒混匀。将PEI/质粒DNA复合物室温孵育15-20分钟，然后轻轻加入制备的细胞悬液中，加入过程中轻轻回荡摇瓶。
（6）将细胞在37°C、 5％CO2、120rpm震荡培养。
（7）转染后第24h、72h添加5ml OPM-CHO PFF05补料。
（8）在转染后约7天（细胞活率低于70%）收集上清。
实施例8：人源Fc重组单域抗体的纯化
（1）将实施例6或7中获得蛋白表达上清用0.45μm的一次性滤头过滤除掉不可溶杂质；
（2）将上述滤液使用蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，利用人源Fc与Protein A结合的能力，使用偶联Protein A的琼脂糖填料进行纯化；
（3）将滤液通过1mL/分钟的流速流穿Protein A预装柱，该步骤中滤液中的目标蛋白会与填料结合；
通过低盐和高盐缓冲液将柱上结合的杂质蛋白洗涤；
（4）用低pH缓冲液将柱上结合的目标蛋白进行系统；
（5）将洗脱液迅速加入pH9.0的Tris-HCl溶液，进行中和；
（6）将上述中和后的蛋白溶液透析后，进行SDS-PAGE分析如图4所示，确定蛋白纯度在95%以上，且浓度在0.5mg/mL以上后，低温保存备用。图4中，4-1里面的1-14分别对应于单域抗体1A10、1A7、1A9、1B2、1B5、2A2、2B10、2B4、2C2、2E8、2F1、2F4、2F9、3A10；4-2里面的1-6分别对应于单域抗体3B1、3B7、3C5、3C8、4A1、4D2。
实施例9：原核表达的纳米抗体与sST2结合能力的初步检测
将实施例4中纯化获得的单域抗体对sST2的亲和力进行初步检测；首先使用定量的标准品测定重组单域抗体与sST2的亲和力步骤如下；
（1）将100ng/100μL标准sST2样品包被到ELISA板材上；
（2）使用脱脂奶粉对上述包被的板材进行封闭；
（3）加入实施例4中获得的针对sST2的单域抗体；
（4）加入HRP标记的鼠抗HA标签的单克隆抗体；
（5）加入显色底物TMB；
（6）加入终止液终止反应；
（7）测量OD450值计算P/N值，结果如图5所示，可见20种针对sST2的单域抗体均与sST2具有较强的亲和力。
实施例10：竞争ELISA针对sST2蛋白的竞争浓度（EC80）检测
（1）将实施例9中P/N值>12的6株sST2的单域抗体以100ng/100μL包被到ELISA板材上；
（2）使用Casein对上述包被的板材进行封闭；
（3）加入等梯度稀释的标准sST2样品（带HA标签）；
（4）加入HRP标记的鼠抗HA标签的单克隆抗体；
（5）加入显色底物TMB；
（6）加入终止液终止反应；
（7）测量OD450值，计算EC80结果如图6所示；
实施例11：针对sST2蛋白的特异性单域抗体在双抗体夹心-ELISA实验中竞争抑制检测
（1）将P/N值>12的6株sST2的单域抗体及Nb_ sST2（阴性对照）以100ng/100μL包被到ELISA板材上；
（2）使用5% Milk Vertex 10 min,对上述包被的板材进行封闭；
（4）加入sST2蛋白，终浓度为各个sST2单域抗体对应的EC80 值，与实施例8中抗体（实施例7制得的抗体经实施例8纯化得到）均双倍浓度配制母液，等比例混合后使用，无需另外孵育。
（5）加入抗HA的抗体孵育（HRP标记）；
（6）加入显色底物TMB；
（7）加入终止液终止反应；
（8）测量OD450值，鉴定出无竞争抑制、配对成功、可用于sST2-ELISA检测试剂盒的抗体 4 对：2B4-1A7、1A9-1A7、 2B4-2B10和1A9-2B10，如下表7所示。
表7 针对sST2蛋白的特异性单域抗体在双抗体夹心-ELISA实验中竞争抑制检测
Figure 989298DEST_PATH_IMAGE008
实施例12：针对sST2蛋白的特异性单域抗体在sST2-ELISA试剂盒中的应用（双抗夹心法）
（1）将实施例8和实施例4中获得单域抗体通过双抗夹心法检测目标样品中sST2的含量，这里使用的是两种不同的单域抗体；
（2）首先使用标准品测定并绘制sST2含量与OD450的标准曲线，步骤如下；
（3）将实施例8中鉴定、纯化得到单域抗体作为捕获抗体包被到ELISA板材上；
（4）使用脱脂奶粉对上述包被的板材进行封闭；
（5）加入标准样品孵育；
（6）加入实施例4中获得的单域抗体作为检测抗体（带有HA标签），孵育；
（7）加入抗HA的抗体孵育（HRP标记）；
（8）加入显色底物TMB;
（9）加入终止液终止反应；
（10）测量OD450值，绘制标准曲线；
（11）然后基于上述步骤获得的标准曲线对待检样品进行检测。
实施例13：针对sST2蛋白的单域抗体在分离纯化sST2蛋白融合蛋白中的应用
将针对sST2蛋白的单域抗体偶联到溴化氢活化的琼脂糖树脂中，进行sST2蛋白的纯化。
实施例14：真核表达载体RJK-V4-hFc的构建
所提及单域抗体通用的目标载体RJK-V4-hFC，为本公司在invitrogen商业化载体pCDNA3.4（载体资料链接：https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf）的基础上融合了人源IgG的重链编码序列（NCBIAccession No.: AB776838.1）中的Fc区段后改造而来的，即该载体包含了IgG重链的铰链区（Hinge）CH2和CH3区。具体改造方案如下：
（1）选取pcDNA3.4上的限制性酶切位点XbaI和AgeI；
（2）在Fc片段编码序列的5’端和3’端通过重叠PCR的方式分别引入多克隆位点（MCS，Multiple Cloning Site）和6×His标签；
（3）使用分别带有XbaI和AgeI酶切位点的一对引物通过PCR的方式将上述片段扩增；
（4）使用限制性内切酶XbaI和AgeI分别酶切pcDNA3.4和（3）中的重组DNA片段；
（5）将酶切后的载体和插入片段在T4连接酶的作用下连接，然后将连接产物转化至大肠杆菌，扩增，测序核实，获得重组质粒。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 南京融捷康生物科技有限公司
<120> 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用
<160> 152
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Phe Ile Asn Trp Ser Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala Ala Ile Glu Ser
35 40 45
Gly Gly Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Leu
50 55 60
Ser Thr Asp Val Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Lys Lys Val Trp
85 90 95
Ala Arg Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 2
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Tyr Ser Arg Asn Cys Val Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile Ala Ala Leu Tyr Thr
35 40 45
Ala Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Pro
85 90 95
Ser Asn Ser Leu Thr Cys Gly Ile Ala Thr Ile Thr Thr Asp Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Thr Tyr Cys Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Gly Ile Asp Ser
35 40 45
Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Leu Ser Pro Arg
85 90 95
Cys Asp Phe Asp Arg Ser Ser Arg Val Thr Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser Gly Val Thr Tyr Arg Arg Thr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr
35 40 45
Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Glu Ala Gly
85 90 95
Asp Glu Cys Ser Ala Ser Ser Val Phe Arg Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Ile Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr
35 40 45
Asn Gly Glu Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Asn
85 90 95
Thr Cys Gly Leu Arg Gly Asp Phe Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Gly Arg Arg Asn Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Ser
35 40 45
Gly Asp Ile Thr Phe Tyr Gly Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Arg Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Pro Gly Asp
85 90 95
Tyr Cys Ser Thr Arg Pro Phe Ala Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Val Ser Gly Tyr Thr Ser Arg His Cys Met Gly Trp Phe Arg
20 25 30
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Leu Tyr Pro Ala
35 40 45
Thr Gly Ser Ala Phe Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Val Glu Ser Thr Ser
85 90 95
Leu Cys Ala Ala Arg Thr Val Pro Ser Phe Lys Phe Arg Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Ala Asp Met Gly Trp Tyr
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser Ser Leu Gly Asp
35 40 45
Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Glu Arg Leu Trp
85 90 95
Thr Ala Ser Thr Val Val Pro Asp Thr Pro Cys Leu Asp Glu Ile Glu
100 105 110
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Val Ser Gly Asn Met Tyr Arg Arg Asn Cys Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr
35 40 45
Ala Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Asp Gly Arg
85 90 95
Asp Gly Asp Leu Cys Ala Ala Arg Ser Asp Phe Arg Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr His Asp Tyr Ser Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala Ser Met Tyr Thr
35 40 45
Gly Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ala Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Thr Arg
85 90 95
Pro Ile Val Asp Arg Trp Cys Gly Leu Pro Trp Pro Leu Tyr Thr Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Arg Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Leu Tyr Thr
35 40 45
Gly Val Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Gly
85 90 95
Pro Leu Cys Gly Leu Gly Ile Gln Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Asn Tyr Arg Met Gly Trp Phe Arg
20 25 30
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Met Ala Ser Ala Ile
35 40 45
Ser Glu Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg
50 55 60
Asp Ser Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Val Trp Gly Arg
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Leu Trp Asn Pro Asp Asp Tyr Asn Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Ser Arg Asn Cys Leu Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala Thr Ile Tyr Thr
35 40 45
Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Val Ser
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Leu Asp Ser
35 40 45
Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Leu Thr Cys
85 90 95
Tyr Cys Ser Asp Gly Tyr Cys Tyr Asn Gly Asp Glu Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser Gly Val Thr Phe Ser Arg Ser Cys Ile Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ile Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Val Tyr Thr
35 40 45
Gly Gly Arg Ser Ile Asp Tyr Ser Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn Ala Trp Asn Thr Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala
85 90 95
Asp Phe Leu Leu Gln Glu Pro Cys Thr Val Leu Ser Ser Arg Gly Phe
100 105 110
Lys Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ala Tyr Ile Asn Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Val Ile Cys Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
50 55 60
Ile Ser Gln Asp Gly Ala Lys Tyr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Arg Arg
85 90 95
Pro Tyr Tyr Ser Gly Ala Tyr Phe Arg Thr Ala Asp Tyr Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser Gly Ser Gly Tyr Phe Tyr Ser Arg Leu Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Arg Glu Ala Val Ala Thr Ser
35 40 45
Tyr Pro Gly Ile Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
50 55 60
Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met
65 70 75 80
Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp
85 90 95
Ala Thr Trp Asn Thr Cys Gly Ile Thr Lys Thr Thr Tyr Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Arg Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Asn Ser
35 40 45
Asp Gly Thr Thr Ile Tyr Gly Asn Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
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Ser Glu Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Val Asp Ser
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Thr Cys Ala Pro Met Pro Ser Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ser Ile Asp Ser
35 40 45
Arg Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile
50 55 60
Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu
65 70 75 80
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Asp Gly Tyr
85 90 95
Gly Leu Glu His Ile Cys Ile Pro His Tyr Tyr Ala Met Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Glu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Arg Arg Ala Cys Met Gly Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala Ile Tyr Thr
35 40 45
Ser Gly Gly Met Thr Phe Tyr Asp Ala Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Asp Tyr Cys Ala Thr Asn Ala Arg Phe Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagagcggcg gcggcagcgt gcagcccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggcgccacct tcatcaactg gagcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gaggtggtgg ccgccatcga gagcggcggc agccccacct acgccgacag cgtgaaggac 180
aggttcaccc tgagcaccga cgtggccaag aacatcctgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgccg acaccgccat gtactactgc gccgccaaga aggtgtgggc cagggagttc 300
gcctactggg gccagggcac ccaggtgacc gtgagcagc 339
<210> 22
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacatct acagcaggaa ctgcgtgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcatcg ccgccctgta caccgccggc ggctacacct actacagcgc cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg ccaggcccag caacagcctg 300
acctgcggca tcgccaccat caccaccgac gacgtgtggg gccagggcac ccaggtgacc 360
gtgagcagc 369
<210> 23
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct acagcaccta ctgcatggcc tggttcaggc aggccctggg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccggcatcga cagcgacggc agcaccacct acgccgacag cgtgaagggc 180
aggttcacca tcagcaagga caacgccaag gacaccctgt acctgcagat ggacagcctg 240
aagcccgagg acaccgccat gtactactgc gccgccctga gccccaggtg cgacttcgac 300
aggagcagca gggtgaccaa ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 24
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccaccagc 60
ggcgtgacct acaggaggac ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccatcta caccagcggc ggcttcacct tctacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacacc 240
ctgaagcccg aggacaccgg catctactac tgcgccgccg aggccggcga cgagtgcagc 300
gccagcagcg tgttcaggag ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 25
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct acagcggcat ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccatcta caccaacggc gagtacacct actacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg acaggaacac ctgcggcctg 300
aggggcgact tctacaacta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 26
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacaccg gcaggaggaa ctgcatgggc tggttcaggc aggccaccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccatcta cagcggcgac atcaccttct acggcgacag cgtgaggggc 180
aggttcacca tcagcaggga cgacgccaag aacgccgtgt acctgcagat ggacaggctg 240
aagcccgagg acaccgccat gtactactgc gccgccggcc ccggcgacta ctgcagcacc 300
aggcccttcg ccttcaacta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgtggtgagc 60
ggctacacca gcaggcactg catgggctgg ttcaggcagg cccccggcaa ggagagggag 120
ggcgtggccg ccctgtaccc cgccaccggc agcgccttct acggcgacag cgtgaagggc 180
aggttcacca tcagccagga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgacg acaccgccct gtactactgc gccgtggaga gcaccagcct gtgcgccgcc 300
aggaccgtgc ccagcttcaa gttcaggggc cagggcaccc aggtgaccgt gagcagc 357
<210> 28
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg caccgccagc 60
ggcttcacct tcggcgacgc cgacatgggc tggtacaggc aggcccccgg caacgagtgc 120
gagctggtga gcagcctggg cgacaacggc agcacctact acgccgacag cgtgaagggc 180
aggttcacca tcagccagga caacgccaag aacaccgtgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgagg acaccgccgt gtactactgc gccgccgaga ggctgtggac cgccagcacc 300
gtggtgcccg acaccccctg cctggacgag atcgaggact tcggctactg gggcaggggc 360
acccaggtga ccgtgagcag c 381
<210> 29
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgtggtgagc 60
ggcaacatgt acaggaggaa ctgcatcggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccatcta caccgccggc ggctacagct actacggcga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacccc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacaac 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccaccg acggcaggga cggcgacctg 300
tgcgccgcca ggagcgactt caggtactgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
<210> 30
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacaccc acgactacag ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagagggtgg ccagcatgta caccggcggc gccgccacct actacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcgccca ggacaacgcc aagaacaccc tgttcctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg acaccaggcc catcgtggac 300
aggtggtgcg gcctgccctg gcccctgtac accggccagg gcacccaggt gaccgtgagc 360
agc 363
<210> 31
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagagcggcg gcggcagcgt gcagagcggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct tcaggaggta ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgtgctgta caccggcgtg gacatcacct actacgccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaagaccc tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc cctgtactac tgcgccgccg acagcggccc cctgtgcggc 300
ctgggcatcc agttcggcta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
<210> 32
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacca tcaactacag gatgggctgg ttcaggcagg cccccggcaa ggagagggag 120
ggcgtggcca tggccagcgc catcagcgag gactacgccg acagcgtgaa gggcaggttc 180
agcatcagca gggacagcgc caagaacacc ctgtacctgc agatgaacag cctgaagccc 240
gaggacaccg gcatgtacta ctgcgccgcc ggcagggtgt ggggcaggct gtggaacccc 300
gacgactaca acagctgggg ccagggcacc caggtgaccg tgagcagc 348
<210> 33
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg caccgccagc 60
ggcatcacct acagcaggaa ctgcctgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagtgggtgg ccaccatcta caccagcacc ggcaccacct acttcgacga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccc tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg ccgtgagcgg ctggagcgtg 300
tgcagcagga gcaccaagta caactactgg ggccacggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
<210> 34
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gagagcggcg gcggcagcgt gcagaccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct acagcagcta ctgcatggcc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccctgga cagcgacggc agcaccacct acgccgacag cgtgaagggc 180
aggttcaccg tgagcaagga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgagg acaccgccat gtactactgc gccgccgacc tgacctgcta ctgcagcgac 300
ggctactgct acaacggcga cgagtacaac tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 35
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaaagcggcg gcggcagcgt gcaggcgggc ggcagcctgc gcctgagctg cgtggcgagc 60
ggcgtgacct ttagccgcag ctgcattggc tggtttcgcc agattccggg caaagaacgc 120
gaaggcgtgg cggtggtgta taccggcggc cgcagcattg attatagcgc gtatgtggat 180
agcgtgaaag gccgctttac cattagccat gataacgcgt ggaacaccgt gtatctgcag 240
atgaacagcc tgaaaccgga agataccgcg atgtattatt gcgcggcgga ttttctgctg 300
caggaaccgt gcaccgtgct gagcagccgc ggctttaaat tttggggcca gggcacccag 360
gtgaccgtga gcagc 375
<210> 36
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
gagtacgcct acatcaacta ctgcatgggc tggttcaggc aggtgcccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgtgatctg cagcggcggc ggcgccacct actacaccga cagcgtgaag 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacggcgcc aagtacaccc tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc catgtactac tgcgccgccg gcaggaggcc ctactacagc 300
ggcgcctact tcaggaccgc cgactacaac tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 37
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagagcggcg gcggcagcgc ccaggccggc ggcagcctga ggctgagctg caccgccagc 60
ggcagcggct acttctacag caggctgtgc atgggctggt tcaggcaggc ccccggcacc 120
ggcagggagg ccgtggccac cagctacccc ggcatcggca gcacctacta cgccgacagc 180
gtgaagggca ggttcaccat cagccaggac aacgccaaga acaccatgta cctgcagatg 240
aacagcctga agcccgagga caccgccatg tactactgcg ccgccgacgc cacctggaac 300
acctgcggca tcaccaagac cacctacgcc tactggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct acagcaggta ctgcatgggc tggttcaggc agacccccgg caagggcagg 120
gagggcgtgg ccagcatcaa cagcgacggc accaccatct acggcaactt cgtgaagggc 180
aggttcacca tcagcgagga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg 240
aagcccgagg acaccgccat gtactactgc gccgccaggg tggacagcac ctgcgccccc 300
atgcccagct ggttcaccta ctggggccag ggcacccagg tgaccgtgag cagc 354
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga gggtgagctg cgccgccagc 60
ggctacacct acagcagcta ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccagcatcga cagcaggggc agcaccacct acgccgacag cctgaagggc 180
aggttcacca tcagcaagga caacgccaag aacaccctgt acctgcagat gaacaacctg 240
aagcccgagg acaccgccaa gtactactgc gccgccggcg acggctacgg cctggagcac 300
atctgcatcc cccactacta cgccatgaac tactggggcg agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gagagcggcg gcggcagcgt gcaggccggc ggcagcctga ggctgagctg cgccgccagc 60
ggcttcacct acaggagggc ctgcatgggc tggttcaggc aggcccccgg caaggagagg 120
gagggcgtgg ccgccatcta caccagcggc ggcatgacct tctacgacgc cagcgtgagg 180
ggcaggttca ccatcagcca ggacaacgcc aagaacaccg tgtacctgca gatgaacagc 240
ctgaagcccg aggacaccgc cacctactac tgcgccgccg gcggcggcga ctactgcgcc 300
accaacgcca ggttcttcaa ctactggggc cagggcaccc aggtgaccgt gagcagc 357
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<211> 8
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Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly Ile Cys
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Gly Tyr Thr Phe Arg Arg Tyr Cys
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Gly Tyr Thr Ile Asn Tyr Arg
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Gly Phe Thr Tyr Arg Arg Ala Cys
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Ile Tyr Thr Ser Gly Gly Phe Thr
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Leu Gly Asp Asn Gly Ser Thr
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Ala Ser Ala Ile Ser Glu
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
Asn
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Ala Ala Asp Arg Asn Thr Cys Gly Leu Arg Gly Asp Phe Tyr Asn Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Gly Pro Gly Asp Tyr Cys Ser Thr Arg Pro Phe Ala Phe Asn
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Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Glu Arg Leu Trp Thr Ala Ser Thr Val Val Pro Asp Thr Pro
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20 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Ala Thr Asp Gly Arg Asp Gly Asp Leu Cys Ala Ala Arg Ser Asp Phe
1 5 10 15
Arg Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Ala Val Ser Gly Trp Ser Val Cys Ser Arg Ser Thr Lys Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Ala Ala Asp Phe Leu Leu Gln Glu Pro Cys Thr Val Leu Ser Ser Arg
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Gly Phe Lys Phe
20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Gly Arg Arg Pro Tyr Tyr Ser Gly Ala Tyr Phe Arg Thr Ala
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Asp Tyr Asn Tyr
20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Ala Gly Asp Gly Tyr Gly Leu Glu His Ile Cys Ile Pro His Tyr
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Tyr Ala Met Asn Tyr
20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Ala Ala Gly Gly Gly Asp Tyr Cys Ala Thr Asn Ala Arg Phe Phe Asn
1 5 10 15
Tyr
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
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Cys Thr Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Thr Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Thr Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Val Val Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ser Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Thr Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser
20
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Val Val Ala
1 5 10 15
Ala
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ile Ala
1 5 10 15
Ala
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Leu Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 114
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
<210> 115
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Asn Glu Cys Glu Leu Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Arg Val Ala
1 5 10 15
Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Val
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Met
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ile Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
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Val
<210> 123
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Val
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Gly Arg Glu Ala Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala
1 5 10 15
Ser
<210> 127
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Leu Ser Thr Asp Val
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 128
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
Tyr Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 129
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asp Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 130
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 131
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 132
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
Phe Tyr Gly Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
1 5 10 15
Ala Lys Asn Ala Val Tyr Leu Gln Met Asp Arg Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 133
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
Phe Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 134
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 135
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Pro Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 136
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 137
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 138
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ser
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Gly Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 139
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
Tyr Phe Asp Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 140
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 141
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
Ala Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Asn
1 5 10 15
Ala Trp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 142
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Gly
1 5 10 15
Ala Lys Tyr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 143
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 144
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
Ile Tyr Gly Asn Phe Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Glu Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 145
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
Thr Tyr Ala Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Lys Tyr Tyr Cys
35
<210> 146
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
Phe Tyr Asp Ala Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 148
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
Thr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 149
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
Trp Gly Glu Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 150
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
Trp Gly His Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 151
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10

Claims (8)

1.针对sST2的单域抗体，其特征在于：所述的单域抗体由重链构成，重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；
所述的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列为下述（1）或（2）：
（1）SEQ ID NO:48所示的CDR1，SEQ ID NO:67所示的CDR2，SEQ ID NO:87所示的CDR3；
（2）SEQ ID NO:42所示的CDR1，SEQ ID NO:61所示的CDR2，SEQ ID NO:81所示的CDR3。
2.根据权利要求1所述的针对sST2的单域抗体，其特征在于：所述单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 2所示。
3.权利要求1或2所述的针对sST2的单域抗体的Fc融合抗体。
4.一种编码权利要求1或2所述的针对sST2单域抗体的核苷酸分子，其特征在于：其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：22所示。
5.一种表达载体，其特征在于，其包含编码权利要求1或2所述的单域抗体或者权利要求3所述的Fc融合抗体的核苷酸分子或者权利要求4所述的核苷酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，其可以表达出权利要求1或2所述的针对sST2的单域抗体，或其包含权利要求5所述的表达载体。
7.包括权利要求1或2所述的单域抗体的sST2-ELISA检测试剂盒。
8.权利要求1或2所述的针对sST2的单域抗体在制备sST2-ELISA检测试剂盒中的应用，或权利要求1或2所述的针对sST2的单域抗体在制备用于检测人体中sST2蛋白的试剂盒中的应用，或权利要求1或2所述的针对sST2的单域抗体在分离纯化sST2蛋白融合蛋白中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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CN112920275A (zh) * 2019-12-06 2021-06-08 菲鹏生物股份有限公司 可特异性结合sST2的结合蛋白、试剂和试剂盒

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