CN110003336B

CN110003336B - Pd-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒

Info

Publication number: CN110003336B
Application number: CN201910301975.0A
Authority: CN
Inventors: 李胜华; 包朝乐萌; 许莎莎; 李莹莹; 余祥
Original assignee: Shenzhen Prijin Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shenzhen Prijin Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2039-04-12
Also published as: CN110003336A

Abstract

本发明公开一种PD‑1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒，其中，该PD‑1单域抗体包括四个框架区域以及三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1：Ser Tyr Ala Met Gly；CDR2：Ala Val Ser Arg Ser Gly Leu Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys；CDR3：Ala Arg Asp Glu Arg Val Tyr Ser Asp Ile Asp Phe Phe Arg Pro Phe Asp Tyr Gly。本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合PD‑1蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合PD‑1蛋白的活性高。

Description

PD-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种PD-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒。

背景技术

程序性死亡分子受体 1（programmed death 1，PD⁃1）属于CD28／CTLA-4家族，是一种I型跨膜受体蛋白，由268个氨基酸组成，包括胞内区、跨膜区以及胞外免疫球蛋白可变区。在胞内区中有两个独立的磷酸化位点，分别为N端的免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)以及c端的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，可通过T细胞抗原和细胞因子受体进行激活，具有调节T细胞间抑制性信号传导的作用。

PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，功能是抑制细胞的激活，这是免疫系统的一种自稳机制，避免过度的T/B细胞激活会引起自身免疫病。然而，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子。肿瘤细胞会诱导微环境中PD-1通路持续激活，抑制T细胞功能，导致其无法杀伤肿瘤细胞，从而实现肿瘤细胞的免疫逃逸。而该通路的拮抗剂——例如PD-1的抗体可以阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，使T细胞能够对肿瘤细胞进行杀伤。

然而，现有的PD-1单域抗体与抗原的结合活性低。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种PD-1单域抗体，旨在解决现有PD-1单域抗体活性低的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种PD-1单域抗体，所述PD-1单域抗体如SEQ IDNO：7所示，包括四个框架区域以及三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，

CDR1：Ser Tyr Ala Met Gly；

CDR2：AlaVal SerArgSerGlyLeu Lys ThrGly TyrAla Asp Ser Val Lys；

CDR3：AlaArg AspGluArg Val Tyr Ser Asp Ile Asp PhePheArg Pro Phe AspTyr Gly。

在一实施例中，所述四个框架区分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其中，

FR1：Asp Val GlnLeuGlnAlaSerGlyGlyAlaGln Val Gln Pro GlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyArgThrPheSer;

FR2：TrpPheArgGlnAlaPro Gly Lys GluArgGluPhe Val Ala ;

FR3：GlyArgPheThr IleSerArg Asp AsnAla Lys AsnThr Val TyrLeuGln MetAsnSerLeu Lys Pro Glu AspThrAla Val Tyr TyrCysAla;

FR4：Tyr TrpGlyGlnGlyThrGln Val Thr ValSerSer。

本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码PD-1单域抗体，所述PD-1单域抗体包括四个框架区域以及三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，

CDR1：Ser Tyr Ala Met Gly；

CDR2：AlaVal SerArgSerGlyLeu Lys ThrGly TyrAla Asp Ser Val Lys；

CDR3：AlaArg AspGluArg Val Tyr Ser Asp Ile Asp PhePheArg Pro Phe AspTyr Gly。

在一实施例中，所述核苷酸序列如下：

GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGCGCAGGTGCAGCCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACTTTCAGTAGCTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTGTTAGTCGGAGTGGTCTTAAGACTGGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGCGCAGCACGTGATGAGAGAGTCTATAGTGATATTGACTTCTTTCGTCCGTTTGATTATGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括PD-1单域抗体，或者包括如核苷酸序列；所述PD-1单域抗体包括四个框架区域以及三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1：Ser Tyr Ala Met Gly；CDR2：AlaVal SerArgSerGlyLeu Lys ThrGly TyrAla AspSer Val Lys；CDR3：AlaArg AspGluArg Val Tyr Ser Asp Ile Asp PhePheArg Pro PheAsp Tyr Gly；所述核苷酸序列为：GATGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGCGCAGGTGCAGCCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACTTTCAGTAGCTATGCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTGTTAGTCGGAGTGGTCTTAAGACTGGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGCGCAGCACGTGATGAGAGAGTCTATAGTGATATTGACTTCTTTCGTCCGTTTGATTATGGCTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合PD-1蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合PD-1蛋白的活性高，分子量小，生产制造成本低，易改造。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明第一轮PCR单域抗体基因电泳图；

图2为图1中1道中750bp-500bp，2道和3道DNA回收后进行第二轮PCR单域抗体基因电泳图；

图3为蛋白表达纯化图；

图4为本发明PD-1单域抗体与PD-1抗原结合活性图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实提出了一种PD-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒。下述内容将针对所述PD-1单域抗体及其筛选过程作详细介绍。

首先，本发明的PD-1单域抗体具有四个框架区和三个互补决定区。其中，三个互补决定区序列如下：

CDR1：Ser Tyr Ala Met Gly；

CDR2：AlaVal SerArgSerGlyLeu Lys ThrGly TyrAla Asp Ser Val Lys；

CDR3：AlaArg AspGluArg Val Tyr Ser Asp Ile Asp PhePheArg Pro Phe AspTyr Gly。

当然，PD-1单域抗体的框架区序列可以有多种。下述内容中以如下四个框架区为具体实施例进行详细阐述。

FR1：Glu Val GlnLeu Val GluSerGlyGlyGlyLeu Val GlnAlaGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyGlyThrPheSer；

FR2：TrpPheArgGlnAlaPro Gly Lys GluArgGluPhe Val Thr；

FR3：GlyArgPheThr IleSerArg Asp AsnAla Lys AsnThr Met PheVal Gln MetAsnSerLeu Lys Pro Glu AspThrAla Val Tyr TyrCysGlu；

FR4：CysTrpGlyGlyGlyThrGln Val Ala Val SerSer。

针对该PD-1单域抗体，本发明构建方式分为抗体库的构建、特异性噬菌体的筛选、特异性阳性单克隆的筛选、PD-1单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、纯化。下述内容将针对每一步进行详细阐述。

一、抗体库的构建

PD-1抗原：厂家Acro，货号PD1-H82E4。

使用1mg上述抗原与等体积福氏佐剂混合。选择成年健康的羊驼，注射该抗原，分6次免疫，第5次免疫后，采取羊驼血清，通过化学发光的方法，测定抗原免疫效价。

a₀: 分离淋巴细胞。当免疫效价达到1万倍以上时，采全血150ml，使用QIAGEN试剂盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit （50），货号，52304）将淋巴细胞分离。

b₀:裂解。将分离后的淋巴细胞裂解，然后进行CDNA文库，使用QIAGEN试剂盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit （50），货号，52304），测定得到CDNA浓度。

c₀：巢式PCR扩增。用cDNA合成试剂盒（MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction KitVer.4.0，TAKARA公司），采用巢式PCR方法，进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段；

第一轮PCR扩增，可得到大于800bp的普通抗体基因片段，800bp~500bp之间的为缺失轻链的重链抗体基因片段，以及500bp的重链抗体可变区片段VHH. 通过电泳，筛选出800bp~500bp的基因片段和500bp的基因片段。

d₀：切胶回收，将步骤c0中800bp~500bp的基因片段切胶回收。具体请参阅图1，1号带为普通抗体DNA和重链抗体DNA，能够看到其中的两条亮带，有大于800bp的（普通抗体DNA），也有在500bp~750bp之间的（重链抗体DNA），将该图中位于750bp~500bp的条带切胶回收；2号和3号带为重链抗体可变区片段VHH，大小在500bp；将2号和3号带目的条带也进行回收。

e₀：VHH目的基因扩增。以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用VHH 特异性引物经第二轮PCR扩增，得到VHH目的基因（500bp）。请参阅图2，可以看到一条亮带，VHH目的基因大约为500bp，也就是该亮带中混杂有多种500bp左右的VHH目的基因。

上述第一轮PCR引物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3核苷酸序列。

其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2配对使用，扩增得到图1中1道所示的两个条带；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3配对使用，扩增得到图1中2道所示的一条条带。

第二轮PCR引物包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列。SEQ ID NO：4和SEQID NO：5配对使用，得到图2所示的500bp目的基因。

f₀：转入TG1感受态细胞。将上述得到的VHH片段连接到pHEN6噬菌体展示载体质粒（通过BamHI,XhoI双酶切），之后将VHH 片段及pHEN6 载体（ZL20111028003.1）经连接酶连接，电转化至TG1感受态细胞中，然后将感受态细胞涂布平板，经菌落PCR验证VHH基因插入率。

当验证VHH基因插入成功后，对重组基因进行克隆效率检测：取电转化菌液涂布LB/ Amp 平板上，32℃，过夜培养，次日用菌落PCR 的方法验证抗体的连接效率。

其中，菌落PCR 的方法如下：1、用高压灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落，先在抗性平板上点单克隆保存（标记），然后置于20ul Triton－x100（或去离子水）中搅和。2、将装有20ul Tritonx－100的EP管在100°C下煮2分钟。3、取1ul上清为模板，加入PCR体系进行PCR反应，PCR体系可以为20ul。4、琼脂糖凝胶电泳观察结果。

当噬菌体抗体库的连接效率低于90%时，说明在操作失误，需要重复上述实验过程；当噬菌体抗体库的效率达到90%时，进行下一步操作。

g₀：扩大培养，保藏。将电转化菌液涂布LB / Amp 平板上，32℃，过夜培养物用2YT培养基洗下，以1:1000比例在2YT培养基下进行扩大培养，加入辅助噬菌体M13K07（Invitrogen）进行感染，过夜培养，离心，收集上清后加入20%PEG-2.5M NaCl混匀（噬菌体在上清中），离心收集沉淀，加入PBS和甘油进行重悬，并保藏于-80℃备用。

二、特异性噬菌体的筛选

由于经过巢式PCR扩增出来的VHH片段有多种，而这些片段中，并非所有这些基因片段都是目标片段，将这些片段VHH片段转入噬菌体后，需要对目标噬菌体进行纯化，下述内容为纯化目标噬菌体的步骤：

a₁: CPBS溶液的配备。将少量无脂牛奶加入到PBS溶液中，其中，无脂牛奶的占比在1%-5%（封闭作用）；将溶解在CPBS溶液中的PD-1蛋白稀释至150μg/ml；

b₁：将PD-1蛋白稀释液后，150μl/孔进行包被；

c₁：静置，并弃包被液，加入封闭液（1% CPBS）300μl/孔，37℃封闭2h；

d₁：将筛选出来的噬菌体加入到微孔中，并加入封闭液混匀至每孔体积150μl；

e₁：室温孵育2h（噬菌体的外壳上分泌抗体，抗体与PD-1蛋白结合）；

f₁：筛孔分别用PBST（含0.05%Tween20）、PBS各洗涤10次，每次2min，将没有结合的噬菌体洗掉；

g₁：加入TEA到筛孔中洗脱噬菌体，吹吸混悬均匀，室温静置10min；

h₁：再次吹吸混悬均匀后加入到预冷的1M Tris-HCl中混匀，进行滴度的测定；

i₁:扩增并纯化扩增后的噬菌体。

上述步骤a₁至步骤i₁，重复三轮，并以步骤i₁的噬菌体作为下一轮步骤d₁中的加入微孔的噬菌体（第一轮的噬菌体来源于上述-80℃保藏备用的，第二轮筛选包被浓度为10μg/ml，第三轮筛选包被浓度为10μg/ml，二、三轮各150μl/孔进行包被）。

筛选结果详见下表

上述步骤a₁至步骤i₁以包被PD-1抗原作为靶标，采用固相筛选法从总噬菌体抗体库进行3轮筛选，经过三轮筛选，洗脱下来的噬菌体滴度增加，也就是说PD-1特异性噬菌体得到了高效富集。

三、特异性阳性单克隆的筛选

虽然上述噬菌体已经得到了高效富集，但是任然残留有少量非特异性的噬菌体，在在下述内容中，将进一步纯化特异性PD-1单域抗体基因。具体步骤如下：

a₂：通过SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列，对上述已经富集的PD-1特异性噬菌体进行PCR扩增，获得的特异性PD-1单域抗体基因（带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物）；

b₂：用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理 PCR 产物和pSJF2载体（ZL201110280031），经 T4 连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-pSJF2；

c₂：从生长菌落的琼脂平板上随机挑取多个单菌落，然后接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中；

d₂：培养4小时后，将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；

e₂：向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导；

f₂：培养过夜后，收获表达蛋白的菌上清液；

g₂：以PD-1抗原进行ELISA测定，选出Anti-PD-1阳性克隆ELISA测定结果；

h₂：挑选出的PD-1阳性克隆，经DNA测序以鉴定抗PD-1单域抗体克隆的基因序列SEQ ID NO：6。

SEQ ID NO：6序列如下：

四、PD-1单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、纯化

得到上述阳性单克隆后，需要将其表达方可得到PD-1单域抗体，后续主要是通过大肠杆菌表达，然后纯化，即可得到所需的PD-1单域抗体。具体操作过程如下：

a₃：将上述含有质粒PD-1的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB 培养板上，37℃过夜。在此，由于pSJF2载体自身对氨基苄青霉素具备抗性，从而，在含氨基苄青霉素的LB 培养板上，只有含有pSJF2载体的大肠杆菌能生长，避免了其它杂菌的干扰；

b₃：挑选单个菌落接种于5ml 的含氨基苄青霉素的 LB 培养液中，37℃，摇床培养过夜；

c₃：转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中；

d₃：37℃摇床培养，240 转/分，培养到OD值达0.4~0.6时，加入 0.5~1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌。

e₃：高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；

f₃：经Ni+离子亲和层析获得纯度达95%以上的蛋白。

具体请参照图3，在图3中，M为蛋白分子标准，条带1为破菌后总蛋白粗提样品。

条带2为总蛋白粗提过镍柱后的样品，说明只有少量的样本被洗脱下来，Ni+柱中还剩余有大量的样本蛋白。

条带3为用含有40毫摩咪唑的洗脱过脱镍柱后剩余的样品，说明经过进一步洗脱后，大部分蛋白都被洗脱下来。

条带4为用含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明Ni+柱中，没有被洗脱下来的蛋白极少。

条带5为用含有400毫摩咪唑的洗脱液过镍柱后剩余的样品，通过此条带可以看出，Ni+柱的蛋白几乎全部被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白较纯。

五、单域抗体与PD-1抗原结合活性测定

上述过程已经将目标抗体筛选并纯化出来，为了验证目标抗体的活性，实验步骤如下：

a₄：以0.05M Na2CO3·NaHCO3（pH 9.5）稀释PD-1抗原至2µg/ml，100µl/孔，抗原包被96孔板，4℃孵育过夜；

b₄：用PBS洗板三次，300µl 2%BSA（或1%CPBS）封闭96孔板，37℃，孵育2小时；

c₄：加入不同稀释浓度的纯化的PD-1单域抗体，按100µl/孔加入，37℃，孵育1小时；

d₄：用0.05%PBST洗板三次；

e₄：加5000倍稀释的antiMyctag antibody（HRP），按100µl/孔加入，37℃，孵育1小时；

f₄：用0.05%PBST洗板三次，加 TMB100µl/孔，避光室温静置10分钟。g4：加入2MH2SO4 50μl/孔终止反应；

g₄：用酶标仪测定450 nm波长下的样品OD值。

从图4可以看出，即便PD-1单域抗体与PD-1抗原结合后的浓度在0.016µg/ml时，依然可以检测到较高的活性。

另外，使用分光光度计对纯化后得到的蛋白进行浓度测定，测得经表达、提取、纯化后蛋白总量为5.92mg。因实施例中所用表达体系为200ml，因此，本实施例中构建的PD-1单域抗体原核表达系统单位表达量为 2.96 mg/100ml

通过分析计算最终获得的表达量，可以证明实施例中所用的表达体系对蛋白的表达效率，即单位表达体积可获得的蛋白质量。通常情况下，表达量达到0.5mg/100ml，即认为体现出了较高的表达水平，本次PD-1单域抗体的表达量达到了2.96 mg/ml，远超行业水准。

最后，由于本发明中，PD-1单域抗体是一种纳米抗体，分子量小，制造成本低，利于后续对其进行改造。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<120> PD-1单域抗体、核苷酸序列及试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

cgccatcaag gtaccagttg a 21

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

cgggatccca ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

ccgctcgagt acttcattcg ttcctgagga gacggt 36

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

ccgctcgagt gaggagacgg tgacctgg 28

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 5

cgggatccga ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36

<210> 6

<211> 384

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 6

gatgtgcagc tgcaggcgtc tgggggagcg caggtgcagc ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg cactttcagt agctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct gttagtcgga gtggtcttaa gactggctat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgcgc agcacgtgat 300

gagagagtct atagtgatat tgacttcttt cgtccgtttg attatggcta ctggggccag 360

gggacccagg tcaccgtctc ctca 384

<210> 7

<211> 128

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 7

Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Ala Gln Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Val Ser Arg Ser Gly Leu Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Asp Glu Arg Val Tyr Ser Asp Ile Asp Phe Phe Arg Pro

100 105 110

Phe Asp Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Claims

1.一种PD-1单域抗体，其特征在于，由四个框架区域以及三个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3组成，其中，

CDR1：Ser Tyr Ala Met Gly；

CDR2：Ala Val Ser Arg Ser Gly Leu Lys Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys；

CDR3：Ala Arg Asp Glu Arg Val Tyr Ser Asp Ile Asp Phe Phe Arg Pro Phe AspTyr Gly；

所述四个框架区分别为FR1、FR2、FR3、FR4，其中，

FR1：Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Ala Gln Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser；

FR2：Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala；

FR3：Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu GlnMet Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala；

FR4：Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。

2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的PD-1单域抗体。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如下：

4.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的PD-1单域抗体，或者包括如权利要求2或3所述的核酸。