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CN110003334B - 多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 - Google Patents

多肽、cd19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种多肽、CD19单域抗体、核苷酸序列及试剂盒，其中，该多肽包括4个框架区和3个可变区，该多肽序列如下：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Met Asn Trp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Tyr Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr His Cys Ala Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。本发明技术方案可特异性结合CD19蛋白，并拥有高结合活性。

Description

多肽、CD19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种多肽、CD19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒。
背景技术
CD19 是表达于B 淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，是由556 个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白。它与B细胞活化、信号传导及生长调节密切相关。作为B淋巴细胞表面的一种功能受体分子，CD19在B细胞抗原受体(BCR)识别抗原时构成B细胞双重抗原结合模型，参与B细胞内Ca2+的转运，调节B细胞的活化与增殖。CDl9作为重要标记物被广泛应用于白血病、淋巴瘤及免疫系统疾病的诊断和预后判断。同时，由于CD19在上述肿瘤细胞中特异性表达，也是免疫治疗的一个重要靶点。因此，近年来大量针对CD19的新型抗体药物不断被研制开发，然而，现有技术中CD19抗体的表达量偏低，结合活性偏低，分子量大，生产成本高，也不易改造。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种多肽序列，旨在至少解决上述CD19抗体存在的一个技术问题。
为实现上述目的，本发明提出一种多肽（SEQ ID NO：7），序列如下：
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly SerLeu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Met Asn TrpLeu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Thr Gly GlySer Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Tyr AsnAla Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala ArgTyr His Cys Ala Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr TrpGly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
本发明还提出一种CD19单域抗体，包括多肽序列，所述多肽序列如下：Glu ValGln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Ile Leu SerCys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Met Asn Trp Leu Arg Gln ThrPro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Thr Gly Gly Ser Arg Thr TyrTyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Tyr Asn Ala Lys Asn ThrLeu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr His Cys AlaArg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly ThrGln Val Thr Val Ser Ser。
本发明还提供一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码的多肽或CD19单域抗体中包含有如下序列：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Met AsnTrp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Thr GlyGly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg TyrAsn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr AlaArg Tyr His Cys Ala Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
在一实施例中，所述核苷酸序列如下：
GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGATACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCATTAGTTATGACATGAACTGGCTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCCTGAGTGGGTCTCAGGTATTAATACTGGTGGTAGTAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGACCGATTCACCGTCTCCAGATACAATGCCAAAAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGGTATCACTGTGCGCGTCAAGTTGGGTACAGCACTCTAGGATATGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明还提供一种试剂盒，包括多肽或者CD19单域抗体，所述多肽和所述CD19单域抗体包含序列如下：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln ProGly Gly Ser Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr AspMet Asn Trp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile AsnThr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val SerArg Tyr Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu AspThr Ala Arg Tyr His Cys Ala Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu TyrAsp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser；
或者所述试剂盒包括核苷酸序列，所述核苷酸序列如下：GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGATACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCATTAGTTATGACATGAACTGGCTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCCTGAGTGGGTCTCAGGTATTAATACTGGTGGTAGTAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGACCGATTCACCGTCTCCAGATACAATGCCAAAAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGGTATCACTGTGCGCGTCAAGTTGGGTACAGCACTCTAGGATATGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
本发明还提供一种CD19单域抗体获取方法，包括以下步骤：
步骤一、获取羊驼经CD19抗原免疫后的淋巴细胞；
步骤二、得到淋巴细胞CDNA文库；
步骤三、采用巢式PCR方法扩增上述CDNA，得到抗体重链可变区VHH基因片段；其中所采用的引物为SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：5；
步骤四、将VHH基因片段插入到pHEN6 噬菌体展示载体质粒；
步骤五、将插入VHH基因片段的质粒转入TG1感受态细胞中；
步骤六、采用辅助噬菌体M13K07加入上述TG1感受态细胞，生产噬菌体；
步骤七、将稀释后的CD19抗原加入到微孔中进行包被；
步骤八、将感染后的噬菌体M13K07加入到上述微孔中，然后用0.05%Tween20和PBS对筛孔分别洗涤多次；
步骤九、加入TEA到筛孔中洗脱噬菌体，吹吸混悬均匀；
步骤十、重复步骤八和步骤九至少两次，以对CD19特异性噬菌体进行富集；
步骤十一、对步骤十中噬菌体CD19单域抗体基因进行PCR扩增，其中，PCR引物为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5；
步骤十二、将步骤十一中的PCR产物经过连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-pSJF2；
步骤十三、将sdAb-pSJF2质粒转入大肠杆菌中；
步骤十四、将含有sdAb-pSJF2质粒的大肠杆菌接种在含氨基苄青霉素的LB 培养板上培养，培养到OD 值达0.4~0.6 时，加入0.5~1.0mM IPTG，继续培养过夜；
步骤十五、高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白，并经Ni+离子亲和层析获得高纯度CD19单域抗体。
在一实施例中，在步骤七中，CD19抗原稀释前，溶解在CPBS中，其中CPBS为PBS中添加1%~5%的无脂牛奶。
本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合CD19蛋白的单域抗体，该抗体特异性结合CD19蛋白的活性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明第一轮PCR单域抗体基因电泳图；
图2为第二轮PCR单域抗体基因电泳图；
图3为蛋白表达纯化图；
图4为本发明CD19单域抗体与CD19抗原结合活性图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实提出了一种多肽、CD19单域抗体、核苷酸序列及试剂盒。下述内容将针对所述多肽及其筛选过程作详细介绍。
首先，本发明的多肽具有四个框架区和三个互补决定区：
FR1：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlySer Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile；
CDR1：Ser Tyr Asp Met Asn；
FR2：Trp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser；
CDR2：Gly Ile Asn Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys；
FR3：Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Tyr Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr LeuGln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr His Cys Ala；
CDR3：Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp；
FR4：Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
一、抗体库的构建
CD19抗原：义翘神州，编号：11880-H08H。
使用2mg上述抗原与等体积福氏佐剂混合。选择成年健康的羊驼，注射该抗原，分8次免疫，第4次免疫后，采取羊驼血清，通过化学发光的方法，测定抗原免疫效价。
当免疫效价达到1万倍以上时，采全血130ml，使用QIAGEN试剂盒（QIAamp RNABlood Mini Kit （50），货号，52304）分离淋巴细胞。
将分离后的淋巴细胞裂解，得到CDNA文库，使用QIAGEN试剂盒（QIAamp RNA BloodMini Kit （50），货号，52304），测定得到CDNA浓度。
用cDNA合成试剂盒（MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0，TAKARA公司），采用巢式PCR方法，进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段。
第一轮PCR扩增，可得到大于800bp的普通抗体基因片段和800bp~500bp之间的缺失轻链的重链抗体基因片段，以及500bp的重链抗体可变区片段VHH。通过电泳，筛选出800bp~500bp的基因片段和500bp的基因片段，然后切胶回收。具体请参阅图1，1号带为普通抗体DNA和重链抗体DNA，能够看到其中的两条亮带，有大于800bp的（普通抗体DNA），也有在500bp~750bp之间的（重链抗体DNA），将该图中位于750bp~500bp的条带切胶回收；2号带为重链抗体可变区片段VHH，大小在500bp；将2号带目的条带也进行回收。
以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模板，用VHH 特异性引物经第二轮PCR扩增，得到VHH目的基因（500bp）。请参阅图2，可以看到一条亮带，VHH目的基因大约为500bp，也就是该亮带中混杂有多种500bp左右的VHH目的基因。
上述第一轮PCR引物包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3核苷酸序列。
其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2配对使用，扩增得到图1中1道所示的两个条带；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3配对使用，扩增得到图1中2道所示的一条条带。
第二轮PCR引物包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列。SEQ ID NO：4和SEQID NO：5配对使用，得到图2所示的500bp目的基因。
将上述得到的VHH片段连接到pHEN6噬菌体展示载体质粒（通过BamHI,XhoI双酶切），之后将VHH 片段及pHEN6 载体（ZL20111028003.1）经连接酶连接，电转化至TG1感受态细胞中，然后将感受态细胞涂布平板，经菌落PCR验证VHH基因插入率。
当验证VHH基因插入成功后，对重组基因进行克隆效率检测：取电转化菌液涂布LB/ Amp 平板上，32℃，过夜培养，次日用菌落PCR 的方法验证抗体的连接效率。
其中，菌落PCR 的方法如下：1、用高压灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落，先在抗性平板上点单克隆保存（标记），然后置于20ul Triton－x100（或去离子水）中搅和。2、将装有20ul Tritonx－100的EP管在100°C下煮2分钟。3、取1ul上清为模板，加入PCR体系进行PCR反应，PCR体系可以为20ul。4、琼脂糖凝胶电泳观察结果。
当噬菌体抗体库的连接效率低于90%时，说明在操作失误，需要重复上述实验过程；当噬菌体抗体库的效率达到90%时，进行下一步操作。
将电转化菌液涂布LB / Amp 平板上，32℃，过夜培养物用2YT培养基洗下，以1:1000比例在2YT培养基下进行扩大培养，加入辅助噬菌体M13K07 （Invitrogen）进行感染，过夜培养，离心，收集上清后加入20%PEG-2.5M NaCl混匀（噬菌体在上清中），离心收集沉淀，加入PBS和甘油进行重悬，并保藏于-80℃备用。
二、特异性噬菌体的筛选
由于经过巢式PCR扩增出来的VHH片段有多种，而这些片段中，并非所有这些基因片段都是目标片段，将这些VHH片段转入噬菌体后，需要对目标噬菌体进行富集，下述内容为富集目标噬菌体的步骤：
a1: CPBS溶液的配备。将少量无脂牛奶加入到PBS溶液中，其中，无脂牛奶的占比在1%-5%（封闭作用）；将溶解在CPBS溶液中的CD19蛋白稀释至80μg/ml ~150μg/ml，在此以100μg/ml为例进行操作；
b1：将CD19蛋白稀释液后，进行包被（具体以150μl/孔进行操作）；
c1：静置，并弃包被液，加入封闭液（1% CPBS）300μl/孔，37℃封闭2h；
d1：将筛选出来的噬菌体加入到微孔中，并加入封闭液混匀至每孔体积150μl；
e1：室温孵育2h（噬菌体的外壳上分泌抗体，抗体与CD19蛋白结合）；
f1：筛孔分别用PBST（含0.05%Tween20）、PBS各洗涤10次，每次2min，将没有结合的噬菌体洗掉；
g1：加入TEA到筛孔中洗脱噬菌体，吹吸混悬均匀，室温静置10min；
h1：再次吹吸混悬均匀后加入到预冷的1M Tris-HCl中混匀，进行滴度的测定；
i1:扩增并纯化扩增后的噬菌体。
上述步骤a1至步骤i1，重复三轮，并以步骤i1的噬菌体作为下一轮步骤d1中的加入微孔的噬菌体（第一轮的噬菌体来源于上述-80℃保藏备用的）。
筛选结果详见下表
上述步骤a1至步骤i1以包被CD19蛋白作为靶标，采用固相筛选法从总噬菌体抗体库进行3轮筛选，检测每轮洗脱下来的噬菌体滴度，由上表可以看出，随着筛选轮数的增加，包被浓度逐级减少，但洗脱下来的噬菌体滴度增加，也就是说CD19特异性噬菌体得到了高效富集。
三、筛选特异性阳性单克隆
虽然上述噬菌体已经得到了高效富集，但是仍然残留有少量非特异性的噬菌体，在下述内容中，将进一步纯化特异性CD19单域抗体基因。具体步骤如下：
a2：通过SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5核苷酸序列，对上述已经富集的CD19特异性噬菌体进行PCR扩增，获得的特异性CD19单域抗体基因（带有限制性内切酶BbsI和BamHI位点的PCR产物）；
b2：用限制性内切酶BbsI和BamHI分别处理 PCR 产物和pSJF2载体（ZL201110280031），经 T4 连接酶连接重组，而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb-pSJF2；
c2：从生长菌落的琼脂平板上随机挑取多个单菌落（例如50个至95个），然后接种在含有Amp的2YT液体培养基的96孔深孔培养板中；
d2：培养4小时后，将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固体平板上；
e2：向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导；
f2：培养过夜后，收获表达蛋白的菌上清液；
g2：以CD19抗原进行ELISA测定，选出Anti-CD19阳性克隆ELISA测定结果；
h2：挑选出的CD19阳性克隆，经DNA测序以鉴定抗CD19单域抗体克隆的基因序列SEQ ID NO：6。
SEQ ID NO：6序列如下：
GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGATACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCATTAGTTATGACATGAACTGGCTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCCTGAGTGGGTCTCAGGTATTAATACTGGTGGTAGTAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGACCGATTCACCGTCTCCAGATACAATGCCAAAAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGGTATCACTGTGCGCGTCAAGTTGGGTACAGCACTCTAGGATATGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
四、CD19单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、纯化
得到上述阳性单克隆后，需要将其表达方可得到CD19抗体，后续主要是通过大肠杆菌表达，然后纯化，即可得到所需的CD19单域抗体。具体操作过程如下：
a3：将上述含有质粒CD19的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB 培养板上，37℃过夜。在此，由于pSJF2载体自身对氨基苄青霉素具备抗性，从而，在含氨基苄青霉素的LB 培养板上，只有含有pSJF2载体的大肠杆菌能生长，避免了其它杂菌的干扰；
b3：挑选单个菌落接种于5ml 的含氨基苄青霉素的 LB 培养液中，37℃，摇床培养过夜；
c3：转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中；
d3：37℃摇床培养，240 转/分，培养到OD值达0.4~0.6时，加入 0.5~1.0mM IPTG，继续培养过夜，然后离心，收菌;
e3：高渗法裂解细菌，离心，收上清中可溶性单域抗体蛋白；
f3：经Ni+离子亲和层析获得纯度达95%以上的蛋白。
具体请参照图3，在图3中，M为蛋白分子标准，条带1为破菌后总蛋白粗提样品。
条带2为总蛋白粗提过镍柱后的样品，说明只有少量的样本被洗脱下来，Ni+柱中还剩余有大量的样本蛋白。
条带3为用含有40毫摩咪唑的洗脱过脱镍柱后剩余的样品，说明经过进一步洗脱后，大部分蛋白都被洗脱下来。
条带4为用含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品，说明Ni+柱中，没有被洗脱下来的蛋白极少。
条带5为用含有400毫摩咪唑的洗脱液过镍柱后剩余的样品，通过此条带可以看出，Ni+柱的蛋白几乎全部被洗脱下来，洗脱下来的目标蛋白较纯。
五、单域抗体与CD19抗原结合活性测定
上述过程已经将目标抗体筛选并纯化出来，为了验证目标抗体的活性，实验步骤如下：
a4：以0.05M Na2CO3·NaHCO3（pH 9.5）稀释CD19抗原至2 µg/ml，100µl/孔，抗原包被96孔板，4℃孵育过夜；
b4：用PBS洗板三次，300µl 2%BSA（或1%CPBS）封闭96孔板，37℃，孵育2小时；
c4：加入不同稀释浓度的纯化的CD19单域抗体，按100µl/孔加入，37℃，孵育1小时；
d4：用0.05%PBST洗板三次；
e4：加5000倍稀释的anti-His antibody（HRP），按100µl/孔加入，37℃，孵育1小时；
f4：用0.05%PBST洗板三次，加 TMB100µl/孔，避光室温静置10分钟。g4：加入2MH2SO4 50μl/孔终止反应；
g4：用酶标仪测定450 nm波长下的样品OD值。
从图4可以看出，即便CD19单域抗体与CD19抗原结合后的浓度在2µg/ml时，依然可以检测到较高的活性。
另外，使用分光光度计对纯化后得到的蛋白进行浓度测定，测得经表达、提取、纯化后蛋白总量为4.32mg。因实施例中所用表达体系为200ml，因此，本实施例中构建的CD19单域抗体原核表达系统单位表达量为 216 μg/ml菌液。
通过分析计算最终获得的表达量，可以证明实施例中所用的表达体系对蛋白的表达效率，即单位表达体积可获得的蛋白质量。通常情况下，表达量达到50μg/ml，即认为体现出了较高的表达水平，本次CD19单域抗体的表达量达到了216 μg/ml，处于较高行业水准。
最后，由于本发明中，CD19单域抗体是一种纳米抗体，利于后续对其进行改造。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<120> 多肽、CD19单域抗体及其制备方法、核苷酸序列及试剂盒
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
cgccatcaag gtaccagttg a 21
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
cgggatccca ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
ccgctcgagt acttcattcg ttcctgagga gacggt 36
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
ccgctcgagt gaggagacgg tgacctgg 28
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
cgggatccga ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36
<210> 6
<211> 366
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
gaggtacagc tggtggaatc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgatactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcatt agttatgaca tgaactggct ccgccagact 120
ccagggaagg ggcctgagtg ggtctcaggt attaatactg gtggtagtag aacatactat 180
gcagactccg tgaaggaccg attcaccgtc tccagataca atgccaaaaa cacgctgtat 240
ctgcaaatgg acagcctgaa acctgaggac acggcccggt atcactgtgc gcgtcaagtt 300
gggtacagca ctctaggata tgagtatgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Ile Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Asn Trp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Asn Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Tyr Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg Tyr His Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
        115                 120

Claims (4)

1.一种CD19单域抗体，其特征在于，序列如下：
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser LeuIle Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Met Asn Trp LeuArg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Thr Gly Gly SerArg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Tyr Asn AlaLys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Arg TyrHis Cys Ala Arg Gln Val Gly Tyr Ser Thr Leu Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp GlyGln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。
2.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的CD19单域抗体。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸序列如下：
GAGGTACAGCTGGTGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGATACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCATTAGTTATGACATGAACTGGCTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCCTGAGTGGGTCTCAGGTATTAATACTGGTGGTAGTAGAACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGACCGATTCACCGTCTCCAGATACAATGCCAAAAACACGCTGTATCTGCAAATGGACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCGGTATCACTGTGCGCGTCAAGTTGGGTACAGCACTCTAGGATATGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的CD19单域抗体，或者包括如权利要求2或3所述的核酸。
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