CN113151500A - 一种基于环境dna的长江江豚检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡水珍稀哺乳动物—长江江豚在淡水环境中快速检测方法，属于生物技术领域。本发明首先基于我国长江江豚全线粒体组设计了1对等温扩增引物和探针，该引物具有特异性好、稳定性高的特点，等温PCR扩增中成功率高，可以很好对长江江豚DNA进行PCR扩增，可广泛应用于长江江豚DNA的快速检测以及物种保护等研究中。本发明还配合环境DNA技术以及恒温扩增PCR技术，提供了针对长江江豚基因快速检测的试剂盒，无需经过测序，通过核酸检测试纸条可得知阳性或阴性结果，成本低，操作简便，耗时10‑20分钟，能快速准确的对淡水环境中长江江豚基因进行检测。

Description

一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒及其应用。

背景技术

长江江豚(Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis)是一种小型齿鲸，被列为国家二级保护动物，主要分布于长江中下游干流、洞庭湖和鄱阳湖及其主要支流，是一个相对独立的淡水亚种。近年来，长江江豚由于航运、过度及非法捕捞，种群数量快速衰退，现已被世界自然保护联盟物种生存委员会(IUCN SSC)列为“极度濒危”(CR)物种，检测和保护长江江豚迫在眉睫。

环境DNA是环境中生物有机体释放在环境中的DNA片段，主要来源于脱落的皮肤细胞、尿液、粪便、体液或其他身体分泌物。环境DNA技术是利用各种分子手段识别环境DNA中所包含的信息，从而确定生物在环境中的分布情况。

公布号为CN108624585A的中国发明专利公开了一种长江江豚环境DNA提取方法及其应用，该发明从长江江豚线粒体D-Loop区域设计1对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，并根据溶解曲线的峰值确定鉴定区域是否有长江江豚生存。该方案中荧光定量PCR方法，一方面需要高温、变性和退火等步骤，历时较长；另一方面需要昂贵的仪器设备且需要专业技术人员进行操作，难以满足非实验室等基层现场环境下的检测要求。此外，环境样品中游离长江江豚DNA浓度低，现有细胞色素氧化酶I(COI，cytochromecoxidaseI)基因引物对环境样本中江豚DNA的扩增能力较差。

因此，开发特异性强、稳定性高的引物，能够在基层现场条件下简单、快速、高效的扩增长江江豚环境DNA以检测长江江豚是否存在显得尤为重要。

发明内容

1.要解决的问题

本发明主要针对传统引物对环境样本中江豚DNA的扩增能力差、荧光定量PCR扩增依赖昂贵设备导致无法现场检测长江江豚是否存在等问题，依据长江江豚的DNA设计了1对等温扩增引物和探针，并开发了一种基于环境DNA的长江江豚检测试剂盒，能够在现场富集水中的DNA，在常温下快速、高效扩增长江江豚基因，能够快速检测扩增产物，从而实现对长江江豚是否存在的快速检测。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种用于检测长江江豚DNA的引物组，包括上游引物和下游引物，所述引物组的上游引物序列为：TGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTATATCCT(5’-3’)；所述引物组的下游引物序列为：GCTGATTAGTCATTAGTCCATCGAGATGTCTT(5’-3’)。该引物组能够在长江江豚DNA浓度较低情况下实现长江江豚DNA的扩增。

优选地，上述引物组下游引物的5’端标记一个修饰基团，如生物素Biotin或地高辛Digoxin。

本发明还提供了一种与上述引物组配合使用的探针，所述探针的序列为：CTCCATTAGATCACGAGCTTAATCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAAC(5’-3’)。

优选地，上述探针的5’端标记一个修饰集团，如FAM或FITC。

优选地，上述探针距5’端约30个碱基的位置上标记dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶IV(endonuclease IV，nfo)的识别位点。进一步地，dSpacer距离5’端25～35个碱基。

优选地，上述探针3’端标记标记一个修饰集团，如胺基、磷酸基团或C3-spacer中一种。

本发明还提供了一种上述引物组和/或探针在长江江豚DNA检测中的应用。

本发明还提供了一种长江江豚快速检测试剂盒，所述试剂盒包含上述引物组和探针。

优选地，上述长江江豚快速检测试剂盒为核酸检测试纸条试剂盒，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

优选地，上述核酸检测试纸条上有两条线：C线和T线，其中，C线上埋有下游引物5’端修饰基团对应的抗体，T线埋有探针5’端修饰基团对应的抗体。

优选地，上述长江江豚快速检测试剂盒还包括重组酶，聚合酶，ddH₂O及PCR缓冲液。

优选地，上述长江江豚快速检测试剂盒还包括核酸抽提试剂盒，所述核酸抽提试剂盒包括：无菌注射器，针筒式过滤器，裂解液，中和管，洗涤管，洗脱管，磁珠，磁棒；所述无菌注射器用于过滤水样；所述针筒式过滤器集成0.45微米孔径滤膜，用于富集水样中的DNA；所述裂解液用于裂解；所述中和管用于中和裂解液；所述洗涤管用于清洗磁珠；所述磁珠用于吸附DNA；所述磁棒用于提供磁力、吸附磁珠。

本发明还提供了一种上述长江江豚快速检测试剂盒的应用，包括如下步骤：以环境DNA为模板进行等温扩增、试纸条检测等温扩增结果。

优选地，上述环境DNA是指从环境源中抽提的DNA，环境源包括水样和/或沉积物，环境DNA抽提可以采用常规方法。

优选地，上述环境DNA抽提还可以通过上述试剂盒内的核酸抽提试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)用无菌注射器吸取水样，将注射器连接到针筒过滤器上，推注射器让水样全部通过针筒过滤器，重复该操作直到针筒过滤器堵塞为止，取下无菌注射器；

(2)向针筒过滤器中加入裂解液，震荡针筒过滤器，将针筒过滤器中的液体吸出，加入装有中和液的离心管中，加入磁珠并上下混匀；进一步地，裂解液1-2mL，针筒过滤器震荡1-5mL，加入磁珠并上下混匀3-5次。

(3)将磁棒插入离心管中静置，待磁珠被全部吸附到磁棒后，将磁棒插入洗涤管中，上下混匀；进一步地，静置1-2min，插入洗涤管后上下混匀3-5次。

(4)将磁棒插入洗脱管中，取下磁棒套，上下混匀后静置，待DNA充分解离后取出磁棒；进一步地，上下混匀5-10次后静置1-3min。

优选地，上述等温扩增包括如下步骤：

(1)向PCR扩增管中依次加入重组酶，聚合酶，上游引物，下游引物，探针，环境DNA，PCR缓冲液，dNTP和ddH₂O并混合均匀，37-42℃恒温反应10-15min。进一步地，反应体系为50μL，其中0.1μL重组酶，0.1μL聚合酶，2μL的上游引物，2μL的下游引物，1μL探针，2μL的环境DNA，25μL的PCR缓冲液和17.8μL的ddH₂O。

(2)反应结束后，用无菌水稀释10-100倍，混合均匀。

优选地，上述37-42℃恒温可以通过用手紧紧握住反应管实现。

优选地，上述试纸条检测包括如下步骤：

(1)取上述混合均匀的反应液加入到核酸检测试纸条的加样孔中，1-2min后读取试纸条上的结果；进一步地，取反应液60μL。

(2)检测结果：C线和T线均显色：检测阳性，存在长江江豚；C线显色和T线不显色：检测阴性，不存在长江江豚；C线和T线均不显色：检测无效；C线不显色：检测无效。

3.有益效果

本发明与现有技术相比，其有益效果在于：

(1)本发明的用于检测长江江豚DNA的引物组，是基于我国长江江豚全线粒体组设计的，如实施例2所示，在模板浓度10Copies/μl时可以实现80％的稳定扩增，超过10Copies/μl时可以实现100％稳定扩增，具有特异性好、稳定性高的特点，等温PCR扩增中成功率高，可以很好对长江江豚DNA进行PCR扩增，减少其他生物DNA如鱼类DNA对结果带来的假阳性干扰。

(2)本发明提供的长江江豚快速检测试剂盒，包括本发明的引物组和探针，由于引物组特异性好、稳定性高的特点，因而能够提高对环境DNA中长江江豚DNA的检测效率，从而提高环境低丰度下长江江豚DNA的扩增与识别。

(3)本发明提供的长江江豚快速检测试剂盒的应用，采用等温PCR技术，目的DNA的PCR扩增无需经历高温、变性和退火等步骤和昂贵的仪器设备，操作简单。

(4)本发明提供的长江江豚快速检测试剂盒的应用，无需测序，通过试纸条可得知阳性或阴性结果，耗时短，仅需10-20分钟，能够实现长江江豚的现场、快速检测。

附图说明

图1是长江江豚阳性标准品PCR跑胶图；

图2是不同DNA浓度下引物扩增成功率；

图3是现场等温扩增操作示意图；

图4是试纸条快速检测示意图；

图5是实施例4中长江南京段4个点位的长江江豚现场试纸条检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例对本发明的引物的灵敏度进行检测，具体操作如下：

取江豚组织DNA做阳性标准品，使用AAGCTGGAATTCTTTATAAACTACTC和AACTATCTGTATGATTTCATTATGGG引物进行3个PCR重复扩增，序列长度为947bp，同时以环境样本做阴性对照、DEPC水做空白对照，PCR产物用凝胶电泳检测，PCR成功率判断标准是2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测需呈现单一亮带，且PCR产物磁珠纯化后用qubit定量浓度不低于5ng/μL。将3管PCR产物混合，使用1.2×XP beads纯化，配制2.0％的琼脂糖凝胶，4μl PCR产物，加2μl 6×Loading buffer混匀，电泳检测需呈现单一明亮条带，如图1所示，然后进行磁珠纯化，用qubit定量浓度。根据阳性标准品PCR纯化浓度及PCR产物长度，计算产物拷贝数，计算公式如下：

Copies＝[(6.02×10²³)×(C×10^-9)/(L×660)]×V

注：Copies为拷贝数；C为标准质粒DNA浓度，单位ng·μL^-1；L为标准质粒DNA长度，单位bp；V为实时荧光qPCR体系中标准质粒DNA体积。

将标准品稀释成1Copies/μl，10Copies/μl，100Copies/μl，1000Copies/μl，10000Copies/μl，并作为模板测试本发明引物在不同模板下的扩增成功率，每个DNA模板做9个PCR重复，扩增成功率为扩增成功的数量占总的扩增数量的比例。

本实施例的引物组的上游引物序列为：TGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTATATCCT(5’-3’)；所述引物组的下游引物为：GCTGATTAGTCATTAGTCCATCGAGATGTCTT(5’-3’)。

PCR扩增过程如下：

(1)向PCR扩增管中依次加入0.1μL重组酶，0.1μL聚合酶，2μL的上游引物，2μL的下游引物，1μL探针，2μL的环境DNA，25μL的PCR缓冲液和17.8μL的ddH₂O。

(2)用手紧紧握住反应管子持续10-15min；

结果如图2所示，本发明的引物在模板浓度10Copies/μl时可以实现80％的稳定扩增，超过10Copies/μl时可以实现100％稳定扩增，在1Copies/μl时扩增成功率不足10％，无法扩增，说明该引物的检出线为10Copies/μl。

实施例2

本实施例提供一种长江江豚检测试剂盒。

一种长江江豚检测试剂盒，包含引物组，探针，核酸检测试纸条，重组酶，聚合酶，ddH₂O，PCR缓冲液及核酸抽提试剂盒，所述核酸抽提试剂盒包括无菌注射器，集成0.45微米孔径滤的针筒式过滤器，裂解液，中和管，洗涤管，洗脱管，磁珠，磁棒。

其中，引物组上游引物序列为：TGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTATATCCT(5’-3’)，引物组下游引物序列为：GCTGATTAGTCATTAGTCCATCGAGATGTCTT(5’-3’)，下游引物的5’端标记生物素Biotin；

探针的序列为：CCATTAGATCACGAGCTTAATCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAAC(5’-3’)，5’端标记FAM；探针距5’端30个碱基的位置上标记一个dSpacer；探针3’端标记标记C3-spacer；

核酸检测试纸条上有C线和T线，其中，C线上埋有生物素抗体，T线埋有FAM基团抗体。

实施例3

本实施例对本发明的核酸抽提试剂盒提取的DNA浓度进行检测。具体方法为：

本实施例的核酸抽提试剂盒包括：无菌注射器，集成0.45微米孔径滤的针筒式过滤器，裂解液，中和管，洗涤管，洗脱管，磁珠，磁棒。

样本来源：长江长江三桥点位，重复采集12个样本做测试。

核酸抽提：

(1)用无菌注射器吸取水样500-800ml水样，将注射器连接到针筒过滤器上，推注射器让水样全部通过针筒过滤器，取下无菌注射器；

(2)向针筒过滤器中加入1mL裂解液，震荡针筒过滤器2min，将针筒过滤器中的液体吸出，加入装有中和液的1.5mL离心管中，加入磁珠并上下混匀3-5次；

(3)将磁棒插入离心管中静置1min，待磁珠被全部吸附到磁棒后，将磁棒插入1mL洗涤管中，上下混匀3-5次；

(4)将磁棒插入洗脱管中，取下磁棒套，上下混匀5-10次后静置2min，待DNA充分解离后取出磁棒。

浓度测定：DNA提取后用qubit3.0测定DNA的浓度，用nanodrop测定DNA纯度。

检测结果如表1所示：DNA提取的浓度分布为14.3-37.2ng/μL，平均浓度为24.3ng/μL，260/280的吸光度平均为1.81，证明DNA浓度较高，纯度较好，完全能满足后续分子生物学实验要求。

表1 DNA提取浓度

实施例4

本实施例提供实施例2中的试剂盒在长江江豚现场检测中的应用。

在长江南京段设置4个点位，按照本发明描述的方法进行DNA提取、等温扩增和检测，具体操作为：

现场用无菌注射器吸取水样，将注射器旋到针筒过滤器上，用力推注射器让水样全部通过针筒过滤器，重复该操作直到针筒过滤器堵塞为止，取下无菌注射器；向针筒过滤器中加入1mL裂解液，用手震荡针筒过滤器2min，将针筒过滤器中的液体吸出，加入装有中和液的1.5mL离心管中，加入磁珠并上下混匀3-5次；将磁棒插入离心管中静置1min，待磁珠被全部吸附到磁棒后，将磁棒插入1mL洗涤管中，上下混匀3-5次；将磁棒插入洗脱管中，取下磁棒套，上下混匀5-10次后静置2min，待DNA充分解离后取出磁棒。

向PCR扩增管中依次加入0.1μL重组酶，0.1μL聚合酶，2μL的上游引物，2μL的下游引物，1μL探针，2μL的环境DNA，25μL的PCR缓冲液和17.8μL的ddH₂O。；用手紧紧握住反应管子持续15-20min(如图3所示)；反应结束后，取1μL用无菌水稀释100倍，混合均匀；取60μL混合均匀的反应液加入到核酸检测试纸条的加样孔中，1-2min后读取试纸条上的结果(如图4所示)。

结果如图5所示，长江4个点位中有两个点位检测呈现阳性，2个点位检测呈现阴性。

Claims (10)

1.一种用于检测长江江豚DNA的引物组，其特征在于，所述引物组的上游引物序列为：TGTCCACTAGCCCTTCATAACCATTATATCCT(5’-3’)；所述引物组的下游引物序列为：GCTGATTAGTCATTAGTCCATCGAGATGTCTT(5’-3’)。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测长江江豚DNA的引物组，其特征在于，所述引物组下游引物的5’端标记生物素Biotin或地高辛Digoxin。

3.一种与权利要求1或2所述的引物组配合使用的探针，其特征在于，所述探针的序列为：CTCCATTAGATCACGAGCTTAATCACCATGCCGCGTGAAACCAGCAAC(5’-3’)；所述探针的5’端标记FAM或FITC；所述探针距5’端25～35个碱基的位置上标记dSpacer；所述探针3’端标记胺基、磷酸基团或C3-spacer中的一种。

4.一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述引物组和权利要求3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为核酸检测试纸条试剂盒，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；所述核酸检测试纸条上有C线和T线，其中，C线上埋有下游引物5’端修饰基团对应的抗体，T线埋有探针5’端修饰基团对应的抗体。

6.根据权利要求5所述的一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包括重组酶，聚合酶，ddH₂O及PCR缓冲液。

7.根据权利要求6所述的一种长江江豚快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸抽提试剂盒，所述核酸抽提试剂盒包括：无菌注射器，集成0.45微米孔径滤的针筒式过滤器，裂解液，中和管，洗涤管，洗脱管，磁珠及磁棒。

8.权利要求4-7任一所述的一种长江江豚快速检测试剂盒的应用，其特征在于，包括如下步骤：以环境DNA为模板进行等温扩增、试纸条检测等温扩增结果，所述环境DNA是从环境源中抽提的DNA，所述环境源包括水样和/或沉积物。

9.根据权利要求8所述的一种长江江豚快速检测试剂盒的应用，其特征在于，

所述等温扩增包括如下步骤：

(1)向PCR扩增管中依次加入重组酶，聚合酶，上游引物，下游引物，探针，环境DNA，PCR缓冲液和ddH₂O并混合均匀，37-42℃恒温反应10-15min；

(2)反应结束后，用无菌水稀释10-100倍，混合均匀。

所述试纸条检测包括如下步骤：

(1)取上述混合均匀的反应液加入到核酸检测试纸条的加样孔中，1-2min后读取试纸条上的结果；

(2)判断标准：C线和T线均显色：检测阳性；C线显色和T线不显色：检测阴性；C线和T线均不显色：检测无效；C线不显色：检测无效。

10.根据权利要求8或9所述的一种长江江豚快速检测试剂盒的应用，其特征在于，所述环境DNA通过试剂盒中提供的核酸抽提试剂盒进行，包括如下步骤：

(1)用无菌注射器吸取水样，将注射器连接到针筒过滤器上，推注射器让水样全部通过针筒过滤器，重复该操作直到针筒过滤器堵塞为止，取下无菌注射器；

(2)向针筒过滤器中加入裂解液，用手震荡针筒过滤器，将针筒过滤器中的液体吸出，加入装有中和液的离心管中，加入磁珠并上下混匀；

(3)将磁棒插入离心管中静置，待磁珠被全部吸附到磁棒后，将磁棒插入洗涤管中，上下混匀；

(4)将磁棒插入洗脱管中，取下磁棒套，上下混匀后静置，待DNA充分解离后取出磁棒。

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