CN111926090A - 用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒。本发明针对沼蛤细胞色素c氧化酶I基因(COI基因)，开发获得了物种特异性引物和探针，并优化了荧光PCR反应体系和反应程序，使试剂盒具有良好的物种特异性和高灵敏度，同时记载了相关检测方法。本发明为淡水环境中沼蛤的早期监测和预警提供有效的技术支撑。

Description

用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于环境分子检测技术领域，尤其涉及一种基于环境DNA(eDNA)的用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及其试剂盒，并记载了具体检测方法，旨在对淡水环境中灾害生物沼蛤进行监测与预警。

背景技术

沼蛤(Limnoperna fortunei)又称金贻贝或淡水壳菜，是一种体型较小的淡水双壳贝类，具有较强的入侵性和污损性。沼蛤原产于我国长江以南及东南亚淡水河流和湖泊，近些年来逐渐入侵到世界各地。沼蛤在我国南方地区有所分布，近几年的实地调查发现其已经成功入侵到京津冀地区，而一些大型输水工程的开发建设可能是沼蛤生物入侵的主要途径。沼蛤一旦入侵成功，便在新的水体环境呈现出快速扩张和传播，产生严重的生物污损现象。沼蛤的入侵和污损一方面会迅速改变入侵水域的生物群落结构，威胁水生生态系统健康和稳定；另一方面沼蛤会黏附在一些重要水利设施的表面，导致设备腐蚀、管道阻塞、水体污染，造成巨大的经济损失。目前尚缺乏治理沼蛤入侵和污损问题的有效措施，因此建立早期检测和预警体系是防控沼蛤生态灾害最直接有效的方式，其中首要问题是在水环境中进行沼蛤检测。

由于沼蛤入侵初期其群体规模极小、常隐匿于水下、其浮游幼体阶段个体微小缺乏明显外部形态特征等特点，因此从复杂的水生群落中检测出低丰度入侵沼蛤便成为构建沼蛤早期检/监测方法的关键。因此，针对沼蛤在水生生态系统中的入侵现状，亟需开发一种基于环境DNA技术的沼蛤荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

作为本发明的一个方面，提供了一种检测淡水环境中沼蛤的特异性引物，包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

作为本发明的另一个方面，提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR探针，所述探针为如SEQ ID NO.3所示的Taqman探针；所述探针序列5’端标记有荧光基团，探针序列3’端标记有淬灭基团。

作为本发明的再一个方面，提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR试剂盒，包括如上所述的特异性引物，以及如上所述的荧光PCR探针。

作为本发明的又一个方面，提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR检测方法，包括以下步骤：提取待检测水样的环境DNA；以提取的环境DNA为模板，利用如上所述的特异性引物以及如上所述的荧光PCR探针进行荧光PCR扩增检测；分析环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸。

作为本发明的又一个方面，提供了一种如上所述的荧光PCR试剂盒在环境中进行沼蛤核酸检测的应用。

基于上述技术方案，本发明的用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针及试剂盒至少具有以下有益效果其中之一或其中一部分：

(1)本发明提供了用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物、探针以及利用或包含上述特异性引物和探针的检测试剂盒，其特异性强、灵敏度高、重复性好，结果稳定可靠，可对沼蛤进行准确检测；

(2)本发明提供了利用环境DNA技术快速检测水环境中沼蛤的方法，相对于传统野外生态调查方法具有特异性强、灵敏度高、省时省力、高效的特点。本发明为淡水环境中沼蛤的早期检测/监测预警提供技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例沼蛤荧光定量PCR检测试剂盒扩增效率实验结果，其中，从左到右依次为标准品梯度稀释至1.50×10¹⁰ copies/μL、1.50×10⁹ copies/μL、1.50×10⁸copies/μL、1.50×10⁷ copies/μL、1.50×10⁶ copies/μL、1.50×10⁵ copies/μL、1.50×10⁴ copies/μL、1.50×10³ copies/μL、1.50×10² copies/μL的扩增曲线及阴性对照；

图2为本发明实施例中荧光定量检测沼蛤COI基因标准曲线；

图3为本发明实施例中在对野外15个典型水域中进行沼蛤检测的应用。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

在实现本发明的过程中，发明人针对沼蛤线粒体细胞色素c氧化酶I基因(COI基因)基因设计的沼蛤特异性引物，利用环境DNA技术对该基因中的特定片段进行检测，以识别环境中是否存在沼蛤，并对沼蛤核酸进行定量。其中环境DNA(environmental DNA，eDNA)是指直接从环境样品(例如水体)中提取到的DNA，是不同物种遗留在环境中的DNA总和，再利用待检测物种的特异性基因识别片段，通过分子生物学手段例如荧光定量PCR技术高效、特异、灵敏地检测环境DNA中是否含有待检测物种的基因识别片段，从而判断取样环境中待检测物种的分布状况。

具体地，本发明提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物，基于沼蛤线粒体COI基因设计，扩增产物长度为197bp，包括正向引物LFF和反向引物LFR，其中：

正向引物LFF序列为：5’-AGAACCCCAGCAGTTGACATAG-3’。

反向引物LFR序列为：5’-CCACCTAGAACTGGTAGTGAAACTAAC-3’。

本发明还提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR探针LF-probe，该探针LF-probe为Taqman探针，序列为：5’-CTCTTCATTTAGCTGGTGCGTCGTC-3’，其中探针LF-probe在5’端标记荧光基团FAM，在3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。

本发明还提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR试剂盒，包括如前述的特异性引物，以及前述的荧光PCR探针，该特异性引物和荧光PCT探针的组合，特异性强、重复性好、灵敏度高，能够准确检测淡水环境中的沼蛤核酸。

在一些实施例中，该试剂盒还包括反应缓冲液和Taq酶的预混液、阳性对照和阴性对照；其中阳性对照为沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒；阴性对照为灭菌去离子水。

本发明还提供了一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR检测方法，包括以下步骤：提取待检测水样的环境DNA；以提取的环境DNA为模板，利用前述的特异性引物以及前述的荧光PCR探针进行荧光PCR扩增检测；分析环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸。

在一些实施例中，荧光PCR扩增检测所采用的反应体系包括：10μL的

qPCR Master Mix，6.8μL的Nuclease-Free Water，终浓度分别为200nM的正向引物、反向引物和荧光PCR探针，以及2μL的环境DNA模板。

在一些实施例中，该荧光PCR扩增检测的反应程序为：95℃预变性120s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共45个循环。在前述的反应体系和反应程序下，具有良好的物种特异性和高灵敏度。

在一些实施例中，荧光PCR扩增检测是以沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒为阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照，分别得到环境DNA模板、阳性对照和阴性对照的扩增曲线及Ct值。Ct值即为PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，与模板的起始拷贝数浓度的对数存在线性关系。

在一些实施例中，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸的标准为：阳性对照出现S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线且无Ct值，若待测水样出现S型扩增曲线，则判定待测水样中存在沼蛤核酸；若待测水样未出现S型扩增曲线且无Ct值，则判定待测水样中无沼蛤核酸。

在一些实施例中，荧光PCR检测方法还包括对沼蛤核酸的定量检测步骤：

以沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒为标准品，利用前述的特异性引物以及前述的荧光PCR探针对不同拷贝数浓度的标准品进行荧光PCR扩增检测，得到Ct值；

将标准品的不同拷贝数浓度的对数值与Ct值绘制标准曲线，将环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果与所述标准曲线对比，得到待测水样中的沼蛤核酸拷贝数浓度，而该沼蛤核酸拷贝数浓度即反应了待测水样中沼蛤的存在数量。

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做详细说明，需要说明的是，下文中的具体实施例仅用于示例，并不用于限制本发明。下述实施例所使用的试验方法如无特殊说明，为常规方法；所使用的材料、试剂等如无特殊说明，为可商业途径得到的试剂和材料。

以下实施例中所涉及的引物和探针均由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，使用前溶解于灭菌去离子水中至终浓度为10μM；荧光定量PCR试剂

qPCRMaster Mix购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；实施例3中的水环境DNA采自2019年8月份野外水生态调查中15个样点；实施例中所涉及的主要仪器为罗氏LightCycler 96荧光定量PCR仪。

实施例1：沼蛤物种特异性引物及探针的设计及筛选

从NCBI网站下载所有大于500bp的沼蛤线粒体COI基因序列，以及与沼蛤COI序列一致性高于70％的其他物种COI序列。利用MEGA软件对以上序列进行多序列比对，在目标物种沼蛤的序列保守区域、同时为其他物种的变异区域设计多对沼蛤物种特异性引物。通过扩增效率、特异性及灵敏性验证，筛选出一组高效扩增环境中沼蛤DNA的物种特异性引物，扩增产物为197bp。然后在该扩增区域内设计Taqman探针，其碱基序列如下所示：

正向引物LFF序列如SEQ ID NO.1所示为：5’-AGAACCCCAGCAGTTGACATAG-3’；

反向引物LFF序列如SEQ ID NO.2所示为：5’-CCACCTAGAACTGGTAGTGAAACTAAC-3’；

探针LF-probe序列如SEQ ID NO.3所示为：5’FAM-CTCTTCATTTAGCTGGTGCGTCGTC-3’BHQ1。

基于本发明的上述特异性引物的设计，沼蛤的DNA模板上的引物结合位点与其他相近科目的物种并不相同，并且由于淡水环境中沼蛤所在沼蛤属中仅有沼蛤物种，因此确保了PCR检测沼蛤的特异性。

实施例2：荧光PCR检测沼蛤的灵敏度及扩增效率验证

(1)标准品制备

为了验证所筛选引物的扩增效率、检测线，同时绘制荧光定量PCR的标准曲线，以沼蛤肌肉组织DNA为模板，用引物对沼蛤的目标扩增序列进行PCR扩增。然后将扩增产物连接进入载体，并转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆进行菌液扩大培养、质粒提取获得含有目的扩增片段的重组质粒载体；利用Nanodrop2000核酸测定仪测定质粒浓度并按照公式换算成拷贝数，即为已知拷贝数浓度的沼蛤阳性标准品。

(2)基于沼蛤阳性标准品的荧光定量PCR检测方法的建立

将已知拷贝数浓度的沼蛤阳性标准品稀释到1.50×10¹⁰ copies/μL、1.50×10⁹copies/μL、1.50×10⁸ copies/μL、1.50×10⁷ copies/μL、1.50×10⁶ copies/μL、1.50×10⁵ copies/μL、1.50×10⁴ copies/μL、1.50×10³ copies/μL、1.50×10² copies/μL、1.50×10¹ copies/μL，用实施例1所述引物对和探针对实施例2步骤(1)中制备的沼蛤阳性标准品梯度稀释品进行荧光定量PCR扩增，扩增体系为20μL，包括：10μL的

qPCR Master Mix，6.8μL的Nuclease-Free Water，终浓度均为200nM的正向引物LFF、反向引物LFR和探针LF-probe，以及2μL的DNA模板。荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性120s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共45个循环。

对PCR扩增产物进行测序和检测，测序结果如SEQ ID NO.4所示为：AGAACCCCAGCAGTTGACATAGCTGCTTTATCTCTTCATTTAGCTGGTGCGTCGTCAATTGGCGGTTCGTTAAATTATATTACTAGTATAAAAAATATACCTGTTAAAGAAATGCGTGGTGAGCGTTTAATATTGTTTGTGTGGTCTCTTGCAGTTACATCTGTTTTGTTGTTAGTTTCACTACCAGTTCTAGGTGG；检测所得扩增曲线如图1所示，从左到右依次为标准品梯度稀释至1.50×10¹⁰ copies/μL、1.50×10⁹ copies/μL、1.50×10⁸ copies/μL、1.50×10⁷ copies/μL、1.50×10⁶ copies/μL、1.50×10⁵ copies/μL、1.50×10⁴ copies/μL、1.50×10³ copies/μL、1.50×10² copies/μL的扩增曲线及阴性对照；

扩增效率验证：根据扩增曲线结果绘制标准曲线，结果如图2所示，获得的标准曲线回归方程为：Y＝-3.5107x+43.64，其中，x为起始拷贝数浓度的对数，y为Ct值，相关系数(R²)为1.00，扩增效率为97％，表明所设计的引物和探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜。

敏感性验证：将已知浓度的阳性标准品稀释到150copies/μL、100copies/μL、50copies/μL、25copies/μL、15copies/μL，根据荧光定量PCR检测方法和体系对上述浓度的质粒标准品重复检测10次，根据所得阳性率≥90％的标准确定最低检测线。结果表明模板为50copies时100％为阳性，25copies时80％为阳性，因此该方法的最低检测拷贝数为50。

实施例3：利用本发明检测淡水环境中沼蛤的应用

(1)水环境样品采集与富集

于2019年8月对15个野外典型水域进行水样采集。采样人佩戴手套使用1L的灭菌塑料采样瓶，瓶口朝向上游来水方向，在采样点水下约5-10cm处采集水样。采样瓶装满水后盖上瓶盖密封并做好标记，放置于冰上或车载冰箱运回实验室。所有水样在样品采集当天完成抽滤，4℃存放不超过24小时。使用0.45μm孔径47mm直径的混合纤维素酯滤膜和真空泵进行水样抽滤。

(2)环境DNA提取

用灭菌剪刀将收集的滤膜剪碎至1-3mm²的碎片，置于1.5mL离心管中，按照QIAGENDNeasy Blood&Tissue DNA提取试剂盒说明书操作，提取水样环境DNA。使用紫外分光光度计检测(Nanodrop 2000)测定环境DNA浓度。

(3)荧光定量PCR检测环境DNA

按照实施例2建立的荧光定量PCR检测方法对水环境DNA样品进行扩增，以重组质粒为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照，获得扩增曲线和Ct值。

检测结果分析

扩增结果如图3所示：用荧光定量PCR方法对野外15个典型水环境中沼蛤进行检测，发现其中3个样点呈沼蛤核酸阳性，表明该3个样点中已经存在沼蛤，并且根据Ct值和前述标准曲线测得沼蛤核酸的拷贝数浓度分别为每微升环境DNA中含有132、57和75拷贝沼蛤COI基因。通过本实施例可为这三个沼蛤检测呈阳性的水域提出沼蛤爆发预警。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测淡水环境中沼蛤的特异性引物，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

2.一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR探针，其特征在于：所述探针为如SEQ IDNO.3所示的Taqman探针；

所述探针序列5’端标记有荧光基团，探针序列3’端标记有淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的荧光PCR探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。

4.一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的特异性引物，以及如权利要求2所述的荧光PCR探针。

5.根据权利要求4所述的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括反应缓冲液和Taq酶的预混液、阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒；所述阴性对照为灭菌去离子水。

6.一种用于检测淡水环境中沼蛤的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取待检测水样的环境DNA；

以提取的环境DNA为模板，利用如权利要求1所述的特异性引物以及如权利要求2所述的荧光PCR探针进行荧光PCR扩增检测；

分析环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸。

7.根据权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增检测所采用的反应体系包括：10μL的2×

Probe qPCR Master Mix，6.8μL的Nuclease-FreeWater，终浓度分别为200nM的正向引物、反向引物和荧光PCR探针，以及2μL的环境DNA模板；

作为优选，所述荧光PCR扩增检测的反应程序为：95℃预变性120s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共45个循环。

8.根据权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增检测是以沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒为阳性对照，以灭菌去离子水为阴性对照，分别得到环境DNA模板、阳性对照和阴性对照的扩增曲线及Ct值。

9.根据权利要求8所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，判定待测水样中是否含有沼蛤核酸的标准为：阳性对照出现S型扩增曲线，阴性对照无扩增曲线且无Ct值，待测水样出现S型扩增曲线，则判定待测水样中存在沼蛤核酸；待测水样未出现S型扩增曲线且无Ct值，则判定待测水样中无沼蛤核酸。

10.根据权利要求6所述的荧光PCR检测方法，其特征在于，所述荧光PCR检测方法还包括：

以沼蛤目的扩增片段的体外重组质粒为标准品，利用如权利要求1所述的特异性引物以及如权利要求2所述的荧光PCR探针对不同拷贝数浓度的标准品进行荧光PCR扩增检测，得到Ct值；

将标准品的不同拷贝数浓度的对数值与Ct值绘制标准曲线，将环境DNA模板的荧光PCR扩增检测结果与所述标准曲线对比，得到待测水样中的沼蛤核酸拷贝数浓度。

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