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CN108728555B - 一种外周血与月经血鉴别用试剂盒及其应用 - Google Patents

一种外周血与月经血鉴别用试剂盒及其应用 Download PDF

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CN108728555B CN201810570772.7A CN201810570772A CN108728555B CN 108728555 B CN108728555 B CN 108728555B CN 201810570772 A CN201810570772 A CN 201810570772A CN 108728555 B CN108728555 B CN 108728555B
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Hebei Medical University
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Abstract

本发明涉及一种外周血与月经血鉴别用试剂盒及其应用，所述试剂盒包括四种环状RNA的上下游PCR扩增引物，所述环状RNA为hsa_circ_0000212、novel_circ_0013653、novel_circ_0013655和novel_circ_0013656。本试剂盒中所涉及的四种环状RNA在月经血中含量丰富且表达水平具有组织特异性，是鉴别外周血与月经血的更为理想的分子标记。通过对外周血与月经血进行鉴别，能够简单、高效地区分外周血与月经血，为犯罪案件的侦破提供技术支持。

Description

一种外周血与月经血鉴别用试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种外周血与月经血鉴别用试剂盒及其应用。
背景技术
对犯罪现场遗留体液的分析检验是法医物证鉴定的重要环节。判断体液的组织来源可以为确定案件性质、进行现场重现提供证据。血痕是犯罪现场最常见的一种体液痕迹，识别犯罪现场的血痕是外周血还是月经血，对案件重塑至关重要。外周血与月经血的外观很难区分，传统方法通常利用月经血中特有细胞的形态特征来鉴别，操作繁琐，无法满足法医检案准确、快速的要求。近十几年来发展起来的以分子遗传学为基础的RNA(mRNA，miRNA等)和DNA甲基化检测方法被认为可能是新型的理想的用于识别不同体液的方法，有望取代传统的体液识别技术。然而既往研究显示：目前筛选出的用于组织/体液识别的差异化甲基化位点还太少，同时甲基化水平易受环境、疾病、年龄等的影响；mRNA极易被无处不在的RNA酶降解，暴露在强日光或紫外光照射下、潮湿环境等因素都会影响mRNA的稳定性；miRNA片段短小，对检测技术设计要求较高，且目前报道的已筛选出的用于月经血鉴别的miRNA位点可重复性不佳。因此，需要探索新的遗传标记进行法医相关体液识别。
发明内容
针对现有检测方法存在易受外界干扰、不稳定、对检测技术设计要求高、可重复性不佳的技术问题，本发明提供了一种外周血与月经血鉴别用试剂盒。
以及，本发明还提供了一种外周血与月经血的实时荧光定量鉴别检测方法。
以及，本发明还提供了上述实时荧光定量鉴别检测方法用于法医鉴别待测血样来自外周血或月经血的应用。
以及，本发明还提供了一种外周血与月经血的琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法。
以及，本发明还提供了一种上述琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法用于法医鉴别待测血样来自外周血或月经血的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种外周血与月经血鉴别用试剂盒，所述试剂盒包括四种环状RNA的上下游PCR扩增引物，所述环状RNA为hsa_circ_0000212、novel_circ_0013653、novel_circ_0013655和novel_circ_0013656；其中，
所述hsa_circ_0000212的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-GAAAGGCACCGCAGAATATGAAC-3’，
下游引物：5’-AGCTGACAAAGTGCTCTCCATG-3’；
所述novel_circ_0013653的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-AGCTCCTTCCAGCACGAGAT-3’，
下游引物：5’-GTCCGGAATTGGGTGAAGGT-3’；
所述novel_circ_0013655的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-CAGGCAGGAGCTGAATACCAT-3’，
下游引物：5’-GGTCTTTGTACTTCTGCCCATC-3’；
所述novel_circ_0013656的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-GGTCTCATGGCTTCTAGGAACT-3’，
下游引物：5’-TCGGGCCCCATTCTTATGATGA-3’。
本试剂盒的检测对象为环状RNA，环状RNA是一类不具有5'端帽子及3'端poly(A)尾巴结构、产生于RNA剪接过程中的单链共价闭合环状非编码RNA，不易被核酸外切酶降解，较线性RNA更加稳定。本试剂盒中所涉及的四种环状RNA，各自的核苷酸剪切序列分别为：
hsa_circ_0000212剪切序列：
GUCGAUCUUUGCUGUGGUUAAACUUGAAAGGCACCGCAGAAUAUGAACAGGAGUUACAGCGAUCCAGGGUGUAUGAUGUUUCUGUUUGGGAGGCUUCUUGGUAAUUUUUUCUGCAGGAUGAAUUAAGAGAAGAGACACUUGCUCAUCAGGCAUGGAGAGCACUUUGUCAGCUUCCAAUAUGCAAGACCCUUCAUCUUC；
novel_circ_0013653剪切序列：
GGAACUUCACUGACCUGUUUCCCCACAGGAACCCAGUCCAGGGCAAGCAGCUCCUUCCAGCACGAGAUGUCCCAAGAAGGCUUCAGCACAGCCCUCACAAUGUUUGCACUGAUGCAGUACUCAAACCUCCUGAAGAUCCACUUCACCUUCACCCAAUUCCGGACCAGCCCGAGCCAGCAGAGCCUGGUGGAUCCCAUC；
novel_circ_0013655剪切序列：
CAUCAGCUCAGCGCCUCCGCAGGACCACGUGUUCAAGGUGGACAACUUUGCAGCCCUUGGCAGCAUCCAGAAGCAGCUGCAGGAGAAGAUCUAUGCAGUUGAGGGACACAGCUAUUUCAUCAUAAGAAUGGGGCCCGAAAAAGUGCCAAGAAGAUCCUCAUUGUCAUCACAGAUGGGCAGAAGUACAAAGACCCCCUGG；
novel_circ_0013656剪切序列：
GGAACUUCACUGACCUGUUUCCCCACAGGAACCCAGUCCAGGGCAAGCAGCUCCUUCCAGCACGAGAUGUCCCAAGAAGGCUUCAGCACAGCCCUCACAAUGGACACAGCUAUUUCAUCAUAAGAAUGGGGCCCGAAAAAGUGCCAAGAAGAUCCUCAUUGUCAUCACAGAUGGGCAGAAGUACAAAGACCCCCUGGA。
上述四种环状RNA在月经血中含量丰富且表达水平具有组织特异性，是鉴别外周血与月经血的更为理想的分子标记。
优选地，所述试剂盒还包括TRIzol试剂、RNA抽提试剂和反转录试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括实时荧光定量试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括PCR试剂盒、琼脂糖、核酸染料和50bp DNAStepMarker。
以及，本发明实施例还提供了一种外周血与月经血的实时荧光定量鉴别检测方法，所述实时荧光定量鉴别检测方法包括以下操作步骤：提取待测血样RNA，用RNA反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA；用实时荧光定量试剂盒和上述环状RNA的上下游PCR扩增引物对所述cDNA进行实时荧光定量检测，根据环状RNA表达水平鉴别待测血样来自外周血或月经血。
以及，本发明实施例还提供了上述实时荧光定量鉴别检测方法用于法医鉴别待测血样来自外周血或月经血的应用。
以及，本发明实施例还提供了一种外周血与月经血的琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法，所述琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法包括以下操作步骤：提取待测血样RNA，用RNA反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA；用PCR试剂盒和上述环状RNA的上下游PCR扩增引物对所述cDNA进行PCR扩增；将PCR扩增产物加入到琼脂糖凝胶中进行电泳，根据电泳条带结果鉴别待测血样来自外周血或月经血。
以及，本发明实施例还提供了一种上述琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法用于法医鉴别待测血样来自外周血或月经血的应用。
将上述实时荧光定量或琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法对外周血与月经血进行鉴别，能够简单、高效地区分外周血与月经血，为犯罪案件的侦破提供技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例2中实时荧光定量的代表性结果。
图2为本发明实施例3中琼脂糖凝胶电泳的代表性结果。
附图说明：
1外周血hsa_circ_0000212条带
2月经血hsa_circ_0000212条带
3外周血novel_circ_0013656条带
4月经血novel_circ_0013656条带
5外周血novel_circ_0013655条带
6月经血novel_circ_0013655条带
7外周血novel_circ_0013653条带
8月经血novel_circ_0013653条带
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种用于外周血与月经血鉴别用试剂盒，四种环状RNA的上下游PCR扩增引物，所述环状RNA为hsa_circ_0000212、novel_circ_0013653、novel_circ_0013655和novel_circ_0013656；其中，
所述hsa_circ_0000212的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-GAAAGGCACCGCAGAATATGAAC-3’，
下游引物：5’-AGCTGACAAAGTGCTCTCCATG-3’；
所述novel_circ_0013653的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-AGCTCCTTCCAGCACGAGAT-3’，
下游引物：5’-GTCCGGAATTGGGTGAAGGT-3’；
所述novel_circ_0013655的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-CAGGCAGGAGCTGAATACCAT-3’，
下游引物：5’-GGTCTTTGTACTTCTGCCCATC-3’；
所述novel_circ_0013656的上下游PCR扩增引物为：
上游引物：5’-GGTCTCATGGCTTCTAGGAACT-3’，
下游引物：5’-TCGGGCCCCATTCTTATGATGA-3’。
本试剂盒中还包括TRIzol试剂、RNA抽提试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、核酸染料和50bp DNA Step Marker。
实施例2
本发明实施例提供了一种外周血与月经血的实时荧光定量鉴别检测方法，包括以下操作步骤：
1、外周血与月经血棉拭子RNA的提取、定量及保存
1)取无RNA酶的灭菌1.5mL离心管1个，将1cm2血棉拭子剪碎到离心管中，加入1mLTRIzol试剂移液器吹打混匀后剧烈震荡1-2分钟，直到絮状物全部溶解，冰上静置5分钟；
2)按TRIzol试剂与三氯甲烷体积比为5:1的比例加入200μL三氯甲烷，上下颠倒剧烈混匀10次，冰上静置5分钟。此时溶液分三层：上层无色液体，下层粉红色，中间层不明显；
3)4℃、12000g/min离心15min，取出EP管，可见管内液体分三层：上层无色上清为RNA，中间层白色沉淀为蛋白(不明显)，下层粉红色为细胞碎片；
4)用微量加样器取上清液(200-400μL)转移至无RNA酶的灭菌1.5mL离心管中，加入与上清等体积的RNA抽提试剂200-400μL，轻轻上下颠倒混匀，冰上静置5分钟；
5)用微量加样器取上清液(100-200μL)转移至无RNA酶的灭菌1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，冰上静置12分钟；
6)4℃、12000g/min离心10min；
7)弃掉上清，可见的白色沉淀即为RNA；
8)加预冷的75％乙醇(DEPC水配制)1mL，轻轻敲打管壁，使RNA沉淀重悬混匀；
9)4℃、8000g/min离心10min，弃上清，倒置于干净滤纸上片刻，开盖，室温干燥5分钟，使乙醇挥发；
10)加入20μL 0.1％DEPC处理水溶解沉淀，吹打混匀，即可获得样本总RNA；
11)应用NanoQ微型分光光度计对所提取的RNA进行检测，并记录下每个样本RNA的浓度与纯度，于-20℃保存。
2、反转录
本实施例采用PrimescriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录。首先进行去除基因组DNA反应，反应体系如表1所示。
表1
反应组分 体积
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
Total RNA 5μL(200ng/μL)
无酶核水 2μL
总体积 10μL
然后进行反转录反应，反应体系如表2所示。
表2
反应组分 体积
Primescript RT Enzyme MixⅠ 1μL
RT primer Mix 1μL
5×Primescript Buffer 2 4μL
无酶核水 4μL
总体积 20μL
3、反转录后的cDNA进行qRT-PCR反应
本实施例采用SYBRR Premix Ex TaqTM II(Tli RnaseH Plus)试剂盒进行qRT-PCR(实时荧光定量聚合酶链式反应)。扩增体系如表3所示。
表3
反应组分 体积
SYBR premix Ex TaqⅡ(Tli RnaseH Plus) 10μL
PCR Forward Primer(10μM) 0.8μL
PCR Reverse Primer(10μM) 0.8μL
ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.4μL
cDNA模板 2μL
无酶核水 6μL
总体积 20μL
所述PCR扩增引物的核苷酸序列如表4所示。
表4
Figure BDA0001685741240000081
qRT-PCR反应步骤：在7500实时荧光定量PCR仪中进行反应，热循环参数：95℃，30sec；(95℃，5sec，60℃，34sec)×40，95℃，15sec，60℃，1min，95℃，15sec。
4、观察qRT-PCR结果，分析结果
根据实时荧光定量CT值情况对外周血与月经血进行鉴别。
4种环状RNA：hsa_circ_0000212、novel_circ_0013653、novel_circ_0013655和novel_circ_0013656在外周血中的结果均表现为“undetermined”，而在月经血样本中可观察到相应大小的CT值。将4种环状RNA用内参基因β-actin标准化后的ΔCT方法进行定量，结果如图1所示，可发现在外周血的ΔCT值均表现为无穷大，即不表达。可见在外周血及月经血样本中表达有显著差异。
实施例3
本发明实施例提供了一种外周血与月经血的琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法，包括以下操作步骤：
1、外周血与月经血棉拭子RNA的提取、定量及保存
1)取无RNA酶的灭菌1.5mL离心管1个，将1cm2血棉拭子剪碎到离心管中，加入1mLTRIzol试剂移液器吹打混匀后剧烈震荡1-2分钟，直到絮状物全部溶解，冰上静置5分钟；
2)按TRIzol试剂与三氯甲烷体积比为5:1的比例加入200μL三氯甲烷，上下颠倒剧烈混匀10次，冰上静置5分钟。此时溶液分三层：上层无色液体，下层粉红色，中间层不明显；
3)4℃、12000g/min离心15min，取出EP管，可见管内液体分三层：上层无色上清为RNA，中间层白色沉淀为蛋白(不明显)，下层粉红色为细胞碎片；
4)用微量加样器取上清液(200-400μL)转移至无RNA酶的灭菌1.5mL离心管中，加入与上清等体积的RNA抽提试剂200-400μL，轻轻上下颠倒混匀，冰上静置5分钟；
5)用微量加样器取上清液(100-200μL)转移至无RNA酶的灭菌1.5mL离心管中，加入400μL异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，冰上静置12分钟；
6)4℃、12000g/min离心10min；
7)弃掉上清，可见的白色沉淀即为RNA；
8)加预冷的75％乙醇(DEPC水配制)1mL，轻轻敲打管壁，使RNA沉淀重悬混匀；
9)4℃、8000g/min离心10min，弃上清，倒置于干净滤纸上片刻，开盖，室温干燥5分钟，使乙醇挥发；
10)加入20μL 0.1％DEPC处理水溶解沉淀，吹打混匀，即可获得样本总RNA；
11)应用NanoQ微型分光光度计对所提取的RNA进行检测，并记录下每个样本RNA的浓度与纯度，于-20℃保存。
2、反转录
本实施例采用PrimescriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录。首先进行去除基因组DNA反应，反应体系如表5所示。
表5
反应组分 体积
5×gDNA Eraser Buffer 2μL
gDNA Eraser 1μL
Total RNA 5μL(200ng/μL)
无酶核水 2μL
总体积 10μL
然后进行反转录反应，反应体系如表6所示。
表6
反应组分 体积
Primescript RT Enzyme MixⅠ 1μL
RT primer Mix 1μL
5×Primescript Buffer 2 4μL
无酶核水 4μL
总体积 20μL
3、反转录后的cDNA进行PCR扩增
本实施例采用PCR试剂盒进行扩增(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)。扩增体系如表7所示。
表7
组分名称 浓度 含量
GoTaq Green Master Mix - 12.5μL
上游引物 10μmol/L 0.5μL
下游引物 10μmol/L 0.5μL
无核酶水 - 10.5μL
模板DNA 50ng/μl 1μL
所述PCR扩增引物的核苷酸序列如表8所示。
表8
Figure BDA0001685741240000111
PCR扩增步骤：在Masercycler Pro S PCR扩增仪中进行扩增，热循环参数：95℃，5min；(95℃，15sec，X℃，30sec，72℃，15sec)×48，72℃，5min。4种环状RNA的退火温度分别为hsa_circ_0000212∶57.1℃，novel_circ_0013653∶58.1℃，novel_circ_0013655∶56.6℃，novel_circ_0013656∶60℃，最终保持在4℃，得扩增产物。
扩增产物在进行琼脂糖凝胶电泳之前，需要制备琼脂糖凝胶。
4、琼脂糖凝胶制备
称取2g琼脂糖粉于三角烧瓶内，加入100mL 0.5×TBE，电炉煮沸至澄清后加入核酸染料(GelredTM显色液)10μL轻摇均匀，然后选择合适大小的梳子灌胶，约0.5mm厚，30min可凝固。
5、对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳
在琼脂糖凝胶孔内加入步骤3中所得的扩增产物4μL，然后加入50bp DNAStepMarker 3μL，电压150V条件下电泳30min。在Azure C500激光近红外成像系统上观察电泳结果。
6、观察琼脂糖凝胶电泳结果，分析结果
根据琼脂糖凝胶电泳条带情况对外周血与月经血进行鉴别。
4种环状RNA：hsa_circ_0000212、novel_circ_0013653、novel_circ_0013655和novel_circ_0013656均在外周血样本无条带而在月经血样本中可观察到相应大小的条带。结果如图2所示，可发现4种环状RNA：hsa_circ_0000212、novel_circ_0013653、novel_circ_0013655、novel_circ_0013656在外周血及月经血样本中条带表达有显著差异。
由结果可见，本发明实施例提供的实时荧光定量(qRT-PCR)及琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法能够对外周血与月经血进行鉴别，为法医相关的案件侦破提供技术支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学
<120> 一种外周血与月经血鉴别用试剂盒及其应用
<130> 2018.5.25
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gaaaggcacc gcagaatatg aac 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
agctgacaaa gtgctctcca tg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agctccttcc agcacgagat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtccggaatt gggtgaaggt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
caggcaggag ctgaatacca t 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ggtctttgta cttctgccca tc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ggtctcatgg cttctaggaa ct 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tcgggcccca ttcttatgat ga 22
<210> 9
<211> 198
<212> RNA
<213> 剪切序列
<400> 9
gucgaucuuu gcugugguua aacuugaaag gcaccgcaga auaugaacag gaguuacagc 60
gauccagggu guaugauguu ucuguuuggg aggcuucuug guaauuuuuu cugcaggaug 120
aauuaagaga agagacacuu gcucaucagg cauggagagc acuuugucag cuuccaauau 180
gcaagacccu ucaucuuc 198
<210> 10
<211> 198
<212> RNA
<213> 剪切序列
<400> 10
ggaacuucac ugaccuguuu ccccacagga acccagucca gggcaagcag cuccuuccag 60
cacgagaugu cccaagaagg cuucagcaca gcccucacaa uguuugcacu gaugcaguac 120
ucaaaccucc ugaagaucca cuucaccuuc acccaauucc ggaccagccc gagccagcag 180
agccuggugg aucccauc 198
<210> 11
<211> 199
<212> RNA
<213> 剪切序列
<400> 11
caucagcuca gcgccuccgc aggaccacgu guucaaggug gacaacuuug cagcccuugg 60
cagcauccag aagcagcugc aggagaagau cuaugcaguu gagggacaca gcuauuucau 120
cauaagaaug gggcccgaaa aagugccaag aagauccuca uugucaucac agaugggcag 180
aaguacaaag acccccugg 199
<210> 12
<211> 198
<212> RNA
<213> 剪切序列
<400> 12
ggaacuucac ugaccuguuu ccccacagga acccagucca gggcaagcag cuccuuccag 60
cacgagaugu cccaagaagg cuucagcaca gcccucacaa uggacacagc uauuucauca 120
uaagaauggg gcccgaaaaa gugccaagaa gauccucauu gucaucacag augggcagaa 180
guacaaagac ccccugga 198

Claims (5)

1.一种外周血与月经血鉴别用试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括引物组合物，所述引物组合物由四对PCR扩增引物组成；所述第一对PCR扩增引物为：
上游引物：5’- GAAAGGCACCGCAGAATATGAAC -3’，
下游引物：5’- AGCTGACAAAGTGCTCTCCATG -3’；
所述第二对PCR扩增引物为：
上游引物：5’- AGCTCCTTCCAGCACGAGAT -3’，
下游引物：5’- GTCCGGAATTGGGTGAAGGT -3’；
所述第三对PCR扩增引物为：
上游引物：5’- CAGGCAGGAGCTGAATACCAT -3’，
下游引物：5’- GGTCTTTGTACTTCTGCCCATC -3’；
所述第四对PCR扩增引物为：
上游引物：5’- GGTCTCATGGCTTCTAGGAACT -3’，
下游引物：5’- TCGGGCCCCATTCTTATGATGA -3’。
2.一种外周血与月经血的实时荧光定量鉴别检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量鉴别检测方法包括以下操作步骤：
提取待测血样RNA，用RNA反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA；
用实时荧光定量试剂盒和权利要求1所述试剂盒中所述四对PCR扩增引物对所述cDNA进行实时荧光定量检测，根据PCR扩增产物的表达水平鉴别待测血样来自外周血或月经血。
3.权利要求2所述实时荧光定量鉴别检测方法用于法医鉴别待测血样来自外周血或月经血的应用。
4.一种外周血与月经血的琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法包括以下操作步骤：
提取待测血样RNA，用RNA反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA；
用PCR试剂盒和权利要求1所述试剂盒中所述四对PCR扩增引物对所述cDNA进行PCR扩增；
将PCR扩增产物加入到琼脂糖凝胶中进行电泳，根据电泳条带结果鉴别待测血样来自外周血或月经血。
5.权利要求4所述琼脂糖凝胶电泳鉴别检测方法用于法医鉴别待测血样来自外周血或月经血的应用。
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