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CN112955569A - 用于测序的电场辅助结 - Google Patents

用于测序的电场辅助结 Download PDF

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CN112955569A CN201980068645.XA CN201980068645A CN112955569A CN 112955569 A CN112955569 A CN 112955569A CN 201980068645 A CN201980068645 A CN 201980068645A CN 112955569 A CN112955569 A CN 112955569A
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Abstract

可以借由在隧穿结处进行隧穿识别来分析分子(例如，进行核酸分子的测序)。本发明的实施例可以允许使用隧穿结来检测个体核苷酸以及进行核酸分子的测序。通过用某一部分标记特定核苷酸，隧穿结可以生成具有合适信噪比的信号。可以施加电场以使所述核酸分子和所述部分移动靠近所述隧穿结，使得电流可行进穿过所述部分。因为可以使用具有合适信噪比的信号来检测单个核苷酸，所述信号由穿过所述部分的所述隧穿电流产生，所以本发明的实施例可以允许使用隧穿电流快速检测核苷酸。

Description

用于测序的电场辅助结
背景技术
用于分析单个分子(例如核酸)的技术包括在两个导电层之间具有亚分子大小的间隙的隧穿结装置。隧穿结使用隧穿识别。隧穿识别基于将分子或分子的部分(例如核酸的核苷酸)放置在导电层之间。当分子或分子的部分接触或足够接近两个层时，分子或分子的部分的轨道将会允许电子从一个层转移到另一个层，从而产生隧穿电流。可以分析隧穿电流以鉴定分子或分子的部分。
为了鉴定分子的部分，诸如核苷酸，间隙的尺寸通常将必须处于纳米数量级，包括小于2nm，或者甚至是亚纳米级。产生如此小的间隙需要精密且昂贵的技术。减小隧穿结的尺寸还可以使分子接触的频率降低并且持续时间较短。此外，如此小的间隙尺寸可能会造成短路，并可能导致高的背景隧穿电流。
因此，仍然需要改进用于化学和生物学检测以及涉及该装置的过程的隧穿结的设计和可制造性。设计和可制造性的改善不应以准确且精确的分析为代价。这些和其他问题由本文档中描述的技术解决。
发明内容
本发明的实施例可以允许通过在隧穿结处的隧穿识别进行分子的分析(例如，核酸分子的测序)。隧穿结可以是电隧穿结或磁隧穿结。本发明的实施例可以允许检测个体核苷酸，并且因此可以使用隧穿结实现核酸的精确测序。通过用某一部分标记特定的核苷酸，隧穿结可以生成二进制信号，该信号以合适的信噪比清晰可见。所述隧穿识别可使用主要穿过所述部分而不是主要穿过所关注的核苷酸或所关注的分子的一部分的隧穿电流。可以施加电场以使该分子和该部分移动至更靠近隧穿结。以这种方式，该部分处于足够近的位置以使电流穿过该部分。
隧穿结装置可以专注于一次读取单个核苷酸。单链核酸分子的多个且相同的拷贝可以在分子的一端附接至隧穿结。单链核酸分子可附接至粘附层，该粘附层可设置在隧穿结装置的电极上。单链核酸分子可用作模板链。聚合酶可连接至模板链，并且可用于使用模板链合成双链DNA分子。单一类型的核苷酸(例如，A核苷酸)可以用某一部分标记并引入装置中。如果所述核苷酸在当前位置与模板链互补，则将其掺入DNA分子中。可以洗涤该装置中过量的游离核苷酸。可使用场电极来施加电场，以将DNA分子和该部分推向隧穿结。如果将所述核苷酸添加到DNA分子中，则该部分可能在隧穿结中造成电流信号。如果所述核苷酸未添加到DNA分子，则电流可能接近零。然后可以去除该部分。可以将下一种类型的标记核苷酸引入设备中，并且可以重复该过程。由该部分产生的电流信号可以是相比于穿过核苷酸本身的背景电流更大的电流。
因为可以使用具有合适信噪比的信号来检测单个核苷酸，所述信号由穿过该部分的隧穿电流产生，所以本发明的实施例可以允许使用隧穿电流快速检测核苷酸。通过检测穿过该部分而不是核苷酸本身的电流，隧穿结中的介电质可能比单个核苷酸的大小厚。因此，可以更容易、更便宜和更快地制造隧穿结。
隧穿结装置可以利用半导体加工技术来制造。用于检测核苷酸的读取时间可以接近或等于闪存驱动器的读取时间。将多个隧穿结并入到单个测序装置中可以允许多路复用。本发明的实施例可以允许许多隧穿结，其类似于闪存驱动器中的隧穿结数量。换句话说，数十亿个隧穿结可以并入到闪存驱动器大小(平方厘米量级的面积)的设备中。高度复用的系统可以实现快速、准确的测序。
参考以下具体实施方式和附图，可以更好地理解本发明的实施例的性质和优点。
附图说明
图1示出根据本发明实施例的随机电报噪声(RTN)的图。
图2A和2B示出根据本发明实施例的穿过具有和不具有某一部分的核苷酸的隧穿电流的图。
图3A和3B示出根据本发明的实施例对具有和不具有某一部分的核苷酸的隧穿电流响应。
图4A、4B和4C示出根据本发明实施例的化合物的实例，该化合物是用有机金属部分(OM、)标记的修饰的核苷酸。
图5A-5H示出根据本发明实施例的用于确定核酸序列的构造。
图6示出根据本发明实施例的使用电隧穿结确定核酸序列的步骤。
图7示出根据本发明实施例的使用磁隧穿结确定核酸序列的步骤。
图8A-8C示出根据本发明实施例的用于确定核酸序列的实例系统。
图9示出根据本发明实施例的隧穿结的电极的构造。
图10示出根据本发明实施例的包括多个隧穿结的构造。
图11A和11B示出根据本发明实施例的具有磁隧穿结的实例系统。
图12示出根据本发明实施例的具有栓系聚合酶的隧穿结的实例系统。
图13示出根据本发明实施例的分析系统。
图14示出根据本发明实施例的计算机系统。
图15示出根据本发明实施例的计算机系统。
术语
术语“接触”可以指使一个物体靠近另一物体，使得电子可以从一个物体隧穿穿过另一物体。在亚原子水平上，两个物体可能永远不会彼此物理接触，因为物体中电子云的排斥力可能会阻止这些物体更近地接近。
“核酸”可以指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语可以涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键合的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性。此类类似物的实例可包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)。
除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19∶5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
除非上下文另外明确指出，否则术语“核苷酸”除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其在使用该核苷酸的特定情况下(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等同的。
术语“振荡”可以指由于布朗运动或其他力而导致的物体在流体中的运动。在没有人或机器主动干预的情况下，物体可能会振荡。在某些情况下，由于施加的电场或压力驱动的流动，物体可能会振动。
当技术术语“部分”用于化学中时，该术语可以包括官能团。另外，部分也可以指键合在一起的原子或原子团，其可以形成较大化合物的一部分。部分可包括磁性纳米颗粒。
方向性术语诸如用于半导体加工层和步骤的“之上”或“在顶部上”可以使用参照系，其中这些术语表示远离由基板的表面限定的平面的位置。“底部”可以是基板的底侧或朝向基板的底侧。本领域技术人员将理解，即使颠倒地处理基板，层的“底部”仍然可以指该层的最靠近基板的底侧或未处理侧的一侧。
术语“电特征”可以理解为是指与电路有关的任何特性。电特征可以指电压、电流、电阻、阻抗、电感或电容及其时间变化(例如，电流频率)。
具体实施方式
隧穿识别是用于鉴定分子或分子的部分(例如核酸)的技术。隧穿结可以包括电隧穿结或磁隧穿结。电隧穿结可以包括将绝缘层夹在中间的两个导体。当一个分子或分子的部分与两个导体接触或足够靠近两个导体时，从一个导体到另一个导体的隧穿电流就会改变。分子或分子的部分可以通过诱导直接传导或陷阱辅助隧穿来改变电流的幅度。
磁隧穿结可以包括将绝缘层夹在中间的两种铁磁材料。当磁性纳米颗粒靠近铁磁材料时，磁畴的相对取向发生变化，并且从一个导体隧穿到另一导体的电流也发生变化。隧穿电流的量取决于铁磁材料的磁化方向(即自旋)。具有相同自旋(即，平行)的铁磁材料的电流高于具有相反自旋(即，反平行)的两种铁磁材料的电流。
对于任一结，隧穿电流可以根据接触两个导体的分子或分子的部分的属性以及多少分子在接触导体与不接触导体之间振荡而发生变化。如果测量仅穿过核酸的单个核苷酸的电流，则绝缘层通常将必须小于核苷酸的大小，以使得核苷酸可以跨绝缘层接触两个导体。
然而，即使是1nm的厚度也大约是三个核苷酸的大小，这可能给检测单个核苷酸造成问题。即使当绝缘层的厚度在1至2nm的数量级时，制造仍然可能是困难的，并且穿过薄绝缘层的背景隧穿电流可能太大，以至于不能检测到来自核苷酸的信号，或者这种薄绝缘层可能无法防止短路。增加绝缘层的厚度可以使制造更容易，但是随后需要可测量的隧穿电流穿过甚至更多的核苷酸。穿过多个核苷酸的信号将牵涉更复杂的信号分析，以鉴定单个核苷酸。
本技术的实施例可以降低电流信号中的噪声，并且不需要大约1至2nm的薄绝缘层。隧穿结装置可以专注于一次读取单个核苷酸。单链核酸分子(即模板母链)可附接或栓系至隧穿结。双链DNA分子可以通过连接至模板母链的聚合酶来合成。具有多个聚合酶的多个模板母链可附接至隧穿结。实施例可以在同一装置上包括许多隧穿结，从而允许多路复用。
在一些实施例中，用某一部分标记一组单一类型的核苷酸(例如，A核苷酸)并将其引入装置中。当所述核苷酸是与模板母链互补的类型时，可以将这些核苷酸添加至新生链。可以在引入额外的标记核苷酸之后的这个时候或之后的一个周期中，清洗掉过量的游离核苷酸。
可以施加电场，以使带负电荷的核酸分子与该部分一起向着隧穿结(例如，绝缘层)移动。可以使该部分足够靠近，以允许电流从一个导体隧穿到另一导体。在一些实施例中，该部分可以同时接触这两个导体，以允许从一个导体到另一导体的直流路径。在该部分同时接触这两个导体以允许直流路径的实施例中，该结可以称为隧穿结，因为该结的构造可以与隧穿结的构造相似或相同，即便隧穿电流不是流经该结的主导电流。附接至隧穿结的多个核酸分子可增加电流信号的概率或可增加电流信号的强度。
如果将核苷酸添加到DNA分子中，则该部分使得隧穿结中产生电流信号。如果所述核苷酸未添加到DNA分子，则电流可能接近零。然后可以去除该部分。可以将下一种类型的标记核苷酸引入装置中，并且可以重复该过程，从而允许检测在每个位置是否掺入了特定核苷酸。通过该部分产生的电流信号可以高于穿过核苷酸本身的背景电流，从而提供具有较少噪声的信号。
I.使用随机电报噪声(RTN)
穿过一个或多个核苷酸本身的隧穿电流可能不会产生具有合适信噪比的足够高的电流信号。所述核苷酸可以与导体短时间接触，并且不同核苷酸或核苷酸序列之间的隧穿电流差异可能很小。因此，需要更强且更容易检测的信号。
A.RTN
为了产生具有合适信噪比的电流信号，本发明的实施例的电流信号可以模仿随机电报噪声(RTN)，其先前被称为隧穿结中不需要的电流信号的问题。不希望受特定理论的束缚，对RTN的一种解释是杂质引起不想要的电流信号。杂质可能已经入陷了电荷，并可能在相当长的时间内维持较高的电流。杂质可能是隧穿结的氧化物中的缺陷，起到类似电荷陷阱的作用。这些杂质可包括氧化物中的氧空位，在金属氧化物基质中被捕获的离子以及替代离子(例如，掺杂剂)。在杂质不再被电荷捕获或杂质去除之后，电流下降。本发明的实施例中的装置用标记的核苷酸的标签有意地再现了这种RTN现象。
图1以电流对时间的曲线图示出RTN的曲线图100。该图示出较高电流的区域(例如，区域102)和接近零的较低电流的区域(例如，区域104)。较高电流的区域可能会有捕获的电荷，而较低电流的区域可能没有捕获的电荷。然后，对是否可以捕获电荷的分析可以取决于鉴定出哪里存在高于背景电流的电流。
B.部分的用法
为了有意模拟RTN，可以将产生RTN的某一部分附接至所关注的分子。例如，如果待分析的分子是核酸，则可以将某一部分附接至待掺入正在生长的核酸链中的核苷酸。
图2A和2B示出某一部分可以如何用于产生电流信号。在图2A中，通过聚合酶204添加到新生链202的最后一个核苷酸连接至部分208。新生链202通过聚合酶204与模板母链206杂交。如果部分208足够靠近第一导体210和第二导体212，则部分208允许电子从第一导体210隧穿到第二导体212。隧穿电子可以产生类似于曲线图220的随时间变化的电流信号。电流信号的随机性质可以是捕获和释放被捕获的电荷状态和/或电容效应(即，充电和放电)的结果。电容效应可能是捕获的电子改变隧穿结附近的电荷分布的结果，这可能会改变隧穿势垒的高度。流经该结的电流的幅度可以指数地取决于势垒高度。由陷阱状态的随机充电和放电引起的势垒高度的小幅变化可以导致隧穿电流的大幅变化，这在图2A中显而易见。
在图2B中，当不存在部分时，电子不能从第一导体210隧穿至第二导体212。在图2B中，类似于曲线图240，隧穿电流应接近零或接近背景隧穿电流。因此，可以通过测量大于零的隧穿电流或背景隧穿电流来检测部分208，并且因此可检测核苷酸。
该部分应该是一个实体，该实体允许基于所施加的某一电位而使隧穿电流穿过。图3A示出当没有部分附接至核苷酸时的隧穿电流响应。聚合酶302靠近隧穿结304。聚合酶302与模板母链306杂交。不存在部分，也没有捕获的电荷。隧穿结处于非共振阱状态308，其不允许电流从一个导体隧穿至另一导体。结果是电流对时间的曲线图310，其中电流接近零且处于背景水平。
图3B示出当某一部分附接至核苷酸时的隧穿电流响应。聚合酶312靠近隧穿结314。聚合酶312与模板母链316杂交。添加的核苷酸具有部分318。部分318以电子转移频率捕获电荷。隧穿结处于共振阱打开状态320。电流可以从一个导体穿过该部分隧穿到另一导体。结果是电流对时间的曲线图322，其中电流达到非零电流和高于背景水平的电流。
II.具有部分的标记化合物
所用的部分可以是标记化合物的一部分，该标记化合物包括比仅该部分更多的组分。本文所述的方法和系统中使用的化学化合物可包括核苷酸、可切割的连接基和部分。核苷酸可以包括四种DNA核苷酸中的任何一个，包括腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)。核苷酸还可以包括四种RNA核苷酸，包括腺嘌呤、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤和胞嘧啶。标记化合物可以足够长，以允许该部分与隧穿结接触，同时施加电场以迫使该部分处的核酸分子更靠近隧穿结。
对于电隧穿结，部分可以选自由有机金属基团、纳米颗粒、共轭芳族基团和导电有机分子组成的组。导电有机分子可以没有带隙，并且可以不是绝缘体或半导体。作为实例，有机金属基团可包括二茂铁、金属酞菁(例如酞菁锰)、钌、锇和过渡金属有机金属化合物。作为实例，纳米颗粒可以包括金、银、铂、镁或氮化钛纳米颗粒。纳米颗粒可以包括具有特征尺寸1至10nm，包括1至5nm和5至10nm的任何颗粒。如果纳米颗粒是球形，则特征尺寸可以是纳米颗粒的直径。然而，如果纳米颗粒不是球形，则特征尺寸可以是具有与非球形纳米颗粒相同体积的球形的直径。在一些情况下，特征尺寸可以是纳米颗粒的宽度、长度或高度的最小值。共轭芳族基团可包括具有几个苯环的化合物，包括具有两个至九个苯环的化合物、蒽、菲、并四苯、
Figure BDA0003024736740000081
苯并菲、芘、并五苯、苯并芘、心环烯、苯并二萘嵌苯、晕苯、卵苯和苯并芴。共轭芳族基团可包括具有以线性结构排列的苯环的化合物。作为实例，导电有机分子可以包括短聚合物，该短聚合物包括聚吡咯和聚苯胺。
如上所述，部分可以通过将电荷保持在共振阱打开状态而允许隧穿电流。在一些实施例中，相同的部分可以附接至四个核苷酸。在其他实施例中，不同的部分可以用于不同的核苷酸，每个部分对于施加的电压产生不同的隧穿电流。部分可以包含多个基团，诸如多个有机金属基团。该部分可以不带高强度负电荷或正电荷。带电荷的部分可能导致对DNA分子的不希望的排斥或吸引。
对于磁隧穿结，部分可以选自由铁磁材料或超顺磁材料组成的组。材料可以包括磁性纳米颗粒(例如，FePt、FeCuPt、Fe2O3)。纳米颗粒的直径或特征尺寸可小于1μm、500nm、100nm或10nm。
该化学化合物可以具有由N-X-S-M表示的结构，其中N是核苷酸，X是可切割的连接基，S是间隔体，并且M是部分。核苷酸可以直接与可切割的连接基键合。
可切割的连接基可以使标记化合物在检测后从掺入的核苷酸中切割。可切割的连接基在本领域中是已知的，并且已经在例如美国专利号7,057,026、7,414,116及其继续申请和改进申请中描述。在一些实施例中，标记通过包含烯丙基或叠氮基基团的连接基附接至嘧啶的5-位或嘌呤的7-位。在其他实施例中，连接基包含二硫键、吲哚或Sieber基团。连接基可进一步包含一个或多个选自烷基(C1-6)或烷氧基(C1-6)、硝基、氰基、氟基团或具有类似性质的基团的取代基。简而言之，连接基可以被水溶性膦或基于膦的含过渡金属的催化剂切割。其他连接基和连接基切割机制是本领域已知的。例如，包含三苯甲基、对烷氧基苄基酯和对烷氧基苄基酰胺以及叔丁氧羰基(Boc)基团和缩醛系统的连接基可以在酸性条件下通过释放质子的切割剂进行切割。硫缩醛或其他含硫的连接基可以使用亲硫金属诸如镍、银或汞进行切割。切割保护基团也可以考虑用于制备合适的连接基分子。含酯和二硫键的连接基可在还原条件下切割。含有三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的连接基可在F离子存在下切割。在不影响反应混合物的其他组分的波长下切割的光可切割的连接基包括包含O-硝基苄基基团的连接基。包含苄氧基羰基基团的连接基可以被基于Pd的催化剂切割。
作为实例，可切割的连接基X可以被金属催化剂(例如烯丙基基团)、酶(例如蛋白酶切割位点，烟草蚀刻病毒[TEV]切割位点)、光(例如硝基苯)、还原反应(例如二硫化物)、酸(例如乙缩醛、甲氧基甲基或保护的乙缩醛(例如O-CH2-N3或-O-CH(N3)-))、碱(例如琥珀酸酯、乙酰基)、氧化反应(例如邻二醇)或磷酸酶(例如磷酸盐)切割。可切割的连接基可以包括-O-NH2，其可以被亚硝酸盐切割。
作为实例，间隔体可以是聚乙二醇(PEG)、烷基或芳基间隔体、肽、阳离子间隔体(例如精胺)、核酸、碳水化合物或其组合。
图4A示出化学化合物的实例。在图4A中，连接基-间隔体-部分附接至脱氧核糖的3′OH基团。核苷酸与X(可切割的连接基)、间隔体以及随后的有机金属(OM)部分链接。封闭3′-OH基团可自动终止聚合酶反应。然而，带有庞大化合物的3′-OH可能不容易被聚合酶接受。
图4B示出另一种化学化合物的实例。连接基-间隔体-部分附接至所述核苷酸的碱基。修饰碱基通常被聚合酶很好地接受。然而，因为3′-OH基团没有被封闭，所以图4B中的化合物可能导致不到100％的终止。
图4C示出化学化合物的另一个实例。碱基和3′OH基团两者都可以键合至可切割的连接基X。键合至碱基的连接基X可以与键合至3′OH基团的X相同。然而，在一些实施例中，两个连接基可以是不同的化合物。图4C中的化合物可以结合图4A中的化合物和图4B中的化合物两者的优点。在3′-OH基团上添加一个小的可切割终止子基团可以确保在掺入后停止。大的X-S-M化合物附接至碱基上可能不会过多地干扰聚合酶。但是，图4C可能需要在两个位点而不仅在一个位点进行切割。
连接基-间隔体-部分可以充当闪电终止子(Stupi，B.P.等人，“Stereochemistryof benzylic carbon substitution coupled with ring modification of 2-nitrobenzyl groups as key determinantsfor fast-cleaving reversibleterminators”，Angew.Chem.Int.Ed.，51，1724-1727(2012)，可在onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/anie.201106516获得)或作为虚拟终止子(Bowers，J.等人，“Virtual terminator nucleotides for next-generation DNAsequencing”，Nature Methods，6，593-595(2009)，可在www.nature.com/articles/nmeth.1354.pdf获得，并且相关补充信息可在media.nature.com/original/nature-assets/nmeth/journal/v6/n8/extref/nmeth.1354-S1.pdf获得)。
该化学化合物还可以包括终止子。终止子可以停止聚合过程。例如，对于聚合酶，终止子可以令聚合酶停止添加核苷酸直到终止子被移除。连接基、间隔体、部分或其组合可以充当终止子。图4A、4B和4C中的标记化合物可各自包括终止子。
如果待分析的分子不是核酸，则可以相应地调整化学化合物。标记化合物可以附接至生物聚合物的单个单元上。例如，如果待分析的化合物是蛋白质，则标记化合物可以附接至氨基酸而不是核苷酸。
III.分析分子的方法
测序装置可包括由绝缘层隔开的两个导体。导体和绝缘层的构造可以与平行板电容器或隧穿结的构造相同。隧穿结可以是电隧穿结或磁隧穿结。导体的这些构造可用于确定核酸的序列。方法可包括将聚合酶连接至与测序装置附接的模板母链。测序装置可包括由绝缘层隔开的第一导体和第二导体。方法可包括将一组核苷酸添加到测序装置。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至标记化合物。标记化合物可以包括某一部分。
方法可进一步包括使用连接至待测序的模板母链的聚合酶来延伸新生链。延伸可包括通过与模板母链杂交而将核苷酸组的第一核苷酸掺入新生链的聚合酶。
方法可包括：施加电位以使模板母链和附接至第一核苷酸的第一标记化合物的第一部分移动至更靠近绝缘层，同时模板母链附接至测序装置。然后，方法可包括：在施加电位的同时，测量穿过第一导体、第一部分和第二导体的电特征或磁特征的值。方法可包括利用电特征或磁特征的值检测第一核苷酸为与模板母链杂交的。
用于电隧穿结和磁隧穿结的方法如下所述。
A.电场辅助结构造
图5A-5G示出用于确定核酸序列的构造。为便于说明，提供了图5A-5G中的测序装置，但是测序装置和方法不限于这些图中的描绘。
图5A示出隧穿结500。隧穿结500包括第一隧穿电极502和第二隧穿电极504。第一隧穿电极502和第二隧穿电极504由绝缘材料506隔开，该绝缘材料在这两个隧穿电极之间形成绝缘层508。
粘附层510可设置在第一隧穿电极502、第二隧穿电极504和绝缘层508的顶部上。粘附层510可以是表面官能化层并且可包含二氧化硅或氧化铝。表面官能化层包括修饰某个表面以包含允许共价键合的官能团。第一隧穿电极502和第二隧穿电极504可以是不允许核酸分子强力粘附的金属材料，并且绝缘层508可以太薄而不能附接核酸分子。粘附层510允许附接核酸分子。核酸可以通过与经由氧原子共价键合至二氧化硅或氧化铝的化合物键合而附接至粘附层510。结可以在没有粘附层510的情况下进行操作。
流体空间512可将粘附层510与第一场电极514隔开。当将隧穿结500用于测序时，流体空间512可充满液体。在一些实施例中，第一场电极514可不接触液体。例如，流体空间512可由壳体封闭，该壳体可以是玻璃或塑料。第一场电极514可以在壳体的外部，但是电场仍然可以影响壳体内的空间。绝缘材料506可以将隧穿电极与第二场电极516隔开。
图5B示出获得单链DNA 520的相同拷贝之后的隧穿结500。单链DNA 520的相同拷贝可以通过桥式扩增获得。桥式扩增可包括向DNA片段的两端添加衔接子。衔接子可包括引物。然后，这些片段可以通过衔接子而结合至表面。DNA片段的两端都可以通过形成桥状结构的衔接子而附接至表面。聚合酶合成DNA片段的反向链，以形成双链DNA。然后使双链DNA变性，留下两条单链DNA。表面可以覆盖有多个衔接子。衔接子可随机分布在表面上或布置在网格中。可能有两种类型的衔接子，一种类型的衔接子与DNA片段的一端处的衔接子互补，第二种类型的衔接子与DNA片段的第二端处的衔接子互补。两条单链DNA可以与互补的衔接子杂交，形成两个桥状结构。每个单链DNA杂交形成双链DNA。双链DNA再次变性。该过程可以重复。结果，在表面上可能留下许多紧密地附接至表面的单链DNA。相同的拷贝也可以通过滚环扩增或其他合适的扩增技术获得。一种类型的衔接子是可切割的，并且这些衔接子可被切割，使得所有单链DNA都在同一末端(3′或5′)附接至表面。可以使用其他技术来确保所有链都在同一方向上。
单链DNA 520可附接至粘附层510。相比于第一隧穿电极502、第二隧穿电极504或绝缘层508，单链DNA 520可更容易或更牢固地附接至粘附层510。
图5C示出添加引物之后的隧穿结500。将引物530添加至单链DNA 520，以形成双链DNA的区段。图5C中所示的每个单链DNA均添加有引物。
图5D示出添加聚合酶后的隧穿结500。聚合酶540连接至单链DNA 520和引物530。图5D中所示的每个单链DNA均有与其连接的聚合酶。
图5E示出添加一组核苷酸之后的隧穿结500。带有标记化合物的核苷酸通过聚合酶掺入并与单链DNA杂交。添加的核苷酸都可以是相同类型的核苷酸。标记化合物可以是本文所述的任何标记化合物。作为图5E中的实例，聚合酶540将核苷酸与具有部分550的标记化合物合并。这些部分所处的距离不会显著影响从第一隧穿电极502到第二隧穿电极504的隧穿电流。
图5F示出了用隧穿结500检测核苷酸。将负电位施加到第一场电极514。将正电位施加到第二场电极516。因为DNA带负电荷，所以DNA从第一场电极514移开并且移向第二场电极516。结果，DNA移向第一隧穿电极502、绝缘层508和第二隧穿电极504。因此，具有带有部分的标记化合物的核苷酸也移向第一隧穿电极502、绝缘层508和第二隧穿电极504。例如，部分550可移动至更靠近第一隧穿电极502、绝缘层508和第二隧穿电极504。部分550可以处在某个距离，在该距离处，从第一隧穿电极502到第二隧穿电极504的隧穿电流受到部分550的存在的影响，并且可以测量隧穿电流中的差异。连接至相邻或附近DNA的临近的部分550也可能类似地影响隧穿电流。
尽管针对第一场电极514描述了负电压以及针对第二场电极516描述了正电压，但是一个电极不必是负的，另一电极不必是正的。电场基于两个电极之间的相对电压。例如，第一场电极514可具有正电压，第二场电极516可具有甚至更大的幅值的正电压。
对隧穿电流的影响可能会导致本文所述的随机电报噪声(RTN)。换句话说，相比于没有施加负电位时或没有掺入具有包括部分的标记化合物的核苷酸时，当向第一场电极514施加负电位时，隧穿电流可以更大。在一些实施例中，电流可以不经历量子隧穿，而是可以从第一隧穿电极502行进到部分550再行进到第二隧穿电极504。
粘附层510在图5F中示出，将部分550与第一隧穿电极502、绝缘层508和第二隧穿电极504隔开。在某些情况下，可以添加其他聚合酶来替代某些可能已经从DNA脱离的聚合酶。图5F示出了施加有正电位的第二场电极516。然而，第二场电极516不必处于正电位，而应是相对于第一场电极514为正。同样，第一场电极514不必处于负电位，而应是相对于第二场电极516为负。另外，两个场电极都可以不作为与隧穿电极隔开的电极而存在。例如，当存在第一场电极514时，可以不存在第二场电极516。相对于施加到第一隧穿电极502和/或第二隧穿电极504的电位，将负电位施加到第一场电极514。隧穿电极然后可以用作第二场电极。类似地，在没有第一场电极514的情况下，可以存在第二场电极516。相对于围绕DNA的流体，可以向第二场电极516施加正电位。正电位可将DNA吸引到隧穿结。
在该所示的位置具有粘附层510将针对给定的距离，减少部分550对隧穿电流的影响。然而，图5F是隧穿结500的二维呈现，并且不排除以下构造：粘附层510可不覆盖第一隧穿电极502、绝缘层508和/或第二隧穿电极504的某些部分。
图5G示出了粘附层510的不同的可能的顶视图，其中粘附层510可不覆盖下层的某些部分。在图5G的顶部，粘附层510限定了一个圆，其露出绝缘层508的圆形部分。图5G的中间部分示出，粘附层510限定了一个矩形，其中露出了绝缘层508的矩形部分。图5G的底部示出一个构造，除了第一隧穿电极502和第二隧穿电极504的一部分也被露出之外，该构造的其它内容都类似于图5G的中间部分的构造。露出第一隧穿电极502和第二隧穿电极504的某些部分可以允许电极与部分直接接触以获得信号。
图5H示出从核苷酸去除标记化合物后的隧穿结500。标记化合物包括连接基560和部分562。标记化合物可以通过光化学、化学、酶促反应或本文所述的任何技术进行切割。然后，标记化合物可以通过用流体流冲洗进行去除。如果去除了聚合酶，则可以再次添加聚合酶。
B.电隧穿结的实例方法。
图6示出根据本技术实施例的使用测序装置确定核酸序列的方法600。测序装置可包括电隧穿结、第一电源和仪表装置。隧穿结包括由绝缘层隔开的第一导体和第二导体。因此，第一导体和第二导体可以是隧穿结的电极。第一电源可以与隧穿结的电极电连通。第二电源可以与场电极电连通，场电极与隧穿结的电极是隔开的。
方法600可包括将模板母链附接至测序装置。方法600可进一步包括在框602所述步骤之前将引物附接至模板母链。在一些实施例中，模板母链是一组模板母链中的一个。在这些实施例中，可以将一组引物附接至该组模板母链。该装置可类似于图5C中的图示。在一些实施例中，第二组引物可以附接至测序装置，其中，第二组引物与附接至该组模板母链的第一组引物互补。然后，由于第一组引物附接于第二组引物，模板母链可附接至测序装置。
在框602，将聚合酶连接至与测序装置附接的模板母链。如上所述，模板母链可以通过引物附接至粘附层而附接至粘附层。粘附层可接触第一导体。在一些实施例中，粘附层可接触第二导体和/或绝缘层。粘附层可包含二氧化硅、氧化铝、硅、类金刚石碳、氮化硅、金或改善模板母链与隧穿结的共价键合的任何合适的材料。
在实施例中，模板母链可以是一组模板母链中的一个模板母链。聚合酶可以是一组聚合酶中的一个聚合酶。方法可包括将该组聚合酶与该组模板母链连接。该组聚合酶中的每个聚合酶均可连接至该组模板母链中的一个且仅一个模板母链。该组模板母链中的每个模板母链均可连接至该组聚合酶中的一个且仅一个聚合酶。在框602，连接聚合酶之后，构造可类似于图5D的图示。
该组模板母链可以已经通过扩增附接至测序装置的较小的一组模板母链而形成。在一些实施例中，正向链可以去除。在其他实施例中，反向链可以去除。剩余的模板母链可以全部在同一方向上并且可以是相同的。因此，该组模板母链可通过桥式扩增来形成。
在框604，可以将一组核苷酸添加到测序装置。该组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含部分的标记化合物。可以通过将核苷酸组包括在与测序装置接触的液体中来将核苷酸组添加到测序装置。该液体可以是离子液体。部分可以选自由有机金属化合物、纳米颗粒和共轭芳族化合物组成的组，或者可以是本文所述的任何部分。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至包括相应部分的相应标记化合物。在一些实施例中，核苷酸组中的每个核苷酸可以是相同类型的核苷酸。例如，核苷酸组中的每个核苷酸可以是G核苷酸。每个标记化合物的每个部分可以是相同类型的部分。在其他实施例中，核苷酸组可以包括两种、三种或四种类型的核苷酸。在这些实施例中，每个核苷酸可以附接至不同类型的部分。具有核苷酸组的液体可以储存在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。
在框606，使用聚合酶延伸新生链。聚合酶与待测序的模板母链连接。延伸包括：聚合酶将一组核苷酸中的第一核苷酸掺入新生链中。新生链可以是单链核酸分子。延伸该链可包括通过与模板母链杂交而将核苷酸组的第一核苷酸掺入新生链。新生链和模板母链可以一起形成双链核酸分子的一部分。
标记化合物可以包括构造为防止新生链进一步延伸的终止子。测序中常规隧穿结的问题可能是待分析的分子可能过快地流过该结，因此与电极接触的时间较短。这样，电流信号可能会太短而难以表征。另外，即使在框604中仅添加一种类型的核苷酸，模板母链中的特定序列也可以多次且连续地包括相同类型的核苷酸。这样，核酸分子可以在一次引入中添加相同类型的多个核苷酸。结果，当已添加多个核苷酸时，该设备可能只为一个核苷酸生成一个信号。终止子可以停止聚合酶的作用，直到终止子被移除。以此方式，一次只能添加一个核苷酸，从而给待测量的电流信号留出足够的时间。
除了第一核苷酸之外的核苷酸组可以从与隧穿结的接触中移除。移除核苷酸可以包括用水冲洗隧穿结。用于冲洗隧穿结的液体可以是没有核苷酸的水或离子液体。这一冲洗液可以存储在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。移除核苷酸组可以发生在测量电特征的值之前。在其他实施例中，在测量电特征的值之前可以不移除核苷酸组。在框606之后，该装置可类似于图5E中的构造。
在框608，施加电位以使模板母链和附接至第一核苷酸的第一标记化合物的第一部分移动至更靠近绝缘层，同时模板母链附接至测序装置。电位可通过上述第二电源施加至场电极。在一些实施例中，施加电位可使第一标记化合物的第一部分移动以接触第一导体和第二导体。在实施例中，第一部分可移动至某个距离，在该距离处，当跨第一导体和第二导体施加电压时，电流可以从第一导体通过第一部分隧穿到第二导体。
施加电场可包括向电极施加负电压。负电压可在-1V至0V的范围内，包括-1V至-0.75V、-0.75V至-0.50V、-0.50V至-0.25V、-0.25V至-0V。施加电场可包括向另一电极施加正电压。正电压可以是从0V到+1V，包括例如0V至0.25V、0.25V至0.50V、0.50V至0.75V或0.75V至1.0V。两个电极之间的电压差可以是大于0V且小于2V的任何电压差，包括0.25V至0.50V、0.50V至0.75V或0.75V至1.0V、1.0V至1.25V、1.25V至1.50V、1.50V至1.75V或1.75V至2.00V。电极可设置成使新生链在电极和绝缘层之间。模板母链、聚合酶和/或第一标记化合物可以在电极和绝缘层之间。
在一些实施例中，可以封端没有掺入核苷酸的链。链的封端可避免分析在核苷酸循环后没有掺入任何核苷酸的链。例如，在引入每个链后，链可能不掺入A、T、G和C核苷酸中的任何一个。如果这些链随后在循环后掺入了核苷酸，则这些链将与在最后一个循环内确实掺入了核苷酸的其他链异相。为了减少这些异相读数，可将链封端，以使它们不掺入其他核苷酸。
在框610，跨第一导体和第二导体施加电压。该电压可以是适于产生穿过与隧穿结接触的实体的电流的任何电压。电流可以是隧穿电流。可以在移除第一核苷酸以外的核苷酸组之后(例如，冲洗后)施加电压。在一些实施例中，电压可以施加更长的持续时间，包括在冲洗之前、在延伸期间(例如，框606)或在添加核苷酸组期间(框604)。在一些实施例中，可以在整个方法中施加恒定电压。该装置可类似于图5F中的构造。
在框612，可以测量穿过第一导体、第一部分和第二导体的电特征的值。在实施例中，第一部分可接触第一导体和第二导体。电特征可以是电流、电压、电阻、电感或脉冲宽度。该值可以是平均值(均值、中值、众数值、均方根)、局部或全局最大值、或瞬时测量值。该值可以大于10nA，大于100nA或大于1μA。
在框614，利用电特征的值，检测第一核苷酸为与模板母链杂交的。方框616和618描述了如何可以检测第一核苷酸。
在框616，可以将电特征的值与电特征的参考值进行比较。参考值可以是穿过第一电极和第二电极并且不穿过部分的背景隧穿电流的值。参考值可以基于背景隧穿电流。例如，参考值可以设置为背景隧穿电流的最大水平，或者设置为与背景电特征具有统计学差异的值。例如，参考值可以设置为与平均背景隧穿电流相差一个、二个或三个标准偏差。在一些实施例中，参考值可以是零。
在框618，可以将该值确定为超过参考值。例如，该值可以确定为大于背景隧穿电流。当确定该值超过参考值时，可以将电流信号转换为二进制信号1。
1.用另一个核苷酸重复测量
方法600可以进一步包括在切割第一标记化合物之后用另一个核苷酸重复测量和检测。第一标记化合物可以切割，并且流体流可去除第一标记化合物，使得装置类似于图5H中的装置。切割第一标记化合物移除了终止子，这使聚合酶可以延伸带有另外核苷酸的新生链。可以通过光切割来切割第一标记化合物，这可以包括使特定波长或波长范围的光闪烁以影响第一标记化合物的光敏部分。在一些实施例中，切割第一标记化合物可包括通过引入切割剂进行化学切割，所述切割剂可包括pH调节剂(例如酸或碱)、酶或化学试剂。在一些实施例中，切割可以是金属(例如钯)催化的切割、还原切割、氧化切割、亲核切割或亲电切割。
方法600可包括将第二组核苷酸添加到测序装置。第二组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含第二部分的第二标记化合物。第二组核苷酸中的每个核苷酸是与第一核苷酸不同类型的核苷酸。每个第二标记化合物可以与第一标记化合物相同。每个第二部分可以是与第一部分相同类型的部分。
在通过掺入第一核苷酸使新生链延伸之后，新生链可以变成延伸的新生链(即，添加有第一核苷酸的新生链)。方法600可以包括通过聚合酶进一步延伸该延伸的新生链。酸聚合酶可以掺入附接至第二标记化合物的第二组核苷酸的包括第二部分的第二核苷酸。
可以测量穿过第一电极、第二部分和第二电极的电特征的第二值。基于电特征的第二值，可检测第二核苷酸为与模板母链杂交的。测量和检测可以与针对第一核苷酸描述的任何测量和检测相同。在聚合酶不将第二核苷酸或第二核苷酸组的任何核苷酸掺入的实施例中，电特征的第二值可以确定为在统计学上等同于参考值，并且可以确定不存在另外的核苷酸。
2.核苷酸组中的多种类型的核苷酸
在一些实施例中，在框604中添加的核苷酸组可以包括两种或更多种类型的核苷酸。核苷酸组可以包括附接至包含第二部分的第二标记化合物的第二核苷酸。在框610中检测第一核苷酸被杂交可以包括在框612中进行电特征的值的比较。在方法600中，可通过将所述电特征的值与电特征的第二参考值进行比较，基于所述电特征的值确定所述第二核苷酸未与模板链杂交。第二参考值可以具有与第一参考值相同或不同的值。
第一部分可以生成在一定范围内或在一定值之上或之下的电特征的值。第二部分可以生成在不同范围内或在一定值之上或之下的电特征的值。可以将电特征的测量值与不同范围或值进行比较，以确定通过电特征的值鉴定出了哪个部分，并因此确定鉴定出了哪个核苷酸。第一参考值和第二参考值可以是第一部分或第二部分的值范围内的端点。
3.多个隧穿结
方法600可以包括使用多个隧穿结来确定核酸的序列。每个隧穿结可以包括相应的第一电极、相应的第二电极和相应的绝缘层。每个相应的隧穿结附接至相应的聚合酶。
方法600可以包括用于多个隧穿结的每个隧穿结的步骤。可以在相应的第一电极和相应的第二电极上施加相应的电压。可以使用附接至相应的隧穿结并连接至待测序的相应母链的相应聚合酶来延伸相应的新生链。延伸可包括相应的聚合酶通过与相应的模板母链杂交而将核苷酸组的相应的核苷酸掺入相应的新生链中。可以通过相应的第一电极、附接至相应的核苷酸的相应的标记化合物的相应的部分以及相应的第二电极来测量相应的电特征的值。可以利用相应的电特征的值检测相应的核苷酸为与相应的模板母链杂交的。
多个隧穿结中的每个隧穿结可以确定与模板母链杂交的核苷酸的存在或不存在。在单个装置中，大约一平方厘米内多个结的数目可以为数千、数百万或数十亿。因为检测涉及鉴定二进制信号0或1，所以隧穿结的读取时间可能类似于闪存驱动器中的读取时间。基于闪存驱动器，隧穿结的读取时间可以是80兆位/秒(即每秒约8000万个结)至5吉比特/秒(即每秒约50亿个结)，甚至更快。在数百亿个隧穿结的情况下，所有隧穿结的读取时间可能只有几秒钟。隧穿结的清洗周期可能约为100μs，短于读取时间。
在实施例中，在添加第二组核苷酸之前移除第一组核苷酸。在其他实施例中，在添加第二组核苷酸之前，可以不移除第一组核苷酸(例如，通过冲洗步骤)。以这种方式，第二核苷酸可以在某些隧穿结处与模板母链杂交。具有电流信号的隧穿结的总数将来自具有来自第一组核苷酸的核苷酸或来自第二组核苷酸的核苷酸的任何母链。因为核苷酸的添加是依序进行的，所以可以基于在添加第一组核苷酸时未出现的信号推导具有来自第二组核苷酸的核苷酸的结。然后可以用剩余的核苷酸重复这一过程。然后可以在引入多组核苷酸后进行清洗。
在一些实施例中，由于具有多个隧穿结，可以一次引入两种不同类型的核苷酸而不是单个核苷酸。可以进行测量以查看哪些隧穿结已经包括具有两种不同标记化合物的两种不同类型核苷酸中的任何一种。然后使用核苷酸特异性移除过程移除第一种类型的核苷酸。例如，具有第一种类型的核苷酸的标记化合物可以用一定波长的光移除，而具有第二种类型的核苷酸的标记化合物可以不从新生链中移除。移除后，进行另一种测量以鉴定具有第二种类型的核苷酸的隧穿结。作为这一技术的结果，可以确定掺入了第一种类型的核苷酸的隧穿结和并入了第二种类型的核苷酸的隧穿结。这一技术还可以用于两种以上类型的核苷酸，只要可以选择性地移除该类型核苷酸的标记化合物即可。
方法600可以适于分析除核酸序列以外的分子。例如，如果待分析蛋白质的氨基酸序列，则可以将聚合酶替换为核糖体。是氨基酸而不是核苷酸将会被标记。取决于待分析的分子，也可以将聚合酶替换为解旋酶、核酸外切酶以及其他酶。
C.磁隧穿结构造
图7示出根据本技术实施例的使用测序装置确定核酸序列的方法700。测序装置可包括磁隧穿结、第一电源和仪表装置。隧穿结包括通过绝缘层隔开的第一铁磁层和第二铁磁层。铁磁层和第二铁磁层是描述用于隧穿结的导体的实例。第一电源可与隧穿结的导体电连通。第二电源可与场电极电连通，该场电极与隧穿结的导体是隔开的。
方法700可以包括将模板母链引入隧穿结。模板母链可以通过流体注入系统引入隧穿结。模板母链可获自生物样品。模板母链可用本文所述的任何方式附接至隧穿结。该装置可类似于图5C中的图示。
在框702，将聚合酶连接至与测序装置附接的模板母链。模板母链可用本文所述的任何方式附接至粘附层。粘附层可接触第一铁磁层。在一些实施例中，粘附层可接触第二铁磁层和/或绝缘层。粘附层可包括二氧化硅或改善模板母链对隧穿结的粘附力的任何合适的材料。在框702，连接聚合酶之后，构造可类似于图5D的图示。
在实施例中，模板母链可以是一组模板母链中的一个模板母链。该组模板链可全部具有同一方向(正向或反向)。聚合酶可以是一组聚合酶中的一个聚合酶。方法可包括将该组聚合酶与该组模板母链连接。该组聚合酶中的每个聚合酶均可连接至该组模板母链中的一个且仅一个模板母链。该组模板母链中的每个模板母链均可连接至该组聚合酶中的一个且仅一个聚合酶。
该组模板母链可以已经通过扩增附接至测序装置的较小的一组模板母链而形成。该组模板母链可以已经通过桥式扩增而形成。
在框704，可以将一组核苷酸添加到测序装置。该组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含某一部分的标记化合物。可以通过将核苷酸组包括在与测序装置接触的液体中来将核苷酸组添加到测序装置。该液体可以是离子液体。该部分可以选自由铁磁材料或超顺磁材料组成的组。该材料可以包括磁性纳米颗粒(例如，FePt、FeCuPt、Fe2O3)，或者可以是本文所述的任何部分。核苷酸组中的每个核苷酸可以附接至包括相应部分的相应标记化合物。在一些实施例中，核苷酸组中的每个核苷酸可以是相同类型的核苷酸。例如，核苷酸组中的每个核苷酸可以是G核苷酸。每个标记化合物的每个部分可以是相同类型的部分。在其他实施例中，核苷酸组可以包括两种、三种或四种类型的核苷酸。在这些实施例中，每个核苷酸可以附接至不同类型的部分。具有核苷酸组的液体可以储存在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。
在框706，使用聚合酶延伸新生链。延伸包括：聚合酶将该组核苷酸中的第一核苷酸掺入新生链中。新生链可以是单链核酸分子。延伸该链可包括通过与模板母链杂交而将核苷酸组的第一核苷酸掺入新生链。新生链和模板母链可以一起形成双链核酸分子的一部分。
标记化合物可以包括构造为防止新生链进一步延伸的终止子。类似于与电隧穿结一起使用的标记化合物，与磁隧穿结一起使用的标记化合物构造为通过包含终止子来允许更长的信号。
除了第一核苷酸之外的核苷酸组可以从与隧穿结的接触中移除。移除核苷酸可以包括用水冲洗隧穿结。用于冲洗隧穿结的液体可以是没有核苷酸的水或离子液体。这一冲洗液可以存储在储器中，并通过注入系统引入隧穿结。去除该组核苷酸可以发生在测量电特征或磁特征的值之前。在其他实施例中，在测量电特征或磁特征的值之前，可以不去除该组核苷酸。在框706之后，该装置可类似于图5E中的构造。
在框708，施加电位以使模板母链和附接至第一核苷酸的第一标记化合物的第一部分移动至更靠近绝缘层，同时模板母链附接至测序装置。电位可通过上述第二电源施加至场电极。
在框710，可以施加磁场以设置第二铁磁层的极性。第一铁磁层可以是永磁体并且可以具有第一极性。可以将磁场施加到第二铁磁层以将极性设置为与第一极性反平行的第二极性。磁场可以由外部磁体施加。可以在移除第一核苷酸以外的一组核苷酸之后(例如，冲洗后)施加磁场。在一些实施例中，电压可以施加更长的持续时间，包括在冲洗之前、在延伸期间(例如，框706)或在添加核苷酸组期间(框704)。在一些实施例中，可以在整个方法中施加恒定磁场。该装置可类似于图5F中的构造。
在框712，可以测量穿过第一铁磁层、第一部分和第二铁磁层的电特征或磁特征的值。电特征可以是电流、电压、电阻、电感或脉冲宽度。该值可以是平均值(均值、中值、众数值、均方根)、局部或全局最大值、或瞬时测量值。该值可以大于10nA，大于100nA或大于1μA。磁特征可以是由磁性纳米颗粒引起并通过磁力传感器测量的磁场扰动。
在框714，可以利用电特征或磁特征的值，检测第一核苷酸为与模板母链杂交的。方框716和718描述了如何可以检测第一核苷酸。
在框716，可以将电特征或磁特征的值与电特征或磁特征的参考值进行比较。参考值可以是穿过第一铁磁层和第二铁磁层并且不穿过该部分的背景隧穿电流、电阻或其他电特征的参考值。参考值可以基于背景隧穿电流。例如，参考值可以设置为背景隧穿电流的最大水平，或者设置为与背景电特征具有统计学差异的值。例如，参考值可以设置为与平均背景隧穿电流相差一个、二个或三个标准偏差。在一些实施例中，参考值可以是零。
在框718，可以将该值确定为超过参考值。例如，该值可以确定为大于背景隧穿电流。当确定该值超过参考值时，可以将电流信号转换为二进制信号1。
方法700可以包括从第一核苷酸切割第一标记化合物。第一标记化合物可以切割，并且流体流可去除第一标记化合物，使得装置类似于图5H中的装置。切割第一标记化合物移除了终止子，这使聚合酶可以延伸带有另外核苷酸的新生链。可以通过光切割来切割第一标记化合物，这可以包括使特定波长或波长范围的光闪烁以影响第一标记化合物的光敏部分。在一些实施例中，切割第一标记化合物可包括通过引入切割剂进行化学切割，所述切割剂可包括pH调节剂(例如酸或碱)、酶或化学试剂。在一些实施例中，切割可以是金属(例如钯)催化的切割、还原切割、氧化切割、亲核切割或亲电切割。
方法700可以包括使用另一核苷酸、核苷酸组中的多种类型的核苷酸和/或类似于已经针对电隧穿结描述的多个隧穿结进行重复测量。类似于方法600，方法700可以适于分析除核酸序列以外的分子。
IV.分析系统
确定核酸序列的方法可包括使用具有隧穿结或类似于电容器的结构的系统。该系统可包括测序装置。测序装置可包括由绝缘层隔开的第一导体和第二导体。导体可以是隧穿结的电极或铁磁层。该系统可包括粘附层，该粘附层接触第一导体或第二导体中的至少一者。模板母链可附接至测序装置。特别地，模板母链可附接至粘附层。第一电源可与第一导体或第二导体中的至少一者电连通。
可以设置不是隧穿结的导体的电极，使得模板母链在电极和绝缘层之间。第二电源可与电极电连通。第二电源可构造为向电极施加电压。该系统可以包括一组核苷酸。该组核苷酸中的每个核苷酸均可附接至包括部分的标记化合物。该系统可进一步包括仪表装置，该仪表装置构造为用于测量经由该部分而穿过第一导体和第二导体的特征的值。该特征可以是电特征或磁特征。
该系统可包括控制系统。控制系统可构造为在使用仪表装置测量特征的值的同时，使用第二电源来施加电压。控制系统可包括计算机，该计算机具有存储有多个指令的计算机可读介质。当由处理器执行时，所述多个指令可以使处理器测量穿过第一导体和第二导体的特征的值。所述指令还可以使处理器将该特征的值与该特征的参考值进行比较。当确定该值超过参考值时，该指令就可使处理器检测核苷酸为与模板母链杂交的。在一些实施例中，控制系统可包括现场可编程门阵列(FPGA)或专用集成电路(ASIC)。FPGA或ASIC可配置为用以执行针对计算机系统中的处理器所描述的操作。例如，FPGA或ASIC可以将特征的值与特征的参考值进行比较。当确定所述值超过参考值时，FPGA或ASIC可检测核苷酸为与模板母链杂交的。FPGA或ASIC可与测序装置在同一基板上。换句话说，FPGA或ASIC可与测序装置在同一芯片上。控制系统可包括计算机、FPGA和ASIC的任意组合，并且在这些组件之间划分操作。
下面描述与电隧穿结和磁隧穿结相关的系统。
A.电隧穿结系统
图8A示出实例系统800。系统800可以包括隧穿结。隧穿结包括第一电极804、第二电极808和绝缘层812。电极材料可以包括金、银、铂或钯。电极可以包括任何金属，该金属的金属氧化物在用作待分析分子的介质的水溶液中是化学稳定的。其他金属可以包括钽、镍、铬、钛和铜。
绝缘层812可以包括介电材料，包括氧化铝(Al2O3)、二氧化铪(HfO2)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、玻璃、石英、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO2)或二氧化锆(ZrO2)。绝缘层812可以具有大于2nm的厚度。该厚度可以是第一电极804和第二电极808之间的距离。因为隧穿结的操作不需要核酸分子的一个或多个核苷酸与两个电极接触，所以绝缘层的宽度可以大于一个或多个核苷酸的大小。另外，绝缘层的宽度可以大于该部分的大小，因为即使该部分小于电极之间的间隙，隧穿仍然可能发生。
粘附层814可接触第一电极804。粘附层814允许表面和核酸分子之间比电极材料更牢固的接触。粘附层814可包括二氧化硅。
隧穿结可以是一直延伸穿过基板的孔隙或小孔的一部分。第一电极804、第二电极808、绝缘层812和粘附层814可限定孔隙或限定孔的一部分。在其他实施例中，诸如图8A中所示的隧穿结，该隧穿结是沟槽、通孔、阱或不一直延伸穿过基板的其他结构的一部分。第二电极808可接触隔离层816。隔离层816可以是绝缘材料，包括二氧化硅。隔离层816可以使第二电极808与第一场电极820隔离或绝缘。
在一些实施例中，隧穿结可以不是孔隙或通孔。相反，隧穿结可以在特征件的侧壁上。该特征件可以是沟槽、圆柱或长方体。电极、绝缘层和粘附层可限定该特征件的侧壁或侧壁的一部分。
第一场电极820可形成隧穿结的底部。第二场电极824可定位成使得第一电极804、第二电极808和绝缘层812在第一场电极820和第二场电极824之间。第一场电极820和第二场电极824可以是本文所描述的任何电极材料。另外，第一场电极820和第二场电极824可不暴露于液体，因此可以由任何导体或半导体材料制成。然而，第二场电极824可以不是第一电极804和/或第二电极808。
第二场电极824可与电源828电连通。电源828可构造为用于向第二场电极824输送负电位或电压。第一场电极820可与电源832电连通。电源832可构造为向第一场电极820输送正电位或电压。电源828可向第二场电极824施加电压，该电压比由电源832向第一场电极820施加的电压更负。在一些实施例中，不存在电源832，并且第一场电极820处于地电位或接近地电位。如前所述，第一场电极820可以不是与隧穿电极(第一电极804和第二电极808)隔开的电极。
系统800可以包括电源836。电源836可以与第一电极804和第二电极808中的至少一个电连通。电源836可以将电压施加到第一电极804和第二电极808。电源836可以构造为用于维持期望的电流或期望的电压。电源836可以提供0到1V，包括10mV到100mV、100mV到200mV、200mV到300mV、300mV到500mV或500mV到1V的电压。在一些实施例中，电源836可以提供0到30nA，包括1pA到10pA、10pA到100pA、100pA到1nA、1nA到10nA或10nA到30nA的电流。
系统800还可以包括仪表装置840。仪表装置840可以构造为用于测量穿过第一电极804和第二电极808的电特征的值。仪表装置840可以是电流表、电压表或示波器。电特征可以是电流或电压。
在图8A中，为了说明简单起见，简化了电连接，并且在许多情况下没有示出装置和电极之间的直接连接。
系统800可包括控制系统844。控制系统844可与电源836和仪表装置840连通。此外，控制系统844可与电源828和电源832连通。控制系统844也可与将流体输送到隧穿结的控制系统连通。控制系统844可包括具有处理器和计算机可读介质的计算机系统。计算机可读介质可以存储多个指令。当由处理器执行时，所述多个指令可以使处理器执行本文所述的任何方法。例如，多个指令在被执行时可以使处理器测量穿过第一电极和第二电极的电特征的值。还可以使处理器将该电特征的值与电特征的参考值进行比较。当确定该值超过参考值时，就可以进一步使处理器检测核苷酸为与模板母链杂交的。当确定该值不超过参考值时，可以进一步使处理器确定不存在与模板母链杂交的核苷酸。控制系统844可包括FPGA或ASIC。FPGA或ASIC可配置为用以执行以上描述的由计算机系统的处理器执行的任何操作。FPGA或ASIC可与隧穿结在同一芯片上。下面更详细地描述控制系统844。
系统800可以包括附接至标记化合物852的核苷酸848。标记化合物852可以包括某一部分。标记化合物852可以是本文所述的任何标记化合物。该部分可以是本文所述的任何部分。
系统800可以包括储器860。储器860可以与隧穿结流体连通。注入系统可构造为用于将液体(例如，包括水)从储器860输送到隧穿结。储器860可以包括附接至标记化合物852的核苷酸848。在一些实施例中，系统800可以包括多个储器。每个储器可包括要注入到隧穿结的不同液体。例如，四种核苷酸中的每一种可以使用不同的储器。可以包括另外的储器来输送水以冲洗隧穿结处的核苷酸。另一个储器可将一组聚合酶输送至隧穿结。该组聚合酶中的每个聚合酶均可构造为用于延伸与母核酸分子链杂交的新生核酸分子链。
系统800可以包括多个隧穿结。多个隧穿结的数量可以为每平方厘米数千、数百万或数十亿。每个隧穿结可以在同一基板的表面上。基板可以包括半导体晶片，该半导体晶片包括硅晶片或绝缘体上硅晶片。可以使用半导体加工技术来制造每个隧穿结。每个隧穿结可以是相同的。电源836可以与多个隧穿结电连通。仪表装置840或多个仪表装置可以与多个隧穿结电连通。
图8B示出具有附接至粘附层814的核酸分子的隧穿结。为了更好地示出所附接的核酸分子，未示出电连接、电源、储器860和控制系统844。
核酸分子864附接至粘附层814。核酸分子864与具有标记化合物852(包括部分856)的核苷酸杂交。聚合酶可用于掺入核苷酸，但显示为被去除。聚合酶可以是一组聚合酶中的一个。每个聚合酶均可连接至一个且仅一个核酸分子。每个核酸分子均可连接至一个且仅一个聚合酶。聚合酶可从核酸分子中被去除，以促进核酸分子后续向着绝缘层812弯曲。
核酸分子864可以是附接至粘附层814的一组核酸分子中的一个核酸分子。附接至粘附层814的该组核酸分子可包括每平方微米超过10个、超过50个、超过100个、超过500个或超过1,000个核酸分子。每个核酸分子可具有一个长度。该组核酸分子中的每个核酸分子均可附接至粘附层814上的相应点。从相应点到阱的开口的距离可小于核酸分子的长度，包括小于0.9、小于0.8、小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1倍的核酸分子长度。相应点可与绝缘层812相距相应距离。相应距离可小于核酸分子的相应长度。结果，如果核酸分子以某些方式定向，则即使该核酸分子仍附接至相应点，该核酸分子也可弯曲以与绝缘层812接触。更具体地，附接至核酸分子的某一部分将能够与绝缘层812接触。因此，相应距离可以是不跨固体材料(例如，电极或粘附层)的距离。
图8C示出在将负电位施加到第二场电极824之后的隧穿结。可以将正电位施加到第一场电极820。核酸分子864保持附接至或栓系于粘附层814，但是向着第一场电极820弯曲进入阱。可以跨第一电极804和第二电极808施加电压差。部分已被推到电极附近，因此电流可从一个电极通过该部分隧穿到另一电极。
在测量隧穿电流并检测核苷酸后，标记化合物和该部分可一起去除。可以将具有另一种标记化合物的另一种核苷酸与聚合酶一起掺入到新生链上，以形成双链核酸分子。随着新生链的生长以及该分子更大程度上是双链分子，核酸分子可能变得更难以向着第一场电极820弯曲。然而，因为粘附层814的表面将被核酸分子覆盖，所以一些分子仍可以被定位，使得即使较小幅度的弯曲也将使部分足够接近以产生包括RTN或隧穿电流的电流。随着掺入更多核苷酸以使核酸分子进一步弯曲，施加到第二场电极824的负电位也可增加。
图9示出隧穿结900的电极的构造。电极902和电极904由绝缘层906隔开。电极902和电极904重叠，并且重叠的区域是绝缘层906的区域。电极902和电极904可彼此垂直或者彼此基本上垂直，并且各自可具有大于重叠区域的面积。阱结开口908被示为圆柱并且可延伸穿过电极902、绝缘层906和电极904。在其他实施例中，阱结开口可以是棱柱、多面体或长方体。模板母链可附接至电极902的顶部。电位可会迫使模板母链朝向和/或进入结开口908。
图10示出包括多个隧穿结的构造。电极1002、1004和1006彼此平行并垂直于电极1008和1010。当电极重叠时，电极被绝缘层(例如，绝缘层1012)隔开。阱结开口(例如，阱结开口1014)可以在每个重叠区域处。多个隧穿结的数量可以为每平方厘米数千、数百万或数十亿。每个下部电极(例如，电极1008和1010)均可设置在同一基板的表面上。基板可以包括半导体晶片，该半导体晶片包括硅晶片或绝缘体上硅晶片。可以使用半导体加工技术来制造每个隧穿结。每个隧穿结可以是相同的。电源可与多个隧穿结电连通。一个仪表装置或多个仪表装置可与多个隧穿结电连通。电极1002、1004和1006可类似于常规存储系统中的字线或位线，电极1008和1010则是其他类型的线。
隧穿结可类似于2018年4月9日提交的题为“FABRICATION OF TUNNELINGJUNCTIONS WITH NANOPORES FOR MOLECULAR RECOGNITION(用于分子识别的具有纳米孔的隧穿结的制造)”的美国临时申请No.62/654,894中描述的隧穿结，该申请的内容通过引用并入本文用于所有目的。
B.磁隧穿结系统
图11A示出实例系统1100。系统1100可以包括隧穿结。隧穿结包括第一铁磁层1104、第二铁磁层1108和绝缘层1112。用于铁磁层的材料可以包括钴；Co/I/La2/3Sr1/3MnO3(LSMO)，其中I为SrTiO3(STO)、Ce0.69La0.31或O1.845(CLO)；CoGd；Copt；CoFe；CoFeB；CoFeTb；铁；Fe2O3；FeOFe2O3；NiOFe2O3；CuOFe2O3；MgOFe2O3；MnBi；Ni；MnSb；MnOFe2O3；Y3Fe5O12；MnAs；Gd；Tb；Dy或EuO。两个铁磁层的材料可以相同或不同。一个铁磁层可以是具有一种极性的永磁体。另一铁磁层的极性可以通过施加的磁场来设定。
绝缘层1112可以包括介电材料，包括氧化铝(Al2O3)、二氧化铪(HfO2)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、玻璃、石英、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO2)或二氧化锆(ZrO2)。绝缘层1112可以具有大于2nm的厚度。该厚度可以是第一铁磁层1104和第二铁磁层1108之间的距离。因为隧穿结的操作不需要核酸分子的一个或多个核苷酸与两个铁磁层接触，所以绝缘层的宽度可以大于一个或多个核苷酸的大小。另外，绝缘层的宽度可以大于该部分的大小，因为即使该部分小于铁磁层之间的间隙，隧穿仍然可能发生。
核酸分子1150可附接至隧穿结。核酸分子1150可在第一铁磁层1104顶部的粘附层上直接或间接地附接至第一铁磁层1104。核酸聚合酶1154可连接至核酸分子1150。核酸聚合酶1154可延伸与模板母链杂交的新生链。核酸聚合酶1154可掺入具有标记化合物的核苷酸，该标记化合物带有部分。
系统1100可包括与电源1164电连通的场电极1160。电源1164可构造为用于向场电极1160输送负电位，以便将连接至核酸分子的部分移动至绝缘层1112。第二个单独的场电极是任选的，并且未显示。场电极构造可以与针对电隧穿结所描述的实施例中的构造类似。
磁隧穿结不需要部分与隧穿结的任何部位接触，因为来自部分的磁场可沿着空隙行进穿过材料。磁隧穿结可嵌入非铁磁材料中，该非铁磁材料可附接至核酸分子1150。非铁磁材料可包含粘附层。
系统1100可以包括电源1120。电源1120可以与第一铁磁层1104和第二铁磁层1108中的至少一者电连通。电源1120可以将电压施加到第一铁磁层1104和第二铁磁层1108。电源1120可以构造为用于维持期望的电流或期望的电压。电源1120可以提供0到3V，包括10mV到100mV、100mV到200mV、200mV到300mV、300mV到500mV、500mV到1V、1V到2V或2V到3V的电压。在一些实施例中，电源1120可以提供0到10μA，包括1pA到10pA、10pA到100pA、100pA到1nA、1nA到10nA、10nA到30nA、30nA到100nA、100nA到500nA、500nA到1μA或1μA到10μA的电流。
系统1100还可以包括仪表装置1124。仪表装置1124可以构造为用于测量穿过第一铁磁层1104和第二铁磁层1108的电特征或磁特征的值。仪表装置1124可以是电流表、电压表或示波器。电特征可以是电流或电压。仪表装置1124可以是用于测量磁场的磁传感器。
系统1100可包括控制系统1128。控制系统1128可与电源1120和仪表装置1124连通。控制系统1128也可与将流体输送到隧穿结的控制系统连通。在一些实施例中，控制系统1128可包括具有处理器和计算机可读介质的计算机系统。计算机可读介质可以存储多个指令。多个指令由进程执行时，可以使处理器执行本文所述的任何方法。例如，多个指令在被执行时可以使处理器测量穿过第一铁磁层和第二铁磁层的电特征的值。还可以使处理器将该电特征的值与电特征的参考值进行比较。当确定该值超过参考值时，就可以进一步使处理器检测核苷酸为与模板母链杂交的。当确定该值不超过参考值时，可以进一步使处理器确定不存在与模板母链杂交的核苷酸。下面更详细地描述计算机系统。在一些实施例中，控制系统1128可包括FPGA或ASIC。FPGA或ASIC可配置为用以执行多个指令。
系统1100可以包括附接至标记化合物1136的核苷酸1132。标记化合物1136可包括部分1138。标记化合物1136可以是本文所述的任何标记化合物。部分1138可以是本文所述的任何部分。
系统1100可以包括储器1140。储器1140可以与隧穿结流体连通。注入系统可以构造为用于将液体从储器1140输送到隧穿结。储器1140可以包括附接至标记化合物1136的核苷酸1132。储器1140可以包括水。在一些实施例中，系统1100可以包括多个储器。每个储器可包括要注入到隧穿结的不同液体。例如，四种核苷酸中的每一种可以使用不同的储器。可以包括另外的储器来输送水以冲洗隧穿结处的核苷酸。另一个储器可将一组聚合酶输送至隧穿结。该组聚合酶中的每个聚合酶均可构造为用于延伸与母核酸分子链杂交的新生核酸分子链。
图11B示出另一构造，显示如何将诸如核酸分子1150之类的核酸分子附接至隧穿结。核酸分子1150可附接至绝缘层1112附近的第一铁磁层1104和第二铁磁层1108上的粘附层上。在图11B中，核酸分子附接至隧穿结的圆柱侧。场电极1160可定向为使得核酸分子1150在隧穿结和场电极1160之间。
系统还可包括多个隧穿结，类似于在2018年6月21日提交的题为“TUNNELINGJUNCTIONS FOR SEQUENCING(用于测序的隧穿结)”的美国临时申请No.62/688,257中描述的实施例，该申请的内容通过引用并入本文用于所有目的。
C.附接有聚合酶的系统
系统还可包括其中聚合酶栓系于隧穿结的系统，类似于在2018年6月21日提交的题为“TUNNELING JUNCTIONS FOR SEQUENCING(用于测序的隧穿结)”的美国临时申请No.62/688,257中描述的隧穿结，该申请的内容通过引用并入本文用于所有目的。
图12示出实例系统1200。该图示出隧穿结和场电极1250，但未示出带有附接至标记化合物的核苷酸的储器或计算机系统，以简化图示并着重于场电极1250。储器和计算机系统可类似于本文先前描述的那些。
系统1200可包括隧穿结。隧穿结包括第一电极1204、第二电极1208和绝缘层1212。电极可以包括任何金属，该金属的金属氧化物在用作待分析分子的介质的水溶液中是化学稳定的。
绝缘层1212可以包括介电材料，包括氧化铝(Al2O3)、二氧化铪(HfO2)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、玻璃、石英、氧化镁(MgO)、二氧化钛(TiO2)或二氧化锆(ZrO2)。绝缘层1212可以具有大于2nm的厚度。该厚度可以是第一电极1204和第二电极1208之间的距离。因为隧穿结的操作不需要核酸分子的一个或多个核苷酸与两个电极接触，所以绝缘层的宽度可以大于一个或多个核苷酸的大小。另外，绝缘层的宽度可以大于该部分的大小，因为即使该部分小于电极之间的间隙，隧穿仍然可能发生。
隧穿结可以横向定向，使得隧穿方向基本上平行与第一电极和第二电极接触的基板的表面。新生链的延伸长方向可以平行于基板的表面。绝缘层可具有与基板正交的纵轴。美国专利公开号2018/0031523 A1中描述了横向定向隧穿结的实例，该专利的内容通过引用并入本文以用于所有目的。
核酸聚合酶1216可以通过由系链化合物1213和化合物1214形成的系链化合物附接至隧穿结。系链化合物1213可包含SpyTag，化合物1214可包含SpyCatcher。核酸聚合酶1216可以在绝缘层1212处附接至隧穿结。核酸聚合酶1216也可以在第一电极1204或第二电极1208处附接至隧穿结。一种或多种化合物可以将核酸聚合酶1216栓系到绝缘层1212。例如，对苯二酚、SpyTag或SpyCatcher可用于将核酸聚合酶1216栓系到绝缘层1212。核酸聚合酶1216可以构造为用于延伸新生链。新生链可以与模板母链杂交。
系统1200还可以包括仪表装置1224。仪表装置1224可以构造为用于测量穿过第一电极1204和第二电极1208的电特征的值。仪表装置1224可以是电流表、电压表或示波器。电特征可以是电流或电压。
系统1200可包括场电极1250。场电极1250可类似于第二场电极824。场电极1250可与电源1254电连通。电源1254可类似于电源828。场电极1250可定位为使得聚合酶1216在场电极1250和绝缘层1212之间。电源1254可将负电压输送到场电极1250。负电压导致产生电场，该电场可将被聚合酶1216杂交的任何核酸分子向绝缘层1212推进。以这种方式，具有标记化合物的核苷酸可在第一电极1204和第二电极1208之间产生隧穿电流或直流。提供接地或正电压的另一个场电极未在图12中示出。该场电极可类似于第一场电极820。
虽然图12示出电隧穿结，但是场电极可与聚合酶栓系于其上的磁隧穿结一起使用。场电极将以类似的方式工作，并将具有核苷酸和部分的模板母链推向隧穿结。
使用具有栓系聚合酶的隧穿结的方法可包括关于向场电极施加电压的附加步骤。电压可以使模板母链和附接至掺入的核苷酸的标记化合物的部分移动至更靠近绝缘层1212。
V.实例系统
图13示出示例性的分析系统。图13所示的系统包括分析装置1302和作为计算机系统1306的一部分的智能模块1304。分析装置1302可以包括系统800、系统1100或本文描述的任何系统。计算机系统1306可以包括计算机系统10的一部分或全部。经由网络连接或直接连接将数据集(电特征性数据集)从分析装置1302传送到智能模块1304，反之亦然。例如数据集可以被处理以鉴定核苷酸。鉴定步骤可以由存储在计算机系统1306的硬件上的软件来实现。可以通过在处理器上运行并存储在智能模块的存储装置上的计算机代码来处理数据集，并且在处理后将其传输回分析模块的存储装置，其中修改后的数据可以在显示设备上显示。在一些实施例中，智能模块也可以在分析装置中实现。
图14示出，计算机系统1400可包括施加模块1410，该施加模块可包括例如跨由绝缘层隔开的第一电极和第二电极而施加电压。计算机系统1400可以是现场可编程门阵列(FPGA)或专用集成电路(ASIC)。计算机系统1400还可包括测量模块1420，其可包括测量穿过第一电极和第二电极的电特征的值。计算机系统1400可进一步包括接收模块，其可包括从分析系统接收电特征的值。计算机系统1400还可包括检测模块，例如，其可包括使用该电特征的值检测核苷酸为与所述模板母链杂交的。
本文提到的任何计算机系统都可以利用任何合适数量的子系统。这种子系统的实例在图15的计算机系统10中示出。在一些实施例中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的组件。在其他实施例中，计算机系统可以包括多个计算机设备，每个计算机设备是具有内部组件的子系统。计算机系统可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。计算机系统10可以是现场可编程门阵列(FPGA)或专用集成电路(ASIC)。
图15所示的子系统经由系统总线75互连。示出附加子系统，诸如打印机74、键盘78、存储装置79、监视器76(其与显示适配器82联接)等。联接至输入/输出(I/O)控制器71的外围装置和I/O装置可以通过本领域中已知的任何数量的机构(例如输入/输出(I/O)端口77(例如USB，
Figure BDA0003024736740000341
Thunderbolt)与计算机系统连接。例如，I/O端口77或外部接口81(例如，以太网，Wi-Fi等)可用于将计算机系统10连接至广域网诸如因特网、鼠标输入装置或扫描仪。通过系统总线75的互连允许中央处理器73与每个子系统通信并控制来自系统存储器72或一个或多个存储装置79(例如，固定磁盘诸如硬盘，或光盘)的指令的执行以及子系统之间的信息交换。系统存储器72和/或存储装置79可以具体表现为计算机可读介质。另一个子系统是数据收集装置85，诸如照相机、麦克风、加速计等。本文提到的任何数据都可以从一个组件输出到另一组件，并可以输出给用户。
计算机系统可以包括多个相同的组件或子系统，例如通过外部接口81或内部接口连接在一起。在一些实施例中，计算机系统、子系统或装置可以在网络上通信。在这种情况下，一台计算机可视为客户端，另一台计算机可视为服务器，其中每台计算机可视为同一计算机系统的一部分。客户端和服务器可以各自包含多个系统、子系统或组件。
应当理解的是，本发明的任何实施例都可以使用硬件(例如，专用集成电路或现场可编程门阵列)和/或使用具有模块化或集成模式的一般可编程处理器的计算机软件以控制逻辑的形式实现。如本文所用，处理器包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器、或在单个电路板上或联网的多个处理单元。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将知道并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实现本发明的实施例的其他方式和/或方法。
可以使用任何合适的计算机语言诸如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift或脚本语言诸如Perl或Python，使用例如传统技术或面向对象技术，将本申请中描述的任何软件组件或功能实现为由处理器执行的软件代码。可以将软件代码作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上，以进行存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁性介质诸如硬盘驱动器或软盘、或者光学介质诸如光盘(CD)或DVD(数字通用光盘)、闪存等。计算机可读介质可以是此类存储装置或传输装置的任何组合。
也可以使用载波信号对此类程序进行编码和传输，该载波信号适合于通过符合包括互联网在内的各种协议的有线、光学和/或无线网络进行传输。这样，可以使用以此类程序编码的数据信号来创建根据本发明的实施例的计算机可读介质。可以将以程序代码编码的计算机可读介质与兼容装置打包在一起，或者与其他装置分开提供(例如，通过互联网下载)。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器、CD或整个计算机系统)上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机系统可以包括监视器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。
本文描述的任何方法可以由包括一个或多个处理器的计算机系统完全或部分地执行，该计算机系统可以构造为用于执行步骤。因此，实施例可以针对构造为用于执行本文描述的任何方法的步骤的计算机系统，可能具有执行相应步骤或相应步骤组的不同组件。尽管以编号的步骤呈现，但是本文的方法的步骤可以同时或以不同顺序执行。另外，这些步骤的部分可以与其他方法的其他步骤的部分一起使用。而且，步骤的全部或部分可以是可选的。另外，任何方法的任何步骤都可以用模块、单元、电路或其他用于执行这些步骤的机构来执行。
在不脱离本发明实施例的精神和范围的情况下，可以以任何合适的方式组合特定实施例的具体细节。然而，本发明的其他实施例可以针对与每个单独方面或者这些单独方面的特定组合有关的特定实施例。
为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的实例实施例的以上描述。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所描述的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。
在前面的描述中，出于解释的目的，已经阐述了许多细节以便提供对本技术的各种实施例的理解。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在没有这些细节中的一些或具有其他细节的情况下实践某些实施例。
已经描述了几个实施例，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，可以使用各种修改、替代架构和等同形式。另外，为了避免不必要地使本发明晦涩难懂，没有描述许多众所周知的过程和元件。另外，任何特定实施例的细节可能并不总是存在于该实施例的变型中，或者可以添加到其他实施例。
在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则也具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，精确至下限单位的十分之一。涵盖了规定范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外，并且其中一个或两个限值包括在较小范围内或两个限值均不包括在较小范围内的每个范围也都为本发明所涵盖，以任何被具体排除在规定范围外的限值为准。在规定范围包括一个或两个限制的情况下，还包括排除那些包括的限制中的一个或两个的范围。
如在本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。因此，例如，提及“一种方法”包括多种此类方法，并且提及“该部分”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个部分及其等同物，等等。为了清楚和理解的目的，现在已经详细描述了本发明。但是，应当理解，在所附权利要求书的范围内可以进行某些改变和修改。

Claims (18)

1.一种使用测序装置确定核酸序列的方法，所述方法包括：
将聚合酶连接至与所述测序装置附接的模板母链，所述测序装置包括由绝缘层隔开的第一导体和第二导体；
将一组核苷酸添加到所述测序装置，所述一组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含部分的标记化合物；
使用连接至所述模板母链的所述聚合酶来延伸新生链，其中所述延伸包括：所述聚合酶通过与所述模板母链杂交而将所述一组核苷酸中的第一核苷酸掺入所述新生链中；
施加电位以使所述模板母链和附接至所述第一核苷酸的第一标记化合物的第一部分移动至更靠近所述绝缘层，同时所述模板母链附接至所述测序装置；
在施加电位的同时，测量穿过所述第一导体、所述第一部分和所述第二导体的电特征或磁特征的值；以及
使用所述电特征或所述磁特征的所述值，检测与所述模板母链杂交的所述第一核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
施加所述电位包括向电极施加负电压，并且
所述电极设置成使得所述新生链位于所述电极和所述绝缘层之间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述模板母链附接至粘附层，并且
所述粘附层接触所述第一导体。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述粘附层包含二氧化硅。
5.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述第一导体、所述第二导体和所述绝缘层形成隧穿结，并且
所述电特征或所述磁特征是通过所述隧穿结的隧穿电流。
6.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述第一部分接触所述第一导体和所述第二导体，
测量所述电特征或所述磁特征的所述值包括测量所述电特征，并且
所述电特征是电流。
7.根据权利要求1所述的方法，其中：
所述模板母链是一组模板母链中的一个模板母链，
所述聚合酶是一组聚合酶中的一个聚合酶，
所述方法进一步包括：
将所述一组模板母链附接至所述测序装置，
将所述一组聚合酶连接至所述一组模板母链，其中：
所述一组聚合酶中的每个聚合酶仅连接至所述一组模板母链中的一个模板母链，并且
所述一组模板母链中的每个模板母链仅连接至所述一组聚合酶中的一个聚合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其中：
所述一组模板母链是第一组模板母链，
所述方法进一步包括：
通过对附接至所述测序装置的第二组模板母链进行桥式扩增，形成所述第一组模板母链。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：在将所述聚合酶连接至所述模板母链之前，将引物附接至所述模板母链。
10.根据权利要求1所述的方法，其中施加所述电位使得所述第一标记化合物的所述第一部分移动以接触所述第一导体和所述第二导体。
11.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括：
跨所述第一导体和所述第二导体施加电压，
其中：
施加所述电位使得所述第一标记化合物的所述第一部分移动一定距离，在所述距离处，当施加所述电压时，电流可以从所述第一导体通过所述第一部分隧穿到所述第二导体。
12.一种用于分析核酸分子的系统，所述系统包括：
测序装置，其包括由绝缘层隔开的第一导体和第二导体；
模板母链，其附接至所述测序装置；
第一电源，其与所述第一导体或所述第二导体中的至少一者电连通；
电极，其设置成使得所述模板母链位于所述电极和所述绝缘层之间；
第二电源，其与所述电极电连通并构造为向所述电极施加电压；
仪表装置，其构造为用于测量穿过所述第一导体和所述第二导体的特征的值，所述特征是电特征或磁特征；和
控制系统，其构造为在使用仪表装置测量所述特征的所述值的同时，使用所述第二电源来施加所述电压。
13.根据权利要求12所述的系统，其进一步包括：
粘附层，其与第一导体或所述第二导体中的至少一者接触，并且所述模板母链附接至所述粘附层。
14.根据权利要求12所述的系统，其进一步包括：
一组核苷酸，所述一组核苷酸中的每个核苷酸均附接至包含部分的标记化合物，其中：
所述特征是经由所述部分穿过所述第一导体和所述第二导体。
15.根据权利要求12所述的系统，其中所述控制系统进一步构造为：
将所述特征的所述值与所述特征的参考值进行比较，并且
当确定所述值超过所述参考值时，检测核苷酸为与所述模板母链杂交的。
16.根据权利要求12所述的系统，其中：
所述控制系统包括现场可编程门阵列或专用集成电路。
17.根据权利要求12所述的系统，其中：
所述控制系统包括存储有多个指令的非暂时性计算机可读介质，所述多个指令当由处理器执行时，使得所述处理器在使用所述仪表装置测量所述特征的所述值的同时，使用所述第二电源来施加所述电压。
18.根据权利要求12所述的系统，其中：
所述电极是第一电极，并且
所述电压是第一电压，
所述系统进一步包括：
第二电极，其设置成使得所述绝缘层在所述模板母链和所述第二电极之间，其中：
施加到所述第一电极的所述电压比施加到所述第二电极的第二电压更负。
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