CN105229170A - 通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于核酸序列检测的新型方法和组合物。在PCR期间通过聚合酶的5ˊ核酸酶活性产生与靶核酸结合的，来自探针的独特的鉴定性可切割片段。靶的身份可以通过鉴定独特的可切割片段进行确定。

Description

通过基于结构的探针切割的核酸靶鉴定

发明领域

本发明涉及核酸检测领域。特别地，本发明提供了执行靶核酸的高流通量多路检测的方法。

发明背景

用于检测靶核酸的许多方法是已知的。目前可获得的用于核酸检测的同质测定包括TaqMan®、Ampliflour®、染料结合、等位基因选择动态PCR和Scorpion®引物测定。由于需要不同染料用于待检测的每种靶核酸，这些测定操作不容易多路化，并且因此在其改善潜力方面有限。为了克服此类局限性，几项近期研究已公开了含有可切割“标签”部分的寡核苷酸探针的使用，所述可切割“标签”部分可以容易分离且检测（例如参见Chenna等人，美国专利申请公开号2005/0053939；Van Den Boom，美国专利号8,133,701）。然而，来自这些研究的结果显示存在能够准确地使检测标签与靶核酸关联的问题，并且仍存在执行靶核酸的高流通量多路检测的准确方法的需要。

发明概述

本发明提供了用于核酸序列检测的新方法。在该方法中，在PCR期间通过DNA聚合酶的5'核酸酶活性产生与扩增区内的靶核酸结合的，来自寡核苷酸探针的独特的鉴定性可切割片段。这通过具有附着至探针5'末端的非互补“翼（flap）”区来实现。靶核酸的身份可以通过鉴定独特的可切割片段进行确定。例如，这可以容易地通过质谱法来完成。由于具有独特和可容易分辨质量的可能可切割片段的极大数目，核酸靶的快速高流通量多路检测因此成为可能。

因此，在一个方面，本发明提供了检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括下述步骤：

（a）通过使包含靶核酸的样品与下述接触制备反应混合物：（i）一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的区域互补的序列，且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的区域互补的序列，且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和（ii）包含至少两个不同部分的寡核苷酸探针，第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，并且其中所述第一部分在3'末端处封闭，以阻止通过核酸聚合酶的延伸，并且阻止通过3'至5'核酸外切酶的切割；并且附着至第一部分的5'末端的包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者的第二部分，包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含核酸外切酶抗性修饰；

（b）在允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针对靶核酸序列退火，并且由所述寡核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能够切割退火的寡核苷酸探针，且从其中释放含有寡核苷酸探针的第二部分，连同或不连同来自寡核苷酸探针的第一部分的另外核苷酸的片段的条件下，用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸序列；

（c）用3'至5'核酸外切酶处理含有寡核苷酸探针的第二部分的所述片段，所述3'至5'核酸外切酶切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰，从而产生具有独特的质量可区别大小的单一片段；和

（d）通过质谱法检测单一片段的存在或不存在，从而检测样品中靶核酸序列的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤（d）之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。

在该方法的一些实施方案中，在单一多路化反应中检测到两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，两种或更多种寡核苷酸探针用于检测单一多路化反应中的两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，核酸外切酶抗性修饰选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸。在一些实施方案中，检测步骤（d）之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。在一些实施方案中，检测步骤（d）通过选自下述的质谱仪完成：基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）MS、串联MS、电喷射电离飞行时间（ESI-TOF）、ESI-离子肼、液相层析（LC）-MS）、气相层析（GC）-MS）和离子迁移率（IM）-MS。在一些实施方案中，核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。

在另一个方面，本发明提供了检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括下述步骤：

（a）通过使包含靶核酸的样品与下述接触制备反应混合物：（i）一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的区域互补的序列，且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的区域互补的序列，且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和（ii）包含至少两个不同部分的寡核苷酸探针，第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，其中第一部分还包含在5'末端处的修饰，这使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性，并且附着至第一部分的3'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性的修饰；

（b）在允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针对靶核酸序列退火，并且由所述寡核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能够切割退火的寡核苷酸探针，且从其中释放含有寡核苷酸探针的第二部分，连同或不连同来自寡核苷酸探针的第一部分的另外核苷酸的片段的条件下，用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸序列；

（c）用单链特异性5’-3’核酸外切酶处理含有寡核苷酸探针的第二部分的所述片段，所述单链特异性5’-3’核酸外切酶切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰，从而产生具有独特的质量可区别大小的单一片段；和

（d）通过质谱法检测单一片段的存在或不存在，从而检测样品中靶核酸序列的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤（d）之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。

在该方法的一些实施方案中，在单一多路化反应中检测到两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，两种或更多种寡核苷酸探针用于检测单一多路化反应中的两种或更多种靶核酸。在一些实施方案中，核酸外切酶抗性修饰选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸。在一些实施方案中，检测步骤（d）之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。在一些实施方案中，检测步骤（d）通过选自下述的质谱仪完成：基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）MS、串联MS、电喷射电离飞行时间（ESI-TOF）、ESI-离子肼、液相层析（LC）-MS）、气相层析（GC）-MS）和离子迁移率（IM）-MS。在一些实施方案中，核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。

在另一个方面，本发明提供了包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分，其中第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，使得所述第一部分能够与靶核酸序列的所述区域结合，并且其中所述第一部分在3'末端处封闭，以阻止所述寡核苷酸探针通过DNA聚合酶的延伸，并且阻止通过3'至5'核酸外切酶的切割；并且附着至第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，并且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含核酸外切酶抗性修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分中的核酸外切酶抗性修饰包含不可切割的核苷酸类似物，其选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物、倒转核苷酸或任何其他修饰，所述修饰致使寡核苷酸片段在修饰附着点外对于核酸外切切割抗性。在其他实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分包含非核苷酸，其可以是任何有机部分或重复单元（例如（CH2-CH2-O）n等）。

在另一个方面，本发明提供了包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分，第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，其中第一部分还包含在5'末端处的修饰，这使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性，并且附着至第一部分的3'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，并且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性的修饰。

在一些实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分中的核酸外切酶抗性修饰包含不可切割的核苷酸类似物，其选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物、倒转核苷酸或任何其他修饰，所述修饰致使寡核苷酸片段在修饰附着点外对于核酸外切切割抗性。在其他实施方案中，寡核苷酸探针的第二部分包含非核苷酸，其可以是任何有机部分或重复单元（例如（CH2-CH2-O）n等）。

附图简述

图1代表本发明的方法的举例说明性描述。

图2代表质谱图，其显示在寡核苷酸T₉JTTTGC的核酸外切酶I消化后的寡核苷酸片段，其中J是2’-O-甲基-尿苷（A）、HEG间隔物（B）或丙二醇间隔物（C）。

图3代表在PCR扩增反应中的EGFR T790M突变体5'-翼探针片段的LC-MS，以及在不具有（A）或具有（B）通过核酸外切酶I的后续消化后的提取离子层析图（EIC）。

发明详述

定义

如本文使用的，术语“样品”包括包含核酸的样本或培养物（例如微生物培养物）。术语“样品”还意欲包括生物和环境样品。样品可以包括合成起源的样本。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液（例如支气管、胃、腹膜、导管、耳、关节镜）、活组织检查样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘膜、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、乳汁、乳房流体、胚胎细胞和胎儿细胞。在一个优选实施方案中，生物样品是血液，并且更优选血浆。如本文使用的，术语“血液”涵盖全血或任何血液级分，例如如常规定义的血清和血浆。血液血浆指起因于用抗凝剂处理的血液离心的全血级分。血液血清指血样已凝固后剩下的流体的水样部分。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水和工业样品，以及得自食物和乳制品加工器械、仪器、设备、器皿、一次性使用和非一次性使用项目的样品。这些例子不应解释为限制可应用于本发明的样品类型。

如本文使用的，术语“靶”或“靶核酸”意指待检测或测量其存在，或者待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶包括对于其存在可检测探针（例如寡核苷酸探针）或测定，或可以通过本领域技术人员产生的基本上任何分子。例如，靶可以是生物分子，例如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测探针（例如抗体）结合或以其他方式接触，其中可检测探针还包含能够通过本发明的方法检测的核酸。如本文使用的，“可检测探针”指能够与目的靶生物分子杂交或对目的靶生物分子退火，且允许如本文描述的特异性检测靶生物分子的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，靶是核酸，并且可检测探针是寡核苷酸。术语“核酸”和“核酸分子”在公开内容自始至终可以互换使用。该术语指寡核苷酸、寡核苷酸（oligo）、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸（DNA）、基因组DNA、线粒体DNA（mtDNA）、互补DNA（cDNA）、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、扩增核酸、扩增子、PCR产物及其他类型的扩增核酸、RNA / DNA杂交体和聚酰胺核酸（PNA），所有这些均可为单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将包含天然核苷酸的已知类似物，其可以以与天然存在的核苷酸相似的方式起作用，及其组合和/或混合物。因此，术语“核苷酸”指天然存在和经修饰的/非天然存在的核苷酸两者，包括核苷三、二和单磷酸，以及在聚核酸或寡核苷酸内存在的单磷酸单体。核苷酸还可以是核糖；2'-脱氧；2',3'-脱氧以及广泛多样的其他核苷酸模拟物，其是本领域众所周知的。模拟物包括链终止核苷酸，例如3'-O-甲基、卤代碱基或糖取代；可替代糖结构包括非糖，烷基环结构；可替代的碱基包括肌苷；脱氮修饰的；接头修饰的x和ψ；质量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替换，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯（boranophosphate）、酰胺、酯、醚；和碱基或完全核苷酸间替换，包括可切割连接例如光可切割的硝基苯基部分。

靶的存在或不存在可以进行定量或定性测量。靶可以以各种不同形式出现，包括例如简单或复杂混合物，或基本上纯化的形式。例如，靶可以是含有其他组分的样品的部分，或可以是样品的唯一或主要组分。因此，靶可以是全细胞或组织、细胞或组织提取物、其分级的裂解产物或基本上纯化的分子的组分。另外，靶可以具有已知或未知的序列或结构。

术语“扩增反应”指用于扩大核酸靶序列的拷贝的任何体外手段。

“扩增”指将溶液提交给足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常指靶核酸中的“指数”增加。然而，如本文使用的，“扩增”还可以指核酸的选择靶序列数目中的线性增加，但不同于一次性单个引物延伸步骤。

“聚合酶链反应”或“PCR”指由此以几何级数扩增靶双链DNA的特异性区段或子序列的方法。PCR是本领域技术人员众所周知的；参见例如美国专利号4,683,195和4,683,202；和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，Innis等人，编辑，1990。

如本文使用的，“寡核苷酸”指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰的核苷单体的线性聚合物。寡核苷酸包括能够与靶核酸特异性结合的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其异头物形式、肽核酸（PNA）等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，以形成大小范围从几个单体单位例如3-4个到几十个单体单位例如40-60个的寡核苷酸。每当寡核苷酸通过字母序列，例如“ATGCCTG”表示时，应当理解核苷酸处于从左到右的5'-3'次序，并且除非另有说明，否则“A”指示脱氧腺苷，“C”指示脱氧胞苷，“G”指示脱氧鸟苷，“T”指示脱氧腺苷，并且“U”指示核糖核苷尿苷。通常，寡核苷酸包含四种天然脱氧核苷酸；然而，它们还可以包含核糖核苷酸或非天然核苷酸类似物。当酶具有关于活性的特异性寡核苷酸或多核苷酸底物需求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则关于寡核苷酸或多核苷酸底物的适当组成的选择完全在普通技术人员的知识内。

如本文使用的，“寡核苷酸引物”或简单的“引物”指多核苷酸序列，其与靶核酸模板上的序列杂交，并且促进寡核苷酸探针的检测。在本发明的扩增实施方案中，寡核苷酸引物充当核酸合成的起始点。在非扩增实施方案中，寡核苷酸引物可以用于制备能够被切割试剂切割的结构。引物可以具有各种长度，并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度12-25个核苷酸。用于PCR中的引物长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原则进行设计。

如本文使用的，术语“寡核苷酸探针”指这样的多核苷酸序列，其能够与目的靶核酸杂交或对目的靶核酸退火，并且允许靶核酸的特异性检测。

“错配核苷酸”或“错配”指在所述一个或多个位置处与靶序列不互补的核苷酸。寡核苷酸探针可以具有至少一个错配，但还可以具有2、3、4、5、6或7个或更多个错配核苷酸。

如本文使用的，术语“多态性”指等位基因变体。多态性可以包括单核苷酸多态性（SNP）以及单序列长度多态性。多态性可以是由于与另一个等位基因相比较，在一个等位基因处的一个或多个核苷酸置换，或可以是由于本领域已知的插入或缺失、复制、倒转及其他改变。

如本文使用的，术语“质量可区别大小”可以与“可切割产物大小”、“降解产物大小”或“探针片段大小”互换使用，并且指起因于寡核苷酸探针切割和释放的一种或多种降解产物，如通过本文方法描述的。具有质量可区别大小（MDF）的片段可以包括但不限于寡核苷酸探针片段、核苷酸寡核苷酸探针片段、非核苷酸寡核苷酸探针片段、含有修饰标签以促进分离（如疏水和亲和部分）的寡核苷酸探针片段。产生具有独特的质量可区别大小的片段导致显著改善的灵敏度，且允许执行多路化反应的能力增强。

如本文使用的，术语“修饰”指在分子水平上（例如碱基部分、糖部分或磷酸盐主链）的寡核苷酸探针改变。核苷修饰包括但不限于引入切割阻断剂或裂解诱导物，引入小沟结合剂，同位素富集，同位素耗尽，引入氘和卤素修饰。核苷修饰还可以包括增加杂交严格性或增加寡核苷酸探针的解链温度的部分。例如，核苷酸分子可以用连接2'和4'碳的额外桥进行修饰，导致对通过核酸酶的切割抗性的锁核酸（LNA）核苷酸。

提及一种分子与另一种分子的结合中的术语“特异性的”或“特异性”，例如探针对于靶多核苷酸的特异性，指两种分子之间的识别、接触和稳定复合物形成，连同基本上更少的该分子与其他分子的识别、接触或复合物形成。如本文使用的，术语“退火”指两种分子之间的稳定复合物形成。

如果探针的至少一个区域与核酸序列的互补体的至少一个区域共享基本序列同一性，则探针“能够对核酸序列退火”。“基本序列同一性”是至少约80%，优选至少约85%，更优选优选至少约90%、95%或99%，且最优选100%的序列同一性。为了测定DNA序列和RNA序列的序列同一性的目的，U和T通常视为相同核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探针能够与包含序列GCUGAU的靶RNA序列杂交。

如本文使用的，术语“切割试剂”指能够切割寡核苷酸探针以获得质量可区别大小的片段的任何手段，包括但不限于酶。对于其中不发生扩增的方法，切割试剂可以仅用于切割、降解或以其他方式释放寡核苷酸探针的第二部分或其片段。切割试剂可以是酶。切割试剂可以是天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。

对于其中扩增发生的方法，切割试剂优选为具有合成（或聚合）活性和核苷酸活性的酶。此类酶通常为核酸扩增酶。核酸扩增酶的例子是核酸聚合酶，例如栖热水生菌（Thermus aquaticus）（Taq）DNA聚合酶（TaqMAN.RTM.）或大肠杆菌（E. coli）DNA聚合酶I。酶可以是天然存在的、未经修饰的或经修饰的。

术语“切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰”意指切割片段直至到达核酸外切酶抗性修饰自身或在定位接近于核酸外切酶抗性修饰的限定核苷酸处的切割活性。对于3'至5'核酸外切酶活性，接近于修饰的限定核苷酸可以定位于距离修饰紧3'的第一个位置处。备选地，限定核苷酸可以定位于距离修饰3'两个或三个或甚至更多个位置，只要通过3'至5'核酸外切酶的切割一致地在限定核苷酸的位置处终止。

术语“丙二醇”或“丙二醇间隔物”指1,3-丙二醇，并且与丙烷-1,3-二醇、1,3-二羟基丙烷和亚丙基二醇同义。术语“HEG”或“HEG间隔物”指六乙二醇，并且与3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1,17-二醇同义。术语倒转核苷酸指其中糖部分经由3'至3'磷酸二酯键而连接至邻近核苷酸的糖部分的核苷酸。

术语“质谱法的污染物”指能够干扰通过质谱仪检测具有质量可区别大小（MDF）的片段的任何物质。质谱法的一些污染物的例子公开于Keller等人，Analytica Chimica Acta（2008）627:71-81中。

“核酸聚合酶”指催化核苷酸掺入核酸内的酶。示例性核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶等。

“热稳定的DNA聚合酶”指当遭受高温所选时间段时，其为稳定的（即抵抗分解或变性）且保持足够的催化活性的DNA聚合酶。例如，当遭受高温使双链核酸变性所需的时间时，热稳定的DNA聚合酶保留实现后续引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的，并且在美国专利号4,683,202和4,683,195中例示。如本文使用的，热稳定的聚合酶通常适用于温度循环反应，例如聚合酶链反应（“PCR”）中。热稳定的核酸聚合酶的例子包括栖热水生菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属（Thermus）物种Z05聚合酶、黄栖热菌（Thermus flavus）聚合酶、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）聚合酶例如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。

“经修饰的”聚合酶指其中至少一个单体不同于参考序列的聚合酶，所述例如参考序列天然或野生型聚合酶或另一种修饰形式的聚合酶。示例性修饰包括单体插入、缺失和置换。经修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定组分序列（例如结构或功能结构域等）。在经修饰的聚合酶的定义内还包括的是包含参考序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚合酶、E678G TMA-30聚合酶等。

术语“5'至3'核酸酶活性”或“5’-3’核酸酶活性”指通常与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'末端去除。例如，大肠杆菌DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段则没有。具有5'至3'核酸酶活性的一些酶是5'至3'核酸外切酶。术语“单链特异性5’-3’核酸外切酶”指对于单链核酸优先超过双链核酸，从5'末端起作用的核酸外切酶。此类单链特异性5’-3’核酸外切酶的例子包括：来自枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的核酸外切酶、来自脾的磷酸二酯酶、来自酵母的核酸外切酶II、来自酵母的核酸外切酶V和来自粗糙链孢霉（Neurospora crassa）的核酸外切酶。

术语“3'至5'核酸外切酶”或“3'至5'核酸外切酶活性”指酶或酶活性，由此核苷酸从核酸链的3'末端去除。3'至5'核酸外切酶的例子包括：来自大肠杆菌的核酸外切酶I、来自大肠杆菌的核酸外切酶IV、来自大肠杆菌的核酸外切酶V、来自噬菌体T4的T4核酸外切酶IV、来自噬菌体T4的T4 DNA聚合酶、来自酵母的核酸外切酶I、来自酵母的核酸外切酶III、来自大肠杆菌的DNA聚合酶I、Klenow片段、来自果蝇属（Drosophila）的DNA聚合酶α、来自果蝇属的DNA聚合酶γ和蛇毒磷酸二酯酶。

本发明的各个方面基于核酸聚合酶的专门特性。核酸聚合酶可以具有几种活性，其中有5'至3'核酸酶活性，由此核酸聚合酶可以从对其更大的互补多核苷酸退火的寡核苷酸切割单核苷酸或小寡核苷酸。为了使切割有效发生，上游寡核苷酸还必须对相同的更大寡核苷酸退火。

利用5'至3'核酸酶活性的靶核酸检测可以通过“TaqMan®”或“5'核酸酶测定”执行，如美国专利号5,210,015；5,487,972；和5,804,375；和Holland等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280中所述。在TaqMan®测定中，在扩增区内杂交的标记的检测探针在扩增反应期间存在。探针如此进行修饰，以便阻止探针充当DNA合成的引物。扩增使用具有对双链核酸5'至3'核酸酶活性的DNA聚合酶执行。在扩增的每个合成步骤期间，与来自待延伸引物下游的靶核酸杂交的任何探针通过DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性降解。因此，新靶链的合成还导致探针的降解，并且降解产物的累积提供了靶序列合成的量度。

适合于检测降解产物的任何方法均可用于5'核酸酶测定中。通常，检测探针用两种荧光染料进行标记，其中之一能够猝灭另一种染料的荧光。染料附着至探针，通常报道或检测染料附着至5'末端，而猝灭染料附着至内部位点，使得当探针处于非杂交状态时，猝灭发生，并且使得通过DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性的探针切割在两种染料之间发生。扩增导致染料之间的探针切割，伴随同时的猝灭消除和对于最初猝灭的染料可观察到的荧光增加。降解产物的累积通过测量反应荧光中的增加进行监控。美国专利号5,491,063和5,571,673描述了用于检测与扩增同时发生的探针降解的方法。

用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3'核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在一些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核酸聚合酶。此类热稳定的聚合酶包括但不限于来自真细菌属的各个物种的天然和重组形式的聚合酶：栖热菌属、热袍菌属（Thermatoga）和栖热腔菌属（Thermosipho），以及其嵌合形式。例如，可以用于本发明的方法中的栖热菌属物种聚合酶包括栖热水生菌（Taq）DNA聚合酶、嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）（Tth）DNA聚合酶、栖热菌属物种Z05（Z05）DNA聚合酶、栖热菌属物种sps17（sps17）和栖热菌属物种Z05（例如美国专利号5,405,774；5,352,600；5,079,352；4,889,818；5,466,591；5,618,711；5,674,738和5,795,762中所述）。可以用于本发明的方法中的热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌（Thermatoga neapolitana）DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌属聚合酶的例子是非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus）DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列公开于具有公开号WO 92/06200的国际专利申请号PCT/US91/07035中。新阿波罗栖热袍菌的序列可以在国际专利公开号WO 97/09451中找到。

在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时发生（即，“实时”）。在一些实施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在一些实施方案中，扩增检测是定性的（例如靶核酸的存在或不存在的终点检测）。在一些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在一些实施方案中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增之后。

在本发明中，来自寡核苷酸探针的降解产物的检测不涉及使用荧光报道染料和猝灭染料，而是涉及具有两个不同部分的探针的合成。第一部分是互补部分，其与靶核酸至少部分互补，并且包含标准核苷酸或核苷酸类似物，使得该部分能够与待检测的靶核酸结合。此外，探针的这个第一部分的3'末端是经修饰的或被封闭的，使得它不能通过DNA聚合酶延伸，并且不能被3'至5'核酸酶切割。第二部分是非互补部分，其附着至第一部分的5'末端，并且形成不能与靶核酸结合的“5'翼”区（参见图1）。该5'翼部分可以包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者。可以存在于寡核苷酸探针的5'翼第二部分中的非核苷酸可以是任何有机部分或重复单位（例如（CH2-CH2-O）n等）。第二部分还含有使得其对3'至5'核酸外切酶的活性抗性的修饰（在图1中显示为“X”）。这种修饰可以是核苷酸类似物，其无法被3'至5'核酸外切酶切割，并且此类核苷酸类似物的例子包括硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物、倒转核苷酸或任何其他修饰，所述修饰致使寡核苷酸片段在修饰附着点外对于核酸外切切割抗性。

本发明提供了寡核苷酸引物和探针。不预期用于产生这些探针和引物的方法以任何方式是限制性的。本领域技术人员熟悉广泛多样的用于产生探针和引物的化学合成策略和试剂。还不预期本发明的寡核苷酸探针限制于天然存在的核苷酸结构或天然存在的碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）。除核酸中通常发现的天然存在的杂环碱基之外，非天然核酸类似物也对本发明有用。

非天然类似物包括具有非天然存在的杂环或其他经修饰的碱基的那些。特别地，许多非天然存在的碱基在例如Seela等人（1991）Helv. Chim. Acta 74:1790，Grein等人（1994）Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971–976和Seela等人（1999）Helv. Chim. Acta 82:1640中进一步描述。为了进一步举例说明，任选包括在核苷酸中使用的充当解链温度（Tm）改性剂的某些碱基。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤（例如，7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等）、吡唑并[3,4-D]嘧啶、丙炔基-dN（例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等）等。参见例如，名称为“SYNTHESIS OF 7-DEAZA-2’-DEOXYGUANOSINE NUCLEOTIDES的美国专利号5,990,303，其于1999年11月23日给予Seela。其他代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞嘧啶；5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-（羧基羟甲基）尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷（queosine）、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸（v）、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-（3-氨基-3-N-2-羧丙基）尿嘧啶、（acp3）W、2,6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶等。为了进一步举例说明，经修饰的寡核苷酸的其他例子包括具有一个或多个锁核酸（LNA™）单体的那些（包含LNA™单体的寡核苷酸可得自例如Link Technologies，Ltd.，Lanarkshire，苏格兰；在来自Exiqon A/S，Vedbæk，丹麦的许可证下）。诸如此类的核苷酸类似物也在例如美国专利号6,639,059和美国专利申请公开号2003/0092905中描述。

寡核苷酸探针和引物可以使用本领域已知的任何技术进行制备。在某些实施方案中，例如，寡核苷酸探针和引物使用任何核酸合成方法进行化学合成，包括例如根据由Beaucage和Caruthers（1981）Tetrahedron Letts. 22（20）:1859 1862描述的固相亚磷酰胺法。为了进一步举例说明，寡核苷酸还可以使用三酯法合成（参见例如Capaldi等人（2000）“Highly efficient solid phase synthesis of oligonucleotide analogs containing phosphorodithioate linkages” Nucleic Acids Res. 28（9）:e40和Eldrup等人（1994）“Preparation of oligodeoxyribonucleoside phosphorodithioates by a triester method” Nucleic Acids Res. 22（10）:1797–1804）。还可以利用本领域已知的其他合成技术，包括例如使用自动化合成仪，如Needham VanDevanter等人（1984）Nucleic Acids Res. 12:6159 6168中所述。广泛多样的用于自动化寡核苷酸合成的设备是商购可得的。还任选利用多核苷酸合成方法（例如三核苷酸合成等）。此外，引物核酸任选包括各种修饰。在某些实施方案中，例如，引物包括限制位点接头，例如以促进后续扩增子克隆等。为了进一步举例说明，引物还任选进行修饰，以改善扩增反应的特异性，如例如美国专利号6,001,611中所述。引物和探针还用如本文描述的或如本领域另外已知的各种其他修饰进行合成。

本发明的反应混合物、方法及其他方面中利用的探针可以具有核苷酸或非核苷酸标签。此类标签可以通过本领域已知的各种技术直接或间接附着至寡核苷酸。为了举例说明，取决于使用的标签类型，标签可以附着至末端（寡核苷酸引物和/或探针的5’或3’末端）或非末端核苷酸，并且可以通过各种大小和组成的接头或间隔物臂间接附着。使用商购可得的亚磷酰胺试剂，经由适当保护的亚磷酰胺，可以产生在5'或3'末端处含有官能团（例如硫醇或伯胺）的寡核苷酸，并且可以使用例如Innis等人（编辑）PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，Elsevier Science & Technology Books（1990）（Innis）中所述的方案，将标签附着至此类寡核苷酸。

基本上任何核酸（标准或非标准的、标记或非标记的）可以从各种商业来源中的任一定制或标准定购，例如Midland Certified Reagent Company（Midland，TX）、Operon Technologies Inc.（Huntsville，AL）、Proligo LLC（Boulder，CO）及许多其他公司。

由于探针的退火的第一部分中的多重切割位点，在TaqMan PCR测定中使用本发明的寡核苷酸探针导致探针的多重片段的生成（图1）。尽管这些片段在通过质谱法的后续检测中获得关于给定靶核酸的“质量可区别标志”，但样品中的多重靶核酸的存在（例如使用超过十种靶核酸的多路测定）生成巨大数目的“质量可区别标志”片段，使得将出现源于不同靶核酸的具有非常相似的质量的片段。因此，特定靶核酸的存在或不存在的准确鉴定将是困难的。这个问题通过提供使用3'至5'核酸外切酶的处理步骤得到解决，所述3'至5'核酸外切酶将切割片段直至到达核酸外切酶抗性修饰自身，或在定位接近于在5'翼部分上的核酸外切酶抗性修饰的3'侧的限定核苷酸处，并且不再进一步切割片段。因此，对于每种个别靶核酸生成单个“独特质粒”片段，并且通过质谱法进行检测。

具有质量可区别大小（MDF）的片段通过特定物理属性或检测特点加以区别，包括但不限于长度、质量、电荷或质荷比。在一个优选实施方案中，检测特点是质量。在另一个相关实施方案中，MDF可以通过与物理属性相关的行为加以区别，包括但不限于MALDI-TOF质谱法中的质量、飞行时间。在一个相关实施方案中，来自一种或多种寡核苷酸探针的MDF被释放且从质谱基质选择性解吸，使得非选择性引物和寡核苷酸探针（即不存在靶核酸）不解吸。对于这些实施方案，与寡核苷酸探针或反应混合物中存在的其他非MDF相比，MDF应从质谱基质更有效地解吸。优选的质谱基质包括2,5-二羟基苯甲酸、α-氰基-4-羟基肉桂酸、3-羟基吡啶甲酸（3-HPA）、柠檬酸二铵（DAC）及其组合。在另一个实施方案中，质谱基质可以设计用于蛋白质分析。用于蛋白质分析的示例性基质包括但不限于DHB和CHCA。

该方法可以进一步包括使一种或多种寡核苷酸探针片段（即MDF）与未切割或部分切割的寡核苷酸探针分离的另外步骤。分离可以使用捕获配体和与捕获配体具有特异性结合活性的捕获试剂来完成，所述捕获配体例如生物素或其他亲和配体，所述捕获试剂例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、抗体、受体、与MDF互补的捕获探针或其功能片段。MDF可以含有对于捕获试剂具有特异性结合活性的捕获配体。捕获配体和捕获试剂还可以用于对MDF的剩余部分添加质量，使得它可以从质谱仪中检测的MDF的质量范围中排除。在一个实施方案中，捕获探针可以具有用于切割产物的通用扩增的通用引物。

分离步骤还可以用于从MDF中去除盐、酶或其他缓冲液组分。本领域已知的几种方法例如层析、凝胶电泳或沉淀可以用于提纯样品。例如，尺寸排阻层析或亲和层析可以用于从样品去除盐。分离方法的选择可以取决于样品量。例如，当少量样品可获得或使用小型化仪器时，可以使用微量亲和层析分离步骤。另外，是否需要分离步骤，以及分离方法的选择，可以取决于使用的检测方法。例如，基质辅助激光解吸/电离和电喷雾电离的效率可以通过从样品去除盐得到改善。例如，盐可以吸收来自基质辅助激光解吸/电离中的激光能量，并且导致更低的电离效率。

质谱法是检测本发明的具有质量可区别大小（MDF）的片段的优选方法，并且因此鉴定和/或定量靶核酸。MDF可以在质谱仪中进行电离，并且离子基于其质荷比在空间或时间中分离。质谱仪随后计算与每种离子相关的质量。因此，当提及质谱法时，术语质量可以用于简单描述质荷比。

质谱法是用于分离且鉴定分子的灵敏且准确的技术。一般地，质谱仪具有两个主要部件，用于产生离子的离子源和用于测量离子的质荷比的质量选择性分析仪，其是且转换成这些离子的质量测量。几种电离法是本领域已知的，并且在本文中描述。MDF可以在从寡核苷酸探针中切割之前、期间或之后是荷电的。因此，通过质谱法测量的MDF不一定需要电荷，因为电荷可以通过质谱法操作获得。在质谱法分析中，MDF的任选组分例如电荷和检测部分可以用于对MDF贡献质量。

如本文描述的，不同的质谱法例如四极杆质谱法、离子阱质谱法、飞行时间质谱法、气相层析质谱法和串联质谱法，可以利用离子源和质量分析仪的各种组合，其允许在设计定制的检测方案中的灵活性。另外，质谱仪可以按程序工作，以将来自离子源的所有离子序贯或同时传递给质谱仪。此外，质谱仪可以按程序工作，以选择特定质量的离子用于传递给质谱仪，同时阻断其他离子。

精确地控制质谱仪中的离子移动的能力允许检测方案中的更多选项，当分析来自多路实验的大量mMDF时，其可以是有利的。例如，在具有大量MDF的多路实验中，从一组相似报道分子中选择个别报道分子且随后分开分析报道分子，可以是有利的。基于控制通过质谱仪检测的质量范围的另一个优点包括从分析中排除未切割或部分切割的加上标签的探针的能力，这降低来自测定的本底噪声。

质谱仪可以分辨具有小质量差异的离子，并且以高准确度测量离子的质量。因此，相似质量的MDF可以一起用于相同实验中，因为质谱仪可以区分即使紧密相关的标签的质量。使用质谱法达到的高度分辨率和质量准确度允许使用加上标签的探针的大集合，因为所得到的报道标签可以彼此区别。当设计多路实验时，使用加上标签的探针的大集合的能力是优点。

使用质谱法用于检测MDF的质量的另一个优点基于这类质量分析的高灵敏度。通过利用通过离子源形成的大部分离子，且将这些离子通过质量分析仪有效地传递给检测器，质谱仪实现高灵敏度。由于这种高水平的灵敏度，使用质谱法可以测量即使有限量的样品。这可以是多路实验中的优点，其中每个MDF种类的量可以很小。

质谱法是本领域众所周知的（参见Burlingame等人Anal. Chem. 70:647R-716R（1998）；Kinter和Sherman，Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience，New York（2000））。与质谱法相关的基本过程是生成衍生自样品的气相离子，且测量其质量。

气相离子的移动可以使用在质谱仪中生成的电磁场精确地加以控制。这些电磁场中的离子移动与离子m/z的成比例，并且这构成测量样品的m/z和因此样品质量的基础。离子在这些电磁场中的移动允许离子被包含且集中，这造成了质谱法的高灵敏度。在m/z测量过程期间，离子以高效率传递给粒子检测器，其记录这些离子的到达。在每个m/z处的离子数量通过曲线上的峰加以证实，其中x轴是m/z，并且y轴是相对丰度。不同的质谱仪具有不同水平的分辨率，即分辨在质量中紧密相关的离子之间的峰的能力。分辨率定义为R=m/δ m，其中m是离子质量，并且δm是质谱中的两个峰之间的质量差异。例如，具有分辨率1000的质谱仪可以分辨具有m/z 100.0的离子与具有m/z 100.1的离子。

几类质谱仪是可获得的，并且可以产生具有各种构型。一般而言，质谱仪具有下述主要部件：样品入口、离子源、质量分析仪、检测器、真空系统和器械控制系统以及数据系统。样品入口、离子源和质量分析仪中的差异一般限定器械类型及其能力。例如，入口可以是毛细管柱液相层析源，或可以是例如质量辅助激光解吸中使用的直接探针或台（stage）。常见离子源是例如电喷射，包括纳米喷雾和微喷雾或基质辅助激光解吸。示例性质量分析仪包括四极滤质器、离子阱质量分析仪和飞行时间质量分析仪。

离子形成过程是用于质谱分析的起点。几种电离法是可获得的，并且电离法的选择取决于待分析的样品。例如，对于多肽分析，相对温和的电离操作例如电喷射电离（ESI）可以是希望的。对于ESI，使含有样品的溶液以高电位经过细针，高电位产生强电场，导致导向质谱仪的高度荷电的小滴的细微喷雾。其他电离操作包括例如快原子轰击（FAB），其使用中性原子的高能束来打击固相样品，促使解吸和电离。基质辅助激光解吸电离（MALDI）是其中激光脉冲用于打击样品的方法，所述样品已在UV吸收化合物基质中结晶化。本领域已知的其他电离操作包括例如等离子体辉光放电、等离子体解吸电离、共振电离、和次级电离。MDF可以在从加上标签的探针中切割之前、期间或之后变得电离。

电喷射电离（ESI）具有用于本文描述的本发明的几种特性。例如，ESI可以用于难以电离或蒸发的生物分子，例如多肽。另外，ESI的效率可以是极高的，其提供了用于高灵敏度测量的基础。此外，ESI产生来自溶液的荷电分子，其对于分析溶液中的MDF是方便的。相比之下，电离操作例如MALDI要求在电离前的样品结晶。

因为ESI可以直接由溶液产生荷电分子，所以它与来自液相层析系统的样品相容。例如，质谱仪可以具有关于液相层析系统例如HPLC的入口，使得级分从层析柱流动到质谱仪内。液相层析系统和质谱仪的这种在线排列有时被称为LC-MS。在质谱法分析前，LC-MS系统可以用于例如使未切割或部分切割的MDF与切割的MDF分离。另外，在质谱法分析前，层析可以用于去除来自MDF样品的盐或其他缓冲液组分。例如，使用在线或离线反相HPLC柱使样品脱盐可以用于增加电离过程效率，且因此改善通过质谱法的检测灵敏度。

各种质量分析仪是可获得的，其可以与不同离子源配对。不同的质量分析仪具有不同的优点，如本领域技术人员已知的和如本文描述的。选择用于检测的质谱仪和方法取决于特定测定，例如当生成少量离子用于检测时，可以使用更灵敏的质量分析仪。几类质量分析仪和质谱法在下文描述。

离子迁移率（IM）质谱法是气相分离方法，其对质谱法（MS）添加新量纲。IM基于其碰撞截面分离气相离子，并且可以与飞行时间（TOF）质谱法偶联，以获得用于鉴定且表征蛋白质和肽的有力工具。因此，当MDF是蛋白质或肽时，IM-MS具有用于本发明的特定效用。IM-MS通过Verbeck等人在Journal of Biomolecular Techniques（第13卷，Issue 2，56-61）中更详细地讨论。

四极质谱法利用四极滤质器或分析仪。这类质量分析仪包含排列为两套两个电连接杆的四个杆。当离子从滤质器开始移动到末端时，将rf和dc电压的组合施加于每对杆，其产生促使离子的振荡运动的场。这些场的结果是在一对杆中产生高通滤质器，并且在另一对杆中产生低通滤器。高通和低通滤器之间的重叠留下限定m/z，其可以经过两个滤器且穿越四极的长度。该m/z被选择且在四极滤质器中保持稳定，而其他m/z具有不稳定轨迹并且不保留在滤质器中。质谱通过慢加速外加场而产生，使得选择渐增的m/z经过滤质器且到达检测器。另外，通过仅施加rf场，四极还可以设置为含有且传递所有m/z的离子。这允许四极充当质谱仪区域中的透镜或聚焦系统，在所述区域中需要离子传递而无需质量过滤。这可用于串联质谱法中，如下文进一步描述的。

四极质量分析仪，以及本文描述的其他质量分析仪，可以按程序工作，以分析限定的m/z或质量范围。质谱仪的这种特性可用于本文描述的本发明。因为切割的MDF的质量范围在测定前将是已知的，所以质谱仪可以按程序工作，以传递投射的正确质量范围的离子，同时排除更高或更低质量范围的离子。选择质量范围的能力可以减少测定中的本底噪声，并且因此增加信噪比。另外，限定的质量范围可以用于排除任何未切割的寡核苷酸探针的分析，其具有比MDF的质量更高的质量。因此，质谱仪可以完成固有的分离步骤以及MDF的检测和鉴定。

量子阱质谱法利用量子阱质量分析仪。在这些质量分析仪中，这样施加场，使得所有m/z的离子最初均在质量分析仪中被诱陷且振荡。离子从离子源通过聚焦装置例如八极透镜系统进入离子阱。在激发和通过电极射出到检测器前，离子诱陷在诱陷区中发生。质量分析通过序贯施加电压来完成，所述电压增加振荡幅度，其方式将m/z渐增的离子射出陷阱且进入检测器内。与四极质谱仪形成对比，所有离子均保留在质量分析仪的场内，除了所选m/z的那些之外。离子阱的一个优点是它们具有极高灵敏度，只要仔细限制一次诱陷的离子数目。离子数目的控制可以通过改变离子经过其注射到陷阱内的时间来完成。离子阱的质量分辨率类似于四极滤质器的那种，尽管离子阱的确具有低m/z局限性。

飞行时间质谱法利用飞行时间质量分析仪。对于这种m/z分析方法，离子首先通过在电场（通过高压生成）中加速给予固定量的动能。在加速后，离子进入无场或“漂移”区，在其中它以与其m/z成反比的速度行进。因此，具有低m/z的离子比具有高m/z的离子更快速行进。测量离子经过无场区域长度所需的时间且用于计算离子的m/z。

这类质量分析中的一个考虑是将待研究的离子集合同时引入分析仪内。例如，这类质量分析非常适合于电离技术如MALDI，其以短的充分确定的脉冲产生离子。另一个考虑是控制通过在其动能量中具有变动的离子产生的速度分布。使用更长的飞行管、离子反射器或更高的加速电压可以帮助使速度分布的效应降到最低。飞行时间质量分析仪具有高水平的灵敏度和比四极或离子阱质量分析仪更宽的m/z范围。另外，使用这类质量分析仪可以快速获得数据，因为不需要质量分析仪的扫描。

气相层析质谱法提供用于实时检测靶的良好解决方案。系统的气相层析（GC）部分将化学混合物分离成分析物（例如MDF）的脉冲，并且质谱仪（MS）鉴定且定量分析物。

串联质谱法可以利用上文描述的质量分析仪的组合。串联质谱仪可以使用根据其m/z分离离子的第一质量分析仪，以便分离目的离子用于进一步分析。经分离的目的离子随后破碎成碎片离子（称为碰撞活化解离或碰撞诱导解离），并且碎片离子通过第二质量分析仪进行分析。这些类型的串联质谱仪系统称为空间串联系统，因为两个质量分析仪通常通过碰撞室在空间中分离。串联质谱仪系统还包括其中使用一种质量分析仪的时间串联系统，然而，质量分析仪序贯使用以分离离子，诱导破碎且随后执行质量分析。

空间串联类别中的质谱仪具有超过一个质量分析仪。例如，串联四极质谱仪系统可以具有第一四极滤质器，随后为碰撞室，随后为第二四极滤质器且随后为检测器。另一种排列是使用四极滤质器用于第一质量分析仪，以及飞行时间质量分析仪用于第二质量分析仪，其中碰撞室使两个质量分析仪分离。其他串联系统是本领域已知的，包括反射式飞行时间、串联扇形和扇形-四极质谱法。

时间串联类别中的质谱仪具有在不同时间执行不同功能的一个质量分析仪。例如，离子阱质谱仪可以用于诱陷所有m/z的离子。应用一系列rf扫描功能，其射出来自陷阱的所有m/z，除了目的离子的m/z之外。在目的m/z已被分离后，施加rf脉冲以对陷阱中的气体分子产生碰撞，以诱导离子的破碎。随后通过质量分析仪测量碎片离子的m/z值。离子回旋加速器共振器械，也称为傅立叶变换质谱仪，是时间串联系统的例子。

几类串联质谱法实验可以通过控制在实验的每个阶段中选择的离子来执行。不同类型的实验利用质量分析仪的不同操作模式，有时称为“扫描”。在称为质谱扫描的第一个例子中，第一质量分析仪和碰撞室将用于质量分析的所有离子传递到第二质量分析仪内。在称为产物离子扫描的第二个例子中，目的离子在第一质量分析仪中进行质量选择，并且随后在碰撞室内破碎。所形成的离子随后通过扫描第二质量分析仪进行质量分析。在称为前体离子扫描的第三个例子中，扫描第一质量分析仪，以将质量分析的离子序贯传递到碰撞室内用于破碎。第二质量分析仪质量选择目的产物离子用于传递给检测器。因此，检测器信号是所有前体离子的结果，其可以破碎成共同的产物离子。其他实验形式包括中性丢失扫描，其中在质量扫描中指出恒定质量差异。与多路实验一样，当报道标签的大集合在单次实验中进行测量时，这些不同的串联质谱法扫描操作的使用可以是有利的。

在典型应用中，通过反应期间生成的MDF量基于循环阈（Ct）值进行测定，所述Ct值代表生成可检测量的核酸所需的循环数目。Ct值的测定是本领域众所周知的。简言之，在PCR期间，随着形成的扩增子的量增加，信号强度增加至可测量水平，并且在反应进入非对数期时的以后循环中到达平台。通过针对反应对数期过程中的循环数目标绘信号强度，可以推断在其下获得可测量信号的特异性循环，且用于计算在PCR起始前的靶数量。测定Ct的示例性方法在例如Heid等人Genome Methods 6:986-94，1996中描述，参考探针水解。

实施例

实施例 1

核酸外切酶抗性修饰的评估

为了评估可以用于实践本发明的方法的不同核酸外切酶抗性修饰，合成下述寡核苷酸：T₉JTTTGC（SEQ ID NO: 1），其中T₉代表5'翼部分，并且J代表修饰。在一个特定实验中使用的修饰包括硫代磷酸酯、2'-氨基-尿苷、2'-氟尿苷、2'-O-甲基尿苷、丙烷二醇间隔物和HEG（全名）间隔物。将1μM每种寡核苷酸悬浮于1 X核酸外切酶I缓冲液（New England Biolabs）和2单位的核酸外切酶I（New England Biolabs）中，并且在37℃下温育三十分钟。反应通过在冰上冷却得到终止，并且在Agilent Q-TOF 6530器械中，通过液相层析-质谱法（LC-MS）分析核酸外切酶消化的产物。来自含有三种修饰（2'-O-甲基尿苷、HEG间隔物和丙二醇间隔物）之一的寡核苷酸的核酸外切酶I消化的产物显示于图2 A-C的质谱图上。这些结果显示这些修饰有效阻断在修饰附着点外的寡核苷酸消化。

实施例 2

使用 5' 翼探针检测 EGFR T790M 扩增

执行PCR测定，以检测人上皮生长因子受体（EGFR）基因的T790M突变（核苷酸变化2369 C->T）。下述引物用于扩增EGFR基因的区域，其包括T790M突变的位置：

正向引物：5`CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGA 3`（SEQ ID NO: 2）

反向引物：5`CAGTCGAAGGGCATGAGCTGEA 3`（E= t-叔苄基-dC，SEQ ID NO: 3）。

对于检测，利用下述5'-翼探针，

5`-C<sub>6</sub>ECCTGCACGGTGGAGGTGAGGCAGP-3`（SEQ ID NO: 4），其中C₆代表非互补的5'-翼部分，E代表1,3-丙二醇，并且P代表磷酸盐。PCR反应混合物在96孔板上制备为具有下述最终浓度：50 mM Tris-HCl（pH 8.0），80-100 mM氯化钾，200 µM每种dATP、dCTP和dGTP，400 µM dUTP，200nM每种引物，200 nM 5`-翼探针，靶DNA（1,000-100,000 EGFR质粒拷贝，20 nM DNA聚合酶（具有5'核酸酶活性），0.1 mM EDTA，2.5 mM乙酸镁。扩增和分析使用Roche LightCycler® 480器械（Roche Applied Science，Indianapolis，Ind.）完成。使用下述温度轮廓：95℃1分钟（或95℃（10秒）至62℃（25秒）的2个循环，随后为从92℃（10秒）循环到62℃（25-30秒）99次。在PCR反应结束时，将10单位的核酸外切酶I（New England Biolabs）加入一些样品孔中，并且将溶液在37℃下温育30分钟，随后在冰上冷却。

使反应产物经过TopTip（Glygen Corp）阴离子交换柱，用于去除去污剂及其他污染物，并且随后装载到Agilent Q-TOF 6530器械上，并且通过LC-MS分析片段。图3显示了在通过核酸外切酶I消化前（A）和后（B），5'-翼探针的片段的提取离子层析图（EIC）。在不含核酸外切酶I消化的反应中观察到两个独特峰，其中预期质量对应于具有序列C₆ECC和C₆ECCT的探针片段。然而，在核酸外切酶I消化后，仅观察到质量对应于探针片段C₆EC的单个独特峰，并且不再观察到对应于C₆ECC和C₆ECCT的峰。

序列表

<110> Roche Diagnostics GmbH

F. Hoffmann-La Roche AG

<120> 通过基于探针切割的结构的核酸靶鉴定

<130> 31525 WO-HS

<150> 61/799,127

<151> 2013-03-15

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> 核酸外切酶抗性修饰

<400> 1

tttttttttt ttgc 14

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

cctccctcca ggaagcctac gtga 24

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<220>

<221> 经修饰的碱基

<222> (21)..(21)

<223> t-丁基苄基-dC

<400> 3

cagtcgaagg gcatgagctg ca 22

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成探针

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(7)

<223> 1,3-丙二醇

<400> 4

cccccccctg cacggtggag gtgaggcag 29

Claims (16)

1.一种检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括下述步骤：

（a）使包含靶核酸的样品与下述接触：

（i）一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的区域互补的序列，且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的区域互补的序列，且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和

（ii）包含至少两个不同部分的寡核苷酸探针，

第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，并且其中所述第一部分在3'末端处封闭，以阻止通过核酸聚合酶的延伸，并且阻止通过3'至5'核酸外切酶的切割；和

附着至第一部分的5'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含核酸外切酶抗性修饰；

（b）在下列条件下用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸序列：允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针对靶核酸序列退火，并且由所述寡核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能够切割退火的寡核苷酸探针，且从其中释放含有寡核苷酸探针的第二部分，连同或不连同来自寡核苷酸探针的第一部分的另外核苷酸的片段；

（c）用3'至5'核酸外切酶处理含有寡核苷酸探针的第二部分的所述片段，所述3'至5'核酸外切酶切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰，从而产生具有独特的质量可区别大小的片段；和

（d）通过质谱法检测单一片段的存在或不存在，从而检测所述样品中靶核酸序列的存在或不存在。

2.权利要求1的方法，其中在单一多路化反应中检测到两种或更多种靶核酸。

3.权利要求2的方法，其中两种或更多种寡核苷酸探针用于检测所述单一多路化反应中的两种或更多种靶核酸。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述核酸外切酶抗性修饰选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述检测步骤（d）之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述检测步骤（d）通过选自下述的质谱仪完成：基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）MS、串联MS、电喷射电离飞行时间（ESI-TOF）、ESI-离子肼、液相层析（LC）-MS）、气相层析（GC）-MS）和离子迁移率（IM）-MS。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。

8.一种检测样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括下述步骤：

（a）使包含靶核酸的样品与下述接触：

（i）一对寡核苷酸引物，其中第一寡核苷酸引物包含与靶核酸序列的一条链中的区域互补的序列，且引发第一延伸产物的合成，并且其中第二寡核苷酸引物包含与所述第一延伸产物中的区域互补的序列，且引发与所述第一延伸产物互补的核酸链的合成，和

（ii）包含至少两个不同部分的寡核苷酸探针，

第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，其中所述第一部分在由所述寡核苷酸引物对结合的靶核酸序列内退火，其中第一部分还包含在5'末端处的修饰，这使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性，和

附着至第一部分的3'末端的第二部分包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性的修饰；

（b）在下列条件下用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶扩增所述靶核酸序列：允许所述寡核苷酸引物对和所述寡核苷酸探针对靶核酸序列退火，并且由所述寡核苷酸引物对合成引物延伸产物，同时核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性能够切割退火的寡核苷酸探针，且从其中释放含有寡核苷酸探针的第二部分，连同或不连同来自寡核苷酸探针的第一部分的另外核苷酸的片段；

（c）用单链特异性5’-3’核酸外切酶处理含有寡核苷酸探针的第二部分的所述片段，所述单链特异性5’-3’核酸外切酶切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰，从而产生具有独特的质量可区别大小的片段；和

（d）通过质谱法检测单一片段的存在或不存在，从而检测所述样品中靶核酸序列的存在或不存在。

9.权利要求8的方法，其中在单一多路化反应中检测到两种或更多种靶核酸。

10.权利要求9的方法，其中两种或更多种寡核苷酸探针用于检测所述单一多路化反应中的两种或更多种靶核酸。

11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述核酸外切酶抗性修饰选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸。

12.权利要求8-11中任一项的方法，其中所述检测步骤（d）之前为纯化所述反应混合物用于去除质谱法的污染物的步骤。

13.权利要求8-12中任一项的方法，其中所述检测步骤（d）通过选自下述的质谱仪完成：基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）MS、串联MS、电喷射电离飞行时间（ESI-TOF）、ESI-离子肼、液相层析（LC）-MS）、气相层析（GC）-MS）和离子迁移率（IM）-MS。

14.权利要求8-13中任一项的方法，其中所述核酸聚合酶是热稳定的DNA聚合酶。

15.一种包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分，其中第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，使得所述第一部分能够与靶核酸序列的所述区域结合，并且其中所述第一部分在3'末端处封闭，以阻止通过核酸聚合酶的延伸，并且阻止通过3'至5'核酸外切酶的切割；并且其中第二部分附着至第一部分的5'末端，且包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，并且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含选自硫代磷酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、丙二醇间隔物、HEG间隔物和倒转核苷酸的核酸外切酶抗性修饰。

16.一种包含寡核苷酸探针的组合物，其中所述寡核苷酸探针包含至少两个不同部分，其中第一部分包含具有或不具有核苷酸类似物的标准核苷酸，其包含与靶核酸序列的区域至少部分互补的序列，使得所述第一部分能够与靶核酸序列的所述区域结合，并且其中第一部分还包含在5'末端处的修饰，这使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性；并且其中第二部分附着至第一部分的3'末端，且包含核苷酸或非核苷酸或核苷酸和非核苷酸两者，并且包含与靶核酸序列非互补的序列，其中所述第二部分还包含使得其对于通过单链特异性5’-3’核酸外切酶的切割抗性的修饰。