CN112715367A - 一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于林木组培繁育技术领域，为了解决目前毛梾组培体系增殖率低，增殖质量差等问题，提供了一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法。采用MS作为基本培养基，以毛梾幼嫩茎段为外植体，进行腋芽诱导，然后将腋芽转接至添加0.2 mg·L^‑1硝酸镧的增殖培养基中进行继代增殖培养，诱导产生大量腋芽和不定芽，增殖率和增殖系数分别达91.5%和18.1。本发明可在短期内获得大量继代增殖材料，显著提高了毛梾组培继代增殖效果，缩短继代芽增殖周期，从而降低毛梾组培产业化育苗中的生产成本。

Description

一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法

技术领域

本发明属于林木组培繁育技术领域，具体涉及一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法。

背景技术

毛梾（Cornus walteri Wanger.），又名黑椋子、车梁木等，隶属山茱萸科梾木属，落叶乔木，集中分布于山西、山东、陕西、河南等地。毛梾果实含油率达31.8%-41.3%，果皮含油率达24.9%-25.7%，可用于生产新型木本食用油、保健品、生物柴油开发，是重要的生物质能源树种。其耐干旱、耐瘠薄，适应性强，根系强大，对土壤要求不严，是绿化荒山和水土保持的良好树种；树形优美，枝叶茂密，白花黑果，可作为园林绿化树种。

大力发展毛梾，扩大栽培面积，培养原料基地林，要求提供大量优质壮苗。近年来，北京已将毛梾列为深度开发的乡土植物，山东省把毛梾列为重点发展树种，山西省已把毛梾作为珍贵乡土树种进行开发利用。目前，毛梾的繁殖方式主要是种子繁殖，但种子萌发率低[1-2]，出苗不齐，存在隔年出苗的现象，繁育时间长，而且易产生变异，不易保持品种的优良特性；虽可采用扦插繁殖，但其存活率低，生根非常困难，又受到季节和资源的限制；嫁接的成活率也较低，不适宜进行大规模繁殖。因此，非常有必要探索一种行之有效的方法对毛梾进行繁育。植物组织培养操作简单、繁殖速度快，可以极大的缩短木本植物的周期，有利于植物的推广和规模化生产，是快速大规模繁殖毛梾的必然选择。

目前，国内外对毛梾组织培养方面的研究较少。仅有张丹等[3]对毛梾初代培养影响因素进行研究；暴甜等[4]学者建立了毛梾优良无性系组培体系。但是现有的研究存在增殖率低、增殖质量差等缺点，无法快速高效地满足大规模生产需要。

发明内容

本发明为了解决目前毛梾组培体系增殖率低、增殖质量差等问题，提供了一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法，采用MS作为基本培养基，以毛梾幼嫩茎段为外植体，进行腋芽诱导，然后将腋芽转接至添加0.2 mg·L^-1硝酸镧的增殖培养基中进行继代增殖培养，诱导产生腋芽和不定芽。

具体步骤如下：

（1）选取外植体：1月-3月，采集当年生枝条进行水培，得到4-5cm的幼嫩茎段；或4-5月选择生长健壮、无病虫害的幼嫩茎段，作为外植体材料；

（2）外植体灭菌：对所得幼嫩茎段用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，沥干，再采用0.1% HgCI₂溶液中消毒4-5 min，无菌水冲洗5次，再切成1.5-1.8cm的茎段，每个茎段至少带一个腋芽，备用；

（3）初代培养：将切取的茎段，接种在初代培养基上进行初代培养，初代培养基为：MS + BA 0.5 mg·L^-1-1.0 mg·L^-1 + NAA 0.1 mg·L^-1 + IBA 0.1 mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1+琼脂6.5 g·L^-1；培养基pH值为5.8 -5.9，培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500-3000lx，光照时间12-14h/d，培养时间20-30天，待腋芽萌发至3cm时，将其切下，备用；

（4）继代增殖培养：将步骤（3）切下的腋芽转接至继代增殖培养基中培养，继代增殖培养基为：MS + BA 1.0 mg·L^-1+ NAA 0.2 mg·L^-1+La(NO₃)₃·6H₂O 0.2 mg·L^-1+蔗糖20 g·L^-1+琼脂6.5 g·L^-1；培养基pH值为5.8 -5.9，培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500-3000lx，光照时间12-14h/d，培养时间20-30天，在茎段基部周围形成丛生芽，并萌发腋芽，将其切成带茎节的切段，扩繁试管苗。

本发明中，BA为植物生长激素6-苄氨基腺嘌呤，其主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生，促进细胞分裂，促进非分化组织分化，促进生物体内物质的积累，促进侧芽发生，防止老化，是植物组织和细胞培养中的细胞分裂素。

IBA为植物生长激素吲哚丁酸，主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成。

NAA为植物生长激素萘乙酸，在植物使用扦插法繁殖时使用，也可用于植物组培快繁，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等，可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。

本发明可在短期内获得大量继代增殖材料，显著提高了毛梾组培继代增殖效果，缩短继代芽增殖周期，从而降低毛梾组培产业化育苗中的生产成本。

本发明利用特定浓度硝酸镧进行毛梾组培继代增殖，采用MS作为基本培养基，通过对初代培养基、增殖培养基的筛选，得到最佳的培养基组分和配比。采用毛梾幼嫩茎段进行启动培养，在MS培养基中添加BA、NAA 和IBA进行调控，诱导腋芽萌发生长；再通过MS培养基中添加适当浓度的BA、NAA、La(NO₃)₃调节腋芽的继代增殖培养，建立了高效、稳定的继代增殖方法。本发明继代增殖方法培养时间短，增殖效率高，增殖系数最高达18.1，能在短期内提供大量遗传性状一致、优质的毛梾试管苗，满足大规模的工厂化育苗及产业化发展需要。

附图说明

图1为毛梾茎段腋芽诱导的图片；

图2为毛梾试管苗增殖培养的图片；

图3为毛梾试管苗的图片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.试验材料：将毛梾茎段诱导的腋芽转接到增殖培养基进行继代增殖培养。均采用单因素完全随机设计，每处理20瓶，重复3次。

2、实验方法：

A、单独添加TDZ或与NAA、IBA、2,4-D组合培养：将诱导的腋芽转接于MS基本培养基，并单独添加TDZ或分别与NAA、IBA、2,4-D组合，4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究单独添加TDZ或与NAA、IBA、2,4-D组合对毛梾试管苗增殖的影响。

B、单独添加BA或与NAA、2,4-D组合培养：将诱导的腋芽转接于MS基本培养基，并单独添加BA或分别与NAA、2,4-D组合，4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究单独添加BA或与NAA、2,4-D组合对毛梾试管苗增殖的影响。

C、硝酸镧与BA、NAA、IBA组合培养：将诱导的腋芽转接于MS基本培养基，并添加BA与NAA、IBA、硝酸镧组合，4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究BA与NAA、IBA、硝酸镧组合对毛梾试管苗增殖的影响。

D、不同浓度硝酸镧与BA 、NAA组合培养：将诱导的腋芽转接于MS基本培养基，添加1.0 mg·L^-1 BA、0.2 mg·L^-1 NAA，分别添加不同浓度的硝酸镧（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg·L^-1），4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究不同浓度硝酸镧与BA、 NAA组合对毛梾试管苗增殖的影响。

E、增殖周期选择：将上述筛选的最佳培养基作为基本培养基，分别将培养20 d、30d、40 d的试管苗转接到新的培养基中进行增殖培养，4周后统计试管苗的增殖率和增殖系数，研究增殖周期对毛梾试管苗增殖的影响。

F、培养条件：培养温度为25 ± 2ºC，光照强度均为2500 lx -3000 lx，光照时间为14 -16 h/d；所有培养基均添加蔗糖20 g·L^-1、琼脂6.5 g·L^-1。

3、数据统计与分析：将试验所得数据采用SPSS 17.0进行方差分析，并用Duncan多重比较方法对均值进行差异显著性检验。具体指标计算如下：

4、结果与分析

A、单独添加TDZ或与NAA、IBA、2,4-D组合对毛梾试管苗增殖的影响：本试验研究了单独添加TDZ或分别与NAA、IBA、2,4-D组合对毛梾试管苗增殖的影响。研究结果见表1，结果表明，试管苗基部仅分化出少量淡黄或淡白、松软愈伤组织，并未实现试管苗增殖（表1）。可见，培养基中单独添加TDZ或与NAA、IBA、2,4-D组合不适宜毛梾试管苗增殖培养。

表1 TDZ或与NAA、IBA、2,4-D组合对试管苗增殖的影响

B、单独添加BA或与NAA、2,4-D组合对毛梾试管苗增殖的影响：本试验研究了单独添加BA或分别与NAA、2,4-D组合对毛梾试管苗增殖的影响。研究结果见表2，结果表明，试管苗基部仅分化出少量淡绿、紧致或淡白、疏松愈伤组织；当BA浓度过高（≥3.0 mg·L^-1）时，茎段出现玻璃化现象，基部膨大，但均未实现试管苗增殖。可见，培养基中单独添加BA或与NAA、2,4-D组合不适宜毛梾试管苗增殖培养。

表2 BA或与NAA、2,4-D组合对试管苗增殖的影响

C、硝酸镧与BA、NAA、IBA组合对毛梾试管苗增殖的影响：本试验研究了硝酸镧与BA、NAA、IBA组合对毛梾试管苗增殖的影响。方差分析表明，硝酸镧与不同浓度的BA、NAA、IBA组合对毛梾试管苗增殖率（P<0.001）、增殖系数（P=0.002）影响显著。多重比较结果见表3。

表3 硝酸镧与BA、NAA、IBA组合对试管苗增殖的多重比较

所有组合中，试管苗基部均分化少量淡绿、紧致愈伤组织，并分化大量腋芽，长势良好，属于丛生芽发生型。实验结果见表3，结果显示，当0.2 mg·L^-1硝酸镧与1.0 mg·L^-1 BA组合时，增殖率为47.4%，增殖系数为3.7；当0.2 mg·L^-1硝酸镧与1.0 mg·L^-1 BA、0.2mg·L^-1 NAA组合时，增殖率达最高，为91.5%，增殖系数为18.1；当0.2 mg·L^-1硝酸镧与0.5mg·L^-1 BA、0.05 mg·L^-1 NAA组合时，增殖率为64.2%，增殖系数为4.2；当0.2 mg·L^-1硝酸镧与0.5 mg·L^-1 BA、0.05 mg·L^-1 NAA、0.1 mg·L^-1 IBA组合时，增殖率为70.4%，增殖系数为5.4（表3）。

由此可见，当培养基中添加0.2 mg·L^-1硝酸镧与1.0 mg·L^-1 BA、0.2 mg·L^-1 NAA组合，是毛梾试管苗的最佳增殖培养基，属于丛生芽发生型。

D、不同浓度硝酸镧与BA、NAA组合对毛梾试管苗增殖的影响：为了进一步筛选硝酸镧的最佳浓度，本试验研究了不同浓度硝酸镧与BA、NAA组合对毛梾试管苗增殖的影响。方差分析结果表明，不同浓度硝酸镧与BA、NAA组合对毛梾试管苗增殖率（P<0.001）、增殖系数（P=0.015）影响显著。多重比较结果见表4。

表4 不同浓度硝酸镧与BA、NAA组合对试管苗增殖的多重比较

研究结果表明，随着硝酸镧浓度增加，增殖率和增殖系数均呈先上升后下降趋势。当0.05 mg·L^-1硝酸镧与1.0 mg·L^-1 BA、0.2 mg·L^-1 NAA组合时，增殖率为40.2%，增殖系数为7.7；随着硝酸镧浓度增高，增殖率和增殖系数也逐渐升高。当硝酸镧浓度增加至0.2mg·L^-1时，增殖率和增殖系数均达最高，分别为91.5%和18.1；当硝酸镧浓度继续增加，增殖率和增殖系数开始下降；当硝酸镧浓度为1.0 mg·L^-1时，增殖率和增殖系数均较低，分别为为72.6%和8.2。

由此可见，当培养基中添加0.2 mg·L^-1硝酸镧与1.0 mg·L^-1 BA、0.2 mg·L^-1 NAA组合，是毛梾试管苗的最佳增殖培养基。

E、增殖周期对毛梾试管苗增殖的影响：本试验以MS+1.0 mg·L^-1 BA+0.2 mg·L^-1 NAA+0.2 mg·L^-1 硝酸镧作为基本培养基，研究不同增殖周期对试管苗增殖的影响。方差分析结果见表5；结果表明，增殖周期对试管苗的增殖率（P=0.074）影响不显著，对增殖系数（P=0.025）影响显著。

表5 增殖周期对试管苗增殖的多重比较

研究发现，增殖周期为20 d和30 d时，试管苗在转接4 d -5 d开始进入明显的生长阶段，20 d后生长至最高峰，并可持续至30d左右，增殖率均较高，分别为91.5%和89.9%，增殖系数分别为18.1和17.7；而培养40d转接的试管苗则生长明显不如前者，增殖率略低，为79.8%，增殖系数为10.4。由此可见，20 d -30 d是毛梾试管苗的最佳增殖周期。

基本培养基仅能保持腋芽或不定芽诱导，但决定试管苗增殖的关键因素是植物生长调节剂的种类、浓度及比例，特别是细胞分裂素和生长素浓度配比。一般情况下，当二者浓度比例高时有利于分化芽，浓度比例适中有利于芽的生长，浓度比例低时有利于生根。因此，只有在培养基中添加一定比例的植物生长调节剂，才能保证试管苗的有效增殖，从而在较短时间内获得较多的组培苗。

不同种类的细胞分裂素和生长素组合对不同植物材料的分化及增殖作用差异较大，但大多数种类以BA最为有效。王秋庆等[5]在偃伏梾木组织培养中发现，不定芽在1/2MS+0.5 mg·L^-1 BA+0.25 mg·L^-1 IBA培养基中能有效增殖。赵青华[6]在红瑞木试管苗增殖培养中发现，芽的增殖以M（MS培养基中的CaCl₂·2H₂O的浓度为1200 mg·L^-1）基本培养基，添加0.5 mg·L^-1 BA和0.05 mg·L^-1 IBA，丛生芽长势最好，增殖率达73.5%，增殖系数为2.32。但本研究中发现，培养基中单独添加TDZ或分别与NAA、IBA、2,4-D组合，试管苗基部仅分化出少量淡黄或淡白、松软愈伤组织，未实现试管苗增殖；单独添加BA或分别与NAA、2,4-D组合，试管苗基部仅分化出少量淡绿、紧致或淡白、疏松愈伤组织，也未实现试管苗增殖。

适量的稀土元素能增加植物体内源激素的含量，从而促进组培苗的分化生长，而高浓度的稀土则会破坏在细胞膜上的作用，影响细胞膜的透性，使胞质中的K⁺等营养离子流失，阻碍了植株的正常营养代谢。本研究表明，当培养基中添加0.2 mg·L^-1硝酸镧与1.0mg·L^-1 BA、0.2 mg·L^-1 NAA组合时，试管苗基部分化少量淡绿、紧致愈伤组织，并分化大量腋芽，长势良好，属于丛生芽发生型，是毛梾试管苗的最佳增殖培养基，可见，硝酸镧有利于毛梾试管苗增殖。

增殖周期对试管苗的增殖也较为重要。本试验研究了不同增殖周期对毛梾试管苗增殖的影响，研究结果表明，增殖周期为20d和30d时，试管苗在转接4d-5d开始进入明显的生长阶段，20 d后生长至最高峰，并可持续至30d左右，增殖率均较高，分别为88.5%和88.1%；而40d转接的试管苗则生长明显不如前者，增殖率略低，因为被转接的试管苗本身处于停滞状态，不易恢复生长。观察显示，培养60 d以后的试管苗叶片发黄、枯萎。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

参考文献：

[1]康永祥,贠玉洁,赵宝鑫,陈绵,康晋.毛梾种子萌发特性及其解除休眠技术研究[J].种子,2011,30(09):22-28+33.

[2]康永祥,贠玉洁,赵宝鑫,陈绵,康晋.毛梾种子萌发特性及幼苗生长规律研究[J].西北林学院学报,2012,27(03):62-67+112.

[3]张丹,康永祥,薛丽艳,叶新华.毛梾初代培养影响因素研究[J].北方园艺,2012(07):123-125.

[4]暴甜,苏淑钗,高赫,陈一帆.毛梾优良无性系组培体系建立[J].中南林业科技大学学报,2017,37(06):70-74+95.

[5]王秋庆,刘华,朱金启,王翠亭,张洪霞.偃伏梾木组织培养及再生体系的建立(简报)(英文)[J].分子细胞生物学报,2008(03):227-232.

[6]赵青华.红瑞木的组织培养与快速繁殖[J].植物学通报,2008(02):220。

Claims (5)

1.一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法，其特征在于：采用MS作为基本培养基，以毛梾水培茎段为外植体，进行腋芽诱导，然后将腋芽转接至添加0.2 mg·L^-1硝酸镧的增殖培养基中进行继代增殖培养，诱导产生腋芽和不定芽。

2.根据权利要求1所述的一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）选取外植体：1月-3月，采集当年生枝条进行水培，得到4-5cm的幼嫩茎段；或4-5月选择生长健壮、无病虫害的幼嫩茎段，作为外植体材料；

（2）外植体灭菌：对所得幼嫩茎段用75%的酒精溶液浸泡30s，无菌水冲洗3次，沥干，再采用0.1% HgCI₂溶液中消毒4-5 min，无菌水冲洗5次，再切成1.5-1.8cm的茎段，每个茎段至少带一个腋芽，备用；

（3）初代培养：将切取的茎段，接种在初代培养基上进行初代培养，培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500-3000lx，光照时间12-14h/d，培养时间20-30天，待腋芽萌发至3cm时，将其切下，备用；

（4）继代增殖培养：将步骤（3）切下的腋芽转接至继代增殖培养基中培养，继代增殖培养基为：MS + BA 1.0 mg·L^-1+ NAA 0.2 mg·L^-1+La(NO₃)₃·6H₂O 0.2 mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1+琼脂6.5 g·L^-1；培养基pH值为5.8 -5.9，培养温度25±2℃，湿度60±2%，光照强度2500-3000lx，光照时间12-14h/d，培养时间20-30天，在茎段基部周围形成丛生芽，并萌发腋芽，将其切成带茎节的切段，扩繁试管苗。

3.根据权利要求2所述的一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法，其特征在于：所述初代培养基为：MS + BA 0.5 mg·L^-1-1.0 mg·L^-1 + NAA 0.1 mg·L^-1 + IBA 0.1mg·L^-1 +蔗糖20 g·L^-1+琼脂6.5 g·L^-1；培养基pH值为5.8 -5.9。

4.根据权利要求2所述的一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法，其特征在于：步骤（4）中继代增殖培养时间为20d，增殖系数为18.1，增殖率为91.5%。

5.根据权利要求2所述的一种利用硝酸镧进行毛梾组培继代增殖的方法，其特征在于：步骤（4）增殖培养30d，增殖系数为17.7，增殖率为89.9%。

Images