CN102217539A - 一种杉木无性系离体生根培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杉木无性系离体生根培养方法，该方法包括以下步骤：选取杉木优良无性系原株的树干的基部萌条为组织培养材料，接入继代增殖培养基进行继代增殖培养，诱导分化出不定芽，然后将不定芽转入MS培养基上进行伸长培养；不定芽长到2～3cm时，转入诱导生根培养基培养，得生根试管苗；移栽生根试管苗，选用黄土、泥炭土3：1比例混合后用作移栽基质。与现有技术中的杉木组培方法相比，本发明的杉木无性系离体生根培养方法优势在于：有效解决了杉木不同优良无性系在组织培养条件下组培苗的生根困难问题，实现建立杉木稳定高效的组培体系，生根率最高可达到100％（洋020），为加快杉木组培苗产业化发展提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及杉木无性繁殖技术，具体涉及一种杉木无性系离体生根培养方法。
背景技术
杉木（Cunninghamia lanceolata）是裸子植物杉科（Taxodiaceae）的常绿大乔木，性喜温暖湿润气候，生长迅速，树干通直，高达30m，胸径2.5～3m。杉木材质轻软、细致、纹理直，易加工；供建筑、桥梁、造船、电焊、坑木、木椿等用，并可作造纸、纺织等原料；树皮及根、叶入药，能祛风燥湿、收敛止血；种子含油约20％，供制肥皂。
杉木是我国南方主要造林树种和最重要的商品用材树种，栽培历史悠久，其造林面积和林分蓄积均居我国人工林的首位。近年来随着经营水平的不断提高，良种壮苗得到高度重视。南方杉木产区选育了大量杉木优良无性系，并利用组织培养快繁技术对这些优良无性系进行了无性育苗造林，取得了显著的增产效果。但由于不同杉木优良无性系在生根性状遗传和生理基础的差异性，导致不同杉木无性系在同一组培配方条件下成功率和有效率方面存在很大的差异，极大地影响了优良杉木无性系组培苗培育以及推广应用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杉木无性系离体生根培养方法，进而解决杉木不同优良无性系在组织培养条件下组培苗的生根困难问题，实现建立杉木稳定高效的组培体系，为加快杉木组培苗产业化发展提供技术支撑。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种杉木无性系离体生根培养方法，包括以下步骤：
（1）选取杉木优良无性系原株的树干的基部萌条为组织培养材料，接入继代增殖培养基进行继代增殖培养，诱导分化出不定芽，然后将不定芽转入MS培养基上进行伸长培养；继代增殖培养基配方为3/4MS＋6BA0.3mg·L-1＋NAA0.02mg·L-1＋蔗糖3%；
（2）步骤（1）的不定芽伸长到2～3cm时，转入诱导生根培养基培养，得生根试管苗；诱导生根培养基以1/2MS或1/4MS为基本培养基，在其中添加植物生长调节剂和2%蔗糖；植物生长调节剂为IBA0.05~0.4mg·L-1、NAA0.05~0.4mg·L-1、IAA0.1~1.0mg·L-1、或IBA0.05~0.4mg·L-1与NAA0.05~0.4mg·L-1的混合；
（3）移栽生根试管苗，选用黄土、泥炭土3：1比例混合后用作移栽基质。
优选：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/2MS，植物生长调节剂为IBA0.1~0.4mg·L-1或NAA0.1~0.2mg·L-1。
优选：骤（2）中，诱导生根培养基为1/4MS，植物生长调节剂为IBA0.1~0.2mg·L-1或NAA0.05~0.2mg·L-1。
优选：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/2MS，植物生长调节剂为IBA0.05~0.2mg·L-1与NAA0.05~0.4mg·L-1的混合。
优选：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/4MS，植物生长调节剂为IBA0.05~0.2mg·L-1与NAA0.05~0.4mg·L-1的混合。
优选：步骤（3）中，在移栽生根试管苗前一周，将生根试管苗放入自然光照下进行炼苗，逐日松开培养瓶封口膜直至最后撤去。
优选：步骤（3）中，试管苗的根长度不小于1cm。
优选：步骤（3）中，试管苗的根长度为1～3cm。
在组培过程中，试管苗生根受培养基、激素以及培养条件等多种因素的影响。一般而言，试管苗生根均需要在低盐培养基中进行。这是由于盐浓度变化导致培养基渗透压变化，从而影响试管苗对营养吸收和向培养基中释放物质。而且盐浓度的变化也使植株体内氮浓度下降到一个适合生根的有利水平。本申请中，洋062、洋061、洋021、洋023的试管苗在1/4MS的培养基上生根效果较好，其生根率最高可分别达到93.3％、56.7％、70％、90％，但洋020的试管苗在1/2MS的基本培养基上生根较好，最高生根率为100％。
试管苗移栽成活率高低是鉴定发根质量和发根技术最有效的依据，本申请杉木试管苗的移栽成活率达70%以上，可说明杉木无性系离体生根培养方法所培养的杉木试管苗不定根为高质根。
有益效果：与现有技术中的杉木组培方法相比，本发明的杉木无性系离体生根培养方法优势在于：有效解决了杉木不同优良无性系在组织培养条件下组培苗的生根困难问题，实现建立杉木稳定高效的组培体系，生根率最高可达到100％（洋020），为加快杉木组培苗产业化发展提供技术支撑，能够产生很好的社会效益，具有很好的经济前景。
附图说明
图1是洋062的生根图；
图2是洋020的生根图；
图3是洋061的生根图；
图4是洋021的生根图；
图5是洋023的生根图；
图6是试管苗移栽成活图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
以下实施例采用南京林业大学和福建合作选育的福建洋口林场杉木优良无性系无菌苗，本申请将各样品分别简称为：洋062、洋020、洋061、洋023和洋021。这些材料起源于南林—福建合作开展的第二代遗传改良计划中选择的优良家系中的优良个体，繁殖成无性系后进行了10多年的无性系测定，再选择后作为优良无性系加速繁殖。所有组织培养材料均起源于无性系原株的树干的基部萌条。
以下各实施例使用的培养条件（除特殊指明）为：培养基中均附加琼脂0.6%，pH5.8，光照（2000lx）14h/d，培养温度25℃左右。
实施例1 芽的分化和伸长
将各组织培养材料（洋062、洋020、洋061、洋023和洋021）分别放入继代增殖培养基中培养，诱导分化出不定芽，继代增殖培养基配方采用3/4MS＋6BA0.3 mg·L-1＋NAA0.02mg·L-1＋蔗糖3%。将经诱导分化的不定芽转入无任何生长调节剂的MS培养基上进行伸长培养。
实施例2 诱导生根
当实施例1的各不定芽长到2～3cm时，将其转入生根培养基培养其生根。在生根培养基中添加植物生长调节剂和蔗糖2%，观察统计数据。数据统计指标包括：不定根的诱导频率（%）=长出不定根的不定芽数/接种不定芽数×100%；平均不定根数=不定根的总数/诱导出不定根的不定芽数；不定根的形成能力（RFC）=平均不定根数×不定根的诱导频率。
在洋062培养中，生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果如表1所示，从表中可见，以附加NAA的培养基生根最好，当NAA浓度<0.2mg·L-1时，生根率与NAA浓度成正相关；当NAA浓度>0.2mg·L-1时，为负相关；而当NAA浓度等于0.2mg·L-1时，生根率最高为46.7％。附加IAA的培养基效果最差。在相同浓度的NAA水平下，1/4MS培养基中生根率明显高于1/2MS培养基；在相同浓度的IBA水平下，1/4MS培养基中生根率也明显高于1/2MS培养基。其中以1/4MS附加NAA0.2mg·L-1培养基效果最好，生根率为56.7%，外植体长势良好。
表1 洋062生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果表
| 培养基及植物生长调节剂 | 接种外植体数 | 生根率 | 平均根数（条） | 不定根形成能力 |
| 1/2MS+NAA0.05 mg·L-1 | 30 | 20 | 2.5 | 0.5 |
| 1/2MS+NAA0.1 mg·L-1 | 30 | 30 | 5.5 | 1.65 |
| 1/2MS+NAA0.2 mg·L-1 | 30 | 46.7 | 4 | 1.87 |
| 1/2MS+NAA0.4 mg·L-1 | 30 | 6.7 | 1.5 | 0.10 |
| 1/2MS+IBA0.05 mg·L-1 | 30 | 3.3 | 1 | 0.03 |
| 1/2MS+IBA0.1 mg·L-1 | 30 | 10 | 1.3 | 0.13 |
| 1/2MS+IBA0.2 mg·L-1 | 30 | 13.3 | 2 | 0.26 |
| 1/2MS+IBA0.4 mg·L-1 | 30 | 6.7 | 1.5 | 0.10 |
| 1/2MS+IAA0.1 mg·L-1 | 30 | 0 | 0 | 0 |
| 1/2MS+IAA0.2 mg·L-1 | 30 | 0 | 0 | 0 |
| 1/2MS+IAA0.5 mg·L-1 | 30 | 26.7 | 3.5 | 0.93 |
| 1/2MS+IAA1.0 mg·L-1 | 30 | 0 | 0 | 0 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1 | 30 | 43.3 | 3.1 | 1.34 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1 | 30 | 50 | 3.9 | 1.95 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1 | 30 | 56.7 | 4 | 2.27 |
| 1/4MS+NAA0.4mg·L-1 | 30 | 13.3 | 2 | 0.26 |
| 1/4MS+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 3.3 | 2 | 0.06 |
| 1/4MS+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 13.3 | 1.8 | 0.24 |
| 1/4MS+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 20.0 | 2.3 | 0.46 |
| 1/4MS+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 10 | 1.7 | 0.17 |
| 1/4MS+IAA0.1 mg·L-1 | 30 | 0 | 0 | 0 |
| 1/4MS+IAA0.2 mg·L-1 | 30 | 13.3 | 1.8 | 0.24 |
| 1/4MS+IAA0. 5 mg·L-1 | 30 | 33.3 | 2.7 | 0.90. |
在洋062培养中，生根培养基及植物生长调节剂（2种）的选取情况及其对应的实验结果如表2所示，从表中可见，在1/2MS培养基中同时附加NAA和IBA时，杉木不定芽生根率普遍上升，平均生根率为53.9%。生长在附加0.1mg·L-1NAA和0.4 mg·L-1IBA的培养基上的组培苗的生根率可达73.3%，大大提高了组培苗生根率，并且随着时间的延长，生根率还有所上升，外植体生长状态良好。由此可知，NAA与IBA协同作用更有利于杉木不定芽生根。不定芽接入生根培养基20d后，1/2MS附加IBA和NAA的生根培养基上有不定根长出，23d后不定根长到1~1.5cm。在1/2MS、1/4MS单独附加IBA和NAA的生根培养基上，不定根诱导时间要晚3~5d，这说明NAA和IBA配合使用，可明显缩短生根时间。
同样激素配比下，在1/4MS培养基中，外植体平均生根率达到82.2%，明显高于1/2MS培养基下53.9%的平均生根率。在附加0.05mg·L-1NAA和0.05 mg·L-1IBA的培养基上外植体生根率最高，为93.3%；在附加0.1mg·L-1NAA和0.2 mg·L-1IBA的培养基上生根率为90%，不定根形成能力较高，且植株生长状态好于前者。在NAA浓度为0.05 mg·L-1平均生根率为84.2％；NAA浓度为0.1mg·L-1时平均生根率为85%，随IBA浓度的增加生根率呈上升趋势，IBA0.2时达最高；NAA浓度为0.2 mg·L-1时平均生根率为77.5%，在IBA0.2时达到最高。由此可知，洋062的最佳生根配方为1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1，生根图如图1所示。
表2洋062生根培养基及植物生长调节剂（2种）的选取情况及实验结果
| 培养基及植物生长调节剂 | 接种外植体数 | 生根率 | 平均根数（条） | 不定根形成能力 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 43.3 | 2.4 | 1.04 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 53.3 | 1.7 | 0.91 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 60 | 2.6 | 1.59 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 56.7 | 2.7 | 1.53 |
| 1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 56.7 | 3.8 | 2.15 |
| 1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 40 | 1.9 | 0.76 |
| 1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 56.7 | 2.8 | 1.59 |
| 1/2MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 73.3 | 2.5 | 1.83 |
| 1/2MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 33.3 | 3.2 | 1.07 |
| 1/2MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 50 | 4.9 | 2.45 |
| 1/2MS+NAA0.2mg·L-1+ IBA 0.2mg·L-1 | 30 | 66.7 | 2.8 | 1.87 |
| 1/2MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 56.7 | 1.9 | 1.07 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 93.3 | 2.3 | 2.15 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 80 | 2 | 1.6 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 80 | 3.3 | 2.64 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 83.3 | 3.4 | 2.83 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 80 | 2.8 | 2.24 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 83.3 | 2.5 | 2.08 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 90 | 2.8 | 2.52 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 86.7 | 2.6 | 2.25 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 80 | 2.7 | 2.16 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 73.3 | 2.4 | 1.76 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 86.7 | 2.9 | 2.51 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 70 | 3 | 2.1 |
在洋020培养中，生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果如表3所示，从表2中可见，以附加IAA的培养基中外植体生根情况最好，平均生根率为95％，且根茎连接处愈伤组织极少；在IAA1.0 mg·L-1生根率达到100％，且不定根的条数多，不定根的形成能力最高，为8.6。在附加NAA的培养基中外植体平均生根率为70％，在浓度为0.2 mg·L-1和0.4 mg·L-1的两个配方中外植体基部膨大，愈伤组织多，生出的根较细弱。在附加IBA的培养基，平均生根率仅为25.8％。由此可知，洋020基因型最佳生根培养基为：1/2MS+IAA 1.0mg·L-1。将洋020诱导的不定芽转入1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1中，生根率为100％，平均根数5.3条，苗生长状态良好，如图2所示。
表3洋020生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果
| 培养基及植物生长调节剂 | 接种外植体数 | 生根率 | 平均根数（条） | 不定根形成能力 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1 | 30 | 70 | 5.6 | 3.92 |
| 1/2MS+NAA0.1 mg·L-1 | 30 | 80 | 2.7 | 2.16 |
| 1/2MS+NAA0.2 mg·L-1 | 30 | 66.7 | 4.5 | 3.00 |
| 1/2MS+NAA0.4 mg·L-1 | 30 | 63.3 | 5.4 | 3.41 |
| 1/2MS+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 13.3 | 2.3 | 0.31 |
| 1/2MS+IBA0.1 mg·L-1 | 30 | 13.3 | 2.3 | 0.31 |
| 1/2MS+IBA0.2 mg·L-1 | 30 | 40 | 3 | 1.2 |
| 1/2MS+IBA0.4 mg·L-1 | 30 | 36.7 | 1.6 | 0.59 |
| 1/2MS+IAA0.1 mg·L-1 | 30 | 86.7 | 5.8 | 5.0 |
| 1/2MS+IAA0.2 mg·L-1 | 30 | 93.3 | 4.3 | 4.0 |
| 1/2MS+IAA0.5mg·L-1 | 30 | 100 | 4.5 | 4.5 |
| 1/2MS+IAA1.0mg·L-1 | 30 | 100 | 8.6 | 8.6 |
在洋061培养中，生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果如表4所示，从表中可见，洋061基因型在1/2MS的基本培养基中，附加不同浓度的NAA、IBA、IAA，其生根率都较低，最高生根率为36.7%，平均生根率仅为22.0%。在1/4MS培养基中同时附加NAA和IBA时，洋061基因型不定芽生根率有所上升，平均生根率达到50.3%。生长在浓度为0.1mg·L-1NAA和0.2 mg·L-1IBA的培养基上的不定芽生根率最高为56.7%，不定根形成能力也最高，为1.87，具体生根图如图3所示。因此，洋061基因型的最佳生根配方为：1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1。
表4洋061生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果
| 培养基及植物生长调节剂 | 接种外植体数 | 生根率 | 平均根数（条） | 不定根形成能力 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1 | 30 | 16.7 | 1.4 | 0.23 |
| 1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1 | 30 | 20 | 4 | 0.8 |
| 1/2MS+ NAA0.2 mg·L-1 | 30 | 20 | 2 | 0.4 |
| 1/2MS+ NAA0.4 mg·L-1 | 30 | 13.3 | 2 | 0.26 |
| 1/2MS+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 20 | 4.1 | 0.82 |
| 1/2MS+IBA0.1 mg·L-1 | 30 | 26.7 | 2 | 0.53 |
| 1/2MS+IBA0.2 mg·L-1 | 30 | 20 | 5 | 1.0 |
| 1/2MS+IBA0.4 mg·L-1 | 30 | 30 | 5 | 1.5 |
| 1/2MS+IAA0.1 mg·L-1 | 30 | 36.7 | 3.5 | 1.28 |
| 1/2MS+IAA0.2 mg·L-1 | 30 | 10 | 2 | 0.2 |
| 1/2MS+IAA0.5mg·L-1 | 30 | 33.3 | 2.5 | 0.83 |
| 1/2MS+IAA1.0mg·L-1 | 30 | 16.7 | 5.4 | 0.90 |
| 1/2MS+NAA0.05mg·L-1 | 30 | 16.7 | 1.4 | 0.23 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 46.7 | 2.3 | 1.07 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 50 | 2 | 1.0 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 53.3 | 2.8 | 1.49 |
| 1/4MS+NAA0.05mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 50 | 3.4 | 1.7 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 50 | 2.6 | 1.3 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 53.3 | 2.5 | 1.33 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 56.7 | 3.3 | 1.87 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 56.7 | 2.8 | 1.59 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 46.7 | 2.7 | 1.26 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 43.3 | 2.4 | 1.04 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 53.3 | 2.9 | 1.55 |
| 1/4MS+NAA0.2mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 43.3 | 3 | 1.30 |
在洋021培养中，优化的生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果如表5所示，从表5中可见，洋021的外植体在1/4MS基本培养基附加不同浓度的NAA与IBA时，平均生根率可达59.9%。当NAA浓度为0.1 mg·L-1、IBA浓度为0.2 mg·L-1时不定芽生根率为70％，平均根数为2.8，平均不定根形成能力最强，为1.96，具体生根图如图4所示。因此，洋021基因型最佳生根配方为：1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1。
表5洋021优化的生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果
| 培养基及植物生长调节剂 | 接种外植体数 | 生根率 | 平均根数（条） | 不定根形成能力 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 46 | 2.5 | 1.15 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 56.7 | 2.4 | 1.36 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 70 | 2.8 | 1.96 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 66.7 | 2.6 | 1.73 |
在洋023培养中，优化的生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果如表6所示，从表6中可见，洋023基因型在1/4MS基本培养基附加不同浓度的NAA和IBA时，平均生根率达到81.7％。在附加NAA0.1 mg·L-1和IBA0.2 mg·L-1的培养基上，不定芽生根率达到90％，平均根数3.8，不定根形成能力为3.42，植株长势良好，具体生根图如图5所示。因此，洋023基因型的最佳生根配方为：1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1。
表6洋023优化的生根培养基及植物生长调节剂的选取情况及其对应的实验结果
| 培养基及植物生长调节剂 | 接种外植体数 | 生根率 | 平均根数（条） | 不定根形成能力 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.05mg·L-1 | 30 | 73.3 | 2.8 | 2.05 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1 | 30 | 83.3 | 2.5 | 2.08 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1 | 30 | 90 | 3.8 | 3.42 |
| 1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.4mg·L-1 | 30 | 80 | 3 | 2.4 |
实施例3
将洋061接种于1/4MS+NAA0.1mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培养基中，在培养基中添加不同浓度活性炭（表7），培养方法同实施例2，35d后观察统计结果。在接入活性炭培养基后，无菌苗长势较弱，在第26d时才发现有不定根长出。由表7可知，在添加活性炭0.02%的培养基上生根率为46.7，随活性炭浓度的增加生根率不断下降，在活性炭大于0.2%时生根率为0；而无活性炭的培养基生根率为56.7%。可知，活性炭不利于杉木不定芽生根。
表7活性炭对洋061生根的影响
| 活性炭（mg/L） | 接种外植体数 | 生根外植体数 | 生根率（%） |
| 0.2 | 15 | 7 | 46.7 |
| 0.5 | 15 | 6 | 40 |
| 1.0 | 15 | 3 | 20 |
| 2.0 | 15 | 0 | 0 |
| 5.0 | 15 | 0 | 0 |
实施例4 再生植株的驯化与移栽
实施例2的生根试管苗，移栽前一周放入自然光照下进行炼苗，逐日松开培养瓶封口膜直至最后撤去，先在培养室内松开盖子，放置2d，然后移到室内，25℃左右放置3d，洗去基部培养基，移植到基质中，用塑料布盖住，每天喷水2~3次，以保持湿度，此后的7d要注意保持一定的温度和湿度，同时又要防止因湿度过大而出现的烂根现象，14d左右揭开塑料布，保持一定的湿度，每天喷水1~2次，同时要注意透风。选用黄土、泥炭土3：1比例混合后用作移栽基质。按根的长度将试管苗分为短根（1cm以下）、中根（1～3cm）和长根（3cm以上）三个类型，每一类型取20株进行试验。将试管苗取出并洗净根部的培养基后栽入基质，保持通风及80~90%的环境湿度。定期观察，30d后统计试管苗的成活率与生长情况，具体结果如表8所示。表8中，组培得到的生根试管苗的移栽成活率在70％以上，根长在1～3cm时植株移栽效果最好，有部分新根发生，植株正常生长，茎基部有新芽抽生，证明试管苗移栽成活并开始生长，具体移栽生长图如图6所示。
表8根长对移栽成活的影响结果表
| 处理 | 根类型 | 处理株数 | 成活株数 | 根生长情况 | 植株生长情况 |
| 1 | <1cm | 20 | 14 | 伸长生长 | 生长健壮 |
| 2 | 1~3cm | 20 | 17 | 伸长生长，新根发生 | 茎基部长出新芽，生长茂盛 |
| 3 | >3cm | 20 | 12 | 新根发生，部分腐烂 | 生长正常 |
Claims (8)
1.一种杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）选取杉木优良无性系原株的树干的基部萌条为组织培养材料，接入继代增殖培养基进行继代增殖培养，诱导分化出不定芽，然后将不定芽转入MS培养基上进行伸长培养；其中，继代增殖培养基配方为3/4MS＋6BA0.3mg·L-1＋NAA0.02mg·L-1＋蔗糖3%；
（2）步骤（1）的不定芽伸长到2～3cm时，转入诱导生根培养基培养，得生根试管苗；诱导生根培养基以1/2MS或1/4MS为基本培养基，在其中添加植物生长调节剂和2%蔗糖；植物生长调节剂为IBA0.05~0.4mg·L-1、NAA0.05~0.4mg·L-1、IAA0.1~1.0mg·L-1、或IBA0.05~0.4mg·L-1与NAA0.05~0.4mg·L-1的混合；
（3）移栽生根试管苗，选用黄土、泥炭土3：1比例混合后用作移栽基质。
2.根据权利要求1所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/2MS，植物生长调节剂为IBA0.1~0.4mg·L-1或NAA0.1~0.2mg·L-1。
3.根据权利要求1所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/4MS，植物生长调节剂为IBA0.1~0.2mg·L-1或NAA0.05~0.2mg·L-1。
4.根据权利要求1所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/2MS，植物生长调节剂为IBA0.05~0.2mg·L-1与NAA0.05~0.4mg·L-1的混合。
5.根据权利要求1所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（2）中，诱导生根培养基为1/4MS，植物生长调节剂为IBA0.05~0.2mg·L-1与NAA0.05~0.4mg·L-1的混合。
6.根据权利要求1所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（3）中，在移栽生根试管苗前一周，将生根试管苗放入自然光照下进行炼苗，逐日松开培养瓶封口膜直至最后撤去。
7.根据权利要求1所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（3）中，试管苗的根长度不小于1cm。
8.根据权利要求1或7所述的杉木无性系离体生根培养方法，其特征在于：步骤（3）中，试管苗的根长度为1～3cm。
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