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CN112694431B - 超敏感荧光探针检验细菌中硝基还原酶及在细菌感染应用 - Google Patents

超敏感荧光探针检验细菌中硝基还原酶及在细菌感染应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于Cy染料的硝基还原酶激活型Cy类荧光探针分子Ⅰ及该荧光探针与氨基糖苷类化合物相连得到的特异性靶向细菌的Cy‑氨基糖苷类荧光探针Ⅱ的制备方法及应用，属于生物荧光成像领域。上述两种探针分子均能特异性检验硝基还原酶，被硝基还原酶激活而荧光增强，降低了荧光成像的背景噪音、提高了成像信噪比。与已报道的硝基还原酶检测类探针分子相比，所合成Cy‑氨基糖苷类荧光探针分子具有良好的水溶性，极快的硝基还原酶反应速率，很低的硝基还原酶检测限。特别是，到目前为止，Cy‑氨基糖苷类荧光探针是首个报道的可以区分细菌感染和低氧肿瘤细胞或肿瘤组织的荧光探针分子。

Description

超敏感荧光探针检验细菌中硝基还原酶及在细菌感染应用
技术领域：
本发明属于医药技术领域。涉及一种用于细菌感染检测并对肿瘤无影响的氨基糖苷类荧光探针，制备方法及应用。
背景内容：
医学成像，是可视化呈现人体内部结构，为临床诊断提供精准位置信息和形态学信息的技术。通过与正常的解剖生理结构比对，确认异常病变。[1-4]与病理组织可视化的传统诊断成像相比，分子成像可以实现在早期的细胞和分子水平上诊断，在组织损伤发生或是在明显的疾病症状出现前观测到。[5,6]临床诊断中主要应用的分子成像技术主要包括正电子衍射成像，单光子衍射，核磁共振和医学光学成像。在考虑到空间分辨率，时间分辨率，灵敏度和费用的情况下，每一种方法都有自身的优缺点。例如，正电子衍射成像利用放射性同位素作为示踪剂，可以获得高灵敏度，但是获取放射性核素需要用到昂贵的回旋加速器。单光子衍射，相对于正电子衍射成像费用明显降低，但空间分辨率降低而造成病灶定位困难。核磁共振具有高分辨率，低灵敏度的特点。而光学成像由于具有高灵敏度和特异性，而获得了广泛的关注。快速发展的光学成像显微镜和一系列易得的探针分子和标记物的出现，促进了在细胞，亚细胞和分子水平上对生理和病理的过程进行可视化监测。常用的探针分子和标记物包括有机分子，过渡金属复合物，镧系配合物，量子点，纳米颗粒和荧光蛋白等。
在光学成像中，光强度可以直观的反应探针的浓度和相应定位的信息。在多色成像中，不同探针的不同发射波长有不同的发光颜色。为了避免发光染料的光漂白，提高组织的穿透能力，需要增强发光染料的光稳定性，调节发射光进入近红外区域，以实现降低生物样品本身的光吸收，从而增强组织穿透能力。正常情况下，探针的荧光强度和样品的溶液浓度成比例，但是在复杂的生物体环境中，检测的准确性和精确性都会降低。这是因为荧光强度也会受到探针浓度在细胞或是生物体内的不确定性，激发光源的波动性和内源性荧光物质的荧光影响。例如，线粒体中的黄素和黄素蛋白能够在450-500nm激发，发射波长在500-600nm。脑组织中的脂质和蛋白的不同复合物，吸收波长在400-550nm，发射波长则覆盖了黄光区域并延伸到近红外区域。内源性荧光物质的吸收和发射波长覆盖了整个可见光区，导致探针的荧光信号收集受到干扰，产生波动性变化。[7]
活体体内发光成像，作为光学成像的一种，包括生物发光成像和荧光成像。生物发光成像，是在存在荧光素酶底物或是由于lux操纵子存在而不需要荧光素酶底物的情况下，荧光素酶，或是通过基因工程而被荧光素酶标记的细菌，真菌，寄生虫和小鼠能够产生发光的现象，以及绿色荧光蛋白通过光照激活，直接产生发光的现象。所有的萤光素酶都是氧化酶，需要大量的氧气才能最佳地发挥作用；甲虫萤光素酶还需要细胞内三磷酸腺苷才能发挥作用；对于需要外源荧光素酶底物的系统，还必须考虑底物的药代动力学和生物体内分布。这些都限制了其进一步的应用。[8]荧光成像可以实现对活细胞的特定细胞器和整个动物可视化成像，是一种强有力的生物研究工具，特别是具有荧光指导手术这一新兴领域的临床应用的价值。[9]荧光成像具有高灵敏度，无损快速分析和实时监测的优点。由于小分子探针具有结构可修饰性，可实现对多种生物靶点的监测，实现在原始环境下对细胞内各种酶实时监测和成像。设计不同结构的探针分子，可以实现与酶相互作用时的光谱性质显著改变，进而提高分子探针的信噪比和灵敏度。[9]
荧光成像存在的主要问题包括自发性荧光，荧光淬灭，光漂白和低的组织穿透能力。相对于可见光区(400-700nm)的荧光成像，近红外光区(700-1700nm) 的荧光成像，在减少光散射，降低生物样品的光吸收和自发性荧光的干扰方面具有明显的优势。[10]近红外光学窗可人为的分为第一近红外光学窗(700-1000nm) 和第二近红外光学窗(1000-1700nm)。然而，缺乏同时具有高量子效率和生物兼容性的第二近红外光学窗生物探针，限制了其在临床使用中的广泛认可。[11]第一近红外光学窗的荧光成像，在过去的十年时间里，在基础研究，临床前和临床应用已广泛开展。这主要得益于存在一系列方便易得的荧光分子，例如吲哚菁绿(激发波长808nm，发射波长822nm)，亚甲基蓝(激发波长665nm，发射波长686nm)，这两种荧光分子已经被美国食品药品管理局批准用于临床。[10]
氨基糖苷类抗生素是一类非常重要的抗生素，已在临床应用了几十年的时间。如新霉素，庆大霉素，卡那霉素，妥布霉素，阿米卡星等。本类药物抗菌谱广，对需氧革兰氏阴性杆菌作用较强，如大肠杆菌，结核杆菌，布氏杆菌，沙门氏菌等。对革兰氏阳性菌除金黄色葡萄球菌及其耐药菌外作用较弱，对厌氧菌无效。氨基糖苷类药物可以透过细菌细胞外膜进入细菌细胞内，主要作用于细菌体内的核糖体，多环节抑制细菌蛋白质的合成，从而起到抗菌的作用。而这类药物产生耐药性的机制主要是通过细胞外膜通透性的改变或者特异性细胞外膜运输系统的改变，导致药物分子无法进入细胞，从而使其在细胞内达不到足够的浓度而降低药物的效力。近年来，随着耐药性问题的出现，越来越多的科学家开始研究新型的氨基糖苷类抗生素用于治疗。有科学家报道了一类方法，通过在氨基糖苷类抗生素上连接带有正电荷的脂质体(cationic lipids)[12]形成偶联物，增加了细菌细胞膜对氨基糖苷类化合物的转运而增加了对其的摄取从而提高了抗菌活性及抗耐药菌的能力，并且增强了对革兰氏阳性菌的活性，扩大了抗菌范围[13]。
迄今已有多种荧光染料用于体外和活体动物实验的研究。其中吲哚菁绿 (ICG)是第一种由美国食品药品管理局批准用于人体的具有代表性的有机染料。之后许多研究小组合成了应用于检测诊断的ICG衍生物、Cy系列菁染料、IRDye 系列菁染料。然而，大多数染料缺乏对靶标的特异性。因此，就需要把它们标记到一些特异的靶向分子上，如抗生素。
硝基还原酶存在于细菌，酵母，锥体虫和低氧肿瘤中。硝基还原酶可应用于低氧肿瘤的监测。同时，由于硝基还原酶广泛存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中，针对硝基还原酶的成像可用于细菌感染的确定。[14-17]芳香硝基化合物有着相对高的硝基还原酶反应活性，主要是由于二者之间的π-π堆积作用及氢键等相互作用。硝基还原酶可以将相应的芳香硝基化合物还原为芳香胺或是芳香羟胺，通过以下两种机制中一种。第一种机制，I型线粒体硝基还原酶可以耐受氧，初始提供两个电子还原芳香硝基化合物为芳香亚硝基化合物，随后完全转化为芳香胺基化合物。第二种机制，在II型线粒体硝基还原酶，初始提供一个电子还原芳香硝基化合物为芳香硝基自由基负离子，在低氧条件下可以完全转化为芳香胺基化合物，如果氧气浓度过高，芳香硝基自由基负离子则被氧化为初始原料芳香硝基化合物。[18]硝基还原酶在人类细胞的活性只是被报道存在于低氧肿瘤中，从哺乳类动物肝细胞分离的线粒体成分也有硝基还原酶的活性，其可能存在I 型线粒体硝基还原酶。[19-21]通过荧光的方法检测在低氧肿瘤组织的硝基还原酶活性，推测可能为II型线粒体硝基还原酶。硝基还原酶还原机理，根据底物结构不同又可以分为两类。第一类是芳香硝基化合物直接还原为芳香胺基化合物。第二类，是在第一类的基础上，得到芳香胺基化合物后，电子重排且诱导相关碳氧键断裂得到新的化合物。
Figure BDA0002243576980000041
根据上述策略，本发明设计合成一类新颖的荧光分子探针，然后基于氨基糖苷类药物，我们在其上连接一个荧光分子得到氨基糖苷类荧光探针。这两种探针是可以特异性地被硝基还原酶激活的近红外探针分子，具有很好的水溶性，在很大程度上避免花氰染料分子在水溶液中的聚集诱导淬灭问题。同时，该探针分子在不同pH值条件下表现出很好的稳定性。在对硝基还原酶的监测过程中，表现出来很好的特异性，高灵敏度和超快反应速率。同时，可以靶向细菌感染部位，但对同样含有硝基还原酶的低氧肿瘤细胞却没有影响。
荧光成像技术具有无创、可视化、靶向性及灵敏度高等优点，它在精确定位细菌感染、鉴别细菌种类、区分细菌感染和无菌炎症及监测疗效方面有着广泛的临床应用价值，为应对细菌感染及其耐药性问题，打下了坚实的基础。而基于抗生素的荧光分子探针的研究将成为这一技术的关键所在。随着荧光成像技术的发展及相应的成像设备应用于临床，基于抗生素的荧光分子探针应用于细菌感染的检测将具有极大的临床应用价值。
发明内容：
本发明解决的技术问题是提供了Cy类荧光探针化合物或其可接受的盐和氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐、其制备方法以及其应用。
为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了如结构I所示的Cy类荧光探针化合物或其可接受的盐：
Figure BDA0002243576980000051
其中：R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、 R16、R17、R18、R19独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br, I，硝基，C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基，C1～6烷氧基，C1～6烷氨基，C1～6 羧酸，C1～6羧酸甲酯，C1～6烷基酰胺；或R1与R2，R2与R3，R3与R4，R6与 R7，R14与R15，R16与R17，R17与R18，R18与R19相邻位置以苯环，萘环，蒽环，菲环形式相连；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R20、R21、R22、R23独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br, I，硝基或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4, C5,C6；
R4，R6与R7，R14与R15，R16与R17，R17与R18，R18与R19相邻位置以苯环，萘环，蒽环，菲环形式相连；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R20、R21、R22、R23独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br, I，硝基或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4, C5,C6；
R24选自
Figure BDA0002243576980000052
乙烯基，乙炔基，苯基；
R25选自硝基取代苯、硝基取代苯酚、硝基取代卤代苯、硝基取代甲苯、硝基取代萘、硝基取代蒽、硝基取代
Figure BDA0002243576980000053
硝基取代苝、硝基取代苯并芘、硝基取代呋喃、硝基取代噻吩、硝基取代吡咯、硝基取代咪唑、硝基取代吡唑、硝基取代噻唑、硝基取代恶唑、硝基取代吡啶、硝基取代嘧啶、硝基取代哒嗪、硝基取代吡嗪、硝基取代嘌呤、硝基取代喹啉、硝基取代异喹啉、硝基取代吲哚的磺酰基，亚磺酰基，羰基或氧化磷基；
m表示1,2,3,4；
n表示1,2,3,4；
p表示0,1,2,3,4,5,6,7,8,9；
X表示F,Cl,Br,I；
L1选自C1～9烷基，C1～9烯基，C1～9炔基，所述C1～9选自C1,C2,C3,C4,C5, C6,C7,C8,C9；
L2选自C1～20烷基，C1～20烯基，C1～20炔基，所述的C1～20选自C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,C15,C16,C17,C18,C19,C20；
R26选自
Figure BDA0002243576980000061
R27选自甲基，羟基，氨基，甲醛基，甲酸，
Figure BDA0002243576980000062
Figure BDA0002243576980000063
如结构II所示的Cy类荧光探针化合物与靶向基团氨基糖苷类化合物相连得到Cy-氨基糖苷类荧光探针化合物或其可接受的盐：
Figure BDA0002243576980000064
其中：靶向基团中所述的氨基糖苷类化合物选自新霉素，链霉素，庆大霉素，卡那霉素，妥布霉素，阿米卡星。
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、 R17、R18、R19独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，硝基，C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基，C1～6烷氧基，C1～6烷氨基，C1～6 羧酸，C1～6羧酸甲酯，C1～6烷基酰胺；或R1与R2，R2与R3，R3与R4，R6与R7，R14与R15，R16与R17，R17与R18，R18与R19相邻位置以苯环，萘环，蒽环，菲环形式相连；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R20、R21、R22、R23独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br, I，硝基或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4, C5,C6；
R24选自
Figure BDA0002243576980000071
乙烯基，乙炔基，苯基；
R25选自硝基取代苯、硝基取代苯酚、硝基取代卤代苯、硝基取代甲苯、硝基取代萘、硝基取代蒽、硝基取代
Figure BDA0002243576980000073
硝基取代苝、硝基取代苯并芘、硝基取代呋喃、硝基取代噻吩、硝基取代吡咯、硝基取代咪唑、硝基取代吡唑、硝基取代噻唑、硝基取代恶唑、硝基取代吡啶、硝基取代嘧啶、硝基取代哒嗪、硝基取代吡嗪、硝基取代嘌呤、硝基取代喹啉、硝基取代异喹啉、硝基取代吲哚的磺酰基，亚磺酰基，羰基或氧化磷基；
m表示1,2,3,4；
n表示1,2,3,4；
p表示0,1,2,3,4,5,6,7,8,9；
X表示F,Cl,Br,I；
L1选自C1～9烷基，C1～9烯基，C1～9炔基，所述C1～9选自C1,C2,C3,C4,C5, C6,C7,C8,C9；
L2选自C1～20烷基，C1～20烯基，C1～20炔基，所述的C1～20选自C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,C15,C16,C17,C18,C19,C20；
R26，R28独立选自
Figure BDA0002243576980000072
优选的Cy类荧光探针化合物和Cy-氨基糖苷类荧光探针化合物的除氨基糖苷类部分选自Cy3,Cy3.3,Cy5,Cy5.5,Cy7,Cy7.5，结构如下：
Figure BDA0002243576980000081
Cy类荧光探针化合物或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针化合物或其可接受的盐，也包括以下化合物：
Figure BDA0002243576980000082
Cy类荧光探针化合物或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针化合物或其可接受的盐，其特征在于，所述的可接受的盐为所述化合物的有机酸盐或无机酸盐，所述的有机酸为三氟乙酸，草酸，琥珀酸，醋酸，丁二酸，马来酸，富马酸或酒石酸；无机酸为盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸或磷酸。
本发明技术方案的第二方面是提供了Cy7类荧光探针或其可接受的盐和 Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐的制备方法：
Figure BDA0002243576980000091
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、 R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28、L1、L2的定义同上述结构I和II；
Ra选自
Figure BDA0002243576980000092
Rb选自氨基取代苯、氨基取代苯酚、氨基取代卤代苯、氨基取代甲苯、氨基取代萘、氨基取代蒽、氨基取代
Figure BDA0002243576980000102
氨基取代苝、氨基取代苯并芘、氨基取代呋喃、氨基取代噻吩、氨基取代吡咯、氨基取代咪唑、氨基取代吡唑、氨基取代噻唑、氨基取代恶唑、氨基取代吡啶、氨基取代嘧啶、氨基取代哒嗪、氨基取代吡嗪、氨基取代嘌呤、氨基取代喹啉、氨基取代异喹啉、氨基取代吲哚的磺酰基，亚磺酰基，羰基或氧化磷基；
步骤a：加入
Figure BDA0002243576980000101
甲苯为溶剂,回流,反应24小时；
步骤b：加入化合物4，醋酸酐为溶剂，70℃反应3小时；加入化合物4，无水乙醇为溶剂，80℃反应6小时；
步骤c：加入氢氧负离子盐，氨基钠和硫醇钠，N,N-二甲基甲酰胺作溶剂,80℃, 反应2小时；
步骤d：加入硝基取代的芳香磺酰卤代物，芳香亚磺酰卤代物，芳香羰基卤代物，或芳香氧化磷卤代物，二氯甲烷为溶剂,室温,反应1小时；
步骤e：加入酰胺，酯，亚磺酰胺，亚磺酰酯，磺酰胺，磺酰酯，氧化磷脂的缩合剂或偶联剂，碱，二氯甲烷为溶剂,回流,室温,反应6小时；
步骤f：加入硝基取代的芳香磺酰卤代物，芳香亚磺酰卤代物，芳香羰基卤代物，或芳香氧化磷卤代物，二氯甲烷做溶剂，室温,反应1小时；加入三氟乙酸，0℃, 反应10分钟；
步骤g：加入叔丁氧羰基保护的氨基取代的芳香磺酰卤代物，芳香亚磺酰卤代物，芳香羰基卤代物或芳香氧化磷卤代物，二氯甲烷做溶剂，室温,反应1小时；加入三氟乙酸，0℃,反应10分钟。
本发明技术方案的第三方面是提供第一方面所述Cy7类荧光探针或其可接受的盐和Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐在分子水平对硝基还原酶特异性检测中的应用。
本发明技术方案的第四方面是提供第一方面所述Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐在细胞或活体水平对细菌感染靶向检测中的应用，其中，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
本发明技术方案的第五方面是提供第一方面所述Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐可特异性检测细菌而低氧肿瘤细胞和肿瘤组织不受影响。
本发明技术方案的第六方面还提供了第一方面所述Cy7类荧光探针或其可接受的盐和Cy7-氨基糖苷类荧光探针及其可接受的盐在制备诊断试剂中的应用。
有益技术效果
Cy7类荧光探针或其可接受的盐可以检测硝基还原酶，可以被硝基还原酶激活而荧光强度明显增强。
Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐具有水溶性，可以检测硝基还原酶，检测限为0.65ng/mL。被硝基还原酶激活而荧光强度明显增强，可达8倍。且在不同pH值的溶液中能够长时间稳定存在。
Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐对硝基还原酶具有特异性识别作用，同时与硝基还原酶反应速率特别快，0.2μg/mL硝基还原酶可在500μMβ- 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物存在下，1分钟内将10μM的Cy7-氨基糖苷类荧光探针及其可接受的盐反应完全，适用于对细菌及时快速诊断。
Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐可以特异性地作用于细菌感染部位，但对含有硝基还原酶的低氧肿瘤细胞没有影响，可以区分细菌感染部位和低氧肿瘤组织。
Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐是可以被硝基还原酶激活的智能型近红外探针分子，可明显降低背景信号。小动物活体实验中，荧光信号在30 分钟达到最大，随后降低。在小动物活体成像试验中表现出了很好的时间分辨率和空间分辨率。
通过对细胞的生长抑制的检测，证明了合成了Cy7-氨基糖苷类荧光探针或其可接受的盐，24小时内，在50μM的浓度下对细胞无抑制作用，即毒性低。
附图说明
图1表示探针1,2及探针2的硝基还原酶还原产物探针3的吸收和发射光谱。
图2表示探针2(10μmol/L)在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物存在下，立即被硝基还原酶(0.25μg/L)还原，而荧光强度明显增强，可达8倍。
图3表示探针分子探针2选择性的被硝基还原酶还原。
图4表示探针2和3在24小时内，50μM浓度下对HepG 2细胞没有毒性。
图5表示探针2具有很好的酶动力学性质，对硝基还原酶来说，米氏常数为1.88 μM，初始最大反应速率为0.178μM/s。
图6表示本探针2具有很低的硝基还原酶检测限，为0.65ng/mL。
图7表示探针2在HepG 2细胞中的共定位荧光成像中，未能在低氧肿瘤细胞中监测到成像结果。在金黄色葡萄球菌中，成像效果很好。
图8表示本发明用于测定探针2在同时接种CT26肿瘤细胞和金黄色葡萄球菌的小动物成像中，能够选择性的靶向细菌成像，而肿瘤不受影响。且在30分钟荧光强度达到最大，随后降低。说明探针2对细菌成像具有很好的时间和空间分辨率。
具体实施方式：
探针分子1,2,3的合成：
Figure BDA0002243576980000121
制备例1,化合物2的制备
将底物1(10g，62.8mmol)均匀分散到甲苯溶剂(16mL)中，加入6-溴己酸(12.2g,62.8mmol)后，反应体系回流24小时。反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂，残余物用依次无水乙醚(3×32mL)和二氯甲烷(3×32mL)洗涤，产物干燥后直接用于下一步。化合物2为白色固体，9.7g，产率43.5％。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ12.00(s,1H),δ8.07–7.95(m,1H),7.91–7.80(m,1H),7.67– 7.56(m,2H),4.47(t,J＝7.7Hz,2H),2.87(s,3H),2.22(t,J＝7.3Hz,2H),1.84(p,J ＝7.8Hz,2H),1.59–1.51(m,8H),1.42(p,J＝8.0,7.4Hz,2H)；13C NMR(125MHz, DMSO-d6)δ196.99,174.80,142.33,141.52,129.84,129.40,124.00,115.99,54.63, 47.93,33.83,27.42,25.86,24.49,22.47,14.59；HRMS(ESI):m/z理论值为C17H24NO2 +:274.1802[M]+；实测值为274.1802。
制备例2,化合物5的制备
将底物4(3.1g，11.6mmol)的醋酸酐溶剂(16.5mL)室温条件下逐滴加入到底物3(2.0g，11.6mmol)的醋酸酐的溶剂(16.5mL)中。反应体系在70 ℃条件下反应3小时后，反应体系冷却到室温，减压蒸馏除去溶剂。反应混合物用无水乙醇(33mL)稀释，依次加入化合物2(4.9g，13.9mmol)和醋酸钠 (2.85g，34.8mmol)。反应体系在80℃条件下反应6小时后，减压蒸馏除去溶剂，残余物用二氯甲烷稀释，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。残余物用用中压柱色谱纯化(6％MeOH/CH2Cl2)，得到产物5为绿色固体，2.9g，产率为38％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝14.1Hz,1H),8.32(d,J＝ 13.9Hz,1H),7.44–7.33(m,4H),7.25–7.17(m,2H),7.13(d,J＝8.0Hz,1H),6.26 (d,J＝14.1Hz,1H),6.13(d,J＝14.0Hz,1H),4.20–4.12(m,4H),2.74(t,J＝6.1 Hz,2H),2.70(t,J＝6.0Hz,2H),2.60(t,J＝7.2Hz,2H),2.00(p,J＝6.2Hz,2H), 1.87(p,J＝7.8Hz,2H),1.79(p,J＝7.3Hz,2H),1.71(s,12H),1.57(q,J＝7.5,7.0 Hz,2H),1.44(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ176.01,172.97, 171.33,150.88,145.20,144.10,142.09,141.95,141.21,141.12,129.10,128.92, 128.06,127.62,125.69,125.15,122.39,122.33,111.27,110.47,101.93,100.42, 49.59,49.28,44.75,39.62,34.73,28.25,28.22,27.01,26.71,26.65,26.31,24.64, 20.79,12.43；HRMS(ESI):m/z理论值为C38H46ClN2O2 +:597.3242[M]+；实测值为597.3242。
制备例3,化合物6的制备
氩气保护条件下，将底物5(200mg，0.295mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(7.9mL)后，缓慢加入醋酸钠(73mg，0.885mmol)。反应体系在80℃条件下反应2小时。反应完毕后，反应体系用二氯甲烷(40mL)稀释，依次用水(2×14mL)和饱和食盐水(3×14mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，残余物用中压柱色谱纯化(2％MeOH/CH2Cl2)，得到产物6为红色固体，100mg，产率为59％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.20(dd,J＝13.4,5.6Hz, 2H),7.18(p,J＝6.6Hz,4H),6.91(q,J＝7.1Hz,2H),6.68(t,J＝7.0Hz,2H),5.48 (dd,J＝13.3,6.8Hz,2H),3.74(q,J＝7.2Hz,2H),3.68(t,J＝7.5Hz,2H),2.61(q,J ＝5.3Hz,4H),2.40(t,J＝7.4Hz,2H),1.87(p,J＝6.3Hz,2H),1.74(t,J＝7.5Hz, 4H),1.67(d,J＝3.5Hz,12H),1.54–1.43(m,2H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ186.58,177.69,162.79,162.45,144.08,143.62,139.87, 139.72,133.87,133.72,127.71,126.43,126.30,121.83,120.68,106.78,106.59, 92.69,92.36,53.50,46.66,42.41,37.11,34.15,30.59,28.72,28.66,26.71,26.03, 25.81,24.62,22.49,11.18。HRMS(ESI):m/z理论值为C38H47N2O3 +:579.3581 [M+H]+；实测值为579.3581。
制备例4,探针1的制备
氩气保护下，将底物6(40mg，0.069mmol)溶于二氯甲烷(1.7mL)中，缓慢加入对硝基苯磺酰氯(38mg，0.173mmol)。反应体系在室温条件下反应 1小时。反应结束后，加入无水甲醇(2uL)淬灭反应。减压浓缩除去溶剂，残余物用中压柱色谱纯化(4％MeOH/CH2Cl2)，得到产物为绿色固体探针1，26 mg，产率为49％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.46(d,J＝8.4Hz,2H),8.23(d,J ＝8.4Hz,2H),7.79(dd,J＝14.1,6.8Hz,2H),7.36(t,J＝7.8Hz,2H),7.32(t,J＝6.6 Hz,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,2H),7.13(t,J＝8.3Hz,2H),6.06(dd,J＝20.6,14.0Hz,2H),4.12(q,J＝7.3Hz,2H),4.07(d,J＝7.7Hz,2H),2.57(q,J＝6.9Hz,3H),2.41 (t,J＝7.1Hz,2H),1.82(q,J＝6.9Hz,4H),1.70(h,J＝9.2Hz,3H),1.53(s,6H), 1.51(s,8H),1.40(t,J＝7.4Hz,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.53,171.73, 157.13,152.98,151.46,148.03,141.93,141.65,141.24,141.16,141.07,140.83, 140.54,130.10,129.04,127.67,125.82,125.64,124.87,123.73,123.29,122.38, 111.24,110.78,101.64,100.86,49.40,49.33,44.56,39.67,34.30,30.65,27.66,27.62, 27.00,26.31,25.48,24.53,20.36,19.26,12.37。HRMS(ESI):m/z理论值为 C44H50N3O7S+:764.3364[M]+；实测值为764.3368。
制备例5,探针2,3的制备
将底物5(68mg，0.098mmol)和底物7(100mg，0.082mmol)溶解于二氯甲烷溶液(1.0mL)后，依次加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(62mg，0.164mmol)和N,N'-二异丙基乙胺(32mg，0.246mmol)，室温搅拌条件下反应。薄层层析板检测反应完全后，反应体系用二氯甲烷(3.0 mL)稀释，依次用水(4.0mL)和饱和食盐水(4.0mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，残余物用中压柱色谱纯化(3％MeOH/CH2Cl2)后，直接用于下一步。
氩气保护下，将上一步产物8(60mg，0.034mmol)溶于二氯甲烷(680uL) 中，缓慢加入对硝基苯磺酰氯(18.7mg，0.085mmol)。反应体系在室温条件下反应1小时。反应结束后，加入无水甲醇(2uL)淬灭反应。减压浓缩除去溶剂，残余物中压柱色谱纯化后直接用于下一步。
氩气保护，0℃条件下，上步产物中逐滴加入三氟乙酸(680uL)。反应体系在0℃条件下继续反应10分钟。反应结束后，直接减压浓缩，残余物直接高压色谱柱纯化，得到绿色固体产物探针2，24mg,三步产率为12％。1H NMR(500 MHz,D2O)δ8.34–8.17(m,2H),7.95–7.78(m,2H),7.57–7.36(m,3H),7.23(d, J＝24.2Hz,2H),7.10(s,3H),6.89(s,3H),6.75(s,1H),5.90(s,1H),5.38–5.30(m, 1H),5.22(s,1H),4.31(s,1H),4.29–4.19(m,3H),4.17(s,3H),4.11–4.01(m,3H), 4.00–3.94(m,2H),3.95–3.83(m,5H),3.76(s,2H),3.70(t,J＝9.5Hz,2H),3.54 (s,2H),3.53–3.41(m,6H),3.41–3.28(m,2H),3.27–3.16(m,2H),2.45(s,1H), 2.14(s,6H),1.89(q,J＝13.1Hz,2H),1.61–1.51(m,2H),1.48–1.36(m,7H),1.24 (s,5H),1.22–1.13(m,13H),1.13–0.99(m,9H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ 176.67,171.36,167.68,167.62,166.76,164.94,162.92,162.64,162.35,162.07, 155.91,151.19,141.69,141.36,140.77,140.54,139.35,139.22,132.37,130.96, 130.61,129.71,129.60,129.52,128.96,128.56,124.70,122.82,121.38,119.87, 117.54,115.22,112.89,109.02,100.94,98.46,95.78,94.91,91.33,84.93,82.73, 80.88,77.44,75.04,73.42,72.25,70.42,70.24,70.12,69.85,68.12,67.53,67.42, 66.58,64.82,53.24,50.84,49.52,48.65,48.53,41.08,40.45,40.05,38.72,35.58, 30.43,27.87,26.91,25.94,25.04,18.93,17.95,16.65,13.31,11.50；HRMS(ESI): m/z理论值为C67H95N10O18S+:1359.6541[M]+；实测值为1359.6548。
氩气保护下，将产物8(60mg，0.034mmol)溶于二氯甲烷(680uL)中，缓慢加入叔丁基氧羰基保护的对氨基苯磺酰氯(24.7mg，0.085mmol)。反应体系在室温条件下反应1小时。反应结束后，加入无水甲醇(2uL)淬灭反应。减压浓缩除去溶剂，残余物中压柱色谱纯化后直接用于下一步。
氩气保护，0℃条件下，上步产物中逐滴加入三氟乙酸(680uL)。反应体系在0℃条件下继续反应10分钟。反应结束后，直接减压浓缩，残余物直接高压色谱柱纯化，得到绿色固体产物探针3，21mg，三步产率为11.5％。1H NMR (500MHz,D2O)δ8.34–8.17(m,2H),7.95–7.78(m,2H),7.57–7.36(m,3H), 7.23(d,J＝24.2Hz,2H),7.10(s,3H),6.89(s,3H),6.75(s,1H),5.90(s,1H),5.38– 5.30(m,1H),5.22(s,1H),4.31(s,1H),4.29–4.19(m,3H),4.17(s,3H),4.11–4.01 (m,3H),4.00–3.94(m,2H),3.95–3.83(m,5H),3.76(s,2H),3.70(t,J＝9.5Hz, 2H),3.54(s,2H),3.53–3.41(m,6H),3.41–3.28(m,2H),3.27–3.16(m,2H),2.45(s,1H),2.14(s,6H),1.89(q,J＝13.1Hz,2H),1.61–1.51(m,2H),1.48–1.36(m, 7H),1.24(s,5H),1.22–1.13(m,13H),1.13–0.99(m,9H)；13C NMR(125MHz, D2O)δ176.67,171.36,167.68,167.62,166.76,164.94,162.92,162.64,162.35, 162.07,155.91,151.19,141.69,141.36,140.77,140.54,139.35,139.22,132.37, 130.96,130.61,129.71,129.60,129.52,128.96,128.56,124.70,122.82,121.38, 119.87,117.54,115.22,112.89,109.02,100.94,98.46,95.78,94.91,91.33,84.93, 82.73,80.88,77.44,75.04,73.42,72.25,70.42,70.24,70.12,69.85,68.12,67.53, 67.42,66.58,64.82,53.24,50.84,49.52,48.65,48.53,41.08,40.45,40.05,38.72, 35.58,30.43,27.87,26.91,25.94,25.04,18.93,17.95,16.65,13.31,11.50；HRMS (ESI):m/z理论值为C67H95N10O18S+:1359.6541[M]+；实测值为1359.6548。
药理实验
实验例1：探针1，2和3的吸收发射光谱测定
将探针分子探针1，2和3溶于0.05M三羟甲基氨基甲烷溶液(pH＝7.4，含 1.5％二甲基亚砜)，酶标仪测定化合物的吸收和正常发射光谱。见图1。
实验例2：探针2被硝基还原酶还原实验
将探针2溶于0.05M三羟甲基氨基甲烷溶液(pH＝7.4，含1.5％二甲基亚砜)，依次加入β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物(500μM)和硝基还原酶(0.25 μg/L)，立即监测化合物的发射光谱(激发波长750nm)。探针2(10μmol/L) 立即被硝基还原酶(0.25μg/L)还原，荧光强度明显增强，可达8倍。见图2。
实验例3：探针2可以选择性的被硝基还原酶还原实验。
将探针2溶于0.05M三羟甲基氨基甲烷溶液(pH＝7.4，含1.5％二甲基亚砜)，在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物(500μM)存在下，分别加入氯化钠(50mM)，氯化钾(50mM)，氯化钙(50mM)，氯化镁(50mM)，维生素C(1mM)，半胱氨酸(1mM)，谷胱甘肽(1mM)，次氯酸钠(1mM)， DL-高半胱氨酸(1mM)，二硫苏糖醇(1mM)，葡萄糖(10mM)，双氧水 (1mM)，精氨酸(1mM)，硝基还原酶(0.25μg/L)在37度水浴条件下反应1小时后测定化合物的发射光谱(激发波长750nm)。说明探针2可以特异性的被硝基还原酶还原。见图3。
实验例4：探针2在50μmol/L浓度下对HepG 2细胞没有毒性。
采用MTS法测定细胞存活率。设一组实验组和九组对照组。将96孔板中贴壁的细胞，依次用浓度为0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.6μM，3.2μM，6.25μM， 12.5μM，25μM和50μM的探针2处理，37℃、5％CO2条件下分别培养24h 后，每孔加入20μL MTS，然后37℃、5％CO2培养4h，酶标仪上测每组的吸收OD值，波长设为490nm。根据各孔OD值，通过公式计算细胞存活率。公式如下：细胞存活率(％)＝(实验组OD/对照组OD)×100％。探针2在50μM浓度下未表现出对HepG 2细胞毒性，说明探针2具有低细胞毒性。见图4。
实验例5：探针2酶动力学性质实验。
将探针2(3μM,4μM,5μM,6μM,7μM和8μM)溶于0.05M三羟甲基氨基甲烷溶液(pH＝7.4，含1.5％二甲基亚砜)，在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物(500μM)存在下，硝基还原酶(0.25μg/L)加入后即刻测定化合物的发射光谱随时间的变化(激发波长750nm，发射波长800nm)。根据米氏方程 V＝Vmax[probe]/(Km+[probe])(V代表最大反应速率,[probe]代表探针浓度, Km代表米氏常数)，计算得到表观米氏常数和初始最大反应速率分别为11.88 μM和0.178μM/s。见图5。
实验例6：表示本探针2酶最低检测线实验
将探针2溶于0.05M三羟甲基氨基甲烷溶液(pH＝7.4，含1.5％二甲基亚砜)，在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物(500μM)存在下，硝基还原酶(0.06, 0.05,0.04,0.03,0.02,0.01和0.005μg/L)加入后即刻测定化合物的发射光谱(激发波长750nm，最大发射波长800nm)。根据线性方程y＝64795C(μg/mL)+ 1875.1(R2＝0.9945).酶检测限(3δ/k，δ代表11个对照样品的标准差，k代表线性方程的斜率)计算为0.65ng/mL。说明探针2具有很低的硝基还原酶检测限。见图6。
实验例7：表示探针2在金黄色葡萄球菌(ATCC29213)和HepG 2细胞中的共聚集荧光成像
细菌共聚焦成像：将探针2(10μM)与金黄色葡萄球菌在37摄氏度条件下孵育1小时，然后用Hoechst 33342在37摄氏度条件下染色0.5小时。磷酸缓冲液洗涤3次后，进行细胞成像。比例尺为8μm。低氧肿瘤细胞共定位成像：HepG2 细胞在1％氧气浓度下培养12小时后，和探针2(10μM)在正常的氧气条件下孵育30分钟，然后用Hoechst 33342在37摄氏度条件下染色0.5小时。磷酸缓冲液洗涤3次后，进行细胞成像。比例尺为25μm。在金黄色葡萄球菌和HepG 2 细胞成像中，Hoechst 33342用于细胞核染色，激发波长为405nm，发射波长收集范围为460±30nm。含探针的八孔板选用670nm作为激发波长，发射波长收集范围为770±30nm。说明探针2应用在细菌细胞中具有很好的成像效果，但是在低氧肿瘤细胞中却没有效果。见图7。
实验例8：表示探针2在小动物活体成像应用。
将6-8周，平均体重20克的BALB/c小鼠，左后肢末端皮下注射CT26细胞悬浮液(200μL,大约2×106个细胞)。培养一周后，在右后肢皮下分别注射金黄色葡萄球菌(50μL，光密度(测定波长600nm)＝1)。随后尾静脉立即注射探针2(100μL,20μM)。分别在0h，0.5h，1h，2h，4h和6h进行小动物活体成像监测(激发波长745nm，发射波长820nm)。结果表明，探针2可以用于特异性靶向细菌，而对肿瘤细胞没有影响，且在30分钟荧光强度达到最大，随后降低。说明探针2对细菌成像具有很好的时间和空间分辨率。见图8。
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Claims (6)

1.以下结构所示的化合物Cy类荧光探针1或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针2或其可接受的盐，
Figure FDA0003739388100000011
2.根据权利要求1的化合物Cy类荧光探针1或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针2或其可接受的盐，所述的可接受的盐为所述化合物的有机酸盐或无机酸盐，所述的有机酸为三氟乙酸，草酸，琥珀酸，醋酸，丁二酸，马来酸，富马酸或酒石酸；无机酸为盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸或磷酸。
3.权利要求1的化合物Cy类荧光探针1或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针2或其可接受的盐在制备分子水平对硝基还原酶特异性检测试剂中的应用。
4.权利要求1的化合物Cy-氨基糖苷类荧光探针1或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针2或其可接受的盐在制备细胞或活体水平对细菌感染靶向检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4的应用，所述的细菌选自革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
6.权利要求1的化合物Cy类荧光探针1或其可接受的盐和Cy-氨基糖苷类荧光探针2或其可接受的盐在制备诊断试剂中的应用。
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