CN112575101B

CN112575101B - 与西葫芦prsv-w病毒病抗性相关的分子标记及其应用

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Publication number: CN112575101B
Application number: CN201910933494.1A
Authority: CN
Inventors: 张国裕; 李海真; 张帆; 田佳星; 贾长才
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: CN112575101A

Abstract

本发明涉及一种与西葫芦PRSV‑W病毒病抗性相关的分子标记及其应用。本发明所提供的西葫芦PRSV‑W病毒病分子标记，为以西葫芦的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1的第39位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第54位下游特异结合的单链DNA。实验证明，可以利用鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV‑W病毒病抗性性状的引物对A1和西葫芦PRSV‑W病毒病分子标记鉴定西葫芦的PRSV‑W病毒病的抗性情况。

Description

与西葫芦PRSV-W病毒病抗性相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种与西葫芦PRSV-W病毒病抗性相关的分子标记及其应用。

背景技术

西葫芦(Cucurbita pepoL.)是我国重要的瓜类蔬菜，栽培面积具有逐年扩大的趋势，特别是保护地栽培面积目前仅次于黄瓜，已成为农民增收、农业结构调整的重要种植作物。

番木瓜环斑病毒西瓜株系(PRSV-W)是危害西葫芦生产的主要病毒病之一，田间发病普遍，危害严重。西葫芦植株感染PRSV-W病毒病后叶片呈现花叶、皱缩卷曲等症状，后期严重可导致植株矮缩，果实表面瘤状凸凹不平、果肉僵硬且味苦涩等症状，使果实失去商品价值，可造成40％以上的产量损失，严重威胁西葫芦的安全生产。

目前还没有防治PRSV-W病毒病的有效试剂和措施，田间生产中主要依靠防治蚜虫及时拔除掩埋发病植株来控制降低病毒病的传播与危害。培育和推广抗病品种是减少病毒病危害最为经济、安全、有效的措施。但目前，由于通过人工接种进行抗性鉴定存在操作繁琐、性状鉴定准确性差、易于杂染其它病毒致使育种中途选择失败等问题，导致抗性性状转育困难，抗病育种效率低、周期长、易失败等问题。与抗病基因紧密连锁的分子标记可以提高选择的准确性、加速抗病育种进程，是分子标记辅助选择育种的必要条件。但目前国内外还没有可实际利用的与西葫芦PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记的研究报道。因此，开发与葫芦PRSV-W抗病基因紧密连锁的分子标记，对于提高西葫芦抗病育种效率，拓展抗病基因应用范围，培育抗病新品种，保障西葫芦产业的健康发展具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何鉴定西葫芦的PRSV-W病毒病抗性性状。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了西葫芦PRSV-W病毒病分子标记。

本发明所提供的与西葫芦PRSV-W病毒病抗性相关的分子标记，为以西葫芦的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行扩增得到的DNA分子；所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第39位上游特异结合的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第54位下游特异结合的单链DNA。

上述西葫芦分子标记的多态性可为西葫芦基因组中对应于SEQ ID No.1第39-54位为SEQ ID No.1第39-54位或缺失SEQ ID No.1第39-54位。

上述西葫芦分子标记中，所述P1可为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2可为与SEQ ID No.1的第144-162位反向互补的单链DNA。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定西葫芦基因型的方法。

本发明所提供的鉴定西葫芦基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法为如下Ⅰ或Ⅱ：

Ⅰ、包括如下K1)和K2)：

K1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；

K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定西葫芦基因型：

所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有一条不含有SEQ IDNo.1的第39-54位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQ IDNo.1的第39-54位所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为SS基因型；

Ⅱ、包括如下L1)和L2)：

L1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)下述L21)或L22)：

L21)检测步骤L1)得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定西葫芦基因型：

所述PCR产物含有162bp和146bp的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有162bp的DNA片段、不含有146bp的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为SS基因型；所述PCR产物不含有162bp的DNA片段、含有146bp的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；

L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定西葫芦基因型：

所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测西葫芦的基因型为SS基因型。

上述鉴定西葫芦基因型的方法中，进行所述PCR扩增的体系可含有：10×buffer，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs，TaqDNA聚合酶，所述P1，所述P2，待测西葫芦基因组DNA。所述体系中dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均可为0.05mM，SEQ ID No.1和2所示单链DNA的终浓度均可为0.2μM，待测西葫芦基因组DNA的浓度可为30ng/μL。

进行所述PCR扩增的反应条件可为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。

上述鉴定西葫芦基因型的方法中，所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述Taq DNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。

上述鉴定西葫芦基因型的方法中，所述RR基因型西葫芦和所述RS基因型西葫芦的抗PRSV-W病毒病性均高于所述SS基因型西葫芦的抗PRSV-W病毒病性。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的方法，为如下1)或2)：

1)包括如下M1)和M2)：

M1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；

M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物含有一条不含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段和一条含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物对应于SEQID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗PRSV-W病毒病西葫芦；

2)包括如下N1)和N2)：

N1)以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用所述A1进行PCR扩增得到PCR产物；

N2)如下N21)或N22)：

N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有162bp和146bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有146bp的DNA片段、不含162bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物不含有146bp的DNA片段、含有162bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗PRSV-W病毒病西葫芦；

N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗PRSV-W病毒病西葫芦。

上述鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定抗PRSV-W病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定抗PRSV-W病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法，为如下I或II：

I、包括如下M1)和M2)：

M2)检测步骤M1)得到的PCR产物，如果所述PCR产物对应于SEQ ID No.1为一条不含有SEQ ID No.1的第39-54位所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病性状稳定遗传西葫芦；

II、包括如下N1)和N2)：

N2)如下N21)或N22)：

N21)检测步骤N1)得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有146bp的DNA片段、不含162bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病性状稳定遗传西葫芦；

N22)检测步骤N1)得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病性状稳定遗传西葫芦。

上述鉴定或辅助鉴定抗PRSV-W病毒病性状稳定遗传西葫芦的方法中进行所述PCR扩增的体系可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的体系，进行所述PCR扩增的反应条件可为上述鉴定西葫芦基因型的方法中进行所述PCR扩增的反应条件。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的引物对。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的引物对，为所述A1。

为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的系统。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的系统，由X1和X2组成；所述X1为所述A1，所述X2为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。

上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTPs、TaqDNA聚合酶和/或PCR反应缓冲液，也可仅为所述dNTP混合物、所述TaqDNA聚合酶和/或所述PCR反应缓冲液；所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述dNTPs具体可为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。所述TaqDNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。所述PCR仪具体可为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。

上述系统中，所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂均可独立包装。所述A1中的各引物对的两条单链DNA可独立包装。进行PCR扩增所需的各试剂均可独立包装。

上述鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的系统也可为仅含有所述A1和所述进行PCR扩增所需的试剂或试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述H1-H10中任一应用：

H1、所述西葫芦PRSV-W病毒病分子标记在鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状中的应用；

H2、所述西葫芦PRSV-W病毒病分子标记在鉴定或辅助鉴定PRSV-W病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；

H3、所述西葫芦PRSV-W病毒病分子标记在西葫芦育种中的应用；

H4、所述鉴定西葫芦基因型的方法或鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的方法在鉴定或辅助鉴定PRSV-W病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；

H5、所述鉴定西葫芦基因型的方法或鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的方法在西葫芦育种中的应用；

H6、所述鉴定西葫芦基因型的方法在鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状中的应用；

H7、所述A1或所述系统在制备鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的试剂或试剂盒中的应用；

H8、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状中的应用；

H9、所述A1或所述系统在鉴定或辅助鉴定PRSV-W病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；

H10、所述A1或所述系统在西葫芦育种中的应用。

上述应用中，所述RR基因型西葫芦和所述RS基因型西葫芦的抗PRSV-W病毒病性均高于所述SS基因型西葫芦的抗PRSV-W病毒病性。

为解决上述技术问题，本发明还提供了西葫芦育种方法。

本发明所提供的西葫芦育种方法，按照所述鉴定西葫芦基因型的方法鉴定西葫芦的基因型，选择RR或RS基因型的西葫芦作为亲本进行育种。

本发明中，所述抗PRSV-W病毒病西葫芦是指人工接种PRSV-W病毒病后植株无病害症状或者表现轻微花叶的西葫芦，所述非抗PRSV-W病毒病西葫芦是指人工接种PRSV-W病毒病后植株高度花叶或叶片皱缩卷曲的西葫芦。

本发明中，所述A1的两条单链DNA的的摩尔数可为1:1。

本发明中，在检测PCR产物的大小时，可通过电泳检测，所述PCR产物含有162bp和146bp的DNA片段可表现为在100bp和200bp间有两条带，所述PCR产物含有146bp的DNA片段、不含162bp的DNA片段可表现为在100bp和200bp间有一条接近100bp的条带，所述PCR产物不含有146bp的DNA片段、含有162bp的DNA片段可表现为在100bp和200bp间有一条接近200bp的条带。

实验证明，利用本发明的西葫芦PRSV-W病毒病分子标记可以鉴定西葫芦的PRSV-W病毒病的抗性性状，以有不同PRSV-W病毒病抗性性状的西葫芦基因组为模板，利用本发明的鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的引物对进行PCR扩增时得到的三种PCR产物对应于不同的西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状，当西葫芦的PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(162bp)不含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(146bp)时，西葫芦表现为感PRSV-W病毒病，当西葫芦的PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(146bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(162bp)，该西葫芦表现为抗PRSV-W病毒病，当西葫芦的PCR产物含有SEQ IDNo.1所示的DNA片段(162bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(146bp)，该西葫芦表现为抗PRSV-W病毒病。表明可以利用鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的引物对A1和西葫芦PRSV-W病毒病分子标记鉴定西葫芦的PRSV-W病毒病的抗性情况。

本发明在西葫芦自交系08-13中发现了一个PRSV-W病毒病显性抗病基因CpPRSV-W，其优异的抗病表现在西葫芦抗病育种中具有重要的利用价值。本发明获得了与抗病基因紧密连锁的分子标记Cp126。利用获得的分子标记进行辅助选择，成功的将抗病基因通过杂交、回交转育的方法导入西葫芦优良自交系纤一白中，使其获得PRSV-W病毒病抗性。

附图说明

图1为分子标记Cp126与西葫芦抗病基因CpPRSV-W的遗传连锁图，左边为标记间的图距。

图2为分子标记Cp126扩增带型。其中P₁为感病亲本纤一白，P₂为抗病亲本08-13，F₁为杂交一代；1-13为F₂单株；M：Trans DNA markerII,箭头所指为146bp特异扩增条带。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的西葫芦自交系08-13、西葫芦自交系纤一白，(西葫芦抗PRSV_CMV遗传分析和抗性基因初步定位，张栋，2016)公众可从北京农科院蔬菜中心处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

PRSV-W病毒，(西葫芦抗PRSV_CMV遗传分析和抗性基因初步定位，张栋，2016)公众可从北京农科院蔬菜中心处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的dNTPs为天根生化科技(北京)有限公司产品，货号为CD111。TaqDNA聚合酶及10×buffer具体可为北京全式金生物技术有限公司产品，货号为AP101-01。PCR仪为北京东胜创新生物科技有限公司产品，型号为ETC-811。

实施例1、西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的鉴定

本实施例利用鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的引物对A1对西葫芦的PRSV-W病毒病抗性性状进行鉴定，A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，P1为SEQ IDNo.1的第1-22位所示的单链DNA，P2为与SEQ ID No.1的第162-144位反向互补的单链DNA。

1、待鉴定西葫芦如下，每种西葫芦均选择50株进行试验：

西葫芦自交系纤一白，其表型为感PRSV-W病毒病；

西葫芦自交系08-13，其表型为抗PRSV-W病毒病；

爱绿2号，其表型为感PRSV-W病毒病，为北京爱普绿农业科技有限公司产品；

玉葫二号F1，其表型为感PRSV-W病毒病，为北京中农绿桥科技有限公司产品；

春韵二号，其表型为感PRSV-W病毒病，为东方正大种子有限公司产品；

406西葫芦，其表型为抗PRSV-W病毒病，为中国种子集团有限公司产品；

DSOT6B，其表型为感PRSV-W病毒病，为合肥庞氏农产品有限公司产品；

夏绿，其表型为感PRSV-W病毒病，为昌吉市艾格瑞特种业有限公司产品；

墨玉，其表型为抗PRSV-W病毒病，为昌吉市艾格瑞特种业有限公司产品；

珍玉369，其表型为抗PRSV-W病毒病，为河南豫艺种业科技发展有限公司产品；

绿丰89，其表型为感PRSV-W病毒病，为寿光万盛种业有限公司产品；

碧玉八号，其表型为感PRSV-W病毒病，为北京北农亨利种子有限公司产品；

法国绿蓓9810，其表型为抗PRSV-W病毒病，为北京立丰信种苗有限公司产品；

瑞丰九号F1，其表型为抗PRSV-W病毒病，为北京中农绿亨种子科技有限公司产品；

京葫8号，其表型为感PRSV-W病毒病，为京研益农(北京)科技种业有限公司产品。

2、西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的检测

用CTAB法(SuePorebskiL.,1997)提取上述各西葫芦幼嫩叶片的基因组DNA，分别以上述基因组DNA为模板，A1为引物对进行PCR扩增，其中，A1为由5’-TTTCATGTTATGATATTGTCAG-3’和5’-TCCAAAGCTTACGTTTACT-3’组成的引物对。

利用引物对A1进行PCR扩增的15μL反应体系为：10×buffer1.5微升，dATP、dTTP、dCTP和dGTP浓度均为2.5mM的dNTPs0.3微升，TaqDNA聚合酶0.2微升，P1，P2，西葫芦基因组DNA30ng，以无菌的超纯水补足15微升，使P1和P2的终浓度均为0.2μM。在PCR仪中进行PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次；72℃延伸10min。将反应产物一部分进行测序，一部分在8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上160V电泳70min，经银染后于灯箱下观察，记载。

以上各西葫芦的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和测序结果如表1所示，表1中162bp的PCR产物表示SEQ ID No.1所示的DNA片段，146bp的PCR产物表示SEQ ID No.2所示的DNA片段。然后鉴定各西葫芦的PRSV-W病毒病抗性的情况，PCR产物与表型的关系如表1所示。

在以不同西葫芦基因组DNA为模板，以A1为引物对进行PCR扩增时，PCR产物共有三种情况：第一种情况是PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(162bp)不含有SEQ IDNo.2所示的DNA片段(146bp)，第二种情况是PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段(146bp)不含有SEQ ID No.1所示的DNA片段(162bp)，第三种情况是PCR产物含有SEQ IDNo.1所示的DNA片段(162bp)和SEQ ID No.2所示的DNA片段(146bp)。根据PCR扩增产物定义西葫芦的基因型，其中RR基因型表示西葫芦的两条同源染色体对应于SEQ ID No.1的区域均为SEQ ID No.2，RS基因型表示西葫芦的一条同源染色体对应于SEQ ID No.1区域为SEQID No.1，另一条同源染色体对应于SEQ ID No.1的区域为SEQ ID No.2，SS基因型表示西葫芦的两条同源染色体对应于SEQ ID No.1的区域均为SEQ ID No.1。其中，RR基因型和SS基因型均可稳定遗传。

将以西葫芦的基因组DNA为模板，采用引物对A1进行PCR扩增得到的DNA分子命名为西葫芦PRSV-W病毒病分子标记，西葫芦PRSV-W病毒病分子标记的多态性为西葫芦基因组中对应于SEQ ID No.1为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。

3.西葫芦PRSV-W病毒品种抗、感病判定方法：

将供试种子经40℃干燥处理2h，65℃高温处理2h，浸种4h后30℃恒温培养箱催芽，24h后播种于灭菌营养钵中，置于防虫网室内25℃～30℃条件下培养，每份材料种植7株，3次重复。待子叶展平，撒少量600目金刚砂于子叶上，用质量浓度为0.5mg/mL的病毒接种液(0.02moL/L的磷酸缓冲液研磨携带PRSV-W病毒的叶片组织)摩擦接种，设置2株空白对照。接种15-25天后，观察植株第1-4片真叶的发病情况，并按照下述分级标准记录分级。

0级，植株无任何症状；1级，少数叶片局部轻微花叶，形态正常；2级，多数叶片花叶，形态正常，个别叶片畸形；3级，多数叶片严重花叶、泡斑，新叶畸形；4级，几乎所有叶片严重花叶、畸形。病情指数(DI)＝100×Σ(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)。其中，DI≤5为高度抗病(HR)，5＜DI≤25为抗病(R)，25＜DI≤70为感病(S)，DI＞70为高度感病(HS)。将以上各西葫芦种类按照上述方法进行检测，检测结果如表1所示。

表1、不同西葫芦PCR产物和PRSV-W病毒病抗性表型分析结果

结果表明，当西葫芦的PCR产物为第一种情况(即西葫芦的基因型为SS基因型)时，该西葫芦表现为感PRSV-W病毒病，当西葫芦的PCR产物为第二种情况(即西葫芦的基因型为RR基因型)，该西葫芦表现为抗PRSV-W病毒病，当西葫芦的PCR产物为第三种情况(即RS基因型)时，该西葫芦表现为抗PRSV-W病毒病。PCR产物的三种情况(或西葫芦的SS、RR和RS基因型)与西葫芦的PRSV-W病毒病的抗性情况完全一致，表明可以利用鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的引物对A1鉴定西葫芦PRSV-W病毒病的抗性情况。

实施例2、与西葫芦PRSV-W病毒病显性抗病基因CpPRSV-W紧密连锁的SSR分子标记的获得方法

将实施例1的西葫芦PRSV-W病毒病分子标记命名为分子标记Cp126，本实施例具体描述了所述的与西葫芦PRSV-W病毒病显性抗病基因CpPRSV-W紧密连锁的SSR分子标记Cp126的获得方法，包括以下步骤：

(一)西葫芦自交系纤一白与08-13F₂代的创建与表型鉴定：

(1)西葫芦自交系纤一白(母本，P1)与08-13(父本，P2)进行杂交得到杂种F₁，F₁自交产生F₂代群体。

(2)F₂代群体单株种植于温室营养钵内，外罩防虫网，子叶完全展开后接种PRSV-W病毒病，接种15天后进行抗病性状调查。鉴定结果见表2。

表2、接种PRSV-W病毒病后纤一白×08-13F₂代群体遗传分析

R、S分别代表抗病单株、感病单株。χ² _0.05,1＝3.84。

(3)F₂代单株进行性状调查后将感病植株移栽于温室种植，自交所得种子为F₃家系。每个F₃家系中选择10粒种子进行子代抗病性测验，以验证F₂代感病单株是否携带纯合感病基因。

(4)通过对F₂代单株进行遗传分析，发现西葫芦自交系08-13携带一个显性抗病基因。

(二)多态性分子标记筛选

(5)将10株抗病F₂单株的叶片等量混成抗池，10株感病F₂单株的叶片等量混成感池。用CTAB法(Sue Porebski L.,1997)提取抗病亲本08-13、感病亲本纤一白、抗池和感池的DNA，应用简单重复序列标记SSR与BSA(Bulk Segregant Analysis)结合的方法进行多态性分子标记筛选。

(6)首先利用本课题组在西葫芦20条染色体上设计合成的843对SSR引物，对08-13、纤一白、抗池和感池进行多态性筛选；

PCR反应体积为15μL，其中10×buffer1.5μL，2.5mMdNTPs0.3μL，Tag酶(5单位/μL)0.2μL，10μM引物(F/R)各0.3μL，模版DNA30ng，加ddH₂O至15μL；

SSR反应条件为DNA95℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸25s，循环36次，最后72℃延伸10min；

在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染后照相记录结果；

选择在亲本间和F₂代群体的抗、感池间扩增出相同有多态型的引物，与抗病基因CpPRSV-W连锁的候选分子标记共3个；

(三)紧密连锁分子标记的获得

(7)根据连锁交换规律，利用3个候选分子标记在纯合感病单株间的基因型资料与单株的抗性资料，构建分子标记与CpPRSV-W基因的连锁图谱，所用软件为Mapmaker/EXP3.0，获得了与抗病基因CpPRSV-W紧密连锁的分子标记Cp126，遗传连锁距离为0.4cM(图1)；

(四)抗病基因CpPRSV-W向感病西葫芦自交系的转移

(8)利用获得的与抗病基因CpPRSV-W紧密连锁的分子标记Cp126，通过杂交、回交转育及自交纯化将抗病基因导入西葫芦优良感病自交系中(图2)。利用上述策略，成功改良西葫芦优良感病自交系纤一白，使其携带CpPRSV-W抗病基因具备了PRSV-W病毒病抗性。

西葫芦种质资源中蕴含丰富的基因资源，高效充分的利用这些基因资源对于西葫芦新品种培育具有重要作用。本发明通过将抗病种质08-13与感病自交系纤一白杂交，经遗传分析确定抗病材料中携带有一个显性的抗病基因，通过构建抗病性状分离群体，经多态性分子标记筛选，构建了抗病基因CpPRSV-W与分子标记Cp126的遗传连锁图谱。利用分子标记辅助选择，经杂交及回交转育，成功将抗病基因CpPRSV-W转育到西葫芦优良感病自交系纤一白中，使其获得了PRSV-W病毒病抗性。在传统育种方法中，由于缺乏与PRSV-W病毒病抗病基因连锁的分子标记，每代的抗病基因转移均需要进行抗性接种鉴定，耗时耗力，且常常由于鉴定准确性差的问题导致选育失败。因此，分子标记Cp126的开发可以在苗期简便准确的筛选含有抗病基因CpPRSV-W的单株，大大节省抗病材料的筛选时间和育种劳动量，提高选择的准确性，加快了抗PRSV-W病毒病新品种的培育速度。

本发明获得与西葫芦PRSV-W病毒病抗病基因CpPRSV-W紧密连锁的共显性分子标记Cp126。Cp126与抗病基因的遗传距离为0.4cM。利用该标记能够通过辅助选择鉴定将抗病基因成功导入其它西葫芦感病优良自交系，使之获得抗病性状。分子标记具有扩增稳定、检测方便、快速准确等优点。用标记Cp126检测西葫芦抗病基因CpPRSV-W，可以确定抗病基因是否存在以及存在状态，并预测植株对PRSV-W病毒病的抗性，加快该抗病基因的利用。本发明提出了利用西葫芦PRSV-W病毒病抗病种质资源08-13中抗病基因的方法：利用分子标记筛选，通过杂交与回交转育将抗病基因导入西葫芦优良的感病自交系中，利用该方法成功将抗病基因CpPRSV-W导入西葫芦优良自交系纤一白，使其获得了PRSV-W病毒病抗性。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 与西葫芦PRSV-W病毒病抗性相关的分子标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttcatgtta tgatattgtc agctctctct ctctctctct ctctctctct ctctcaactt 60

gcaaaaatca tatctttttc tctctctacc tattatactt tagagataga ttttagtgtg 120

taaactgtaa atttataatg tacagtaaac gtaagctttg ga 162

<210> 2

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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tttctctctc tacctattat actttagaga tagattttag tgtgtaaact gtaaatttat 120

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Claims

1.鉴定西葫芦基因型的方法，所述基因型为RR基因型、RS基因型和SS基因型，所述方法包括如下L1）和L2）：

L1）以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用A1进行PCR扩增得到PCR产物；

L2）下述L21）或L22）：

L21）检测步骤L1）得到的PCR产物的大小，根据所述PCR产物的大小确定西葫芦基因型：

L22）检测步骤L1）得到的PCR产物的序列，根据所述PCR产物确定西葫芦基因型：

所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA片段的所述待测西葫芦的基因型为RS基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述待测西葫芦的基因型为RR基因型；所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测西葫芦的基因型为SS基因型；

所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第162-144位反向互补的单链DNA，

所述基因型为SS基因型的西葫芦为感PRSV-W病毒病型西葫芦，所述基因型为RS基因型的西葫芦为抗PRSV-W病毒病型西葫芦，所述基因型为RR基因型的西葫芦为抗PRSV-W病毒病型西葫芦。

2.鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状的方法包括如下N1）和N2）：

N1）以待测西葫芦基因组DNA为模板，采用A1进行PCR扩增得到PCR产物，所述A1由名称为P1和P2的单链DNA组成，所述P1为SEQ ID No.1的第1-22位所示的单链DNA，所述P2为与SEQ ID No.1的第162-144位反向互补的单链DNA；

N2）如下N21）或N22）：

N21）检测步骤N1）得到的PCR产物的大小，如果所述PCR产物含有162bp和146bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有146bp的DNA片段、不含162bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物不含有146bp的DNA片段、含有162bp的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗PRSV-W病毒病西葫芦；

N22）检测步骤N1）得到的PCR产物的序列，如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.2所示的DNA片段、不含SEQ ID No.1所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为抗PRSV-W病毒病西葫芦；如果所述PCR产物含有SEQ ID No.1所示的DNA片段、不含SEQ ID No.2所示的DNA片段，所述待测西葫芦为或候选为非抗PRSV-W病毒病西葫芦。

3.下述H1-H3中任一应用：

H1、权利要求1或2所述方法在鉴定或辅助鉴定PRSV-W病毒病抗性性状稳定遗传西葫芦中的应用；

H2、权利要求1或2所述方法在西葫芦育种中的应用；

H3、权利要求1所述鉴定西葫芦基因型的方法在鉴定或辅助鉴定西葫芦PRSV-W病毒病抗性性状中的应用。

4.西葫芦育种方法，按照权利要求1所述的方法鉴定西葫芦的基因型，选择RR或RS基因型的西葫芦作为亲本进行育种。