CN111910013A - 与茄子花青素合成基因紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，特别涉及分子遗传学领域，具体涉及与茄子花青素合成基因紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用，为开发控制茄子花青素合成上位性基因的分子标记，本发明将1个抑制茄子花青素合成突变体p^w基因定位于茄子的8号染色体上的较小关联区域内，开发了与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的分子标记InDel87335789，该分子标记距离目标基因P的遗传距离为0.65cM，有望应用于茄子花青素合成突变体p^w基因的分子标记辅助育种；本发明的分子标记及分子标记的扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，同时为克隆茄子突变体p^w基因及其功能研究奠定了良好的基础。

Description

与茄子花青素合成基因紧密连锁的InDel分子标记及其引物 和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及分子遗传学领域，具体涉及与茄子花青素合成基因紧密连锁的InDel分子标记及其引物和应用。

背景技术

茄子花青素合成是多基因控制的复杂性状。申请人在茄子育种实践中发现2对上位性效应基因控制的茄子果色遗传现象(图1)。即2个纯合的绿果色茄子杂交后，F₁代果色为紫红色，F₂代紫红果色和绿果色植株的分离比为9:7，说明其果皮花青素合成受到上位性的2个基因位点控制，2个绿果色茄子是由于控制花青素生物合成过程的2个独立而又互补的基因位点(P基因和Y基因)分别突变失活引起的。在已有参考文献(Tigchelaar E C,Janick J,Erichson H T.The genetics of anthocyanin coloration in eggplant(Solanum melongena L.).Genetics,1968,60:475-491)中，把控制茄子果色花青素合成的3个上位性基因分别定义为D、P和Y基因，本研究根据亲本材料表型特征及遗传规律沿用该基因命名。其中P基因按照显性顺序有P、p和p^w三种等位基因形式，p抑制下胚轴和果皮花青素的合成，p^w则抑制植株各个部分花青素的合成。本研究所采用的P基因突变体绿茄亲本材料母本在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片、果实都观察不到花青素的合成，因此P位点的基因型为p^wp^w。

目前，有关茄子花青素合成的突变体p^w基因尚未开展相关分子标记及定位研究。因此，开展控制茄子花青素合成上位性基因的分子标记和定位研究，可以为茄子果色分子标记辅助选择育种及基因克隆奠定基础。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记InDel87335789。

本发明的第二个目的是提供用于扩增上述的分子标记InDel87335789的引物对。

本发明的第三个目的是提供上述的分子标记InDel87335789或引物对在茄子果色选育中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种茄子果色的分子标记辅助选育方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记InDel87335789，所述分子标记InDel87335789的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQID NO.2的245pb-294pb处为插入或缺失片段，所述插入或缺失片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

优选地，所述分子标记InDel87335789为从抑制茄子花青素合成的突变体p^w基因的关联区域内开发得到。

更优选地，所述突变体p^w基因定位于茄子的8号染色体上，所述关联区域位于115.311-118.302cM之间。

优选地，所述分子标记InDel87335789与上位性基因P的遗传距离为0.65cM。

本发明采用SLAF-seq技术和HighMap软件对茄子E4453 F₂遗传分离群体(2个亲本重测序和154个子代SLAF简化基因组测序)进行高密度分子标记开发，并进行遗传图谱构建和相关性状的QTL定位分析，将控制茄子果皮花青素合成的2个突变基因(y和p^w)分别定位到相应的两个较小的区域。发现同时抑制茄子植株茎、叶脉、花和果花青素合成的上位性基因p^w定位于茄子的8号染色体上的相同区域上。结合基因组重测序结果，在茄子第8号染色体的上位性基因p^w的关联区域(115.311-118.302cM之间)内开发得到InDel分子标记InDel87335789。

分子标记InDel87335789在母本(基因型为p^wp^wYY)中具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；在父本(基因型为PPyy)中则具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，母本较父本缺失了50bpInDel。根据F₂群体紫红果色单株(基因型有PPYY、Pp^wYY、PPYy和Pp^wYy)及F₂群体绿果色单株(基因型有p^wp^wYY、p^wp^wYy、PPyy和Pp^wyy)的基因型分布情况计算InDel87335789分子标记的交换律，确定该InDel标记距离目标基因P的遗传距离为0.65cM。可直接用于茄子花青素合成突变体p^w基因的分子标记辅助育种体系的建立，有望应用于茄子果色选育实践中；同时，本发明对茄子花青素合成突变体p^w的定位结果，为茄子花青素合成相关基因的精细定位和克隆奠定了基础。

本发明还提供了用于扩增分子标记InDel87335789的引物对。

优选地，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了分子标记InDel87335789或其引物对在茄子果色选育中的应用。

本发明还提供了一种茄子果色的分子标记辅助选育方法，即利用分子标记InDel87335789的特异性引物PCR扩增待检测植株的DNA，若扩增产物中仅有278bp大小的片断，则该植株的基因型为p^wp^w，果色为绿色；若仅有328bp大小的片断，则该植株的基因型为PP，若同时有278bp和328bp大小的两个片断，则该植株的基因型为Pp^w，基因型为PP和Pp^w情况下，果色取决于另一个上位性基因位点Y的基因型。

优选地，所述特异性引物包括但不限于SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对。

优选地，所述待检测植株的母本和父本均为果色上位性遗传的亲本类型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明将1个抑制茄子花青素合成突变体p^w基因定位于茄子的8号染色体上的较小关联区域内，开发了与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的分子标记InDel87335789，该分子标记距离目标基因P的遗传距离为0.65cM，可直接用于茄子花青素合成突变体p^w基因的分子标记辅助育种体系的建立；本发明的分子标记及分子标记的扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，同时为克隆茄子突变体p^w基因及其功能研究奠定了良好的基础。

附图说明

图1为母本、父本、E4453 F₁各组织部位的主要特征；

图2为InDel87335789标记在E4453 F₂的父本、母本以及E4453 F₁和E4453 F₂不同单株中的分布情况。

图1中，母本材料的果色为绿色，而且在整个生育期，子叶、下胚轴、叶脉，花，萼片和果皮都观察不到花青素的合成；父本材料的果色也为绿色，在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片和果皮也都观察不到花青素的合成，F1代材料的下胚轴、叶脉、花色和果色都呈现紫红色。

图2中，M为DNAmarker；泳道1-24均为E4453 F₂单株。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

下述实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE胶电泳等实验，如无特殊说明，均按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例1分子标记InDel87335789的获取

(1)遗传群体的构建及遗传分析

1、供试材料

植物材料：以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的2份绿果色的茄子纯化自交系(品种编号为E4453)为母本(基因型为p^wp^wYY)和父本(基因型为PPyy)，配制杂交组合F₁(E4453 F₁)，F₁单株自交得到F₂(E4453 F₂)。母本和父本材料果色均为绿色，而且在整个生育期，下胚轴、叶脉、花、萼片都观察不到花青素的合成；F₁代材料的下胚轴、叶脉、花色和果色都呈现紫红色；F₂分离世代的紫红色植株和绿果色植株的分离比经卡方检验符合9:7(图1)。

2、遗传分析

F₂代分离群体的果色可分为紫红果色(有花青素)和绿果色(无花青素)。154个单株组成的F₂群体中，紫红果色单株和绿果色单株的数量分别为92株和62株，卡方(X²)检验其是否符合9：7比率，结果X²＝0.76(P＝0.38)，小于X² _0.05＝3.84(df＝1)，说明紫红果色单株总数和绿果色单株总数符合9：7的比率。因此，明确了本研究中所用的茄子材料果色遗传是受2个相互作用的上位性基因(P和Y)控制的。本研究的果色与花色、茎色、叶脉色是紧密连锁的性状，果实不含花青素为绿色，则花色为白色(不含花青素)、茎色和叶脉也为绿色(不含花青素)，若果色为紫红(含花青素)，则花、茎和叶脉都合成花青素，呈紫红色。

(2)茄子果色上位基因定位

1、亲本及F₂单株DNA制备

2个绿茄父、母本各取10株苗期叶片，分别提取叶片DNA，每株取等量DNA混合，构成父本池和母本池；F₂分离群体，单株取叶片，分别提取DNA。在苗期、开花期、坐果期对子叶、下胚轴、茎色、花色和果色进行调查。

2、遗传图谱构建及茄子果色上位性基因定位

本研究前期委托北京百迈客生物科技有限公司利用其自主研发的SLAF-seq技术进行简化基因组测序，通过与参考基因组的定位将SNP分为12个连锁群，通过两两标记之间的重组率计算MLOD值，过滤掉与其他SNP的MLOD值均低于3的标记，共上图2,017个，定位为上图标记(Marker)。采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到总图距为1,176.5cM的遗传图谱。采用lciMapping进行QTL定位分析，阈值为2.5，将抑制茄子花青素合成突变体p^w基因定位于茄子的8号染色体上,突变体p^w基因在8号染色体上的关联区域(115.311-118.302cM)的基本信息如表1所示。

表1突变体p^w基因关联区域的基本信息

3、分子标记InDel87335789的开发

基于父、母本基因组重测序结果，在8号染色体关联区域附近寻找InDel标记，在8号染色体的第87335789位点找到了一个与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记，命名为InDel87335789。该分子标记在母本(基因型为p^wp^wYY)中的核苷酸序列为：ACTTCAAACAAAGCATCAAACTCAAATTCCAGTCGTGTTGAATACTGAAAAAATGCAAGTGATGAATTTGAAATCCCATATTGCACGCCAGGGTCACTCAGTGACCCTGCCATAAGAGGAACGATAGTCATATGTTTGGCAGGTGGTGGTGTTACGAGGGTTGAAATGGACAAGCTGTCGAGGAGGGCTCGATCTTACCTTATCAATCGTAATTGTACCAAACCTCTACCAATTAACTACCATCAAGAAAATAAGAGTTAGAGAGAGAATTTTTTTCT；在父本(基因型为PPyy)中的核苷酸序列为

其在母本比父本缺失了50个碱基(TTACCTTATCAATCGTAATTGTACCAAACCTCTACCAGTTAACTACCATG)。根据F2群体紫红果色单株(基因型有PPYY、Pp^wYY、PPYy和Pp^wYy)及F2群体绿果色单株(基因型有p^wp^wYY、p^wp^wYy、PPyy和Pp^wyy)的基因型分布情况，计算该分子标记的交换律，确定该分子标记距离目标基因P的遗传距离为0.65cM。

根据上述开发得到的InDel分子标记的序列信息，运用Primer5.0软件设计了特异性引物：

87335789F：5'-ACTTCAAACAAAGCATCAAACTC-3'；

87335789R：5'-AGAAAAAAATTCTCTCTCTAACTC-3'。

实施例2分子标记InDel87335789的应用

1、植物材料：以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的2份绿果色的茄子纯化自交系(品种编号为E4453)为母本(基因型为pwpwYY)和父本(基因型为PPyy)，配制杂交组合F1(E4453 F1)，F1单株自交得到F2(E4453 F2)为实验材料。

2、基因组DNA的提取和检测

取茄子父本、母本、F1和F2的幼嫩叶片，采用CTAB方法提取。具体步骤如下：取0.5g新鲜幼嫩的叶片在液氮中快速研磨成粉末后，置于1.5mL的离心管中；加入0.5mL提取缓冲液，65℃水浴；冷却后，加入0.5mL苯酚-氯仿-异戊醇(25：24：1的体积比)，用移液枪混匀，然后在12000rpm的条件下离心10min，抽取上清液转入新管，加入冷处理的异丙醇，轻轻混匀，冰浴30min；4℃，8000rpm离心10min；倒掉上清液，70％酒精冲洗两次，干燥后，加入缓冲液溶解，加入RNase除去RNA，37℃水浴30min，琼脂糖电泳检测DNA质量。

3、PCR扩增

利用实施例1中设计的特异性引物对父本、母本、F1和F2分离群体单株中进行PCR扩增，PCR反应体系为：PCRmix(2x Taq PCR Green mix，鼎国)10.0μL，R(10μmol·L^-1)0.5μL，F(10μmol·L^-1)0.5μL，DNA模板1.0μL，RNase Free dH₂O 8.0μL，Total 20μL。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃再延伸5min。

4、PAGE胶电泳及显色

反应结束后，PCR产物检测利用8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，上样量为1μL，采用160V恒电压电泳2h。PAGE胶染色采用快速银染法，具体为：(1)从玻璃板上拆下胶置于蒸馏水中漂洗，并重复一次；(2)0.1％AgNO₃溶液中染色10min；(3)蒸馏水漂洗2次；(4)1×显色液200mL+800μL甲醛中显色10分钟；(5)自来水漂洗2次后读带。银染后得到的电泳图谱如图2所示。

5、果色鉴定结果

如图2所示，InDel 87335789标记在母本中的扩增长度为278bp(基因型p^wp^w)、父本中的扩增长度为328bp(基因型PP)，二者杂交F₁代扩增带型为278bp和328bp两条带(基因型Pp^w)，E4453 F₂绿果色单株1、16、19、22、23、24仅有278bp的扩增条带，基因型为p^wp^w；E4453F2单株4、5、12、13、14、15、18和21的基因型为PP，果色取决于另一基因位点Y(基因型PPYY，PPYy为紫红果色，PPyy为绿果色)；E4453 F2单株2、3、6、7、8、9、10、11、17和20的基因型Pp^w，果色取决于另一基因位点Y(基因型Pp^wYY，Pp^wYy为紫红果色，Pp^wyy为绿果色)。

综合实施例1和实施例2可知，本发明对茄子花青素合成突变体p^w的定位结果，为茄子花青素合成相关基因的精细定位和克隆奠定了基础；InDel87335789分子标记及其扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，加速茄子果色性状改良的进程。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 与茄子花青素合成基因紧密连锁的 InDel 分子标记及其引物和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Claims (10)

1.与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记InDel87335789，其特征在于，所述分子标记InDel87335789的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述SEQ ID NO.2的245pb-294pb处为插入或缺失片段，所述插入或缺失片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记InDel87335789，其特征在于，所述分子标记InDel87335789为从抑制茄子花青素合成的突变体p^w基因的关联区域内开发得到。

3.根据权利要求2所述的与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记InDel87335789，其特征在于，所述突变体p^w基因定位于茄子的8号染色体上，所述关联区域位于115.311-118.302cM之间。

4.根据权利要求1所述的与茄子花青素合成突变体p^w基因紧密连锁的InDel分子标记InDel87335789，其特征在于，所述分子标记InDel87335789与上位性基因P的遗传距离为0.65cM。

5.用于扩增权利要求1-4任一项所述的分子标记InDel87335789的引物对。

6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求1-4任一项所述的分子标记InDel87335789或权利要求5-6任一项所述的引物对在茄子果色选育中的应用。

8.一种茄子果色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，用分子标记InDel87335789的特异性引物PCR扩增待检测植株的DNA，若扩增产物中仅有278bp大小的片断，则该植株的基因型为p^wp^w，果色为绿色；若仅有328bp大小的片断，则该植株的基因型为PP，若同时有278bp和328bp大小的两个片断，则该植株的基因型为Pp^w，基因型为PP和Pp^w情况下，果色取决于另一个上位性基因位点Y的基因型。

9.根据权利要求8所述的一种茄子果色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述特异性引物包括但不限于权利要求5-6任一项所述的引物对。

10.根据权利要求8所述的一种茄子果色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述待检测植株的母本和父本均为果色上位性遗传的亲本类型。

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