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CN112566650A - 异二聚体蛋白及其用途 - Google Patents

异二聚体蛋白及其用途 Download PDF

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CN112566650A
CN112566650A CN201980053803.4A CN201980053803A CN112566650A CN 112566650 A CN112566650 A CN 112566650A CN 201980053803 A CN201980053803 A CN 201980053803A CN 112566650 A CN112566650 A CN 112566650A
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G·弗罗姆
S·达西瓦
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Shattuck Labs Inc
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Abstract

本发明尤其涉及包含可用于治疗疾病，例如针对癌症和自身免疫的免疫疗法的异二聚体蛋白的组合物和方法。

Description

异二聚体蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及可用于治疗疾病，例如针对癌症和自身免疫的免疫疗法的异二聚体蛋白。
优先权
本申请要求在2018年6月21日提交的美国临时申请号62/688,167和在2018年7月25日提交的美国临时申请号62/703,248的权益。其内容通过引用以其全文并入本文。
对电子提交的文本文件的描述
一并电子提交的文本文件的内容通过引用以其全文并入本文：序列表(文件名：SHK-004PC-Sequence_Listing_ST25；创建日期：2019年6月21日；文件大小：112KB)的计算机可读形式拷贝。
背景技术
蛋白-蛋白相互作用对于细胞和多细胞生物体的正常生理功能至关重要。例如，细胞因子作为配体与它们的相关受体结合以调控必要的生物学过程，例如炎症和免疫。就这一点而言，有许多天然细胞因子、细胞因子受体、整联蛋白和其他蛋白以多聚体蛋白复合物存在或发挥功能。一些多聚体(例如肿瘤坏死因子超家族中的那些)以同三聚体发挥功能，其他配体包括细胞因子的IL-12家族(例如IL12、IL23、IL27或IL-35)形成异二聚体。类似地，细胞因子受体也可以以异二聚体复合物发挥功能。例如，许多白介素受体形成异二聚体用于信号转导。
蛋白-蛋白相互作用的调节是多种疾病和病理学的治疗干预的有用机制。与配体相互作用的可溶性结合蛋白可潜在地将配体与受体隔离，从而减少对特定受体通路的激活。或者，将配体隔离可以延迟其的消除或降解，从而增加其作用和生物活性的时间。另外，可利用可溶性配体来激活或抑制特异性受体。然而，在期望产生异二聚体蛋白时，可溶蛋白的合成和生产可能受到阻碍。特别是合成效率会由于同二聚体和异二聚体的混合物的形成而大大降低。
因此，仍然需要有效合成和生产用于治疗用途的异二聚体蛋白的新方法。
发明概述
在各种实施方案中，本发明提供了包含第一多肽链和第二多肽链的异二聚体蛋白，其中第一多肽链包含在氨基末端的第一蛋白的第一亚基，其通过第一电荷极化核心结构域连接至在羧基末端的第二蛋白的第一亚基；且第二多肽链包含在氨基末端的第一蛋白的第二亚基，其通过第二电荷极化核心结构域连接至在羧基末端的第二蛋白的第二亚基。
在多个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链异二聚体通过第一和第二电荷极化核心结构域上带正电荷的氨基酸残基和带负电荷的氨基酸残基之间的静电相互作用。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基可包括选自His、Lys和Arg的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，带负电荷的氨基酸残基可包括选自Asp和Glu的一个或多个氨基酸。
因此，在多个实施方案中，第一和/或第二电荷极化核心结构域中每一个均包含位于核心结构域的氨基和羧基末端的具有带正电荷或负电荷的氨基酸残基的肽。在一个示例性的实施方案中，第一电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带正电荷氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域(stabilizing domain))邻接至(adjoin to)在羧基末端的具有带负电荷氨基酸残基的肽。在这样的实施方案中，第二电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带负电荷氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至在羧基末端的具有带正电荷氨基酸残基的肽。在另一个示例性实施方案中，第一电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带负电荷氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至在羧基末端的具有带正电荷氨基酸残基的肽。在这样的实施方案中，第二电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带正电荷氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至在羧基末端的具有带负电荷氨基酸残基的肽。
在多个实施方案中，第一和/或第二电荷极化核心结构域中的每一个均进一步包含邻接至具有正电荷或负电荷氨基酸的肽的接头(例如稳定化结构域)。在一些实施方案中，接头(例如稳定化结构域)任选选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区或抗体序列。在一个实施方案中，接头(例如稳定化结构域)包含衍生自IgG1，任选人IgG1的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在另一个实施方案中，接头(例如稳定化结构域)包含衍生自IgG4，任选人IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白选自细胞因子、生长因子和/或激素。在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白选自细胞因子、生长因子和/或激素的受体。
在一些实施方案中，在异二聚体蛋白中，第一蛋白选自表1和/或第二蛋白选自表1。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白质是白介素。在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是包含IL12α和IL27β亚基的IL-35。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白选自细胞因子、生长因子和/或激素的受体。在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是白介素的受体。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是包含IL6Rα和gp130亚基的IL6受体。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是包含IL21r和IL2rg亚基的IL21受体。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是包含IFNgR和IFNGR2亚基的IL21受体。
在一些实施方案中，氨基或羧基末端上的蛋白是天然异二聚体的，并且其中相对末端上的蛋白不是天然异二聚体的。
同样在多个方面，本发明的异二聚体蛋白用于治疗自身免疫疾病的方法中，包括向有此需要的患者施用有效量的包含异二聚体蛋白的药物组合物。在进一步的方面，本发明的异二聚体蛋白用于治疗感染(包括但不限于病毒感染或其他细胞内病原体)的方法中。在还进一步的方面，本发明的异二聚体蛋白用于治疗癌症的方法中。
本文公开的任何方面或实施方案均可与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
附图简要说明
图1提供了本发明的蛋白质工程实施方案的图解，显示了包含IL6受体(其包括IL6Rα和gp130亚基)和IL-35细胞因子(其包括IL12α和IL27β亚基)的示例性的本发明的异二聚体蛋白。异二聚体蛋白优选通过电荷极化核心结构域之间的静电相互作用来形成。
图2提供了对来自瞬时转染培养物的gp130-Fc-IL12a和IL6RA-Fc-IL27β的产物电泳的蛋白质印迹分析。使用亲和色谱法捕获分泌蛋白，并从柱上洗脱以获得含有被人Fc特异性抗体识别的结构域的蛋白。由于蛋白是在变性条件下电泳的，可以看到alpha和beta链的各个条带。
图3提供了对纯化的gp130-Fc-IL12a和IL6RA-Fc-IL27β异二聚体蛋白的蛋白质印迹分析。SDS-PAGE凝胶(左侧两个凝胶)表明在非变性条件下在约300kDa处存在单个条带(每个印迹中除分子量标准外的左侧泳道)。这个条带在用β-巯基乙醇温育后可分离成组分alpha和beta链(每个凝胶中的中间泳道)，其电泳的表观分子量高于预期，这表明了可能的翻译后修饰包括糖基化。这一点在每个凝胶的最右侧泳道中得以证实，其表明在去除N-连接和O-连接的糖基化之后，alpha和beta链的分子量降低至预期分子量。对于右侧凝胶，使用天然PAGE凝胶(native PAGE gel)以进一步研究与alpha/alpha或beta/beta同二聚体形式相比，以alpha/beta异二聚体形式存在的纯化蛋白的比例。该凝胶表明alpha/beta异二聚体富集至制备物中总蛋白的约60％，相比之下alpha/alpha同二聚体为约30％，beta/beta同二聚体为约10％。
图4描述了使用分光光度法对捕获的异二聚体IL-6R-Fc-IL-35蛋白进行定量。
图5提供了gp130-alpha-IL12A和IL6RA-beta-IL27B构建体在CHO细胞中双重转染并随后使用蛋白A纯化所分泌的蛋白后，IL-6R-Fc-IL-35构建体的体积排阻色谱(size-exclusion chromatography，SEC)色谱图。
图6提供了ELISA测定的示意图，开发其用以证明IL-6R-Fc-IL-35蛋白能够与固定的人IL-6结合。预期在该测定法中仅目标物质(显示在上方中间的图中)与IL-6结合，这可以用针对异二聚体的IL-27a(EBI3)结构域的抗体特异性地检测到。
图7提供了ELISA测定的另一个示意图，开发其用以证明IL-6R-Fc-IL-35蛋白能够与固定的人IL-6结合。使用IL-6RA结构域来检测所结合的蛋白。
图8提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用抗人gp130抗体特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用抗人IL-27a(EBI3)抗体检测所结合的蛋白。
图9提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用抗人gp130抗体特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用IL-6RA结构域检测所结合的蛋白。
图10提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用IL-6RA结构域特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用抗人IL-27a(EBI3)抗体检测所结合的蛋白。
图11提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用IL-6RA结构域特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用IL-6RA结构域检测所结合的蛋白。
图12提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用IL-12a p35特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用抗人IL-27a(EBI3)抗体检测所结合的蛋白。
图13提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用IL-12a p35结构域特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用IL-6RA结构域检测所结合的蛋白。
图14提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用抗人IL-27a(EBI3)抗体特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用抗人IL-27a(EBI3)抗体检测所结合的蛋白。
图15提供了开发的ELISA测定的示意图，其使用抗人IL-27a(EBI3)抗体特异性捕获示例性的本发明的异二聚体蛋白，并使用IL-6RA结构域检测所结合的蛋白。
图16A和图16B提供了IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的体积排阻色谱(SEC)色谱图。在图16A中，吸收波长是210nm，在图16B中，吸收波长是280nm。
图17显示了使用IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的IL-6SINK测定的结果的图。
图18包括显示IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白(确定为HdA‘00)诱导至少IL-35的能力的图。条件“Halycon”是指用对照嵌合蛋白进行处理。
图19A显示了包含IL-21r-Fc(alpha)-IL12a链和IL2rg-Fc(beta)-IL27B链的IL-21R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的示意图。图19B显示了SDS-PAGE凝胶，其表明在还原的去糖基化的条件下在约84.4kDa和78.1kDa处存在两个单条带(最右侧泳道)。
图20提供了在L-21r-Fc(alpha)-IL12a和IL2rg-Fc(beta)-IL27B构建体在CHO细胞中双重转染并随后使用蛋白A纯化所分泌的蛋白后，IL-21R-Fc-IL-35IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白的体积排阻色谱(SEC)色谱图。
图21是对IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白的蛋白质印迹分析，该异二聚体蛋白包含IFNgR-Alpha-IL12a链和IFNGR2-Beta-IL27B链，其被每个印迹下面所示的抗体探测到。将蛋白在非变性条件下(每个印迹中除分子量标准外的左侧泳道)、在用β-巯基乙醇处理的变性条件下(每个凝胶中的中间泳道)以及变性和去糖基化处理下电泳。
图22提供了在IFNgR-Alpha-IL12a和IFNGR2-Beta-IL27B链构建体在CHO细胞中双重转染并随后使用蛋白A纯化所分泌的蛋白后，IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白的体积排阻色谱(SEC)色谱图。
发明详述
本发明涉及用于合成和生产异二聚体蛋白的蛋白质工程化平台。本发明的方法可以有效产生用于调节免疫信号以治疗多种疾病，包括但不限于自身免疫疾病的异二聚体蛋白。
电荷极化核心结构域(Charge Polarized Core Domain)
在一个方面，本发明涉及异二聚体蛋白。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含两条多肽链。第一多肽链包含在氨基末端的第一蛋白的第一亚基，其通过第一电荷极化核心结构域连接至在羧基末端的第二蛋白的第一亚基。第二多肽链包含在氨基末端的第一蛋白的第二亚基，其通过第二电荷极化核心结构域连接至在羧基末端的第二蛋白的第二亚基。在多个实施方案中，第一多肽链和第二多肽链通过在第一和第二极化核心结构域上的带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的氨基酸残基之间的静电相互作用形成异二聚体。
在多个实施方案中，第一和第二电荷极化核心结构域中的每一个均包含在核心结构域的氨基和羧基末端的具有带正电荷或负电荷氨基酸残基的肽。在一个示例性的实施方案中，第一电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带正电荷氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至位于羧基末端的具有带负电荷的氨基酸残基的肽。第二电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带负电荷氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至在羧基末端的具有带正电荷氨基酸残基的肽。
在另一个示例性实施方案中，第一电荷极化核心结构域可包含在氨基末端的具有带负电荷的氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至位于羧基末端的具有带正电荷的氨基酸残基的肽。第二电荷极化核心结构域可包含位于氨基末端的具有带正电荷的氨基酸的肽，其通过接头(例如稳定化结构域)邻接至位于羧基末端的具有带负电荷的氨基酸残基的肽。
在多个实施方案中，异二聚体蛋白的形成是由位于第一和第二电荷极化核心结构域的氨基和羧基末端的带正电荷和带负电荷的氨基酸残基之间的静电相互作用驱动的。此外，位于第一和第二电荷极化核心结构域的氨基和羧基末端的带正电荷的氨基酸残基或带负电荷的氨基酸残基之间的排斥作用阻止了同二聚体蛋白的形成。
在多个实施方案中，位于电荷极化核心结构域的氨基或羧基末端的包含带正电荷和/或带负电荷的氨基酸残基的肽的长度是约2至约50个氨基酸。例如，位于电荷极化核心结构域任一末端的包含带正电荷和/或带负电荷的氨基酸残基的肽的长度可以是约50个、约45个、约40个、约35个、约30个、约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约12个、约11个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个、约5个、约4个、约3个或约2个氨基酸。
在多个实施方案中，包含带正电荷的氨基酸残基的肽可包括选自His、Lys和Arg的一个或多个氨基酸。在多个实施方案中，包含带负电荷的氨基酸残基的肽可包括选自Asp和Glu的一个或多个氨基酸。
在多个实施方案中，第一和/或第二电荷极化核心结构域中的每一个均可以包含含有下表中提供的氨基酸序列或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％的同一性的氨基酸序列的肽。
Figure BDA0002942125570000081
例如，在一个实施方案中，第一和第二电荷极化核心结构域中每一个均可以包含含有序列YYnXXnYYnXXnYYn的肽(其中X是带正电荷的氨基酸例如精氨酸、组氨酸或赖氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸；SEQ ID NO：3)。示例性的肽序列包括但不限于RKGGKR(SEQ ID NO：11)或GSGSRKGGKRGS(SEQ ID NO：12)。
在另一个示例性实施方案中，第一和第二电荷极化核心结构域中每一个均可以包含含有序列YYnZZnYYnZZnYYn的肽(其中Z是带负电荷的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)。示例性的肽序列包括但不限于DEGGED(SEQ ID NO：13)或GSGSDEGGEDGS(SEQ ID NO：14)。
在一些实施方案中，以下提供了电荷极化核心结构域(负-正，在本文中也称为“alpha核心结构域”)：
Figure BDA0002942125570000091
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含变体alpha核心结构域。作为示例，该变体可与SEQ ID NO:16具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，以下提供了电荷极化核心结构域(正-负，在本文中也称为“beta核心结构域”)：
Figure BDA0002942125570000092
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含变体beta核心结构域。作为示例，该变体可与SEQ ID NO:17具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在多个实施方案中，包含带电荷的氨基酸残基的肽可以进一步包含一个或多个半胱氨酸残基，以促进静电带电(electrostatically charge)核心结构域之间的二硫键合，作为稳定异二聚体的另一种方法。
在多个实施方案中，第一和第二电荷极化核心结构域中每一个均包含可任选地发挥稳定化结构域的功能的接头序列。在多个实施方案中，接头可以衍生自天然存在的多结构域蛋白，或者是经验性接头，例如在Chichili等人、(2013),蛋白Sci.22(2):153-167，Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369中描述的，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以使用例如在Chen等人,(2013),Adv Drug DelivRev.65(10):1357-1369和Crasto等人,(2000),蛋白Eng.13(5):309-312(其全部内容通过引用并入本文)中描述的接头设计数据库和计算机程序来设计接头。
在一些实施方案中，接头(例如稳定化结构域)是合成接头，例如PEG。
在其他实施方案中，接头(例如稳定化结构域)是多肽。在一些实施方案中，接头(例如稳定化结构域)的长度小于约500个氨基酸，约450个氨基酸，约400个氨基酸，约350个氨基酸，约300个氨基酸，约250个氨基酸，约200个氨基酸，约150个氨基酸或约100个氨基酸。例如，接头(例如稳定化结构域)的长度可以小于约100个，约95个，约90个，约85个，约80个，约75个，约70个，约65个，约60个，约55个，约50个，约45个，约40个，约35个，约30个，约25个，约20个，约19个，约18个，约17个，约16个，约15个，约14个，约13个，约12个，约11个，约10个，约9个，约8个，约7个，约6个，约5个，约4个，约3个或约2个氨基酸。
在多个实施方案中，接头(例如稳定化结构域)主要包含甘氨酸和丝氨酸残基(例如，约30％，或约40％，或约50％，或约60％，或约70％，或约80％，或约90％，或约95％，或约97％的甘氨酸和丝氨酸)。
在各种实施方案中，接头(例如稳定化结构域)是抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及IgA1和IgA2))的铰链区。在IgG、IgA、IgD和IgE类抗体中发现的铰链区用作柔性间隔，允许Fab部分在空间上自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多样的，其序列和长度在不同免疫球蛋白类别和亚类之间变化。例如，铰链区的长度和柔性在不同IgG亚类之间变化。IgG1的铰链区涵盖氨基酸216-231，并且由于它是自由柔性的，故Fab片段可以绕其对称轴旋转并在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球内移动。IgG2的铰链比IgG1短，其具有12个氨基酸残基和4个二硫桥。IgG2的铰链区缺少甘氨酸残基，相对较短，并含有一个通过额外的重链间二硫桥来稳定的刚性多脯氨酸双螺旋。这些性质限制了IgG2分子的柔性。IgG3与其他亚类的不同之处在于其独特的延伸铰链区(约为IgG1铰链的四倍)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成一个非柔性的多脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段距离Fc片段相对较远，这赋予了分子更大的柔性。IgG3中的加长铰链也是其相比于其他亚类分子量较高的原因。IgG4的铰链区比IgG1的铰链区短，并且其柔性介于IgG1和IgG2之间。据报道，铰链区的柔性以IgG3>IgG1>IgG4>IgG2的顺序降低。在其他实施方案中，接头可以衍生自人IgG4并含有一个或多个突变以增强二聚化(包括S228P)或FcRn结合。
根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区可以在功能上进一步细分为三个区域：上铰链区、核心区和下铰链区。参见Shin等人,1992Immunological Reviews 130:87。上铰链区包括从CH1的羧基末端到铰链中第一个限制移动的残基(通常是在两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基)的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的区段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥，且下铰链区连接CH2结构域的氨基末端并包含CH2中的残基。同上。野生型人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，当其通过形成二硫键而二聚化时形成环状八肽，该环状八肽被认为充当枢轴(pivot)而赋予柔性。在多个实施方案中，本发明的接头(例如稳定化结构域)包含任何抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及IgA1和IgA2))的上铰链区、核心区和下铰链区中的一个或两个或三个。铰链区还可以含有一个或多个糖基化位点，其包括许多在结构上类别不同的位点用于碳水化合物结合。例如，IgA1在铰链区的17个氨基酸的区段内含有五个糖基化位点，赋予了铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性，这被认为是分泌性免疫球蛋白的有利性质。在多个实施方案中，本发明的接头(例如稳定化结构域)包含一个或多个糖基化位点。
在多个实施方案中，接头(例如稳定化结构域)包含抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及IgA1和IgA2))的Fc结构域。在多个实施方案中，接头(例如稳定化结构域)包含衍生自人IgG4抗体的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在多个实施方案中，接头(例如稳定化结构域)包含衍生自人IgG1抗体的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域表现出对新生儿Fc受体(neonatal fc receptor，FcRn)的亲和力增加和对其结合增强。在一些实施方案中，Fc结构域包含一个或多个增加对FcRn的亲和力并增强与FcRn的结合的突变。不希望被理论所束缚，认为对FcRn亲和力的增加和与FcRn结合的增强增加了本发明的异二聚体蛋白的体内半衰期。
在一些实施方案中，Fc结构域含有在氨基酸残基250、252、254、256、308、309，311、428、433或434(根据Kabat编号)处的一个或多个氨基酸取代，或其等同物。在一个实施方案中，在氨基酸残基250处的氨基酸取代是用谷氨酰胺取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基252处的氨基酸取代是用酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或苏氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基254处的氨基酸取代是用苏氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基256处的氨基酸取代是用丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或苏氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基308处的氨基酸取代是用苏氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基309处的氨基酸取代是用脯氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基311处的氨基酸取代是用丝氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基385处的氨基酸取代是用精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基386处的氨基酸取代是用苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基387处的氨基酸取代是用精氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基389处的氨基酸取代是用脯氨酸、丝氨酸或天冬酰胺取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基428处的氨基酸取代是用亮氨酸取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基433处的氨基酸取代是用精氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或谷氨酰胺取代。在一个实施方案中，在氨基酸残基434处的氨基酸取代是用组氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸取代。
在一些实施方案中，Fc结构域(例如，包含IgG恒定区)包含在氨基酸残基252、254、256、433、434或436处(根据Kabat编号)的一个或多个突变，例如取代。在一个实施方案中，IgG恒定区包括三重的M252Y/S254T/T256E突变或YTE突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包括三重的H433K/N434F/Y436H突变或KFH突变。在进一步的实施方案中，IgG恒定区包括YTE和KFH突变的组合。
在一些实施方案中，本发明的修饰的人源化抗体包含IgG恒定区，其含有在氨基酸残基250、253、307、310、380、428、433、434和435处的一个或多个突变。示例性突变包括T250Q、M428L、T307A、E380A、I253A、H310A、M428L、H433K、N434A、N434F、N434S和H435A。在一个实施方案中，IgG恒定区包含M428L/N434S突变或LS突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含T250Q/M428L突变或QL突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含N434A突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含T307A/E380A/N434A突变或AAA突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含I253A/H310A/H435A突变或IHH突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含H433K/N434F突变。在另一个实施方案中，IgG恒定区包含M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F突变的组合。
在多个实施方案中，引入突变以增加Fc结构域的稳定性和/或半寿期。示例性的Fc稳定突变体是S228P。其他示例性的Fc半寿期延长突变体是T250Q、M428L、V308T、L309P和Q311S，且本发明的接头(例如稳定化结构域)可以包含这些突变体中的1个、或2个、或3个、或4个、或5个。
在一些实施方案中，缺乏电荷极化的核心结构域具有以下序列：
Figure BDA0002942125570000141
IgG恒定区中的其他示例性突变描述于例如Robbie,等人,Antimicrobial Agents和Chemotherapy(2013),57(12):6147-6153、Dall’Acqua等人,JBC(2006),281(33):23514-24、Dall’Acqua等人,Journal of Immunology(2002),169:5171-80、Ko等人Nature(2014)514:642-645、Grevys等人Journal of Immunology.(2015),194(11):5497-508和U.S.专利号7,083,784中，其全部内容通过引用并入本文。
在多个实施方案中，接头可以是柔性的，包括但不限于高度柔性的。在多个实施方案中，接头可以是刚性的，包括但不限于刚性α螺旋。
在多个实施方案中，接头可以是功能性的。例如但不限于，接头可以起到改善本发明的异二聚体蛋白的折叠和/或稳定性，改善其表达，改善其药代动力学和/或改善其生物活性的作用。在另一个示例中，接头可以起到使异二聚体蛋白靶向特定细胞类型或位置的作用。
在一些实施方案中，核心结构域包含一个或多个“杵臼”(“Knobs-into-holes”)氨基酸改变。“杵臼”氨基酸改变是之前在抗体工程中用于其重链的异二聚化的一种合理的设计策略。参见，例如，Ridgway,J.B.等人“'Knobs-into-holes'engineering of antibodyCH3 domains for heavy chain heterodimerization,”Protein Eng.9(7):617-2(1996)和Carter,“Bispecific human IgG by design.”Immunol.Methods,248(1-2):7-15(2001)，其内容通过引用以其全文并入本文。在此，对氨基酸改变进行工程化以在“alpha”重链的CH3结构域中创建一个“杵”，并在“beta”重链的CH3中创建一个“臼”；或者，在此，对氨基酸改变进行工程化以在“beta”重链的CH3结构域中创建一个“杵”，并在“alpha”重链的CH3中创建一个“臼”。在一个示例中，“杵”以IMGT体积“非常大”的氨基酸类型中的酪氨酸(Y)为代表，而“臼”以IMGT体积“小”的苏氨酸类型中的(T)为代表。氨基酸的IMGT类别的表征描述于Pommié,C.等人,“IMGT standardized criteria for statistical analysis ofimmunoglobulin V-REGION amino acid properties.”J.Mol.Recognit.,17,17-32(2004)中，其内容通过引用以其全文并入本文。在单独的重链上的两个CH3结构域之间的界面中，beta重链中的苏氨酸(T)T22在alpha重链中的酪氨酸(Y)Y86的氢键键合距离之内。Y86是T22的主要域间接触，并且这些氨基酸参与氢键。然而，Y86还与其相对重链上的Y86和赖氨酸(K)K88具有许多范德华接触。
以下是示例性的铰链-CH2-CH3，其包含“杵臼”氨基酸改变并且可用于本发明。以下示例性序列基于IgG1，并且进一步包含其他效应子和补体沉默取代(effector andcomplement silencing substitution)：L234A和L235A(LALA)以及任选的P329G；和半寿期延长突变：M252Y、S254T、T256E。
示例性人IGHG1杵臼“alpha核心结构域”(T22Y)如下所示：
Figure BDA0002942125570000151
示例性人IGHG1杵臼“beta核心结构域”(Y86T)
Figure BDA0002942125570000152
任何可用于本发明的核心结构域均可以包含一个或多个“杵臼”突变。
蛋白亚基
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含两个多肽链。在多个实施方案中，每个多肽链包含第一蛋白的亚基，其通过电荷极化核心结构域连接至第二蛋白的亚基。在电荷极化核心结构域之间的静电相互作用下，亚基被异二聚化以形成功能性二聚第一蛋白和功能性二聚第二蛋白。在一些实施方案中，多肽链形成经由电荷极化核心结构域(其任选包含接头(例如，稳定化结构域)如Fc区)连接的功能性双侧异源二聚体蛋白。
在多个实施方案中，第一和第二蛋白可以是任何具有两个或更多个亚基的多聚体蛋白。在一些实施方案中，第一蛋白和第二蛋白选自细胞因子、生长因子和/或激素。这些细胞因子、生长因子和激素的说明性示例包括但不限于淋巴因子，单核因子，传统多肽激素，包括但不限于集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，例如但不限于IL-18、IL-27和IL-35；白介素受体，例如但不限于IL-2R、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R、IL-7R、IL-9R、IL-10R、IL-11R、IL-12R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-20R、IL-21R、IL-22R、IL-23R、IL-27R、IL-35R；以及其他多肽因子，包括但不限于EGFR、整联蛋白、神经纤维蛋白(neuropilin)和生长抑素(somatostatin)受体。如本文所用，细胞因子、生长因子和激素包括获自天然来源的蛋白或从重组细菌、真核或哺乳动物细胞培养系统产生的蛋白以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是免疫调节剂，例如白介素和干扰素中的一种或多种。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是白介素，包括例如IL-18、IL-27和IL-35，或其片段、变体、类似物或家族成员。白介素是由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞合成的一组多功能细胞因子。已知功能包括刺激免疫细胞(例如T辅助细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)增殖、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的趋化作用和/或干扰素的抑制。可以使用本领域已知的测定法来确定白介素活性：Matthews等人在Lymphokines and Interferons:APractical Approach中，Clemens等人,eds,IRL Press,Washington,D.C.1987,pp.221-225；和Orencole&Dinarello(1989)Cytokine 1,14-20。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是激素，例如生长抑素。
在多个实施方案中，第一和/或第二蛋白是细胞因子、生长因子和/或激素的受体。在一些实施方案中，第一蛋白和/或第二蛋白是I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、趋化因子受体、TGF-β受体、免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体和/或酪氨酸激酶超家族中的受体。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是I型细胞因子受体。I型细胞因子受体是本领域已知的，且包括但不限于IL2(β亚基)、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、IL12、GM-CSF、G-CSF、LIF、CNTF的受体，以及血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、催乳素(prolactin)和生长激素的受体。示例性的I型细胞因子受体包括但不限于GM-CSF受体、G-CSF受体、LIF受体、CNTF受体、TPO受体和I型IL受体。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是II型细胞因子受体。II型细胞因子受体是包含异源亚基的多聚体受体，并且主要是干扰素的受体。该受体家族包括但不限于针对干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ、IL10、IL22和组织因子的受体。示例性的II型细胞因子受体包括但不限于IFN-α受体(例如IFNAR1和IFNAR2)、IFN-β受体、IFN-γ受体(例如IFNGR1和IFNGR2)和II型IL受体。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是G蛋白偶联受体。趋化因子受体是具有七个跨膜结构的G蛋白偶联受体，并与G蛋白偶联以进行信号转导。趋化因子受体包括但不限于CC趋化因子受体、CXC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体和XC趋化因子受体(XCR1)。示例性趋化因子受体包括但不限于CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CSCR6、CXCR7、XCR1和CX3CR1。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是TGF-β受体。TGF-β受体是单次跨膜(single pass)丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β受体包括但不限于TGFBR1、TGFBR2和TGFBR3。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是Ig超家族受体。免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体与免疫球蛋白具有结构性同源。Ig超家族中的受体包括但不限于白介素-1受体、CSF-1R、PDGFR(例如PDGFRA和PDGFRB)和SCFR。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是B7超家族成员。B7超家族的成员彼此之间具有结构性同源。该家族的成员包括但不限于CD28、CD80、CD86、ICOS、ICOSL、B7-H3、B7-H4、PD-1、PD-L1、PD-L2等。
在一些实施方案中，第一和/或第二蛋白是酪氨酸激酶超家族受体。酪氨酸激酶超家族中的受体是本领域公知的。大约有58种已知的受体酪氨酸激酶(RTK)，分为20个亚家族。酪氨酸激酶超家族中的受体包括但不限于FGF受体及其各种同工型，例如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR5。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是包含IFNAR1和/或IFNAR2亚基的IFN-α/β受体(IFNAR)。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是包含IFNGR1(也称为IFNgR)和IFNGR2亚基的干扰素-γ受体(IFNGR)。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是VEGF受体，包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。
在本文公开的任何异二聚体蛋白中，氨基或羧基末端是天然异二聚体的，并且其中相对末端上的蛋白不是天然异二聚体的。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-1的受体，例如IL-1R1和/或IL-1RAcP。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-2的受体，例如IL-2Rα或IL-2Rβ或IL-2Rγ。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-3的受体，其是具有与共同的β(βc或CD131)亚基配对的独特α链的异二聚体。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-4的受体，例如1型或2型IL-4受体。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-6的受体，其是细胞表面I型细胞因子受体复合物，包括配体结合IL-6R链(CD126或IL-6Rα)和信号转导组分gp130。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-10的受体，例如IL-10受体-1和IL-10受体-2。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-11的受体，例如IL-11Rα或IL-11Rβ或gp130。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-12的受体，例如IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-13的受体，例如IL-4受体(IL-4Rα)或IL-13Rα1。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-18。在另一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-18的受体，例如IL-18Rα和/或IL-18Rβ。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-21的受体，其是包括包含IL-21r和IL-2rg的配体结合IL-21R链的细胞表面I型细胞因子受体复合物。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-33的受体，例如ST-2受体或IL-1RAcP。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-35(例如包含IL12α和IL27β亚基)。在另一个示例性实施方案中，第一和/或第二蛋白是IL-35的受体，例如包含IL6Rα和gp130亚基的IL-35受体。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是EGP的受体，例如EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3和ErbB4。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是胰岛素或胰岛素类似物的受体，例如胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体。
在一个示例性的实施方案中，第一和/或第二蛋白是EPO的受体，例如EPO受体(EPOR)受体和/或肝配蛋白(ephrin)受体(EphR)。
在多个实施方案中，第一和第二蛋白可包含可溶性(例如，非膜结合的)蛋白的结构域。在多个实施方案中，第一和第二蛋白可包含参与信号传导的可溶性蛋白的片段(例如，与受体相互作用的可溶性蛋白的一部分)。
在多个实施方案中，第一和第二蛋白可包含跨膜蛋白的细胞外结构域。在多个实施方案中，其中一个细胞外结构域转导免疫抑制信号并且其中一个细胞外结构域转导免疫刺激信号。
在一些实施方案中，细胞外结构域是指能够与细胞外环境相互作用的跨膜蛋白的一部分。在多个实施方案中，细胞外结构域是指跨膜蛋白的一部分，其足以与配体或受体结合并有效地将信号传递给细胞。在多个实施方案中，细胞外结构域是在细胞或细胞膜外部的跨膜蛋白的整个氨基酸序列。在多个实施方案中，细胞外结构域是跨膜蛋白的氨基酸序列的一部分，其在细胞或细胞膜的外部并为信号转导和/或配体结合所需要，如可使用本领域已知的方法(例如，体外配体结合和/或细胞活化测定法)进行测定。
在一些实施方案中，免疫抑制信号是指减弱或消除免疫应答的信号。例如，在肿瘤学领域，这种信号可以减弱或消除抗肿瘤免疫力。在正常的生理条件下，抑制信号可用于维持自身耐受(例如防止自身免疫)，并且在免疫系统对病原体感染作出应答时还可用于保护组织免受损害。例如但不限于，可以通过在阻断这种抑制信号时检测细胞增殖、细胞因子产生、细胞杀伤活性或吞噬活性的增加，来识别免疫抑制信号。
在一些实施方案中，免疫刺激信号是指增强免疫应答的信号。例如，在肿瘤学领域，这种信号可以增强抗肿瘤免疫力。例如但不限于，可以通过直接刺激白细胞的增殖、细胞因子产生、杀伤活性或吞噬活性来识别免疫刺激信号。具体示例包括使用编码针对这些受体的配体(分别是IL-2、IL-7、IL-15、IL-17或IL-21)的融合蛋白直接刺激细胞因子受体例如IL-2R、IL-7R、IL-15R、IL-17R或IL-21R。来自任一这些受体的刺激均可以直接刺激单个T细胞亚群的增殖和细胞因子产生。
在一些实施方案中，可使用细胞外结构域产生可溶性蛋白以竞争性抑制通过那个受体的配体的信号传导。例如但不限于，可以使用PD-1实现对PD-L1或PD-L2的竞争性抑制，或者可以使用TIGIT实现对PVR的竞争性抑制。在一些实施方案中，可使用细胞外结构域提供人工信号传导。
在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白递送或遮蔽免疫抑制信号。在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白递送或遮蔽免疫刺激信号。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含两个独立的结合结构域，它们每个来自异二聚的人蛋白的一个亚基。表1提供了可以形成作为本发明的异二聚体蛋白的一部分的示例性蛋白。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白具有一个表1中提供的示例性蛋白。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白具有两个表1中提供的示例性蛋白。
表1
可并入本发明的组合物和方法中的示例性蛋白包括以下(如本文所用，“条目(entry)”是指Uniprot数据库中的蛋白条目，且“条目名称”是指Uniprot数据库中的蛋白条目)：
Figure BDA0002942125570000201
Figure BDA0002942125570000211
Figure BDA0002942125570000221
Figure BDA0002942125570000231
Figure BDA0002942125570000241
Figure BDA0002942125570000251
Figure BDA0002942125570000261
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Figure BDA0002942125570000411
在多个实施方案中，可以将本发明的异二聚体蛋白工程化以靶向驻留在人白细胞上的一种或多种分子，包括但不限于以下的细胞外结构域(如果适用)：SLAMF4、IL-2Rα、IL-2Rβ、ALCAM、B7-1、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMFS、CEACAM1、IL-6R、IL-7Rα、IL-10Rα、IL-l 0Rβ、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2、CD2、IL-13Rα1、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CDS5j、ILT3/CDS5k、ILT4/CDS5d、ILT5/CDS5a、lutegrinα4/CD49d、CDS、整联蛋白αE/CD103、CD6、整联蛋白αM/CD 11b、CDS、整联蛋白αX/CD11c、整联蛋白β2/CDlS、KIR/CD15S、KIR2DL1、CD2S、KIR2DL3、KIR2DL4/CD15Sd、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CDS3、白三烯B4-R1、CDS4/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、共同γ链/IL-2Rγ、骨桥蛋白、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、CX3CR1、CX3CL1、L-选择素、SIRPβ1、SLAM、TCCR/WSX-1、DNAM-1、胸腺生成素(Thymopoietin)、EMMPRIN/CD147、TIM-1、EphB6、TIM-2、TIM-3、TIM-4、FcγRIII/CD16、TIM-6、粒溶蛋白(Granulysin)、ICAM-1/CD54、ICAM-2/CD102、IFN-γR1、IFN-γR2、TSLP、IL-1R1和TSLP R。
在一些实施方案中，可以将本发明的异二聚体蛋白工程化以靶向一种或多种参与免疫抑制的分子，包括例如：CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA/VSIG8、KIR、2B4、TIGIT、CD160(也称为BY55)、CHK1和CHK2激酶、A2aR、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)以及各种B-7家族配体(包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7)。
在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含免疫抑制剂的细胞外结构域。
在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含具有免疫抑制性的可溶性蛋白或膜蛋白的细胞外结构域。
在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白模拟了抑制性信号配体与其同源受体的结合，但抑制抑制信号传输至免疫细胞(例如T细胞、巨噬细胞或其他白细胞)。
在多个实施方案中，异二聚体蛋白包含免疫抑制受体细胞外结构域和免疫刺激配体细胞外结构域，它们可以但不限于将免疫刺激递送至T细胞，同时掩蔽肿瘤细胞的免疫抑制信号。在多个实施方案中，异二聚体蛋白递送具有T细胞激活的最终结果(net result)的信号。
在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白包含具有免疫刺激性质的可溶性蛋白或膜蛋白的细胞外结构域。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含Gp130的细胞外结构域。Gp130(也称为白介素-6受体亚基β、IL-6R-β、IL-6RB和IL-6ST)是一种信号转导分子。IL6、LIF、OSM、CNTF、IL11、CTF1和BSF3的受体系统可以利用Gp130来启动信号传输。IL6与IL6R的结合诱导IL6ST均二聚化并形成高亲和力的受体复合物，其激活Janus激酶。这导致Gp130酪氨酸残基的磷酸化，其转而激活STAT3。Gp130介导调控免疫反应、造血、疼痛控制和骨代谢的信号(通过相似性)。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含Gp130的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与Gp130(例如人Gp130)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，Gp130的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000431
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含Gp130的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO:18具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择Gp130的已知氨基酸序列的变体，例如Hibi等人,“Molecular cloning and expression of an IL-6signal transducer,gp130”Cell 63(6),1149-1157(1990)；Waetzig等人,“N-linked glycosylation is essentialfor the stability but not the signaling function of the interleukin-6signaltransducer glycoprotein 130”,J.Biol.Chem.285(3),1781-1789(2010)；Schutt等人,“gp130 activation is regulated by D2-D3 interdomain connectivity”,Biochem.J.450(3),487-496(2013)；Bravo等人,“Crystal structure of a cytokine-binding region of gp130”,EMBO J.17(6),1665-1674(1998)；Chow等人,“Structure ofan extracellular gp130 cytokine receptor signaling complex”,Science 291(5511),2150-2155(2001)；Boulanger等人,“Hexameric structure and assembly of theinterleukin-6/IL-6alpha-receptor/gp130 complex”,Science 300(5628),2101-2104(2003)；Xu等人,“Crystal structure of the entire ectodomain of gp130:insightsinto the molecular assembly of the tall cytokine receptor complexes”,J.Biol.Chem.285(28),21214-21218(2010)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-6RA的细胞外结构域。IL-6RA(也称为白介素-6受体亚基α、IL-6受体亚基α、IL-6R亚基α和IL-6R-α)是白介素6受体的一部分，其以低亲和力与IL6结合，但并不转导信号。信号激活需要与gp130的结合。激活可以导致免疫反应、急性期反应和造血功能的调控。低浓度的可溶形式的IL6受体充当IL6活性的激动剂。IL6和该受体的生产失调与许多疾病例如多发性骨髓瘤、自身免疫疾病和前列腺癌的发病机理有关。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-6RA的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IL-6RA(例如人IL-6RA)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IL-6RA的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000451
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IL-6RA的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO:19具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IL-6RA的已知氨基酸序列的变体，例如Yamasaki等人,“Cloning and expression of the human interleukin-6(BSF-2/IFNbeta 2)receptor”Science 241(4867),825-828(1988)；Buk等人,“Increasedassociation with detergent-resistant membranes/lipid rafts of apicallytargeted mutants of the interleukin-6receptor gp80”Eur.J.Cell Biol.84(10),819-831(2005)；Yawata等人,Structure-function analysis of human IL-6receptor:dissociation of amino acid residues required for IL-6-binding and for IL-6signal transduction through gp130”EMBO J.12(4),1705-1712(1993)；Horiuchi等人,“Soluble interleukin-6receptors released from T cell or granulocyte/macrophage cell lines and human peripheral blood mononuclear cells aregenerated through an alternative splicing mechanism”Eur.J.Immunol.24(8),1945-1948(1994)；Boulanger等人,“Hexameric structure and assembly of theinterleukin-6/IL-6alpha-receptor/gp130 complex”,Science 300(5628),2101-2104(2003)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-12A的细胞外结构域。IL-12A(也称为白介素-12亚基α和IL-12亚基p35)是一种细胞因子，其能充当活化的T和NK细胞的生长因子，增强NK/淋巴因子活化的杀伤细胞的裂解活性，并刺激静息PBMC产生IFN-γ。该细胞因子是由该基因编码的35kD亚基和细胞因子受体家族成员40kD亚基组成的二硫键连接的异二聚体。该细胞因子是干扰素γ(INF-γ)的T细胞依赖性诱导所必需的，并且对于Th1和Th2细胞的分化都是重要的。淋巴细胞对该细胞因子的应答由转录蛋白STAT4的激活物介导。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-12A的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IL-12A(例如人IL-12A)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IL-12A的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000461
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IL-12A的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO：20具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO：20的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IL-12A的已知氨基酸序列的变体，例如Wolf等人,“Cloning of cDNA for natural killer cell stimulatory factor,aheterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killercells”,J.Immunol.146(9),3074-3081(1991)；Devergne等人,“Epstein-Barr virus-induced gene 3and the p35 subunit of interleukin 12form a novel heterodimerichematopoietin”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(22),12041-12046(1997)；Yoon等人,“Charged residues dominate a unique interlocking topography in theheterodimeric cytokine interleukin-12”,EMBO J.19(14),3530-3541(2000)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-27B的细胞外结构域。IL-27b(也称为白介素-27亚基β、IL-27亚基β和IL-27B)与IL-12a一起形成白介素35(IL-35)。IL-35是由IL-12α和IL-27β链组成的二聚体蛋白，其分别由称为IL12A和EBI3的两个独立基因编码。IL-27具有促炎和抗炎性质，其可调控T辅助细胞的发育，抑制T细胞增殖，刺激细胞毒性T细胞活性，诱导B细胞中的同种型转换，并对先天免疫细胞具有多种作用。IL-27基因通过在应答爱泼斯坦-巴尔病毒感染时其在B淋巴细胞中的诱导表达来鉴定。IL-27部分通过激活CD4+T细胞的Jak/STAT通路来调控T细胞和炎症应答。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-27B的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IL-27B(例如人IL-27B)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IL-27B的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000481
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IL-27B的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO：21具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO：21的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IL-27B的已知氨基酸序列的变体，例如Devergne“Epstein-Barr virus-induced gene 3and the p35 subunit of interleukin12form a novel heterodimeric hematopoietin”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(22),12041-12046(1997)；Pflanz等人,“IL-27,a heterodimeric cytokine composed of EBI3and p28 protein,induces proliferation of naive CD4+T cells”,Immunity 16(6),779-790(2002)；Batten和Ghilardi“The biology and therapeutic potential ofinterleukin 27”,J.Mol.Med.85(7),661-672(2007)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的alpha链包含：(1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“Gp130-Alpha-IL12A”。
在实施方案中，用于本发明的Gp130-Alpha-IL12A链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000491
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的beta链包含：(1)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：25至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“IL6RA-Beta-IL27B”。在一些实施方案中，本发明中使用的IL6RA-Beta-IL27B链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000501
当Gp130-Alpha-IL12A链和IL6RA-Beta-IL27B链结合(在细胞内或体外)时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中称为IL-6R-Fc-IL-35。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-21r的细胞外结构域。白介素-21受体(也称为IL-21受体和IL-21R)是白介素-21的受体，属于I型细胞因子受体，并已显示其与共同的γ链(也是白介素2、4、7、9和15的受体共有的受体亚基)形成异二聚体受体复合体。该受体转导IL21的促生长信号，并且对于T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞的增殖和分化是重要的。该受体的配体结合导致多个下游信号传导分子(包括JAK1、JAK3、STAT1和STAT3)的激活。小鼠中类似基因的敲除研究表明了该基因在调控免疫球蛋白生产中的作用。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL-21r的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IL-21r(例如人IL-21r)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IL-21r的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000511
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IL-21r的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO：26具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IL-21r的已知氨基酸序列的变体，例如Ozaki等人,“Cloning of a type I cytokine receptor most related to the IL-2receptor beta chain”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(21),11439-11444(2000)；Kotlarz等人,“Loss-of-function mutations in the IL-21receptor gene cause aprimary immunodeficiency syndrome”J.Exp.Med.210(3),433-443(2013)；Hamming等人,“Crystal structure of interleukin-21receptor(IL-21R)bound to IL-21revealsthat sugar chain interacting with WSXWS motif is integral part of IL-21R”J.Biol.Chem.287(12),9454-9460(2012)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL2RG的细胞外结构域。白介素-2受体亚基γ(也称为细胞因子受体共同亚基γ、IL-2受体亚基γ、IL-2R亚基γ和IL-2RG)是多个白介素的受体(包括白介素-2、-4，-7和-21的受体)的共同亚基，因此被称为共同的γ链。该基因中的突变会导致X连锁重度联合免疫缺陷(XSCID)，以及X连锁联合免疫缺陷(XCID)(较不严重的免疫缺陷病症)。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IL2RG的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IL2RG(例如人IL2RG)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IL2RG的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000521
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IL2RG的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO：27具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IL2RG的已知氨基酸序列的变体，例如Takeshita等人,“Cloning of the gamma chain of the human IL-2receptor”,Science257(5068),379-382(1992)；Ratthe等人,“Interleukin-15enhances human neutrophilphagocytosis by a Syk-dependent mechanism:importance of the IL-15Ralphachain”,J.Leukoc.Biol.76(1),162-168(2004)；Bamborough等人,“The interleukin-2andinterleukin-4receptors studied by molecular modelling”,Structure 2(9),839-851(1994)；Wang等人,“Structure of the quaternary complex of interleukin-2with itsalpha,beta,and gammac receptors”Science 310(5751),1159-1163(2005)；Stauber等人,“Crystal structure of the IL-2signaling complex:paradigm for aheterotrimeric cytokine receptor”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103(8),2788-2793(2006)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的alpha链包含：(1)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“IL21r-Alpha-IL12a”。
在一些实施方案中，用于本发明的IL21r-Alpha-IL12a链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000541
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的beta链包含：(1)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：25至少95％同一的氨基酸序列。这样的beta链可以称为“IL2rg-Beta-IL27B”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IL2rg-Beta-IL27B链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000542
当IL21r-Alpha-IL12a链和IL2rg-Beta-IL27B链结合(在细胞内或体外)时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中称为IL-21R-Fc-IL-35。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的alpha链包含：(1)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：25至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“IL21r-Beta-IL12a”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IL21r-Beta-IL12a链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000551
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的beta链包含：(1)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24至少95％同一的氨基酸序列。这样的beta链可以称为“IL2rg-Alpha-IL27B”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IL2rg-Alpha-IL27B链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000552
当IL21r-Beta-IL12a链和IL2rg-Alpha-IL27B链结合(在细胞内或体外)时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中也可以称为IL-21R-Fc-IL-35。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IFNgR的细胞外结构域。IFNgR(也称为干扰素γ受体1、IFN-γ受体1、IFN-γ-R1、IFN-γ-R-α、IFNγR和IFNGR1)与IFNGR2结合以形成细胞因子干扰素γ(IFNG)的受体。配体结合刺激了JAK/STAT信号传导通路的激活。它在对传染物质的细胞应答所需的IFN-γ通路中起着至关重要的作用。IFNGR1中的遗传变异与对幽门螺杆菌感染的易感性有关。此外，IFNGR1中的缺陷是孟德尔遗传易感分枝杆菌病(也称为家族性散播性非典型分枝杆菌感染)的原因。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IFNgR的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IFNgR(例如人IFNgR)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在实施方案中，IFNgR的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000561
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IFNgR的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO：30具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO：30的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IFNgR的已知氨基酸序列的变体，例如Aguet等人,“Molecular cloning and expression of the human interferon-gammareceptor”Cell 55(2),273-280(1988)；Stuber等人,“Alignment of disulfide bonds ofthe extracellular domain of the interferon gamma receptor and investigationof their role in biological activity”,Biochemistry 32(9),2423-2430(1993)；Sakatsume等人,“The Jak kinases differentially associate with the alpha andbeta(accessory factor)chains of the interferon gamma receptor to form afunctional receptor unit capable of activating STAT transcription factors”,J.Biol.Chem.270(29),17528-17534(1995)；Walter等人,“Crystal structure of acomplex between interferon-gamma and its soluble high-affinity receptor”,Nature 376(6537),230-235(1995)；Sogabe等人,“Neutralizing epitopes on theextracellular interferon gamma receptor(IFNgammaR)alpha-chain characterizedby homolog scanning mutagenesis and X-ray crystal structure of the A6fab-IFNgammaR1-108 complex”,J.Mol.Biol.273(4),882-897(1997)；Thiel等人,“Observation of an unexpected third receptor molecule in the crystalstructure of human interferon-gamma receptor complex”,Structure 8(9),927-936(2000)；van de Wetering等人,“Functional analysis of naturally occurring aminoacid substitutions in human IFN-gammaR1.”Mol.Immunol.47:1023-1030(2010)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IFNGR2的细胞外结构域。IFNGR2(也称为干扰素γ受体2，也称为IFN-γ受体2和IFN-γ-R2)是γ干扰素受体的非配体结合β链。人干扰素-γ受体是IFNGR1和IFNGR2的异二聚体。配体结合刺激了JAK/STAT信号传导通路的激活。相对于负责配体结合的其他受体亚基，IFNGR2是信号转导所必需的。IFNGR2中的缺陷是孟德尔遗传易感分枝杆菌病(MSMD)(也称为家族性散播性非典型分枝杆菌感染)的原因。MSMD是具有常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传或X连锁遗传的遗传异质性疾病。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体蛋白包含IFNGR2的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与IFNGR2(例如人IFNGR2)的已知氨基酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，IFNGR2的细胞外结构域具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000581
在一些实施方案中，异二聚体蛋白包含IFNGR2的细胞外结构域的变体。作为示例，该变体可与SEQ ID NO：31具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白的一条链包含与SEQ ID NO：31的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列。
普通技术人员可以通过参考文献来选择IFNGR2的已知氨基酸序列的变体，例如Soh等人,“Identification and sequence of an accessory factor required foractivation of the human interferon gamma receptor”,Cell 76(5),793-802(1994)；Sakatsume等人,“The Jak kinases differentially associate with the alpha andbeta(accessory factor)chains of the interferon gamma receptor to form afunctional receptor unit capable of activating STAT transcription factors”,J.Biol.Chem.270(29),17528-17534(1995)；Rosenzweig等人,“Characterization of adipeptide motif regulating IFN-gamma receptor 2plasma membrane accumulationand IFN-gamma responsiveness”,J.Immunol.173(6),3991-3999(2004)；Mikulecky等人,“Crystal structure of human interferon-gamma receptor 2reveals the structuralbasis for receptor specificity”,Acta Crystallogr.D 75,1017-1024(2016)；Kotenko等人,“Interaction between the components of the interferon gamma receptorcomplex.”J.Biol.Chem.270:20915-20921(1995)，以上通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的alpha链包含：(1)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“IFNgR-Alpha-IL12a”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IFNgR-Alpha-IL12a链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000591
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的beta链包含：(1)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：25至少95％同一的氨基酸序列。这样的beta链可以称为“IFNGR2-Beta-IL27B”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IFNGR2-Beta-IL27B链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000601
当IFNgR-Alpha-IL12a链和IFNGR2-Beta-IL27B链结合(在细胞内或体外)时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中称为IFNγR-Fc-IL-35。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的alpha链包含：(1)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：25至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“IFNgR-Beta-IL12a”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IFNgR-Beta-IL12a链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000611
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的beta链包含：(1)包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24至少95％同一的氨基酸序列。这样的beta链可以称为“IFNGR2-Alpha-IL27B”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IFNGR2-Alpha-IL27B链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000612
当IFNgR-Beta-IL12a链和IFNGR2-Alpha-IL27B链结合(在细胞内或体外)时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中也可以称为IFNγR-Fc-IL-35。
上文公开了IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的一个实施方案，即包含Gp130-Alpha-IL12A链和IL6RA-Beta-IL27B链。在替代实施方案中，IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白可以包含IL6RA-Alpha-IL12a链和Gp130-Beta-IL27b。
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的alpha链包含：(1)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24至少95％同一的氨基酸序列。这样的alpha链可以称为“IL6RA-Alpha-IL12a”。
在一些实施方案中，本发明中使用的IL6RA-Alpha-IL12a链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000621
在一些实施方案中，可用于本发明的异二聚体嵌合蛋白的beta链包含：(1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的第一结构域，或其变体，(b)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的第二结构域，或其变体，以及(c)alpha核心结构域或其变体，其包含与SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：25至少95％同一的氨基酸序列。这样的beta链可以称为“Gp130-Beta-IL27b”。
在一些实施方案中，本发明中使用的Gp130-Beta-IL27b链具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0002942125570000622
当IL6RA-Alpha-IL12a链和Gp130-Beta-IL27b链结合(在细胞内或体外)时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中也可以称为IL-6R-Fc-IL-35。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白可包含任何已知细胞因子、生长因子和/或激素的变体。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白可包含细胞因子、生长因子和/或激素的任何已知受体的变体。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白可包含任何已知的细胞外结构域的变体，例如，与已知氨基酸或核酸序列具有至少约60％，或至少约61％，或至少约62％，或至少约63％，或至少约64％，或至少约65％，或至少约66％，或至少约67％，或至少约68％，或至少约69％，或至少约70％，或至少约71％，或至少约72％，或至少约73％，或至少约74％，或至少约75％，或至少约76％，或至少约77％，或至少约78％，或至少约79％，或至少约80％，或至少约81％，或至少约82％，或至少约83％，或至少约84％，或至少约85％，或至少约86％，或至少约87％，或至少约88％，或至少约89％，或至少约90％，或至少约91％，或至少约92％，或至少约93％，或至少约94％，或至少约95％，或至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％的序列同一性的序列。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白可包含相对于任何已知蛋白序列具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，该一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。
在一些实施方案中，氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
可以例如基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行“保守取代”。20种天然存在的氨基酸可分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水的：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr，Asn、Gln；(3)酸性的：Asp、Glu；(4)碱性的：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；以及(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
如本文所用，“保守取代”定义为将一种氨基酸交换为上面显示的六个标准氨基酸组的同一组中列出的另一种氨基酸。例如，将Asp交换为Glu在如此修饰的多肽中保留了一个负电荷。另外，基于甘氨酸和脯氨酸破坏α-螺旋的能力，它们可以互相取代。
如本文所用，“非保守取代”定义为将一种氨基酸交换为在上面显示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一种氨基酸。
在多个实施方案中，取代还可以包括一般的非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butylalanine)、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计师氨基酸(designer amino aicd)例如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及氨基酸类似物)。
还可以参考遗传密码，包括考虑密码子简并性，对异二聚体蛋白的核苷酸序列进行突变。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够并且可以用于包括促进免疫活化(例如，针对肿瘤)的方法中。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够并且可以用于包括阻抑免疫抑制(例如，该免疫抑制允许肿瘤存活)的方法中。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白提供改善的免疫活化和/或改善的对免疫抑制的阻抑。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够或可以用于包括调节免疫应答的幅度，例如调节效应子输出水平的方法。在一些实施方案中，例如，当用于治疗癌症时，与免疫抑制相比，本发明的异二聚体蛋白改变了免疫刺激的程度以增加T细胞应答的幅度，包括但不限于刺激细胞因子产生水平、增殖或目标杀伤力的增加。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白在一些实施方案中能够或发现可用于涉及掩蔽肿瘤细胞表面上的抑制性配体并将该免疫抑制性配体替换为免疫刺激性配体的方法中。因此，本发明的异二聚体蛋白在一些实施方案中能够或发现可用于涉及减少或消除抑制性免疫信号和/或增加或激活免疫刺激性信号的方法中。例如，携带抑制性信号(从而逃避免疫应答)的肿瘤细胞可被取代为结合在T细胞上的阳性信号(其然后可以攻击肿瘤细胞)。因此，在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白掩蔽抑制性免疫信号，并激活刺激性免疫信号。通过本发明的异二聚体蛋白的单一构建方法(single construct approach)增强了这些有益性质。例如，信号替换可以几乎同时起效，并且信号替换经定制而局部位于具有临床重要性的部位(例如，肿瘤微环境)。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够或发现可用于包括刺激或增强免疫刺激性受体/配体对的结合的方法中。
在其他实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够或发现可用于涉及增强、恢复、促进和/或刺激免疫调节的方法中。在一些实施方案中，本文所述的本发明的异二聚体蛋白恢复、促进和/或刺激一种或多种针对肿瘤细胞的免疫细胞的活性或活化，所述免疫细胞包括但不限于：T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如M1巨噬细胞)、B细胞和树突细胞。在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白增强、恢复、促进和/或刺激T细胞的活性和/或活化，以非限制性示例的方式包括激活和/或刺激一种或多种T细胞内源信号，包括促生存信号；自分泌或旁分泌生长信号；p38 MAPK-、ERK-、STAT-、JAK-、AKT-或PI3K-介导的信号；抗凋亡信号；和/或促进以下的一种或多种和/或为其所必需的信号：促炎性细胞因子的产生或T细胞迁移或T细胞肿瘤浸润。
在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够或发现可用于涉及引起以下一种或多种细胞在肿瘤或肿瘤微环境的增加：T细胞(包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤T(NKT)细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞(例如M1和M2中的一个或多个)。在一些实施方案中，本发明的异源二聚体蛋白能够或发现可用于涉及抑制和/或引起免疫抑制细胞(例如髓源性抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)、肿瘤相关的嗜中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞和肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))募集到肿瘤或肿瘤微环境的减少。在一些实施方案中，本发明的疗法可以改变肿瘤部位和/或TME中M1与M2巨噬细胞的比例以偏好M1巨噬细胞。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够并且可以用于包括抑制和/或减少T细胞失活和/或对肿瘤的免疫耐受的方法，包括将有效量的本文所述的异二聚体蛋白施用给受试者。在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够增加各种细胞因子的血清水平，所述细胞因子包括但不限于以下的一种或多种：IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-17F和IL-22。在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够增强经治疗的受试者的血清中的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-22或IFNγ。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白抑制、阻断和/或减少抗肿瘤CD8+和/或CD4+T细胞的细胞死亡；或刺激、诱导和/或增加促肿瘤T细胞(pro-tumor T cell)的细胞死亡。T细胞衰竭是T细胞功能障碍的一种状态，其特征在于增殖和效应功能逐渐丧失，以克隆缺失告终。因此，促肿瘤T细胞是指在许多慢性感染和癌症期间出现的T细胞功能障碍的状态。该功能障碍定义为不良的增殖和/或效应子功能、抑制性受体的持续表达以及不同于功能性效应子或记忆T细胞状态的转录状态。衰竭阻止了对感染和肿瘤的最佳控制。另外，抗肿瘤CD8+和/或CD4+T细胞是指可以对肿瘤进行免疫应答的T细胞。示例性促肿瘤T细胞包括但不限于Treg、表达一种或多种检查点抑制性受体的CD4+和/或CD8+T细胞、Th2细胞和Th17细胞。检查点抑制性受体是指在免疫细胞上表达的可预防或抑制不受控制的免疫应答的受体(例如CTLA-4、B7-H3、B7-H4、TIM-3)。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够并且可以用于包括增加效应T细胞与调节性T细胞的比例的方法中。示例性效应T细胞包括ICOS+效应T细胞；细胞毒性T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD8+、CD45RO+)；CD4+效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+、CCR7+、CD62Lhi、IL-7R/CD127+)；CD8+效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD8+、CCR7+、CD62Lhi、IL-7R/CD127+)；效应记忆T细胞(例如CD62L低、CD44+、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+、CCR7低)；中央记忆T细胞(例如CCR7+、CD62L+、CD27+；或CCR7hi、CD44+、CD62Lhi、TCR、CD3+、IL-7R/CD127+、IL-15R+)；CD62L+效应T细胞；CD8+效应记忆T细胞(TEM)，包括早期效应记忆T细胞(CD27+CD62L-)和晚期效应记忆T细胞(CD27-CD62L-)(分别为TemE和TemL)；CD127(+)CD25(低/-)效应T细胞；CD127(-)CD25(-)效应T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞(TSCM)(例如CD44(低)CD62L(高)CD122(高)sca(+))；TH1效应T细胞(例如CXCR3+、CXCR6+和CCR5+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-12R+、IFNγR+、CXCR3+)、TH2效应T细胞(例如CCR3+、CCR4+和CCR8+；或αβTCR、CD3+、CD4+、IL-4R+、IL-33R+、CCR4+、IL-17RB+、CRTH2+)；TH9效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+)；TH17效应T细胞(例如αβTCR、CD3+、CD4+、IL-23R+、CCR6+、IL-1R+)；CD4+CD45RO+CCR7+效应T细胞、CD4+CD45RO+CCR7(-)效应T细胞；和分泌IL-2、IL-4和/或IFN-γ的效应T细胞。示例性调节性T细胞包括ICOS+调节性T细胞、CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞、CD4+CD25-调节性T细胞、CD4+CD25高调节性T细胞、TIM-3+PD-1+调节性T细胞、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)+调节性T细胞、CTLA-4/CD152+调节性T细胞、神经纤毛蛋白1(Nrp-1)+调节性T细胞、CCR4+CCR8+调节性T细胞、CD62L(L-选择素)+调节性T细胞、CD45RB低调节性T细胞、CD127低调节性T细胞、LRRC32/GARP+调节性T细胞、CD39+调节性T细胞、GITR+调节性T细胞、LAP+调节性T细胞、1B11+调节性T细胞、BTLA+调节性T细胞、1型调节性T细胞(Tr1细胞)、T辅助3型(Th3)细胞、自然杀伤T细胞表型调节性细胞(NKTreg)、CD8+调节性T细胞、CD8+CD28-调节性T细胞和/或分泌IL-10、IL-35、TGF-β、TNF-α、半乳凝素-1、IFN-γ和/或MCP1的调节性T细胞。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够并且可以用于包括瞬时刺激效应T细胞时间不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或约1周或约2周的方法。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白能够并且可以用于包括瞬时消耗或抑制调节性T细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或约1周或约2周的方法。在多个实施方案中，对效应T细胞的瞬时刺激和/或对调节性T细胞的瞬时消耗或抑制基本上发生在患者的血液中或特定的组织/部位中，包括淋巴组织例如骨髓、淋巴结、脾、胸腺、粘膜相关淋巴组织(MALT)、非淋巴组织或肿瘤微环境中。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白提供了包括但不限于易于使用和易于生产的优点。这是因为将两种不同的免疫治疗剂组合成单个产品，其允许了单个制造过程而不是两个独立的制造过程。另外，施用单一药剂而不是两种分开的药剂允许更容易的施用和更大的患者依从性。而且，与例如单克隆抗体(含有许多二硫键和翻译后修饰(例如糖基化)的大型多聚蛋白)相比，本发明的异二聚体蛋白的制造更容易并且更具成本效益。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白提供了协同的治疗效果，因为其允许两种免疫治疗剂的改善的位点特异性相互作用。在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白提供了减少脱位(off-site)和/或全身毒性的潜力。
疾病；治疗方法和患者选择
在多个实施方案中，本发明涉及异二聚体蛋白在治疗一种或多种自身免疫疾病或病症中的用途。在多个实施方案中，治疗自身免疫疾病或病症可涉及用本发明的异二聚体蛋白调节免疫系统，以偏好免疫抑制胜过免疫刺激。用本发明的异二聚体蛋白可治疗的示例性自身免疫疾病或病症包括机体自身抗原成为免疫应答靶标的那些疾病或病症，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、糖尿病(diabetes mellitus)、强直性脊柱炎、干燥综合征、炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)、多发性硬化、结节病、银屑病、格雷夫斯病(Grave's disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、银屑病、超敏反应(例如过敏、花粉症、哮喘和急性水肿引起的I型超敏反应)和血管炎。
可以使用本发明的异二聚体蛋白治疗或预防的示例性自身免疫疾病或病症包括但不限于多发性硬化、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、硬皮病(scleroderms)、肺出血肾炎综合症(Goodpasture'ssyndrome)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、自身免疫性癫痫、拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen's encephalitis)、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、阿狄森氏病(Addison's disease)、桥本氏甲状腺炎、纤维肌痛症(Fibromyalgia)、梅尼尔综合征(Menier's syndrome)；移植排斥(例如预防同种异体排斥)、恶性贫血、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、莱特尔氏综合征(Reiter's syndrome)、格雷夫斯病以及其他自身免疫疾病。
在多个实施方案中，本发明适用于癌症和/或肿瘤；例如，治疗或预防癌症和/或肿瘤。如本文别处所述，在多个实施方案中，治疗癌症可涉及用本发明的异二聚体蛋白调节免疫系统以偏好免疫刺激胜过免疫抑制。
癌症或肿瘤是指细胞不受控制地生长和/或异常增加的细胞存活和/或凋亡受到抑制，其干扰身体器官和系统的正常功能。包括良性和恶性癌症、息肉、增生以及休眠肿瘤或微转移。还包括具有不受免疫系统阻碍的异常增殖的细胞(例如病毒感染的细胞)。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。原发性癌症可以是在临床上可检测的起源部位处的癌细胞区域，并且可以是原发性肿瘤。相反，转移性癌症可以是疾病从一个器官或部分传播到另一非邻近器官或部分。转移性癌症可以由获得穿透并浸润局部区域的周边正常组织的能力的癌细胞引起，从而形成可以是局部转移的新肿瘤。癌症也可以由获得穿透淋巴壁和/或血管壁的能力的癌细胞引起，此后该癌细胞能够通过血液(从而成为循环肿瘤细胞)循环至体内的其他部位和组织。癌症可以是由于例如淋巴扩散或血源扩散的过程引起的。癌症也可以由停留在另一个部位、重新穿透血管或壁、继续增殖并最终形成另一个临床上可检测的肿瘤的肿瘤细胞引起。癌症可以是新肿瘤(可以是转移性(或继发性)肿瘤)。
癌症可以由已转移的肿瘤细胞引起，其可以是继发性或转移性肿瘤。该肿瘤的细胞可以与原始肿瘤中的细胞相似。例如，如果乳腺癌或结肠癌转移至肝，则继发性肿瘤虽然存在于肝中，但由异常的乳腺或结肠细胞而不是异常的肝细胞组成。肝中的肿瘤因此可以是转移性乳腺癌或转移性结肠癌，而不是肝癌。
癌症可能起源于任何组织。癌症可能起源于黑色素瘤、结肠、乳腺或前列腺，并因此可以由起源分别是皮肤、结肠、乳腺或前列腺的细胞组成。癌症也可以是恶性血液肿瘤，可以是白血病或淋巴瘤。癌症可以侵入组织例如肝、肺、膀胱或肠。
本发明的代表性的癌症和/或肿瘤包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食管癌；眼癌；头颈部癌症；胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；肝癌(hepatic carcinoma)；肝瘤(hepatoma)；上皮内赘生物(intra-epithelialneoplasm)；肾癌(kidney or renal cancer)；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽部)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中度/滤泡性NHL；中度弥漫性NHL；高度免疫母细胞NHL；高度淋巴母细胞NHL；高度小非裂解细胞NHL；巨大肿块NHL(bulky diseaseNHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'sMacroglobulinemia)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；以及其他癌和肉瘤；以及移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与母斑细胞病(phakomatose)、水肿(例如与脑肿瘤有关的)和梅格斯综合征(Meigs’syndrome)相关的异常血管增殖。
在一些实施方案中，使用异二聚体蛋白治疗患有难治性癌症的受试者。在一些实施方案中，使用异二聚体蛋白治疗一种或多种免疫调节剂难治性受试者。例如，在一些实施方案中，使用异源二聚体蛋白治疗在12周左右的治疗后对治疗无反应或甚至病情进展的受试者。例如，在一些实施方案中，受试者是PD-1和/或PD-L1和/或PD-L2剂难治性的，包括例如纳武单抗(nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106，OPDIVO，BRISTOL MYERSSQUIBB)、派姆单抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA，MERCK)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011，CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、依鲁替尼(Ibrutinib)(PHARMACYCLICS/ABBVIE)、阿特朱单抗(atezolizumab)(TECENTRIQ，GENENTECH)，和/或MPDL328OA(ROCHE)难治性患者。例如，在一些实施方案中，受试者是抗CTLA-4剂难治性的，例如伊匹木单抗(ipilimumab，YERVOY)难治性患者(例如黑色素瘤患者)。因此，在多个实施方案中，本发明提供了挽救对各种疗法(包括一种或多种免疫调节剂的单一疗法)无反应的患者的癌症治疗方法。
在多个实施方案中，本发明提供了靶向肿瘤微环境内的细胞或组织的异二聚体蛋白。在一些实施方案中，肿瘤微环境内的细胞或组织表达异二聚体蛋白的一个或多个靶标或结合伴侣。肿瘤微环境是指细胞环境(cellular milieu)，包括细胞、分泌的蛋白、生理小分子和其中存在肿瘤的血管。在一些实施方案中，肿瘤微环境内的细胞或组织是以下一种或多种：肿瘤脉管系统；肿瘤浸润性淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关的成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ECM)的成分；树突细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；和位于肿瘤近端的其他免疫细胞。在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白靶向癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞表达异二聚体蛋白的一种或多个靶标或结合伴侣。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白可以靶向表达任何本文所述的受体的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。例如，本发明的异二聚体蛋白质可以靶向表达任何本文所述的细胞因子、生长因子和/或激素的受体的细胞。
在一些实施方案中，本方法提供了用异二聚体蛋白治疗其他药剂难治性的患者，该“其他药剂”描述于本文别处，包括但不限于本文所述的各种化学治疗剂。
在一些方面，使用本发明的嵌合剂消除细胞内病原体。在一些方面，使用本发明的嵌合剂治疗一种或多种感染。在一些实施方案中，本发明的异二聚体蛋白用于治疗病毒感染(包括例如HIV和HCV)、寄生虫感染(包括例如疟疾)和细菌感染的方法。在多个实施方案中，感染诱导免疫抑制。例如，HIV感染常常导致被感染受试者中的免疫抑制。因此，如本文别处所述，在多个实施方案中，治疗这些感染可以包括用本发明的异二聚体蛋白调节免疫系统，以偏好免疫刺激胜过免疫抑制。或者，本发明提供了用于治疗诱导免疫激活的感染的方法。例如，肠道蠕虫感染与慢性免疫激活有关。在这些实施方案中，治疗这些感染可以包括用本发明的异二聚体蛋白调节免疫系统，以偏好免疫抑制胜过免疫刺激。
在多个实施方案中，本发明提供了治疗病毒感染的方法，包括但不限于急性或慢性病毒感染，例如呼吸道的、乳头瘤病毒感染的、单纯疱疹病毒(HSV)感染的、人免疫缺陷病毒(HIV)感染的以及内部器官的病毒感染的，例如肝炎病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染由黄病毒科的病毒引起。在一些实施方案中，黄病毒科的病毒选自黄热病病毒、西尼罗病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和丙型肝炎病毒。在其他实施方案中，病毒感染由小核糖核酸病毒科的病毒例如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒引起。在其他实施方案中，病毒感染由正粘病毒科的成员例如流感病毒引起。在其他实施方案中，病毒感染由逆转录病毒科的成员例如慢病毒引起。在其他实施方案中，病毒感染由副粘病毒科的成员例如呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、风疹病毒(例如腮腺炎病毒)、麻疹病毒和人偏肺病毒(human metapneumovirus)引起。在其他实施方案中，病毒感染由布尼亚病毒科的成员例如汉坦病毒引起。在其他实施方案中，病毒感染由呼肠孤病毒科成员例如轮状病毒引起。
在多个实施方案中，本发明提供了治疗寄生虫感染如原生动物(protozoa)或蠕虫感染的方法。在一些实施方案中，寄生虫感染由原生动物寄生虫(protozoan parasite)引起。在一些实施方案中，oritiziab寄生虫选自肠道原生动物、组织原生动物或血液原生动物。示例性对原生动物寄生虫包括但不限于Entamoeba hystolytica、兰氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、鼠隐孢子虫(Cryptosporidium muris)、冈比亚锥虫(Trypanosomatida gambiense)、罗得西亚锥虫(Trypanosomatida rhodesiense)、变形锥虫(Trypanosomatida crusi)、墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、热带利什曼原虫(Leishmania tropica)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和组织滴虫(Histomonas meleagridis)。在一些实施方案中，寄生虫感染由蠕虫寄生虫例如线虫门(例如有腺纲(Adenophorea))引起。在一些实施方案中，寄生虫选自侧尾腺口纲(Secementea)(例如毛首鞭形线虫(Trichuris trichiura)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、蛲虫(Enterobius vermicularis)、十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)、美洲钩虫(Necator americanus)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinensis))。在一些实施方案中，寄生虫选自吸虫(例如血吸虫、肝吸虫、肠吸虫和肺吸虫)。在一些实施方案中，寄生虫选自：曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、巨片吸虫(Fasciolagigantica)、异形吸虫(Heterophyes heterophyes)、卫氏肺吸虫(Paragonimuswestermani)。在一些实施方案中，寄生虫选自绦虫(例如猪肉绦虫(Taenia solium)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、微小膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)。
在多个实施方案中，本发明提供了治疗细菌感染的方法。在多个实施方案中，细菌感染是由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、好氧细菌和/或厌氧细菌引起的。在多个实施方案中，细菌选自但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、八叠球菌属(Sarcina)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、消化球菌属(Peptococcus)、梭菌属(Clostridium)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、沙雷菌属(Serratia)、嗜血菌属(Haemophilus)、布鲁杆菌属(Brucella)及其他生物体。在一些实施方案中，细菌选自但不限于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)、产碱假单胞菌(Pseudomonasalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、洋葱伯霍尔德杆菌(Burkholderia cepacia)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、宋氏志贺菌(Shigella sonnei)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、溶血不动杆菌(Acinetobacter haemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、中间耶尔森菌(Yersinia intermedia)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血性嗜血杆菌(Haemophilushaemolyticus)、副溶血性嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)、粘膜炎布兰汉球菌(Branhamella catarrhalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、胎儿弯曲肝菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、博氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、金氏菌属(Kingella)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、狄氏拟杆菌(Bacteroides distasonis)、拟杆菌属3452A同源组(Bacteroides 3452A homologygroup)、、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovalus)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、内脏拟杆菌(Bacteroides splanchnicus)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟型分枝杆菌(Mycobacterium avium)、细胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、溃疡棒状杆菌(Corynebacterium ulcerans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、猪葡萄球菌猪亚种hyicus(Staphylococcus hyicus subsp.hyicus)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)或解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)。
在另一个其他方面，本发明涉及治疗和预防T细胞介导的疾病和病症的方法，例如但不限于本文别处所述的疾病或病症以及炎性疾病或病症、移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥和T细胞增殖性病症。
在一些方面，本发明的嵌合剂用于例如经由具有免疫刺激信号的细胞外结构域激活T细胞的方法中。
在一些方面，本发明的嵌合剂用于预防免疫抑制信号的细胞传递的方法。联合疗法和偶联(conjugation)
在一些实施方案中，本发明提供了异二聚体蛋白和进一步包括向受试者施用其他药剂的方法。在一些实施方案中，本发明涉及共同施用和/或共同配制。任何本文所述的组合物均可以共同配制和/或共同施用。
在一些实施方案中，任何本文所述的异二聚体蛋白在与另一种药剂共同施用时协同作用，并且施用剂量来低于当将这种药剂用作单一疗法时通常采用的剂量。在多个实施方案中，本文提及的任何药剂均可以与本文描述的任何异二聚体蛋白组合使用。
在多个实施方案中，本文公开的任何异二聚体蛋白均可以与本文公开的另一种异二聚体蛋白共同施用。不希望受到理论的束缚，认为涉及施用一种或多种诱导先天免疫应答的异二聚体蛋白和一种或多种诱导适应性免疫应答的异二聚体蛋白的组合方案可以产生协同作用(例如，协同抗肿瘤作用)。
在多个实施方案中，任何诱导先天免疫应答的异二聚体蛋白均可用于本发明。在多个实施方案中，任何诱导适应性免疫应答的异二聚体蛋白均可用于本发明。
在一些实施方案中，包括但不限于癌症应用，本发明涉及作为其他药剂的化学治疗剂。化学治疗剂的示例包括但不限于烷化剂，例如噻替哌和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰类(acetogenin)(例如，布洛他辛(bullatacin)和布洛他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀(cally statin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡泽来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(例如念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物、KW-2189和CB 1-TM1)；eleutherobin；水蕉鬼碱(pancratistatin)；sarcodictyin；spongistatin；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氧化盐酸氮芥、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是calicheamicin gammall和calicheamicin omegall(参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐(bisphosphonate)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团(related chromoprotein enediyne antibiotic chromophore))、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮杂丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpholino-doxorubicin),、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)例如丝裂霉素c、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-阿扎尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素例如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪内酯酮(testolactone)；抗肾上腺素例如胺鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充物例如亚叶酸；乙酰葡醛酸内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利乙铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登素(maytansinoid)例如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼群克林(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)、PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(例如T-2毒素、疣疱菌素A(verrucarin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethane)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；噶萨托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside，“Ara-C”)、环磷酰胺；噻替哌；紫衫烷类(taxoids)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE不含氢化蓖麻油的白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒制剂(ABRAXANE Cremophor-free,albumin-engineerednanoparticle formulation of paclitaxel，American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,111.)和TAXOTERE多西紫杉醇(doxetaxel)(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；氮芥苯丁酸；GEMZAR吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨喋呤；铂类似物例如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；NAVELBINE.长春瑞滨(vinorelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨喋呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类(retinoids)，例如维甲酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin，LV)；奥沙利铂(oxaliplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB)；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR的抑制物(例如埃罗替尼(erlotinib)(Tarceva))和减少细胞增殖的VEGF-A，以及以上任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物。另外，治疗方法可以进一步包括使用辐射。另外，治疗方法可以进一步包括使用光动力疗法。
在多个实施方案中，包括但不限于癌症应用，本发明的其他药剂是选自以下的一种或多种免疫调节剂：阻断、降低和/或抑制PD-1和PD-L1或PD-L2和/或PD-1与PD-L1或PD-L2结合的药剂(作为非限制性示例，纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558,MDX1106,OPDIVO,BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA,Merck)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、阿特朱单抗(TECENTRIQ，GENENTECH)、MPDL328OA(ROCHE))，增加和/或刺激CD137(4-1BB)和/或CD137(4-1BB)与一种或多种4-1BB配体的结合的药剂(作为非限制性示例，乌瑞芦单抗(urelumab)(BMS-663513和抗4-1BB抗体)，以及阻断、减少和/或抑制CTLA-4活性和/或CTLA-4与AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A中的一种或多种的结合和/或OX40与OX40L的结合的药剂(作为非限制性示例，GBR830(GLENMARK)、MEDI6469(MEDIMMUNE)。
在一些实施方案中，包括但不限于传染性疾病应用，本发明涉及作为其他药剂的抗感染药。在一些实施方案中，抗感染药是抗病毒剂，包括但不限于阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Acyclovir)、阿德福韦(Adefovir)、安普那韦(Amprenavir)、阿扎那韦(Atazanavir)、西多福韦(Cidofovir)、达鲁那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、地达诺新(Didanosine)、二十二醇(Docosanol)、依法韦伦(Efavirenz)、艾维雷韦(Elvitegravir)、恩曲他滨(Emtricitabine)、恩夫韦地(Enfuvirtide)、依曲韦林(Etravirine)、泛昔洛韦(Famciclovir)和膦甲酸钠(Foscarnet)。在一些实施方案中，抗感染药是抗细菌剂，包括但不限于头孢菌素抗生素(头孢氨苄(cephalexin)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)和头孢比普(ceftobiprole))；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星(cipro)、左氧氟沙星(Levaquin)、氟尿苷(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)和诺氟沙星(norflox))；四环素抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和多西环素(doxycycline))；青霉素抗生素(阿莫西林、氨苄西林、青霉素V、双氯西林、羧苄西林、万古霉素(vancomycin)和甲氧西林)；单菌胺抗生素(氨曲南)；和碳青霉烯类抗生素(厄他培南(ertapenem)、多利培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)/西司他丁(cilastatin)和美罗培南(meropenem))。在一些实施方案中，抗感染药包括抗疟疾剂(例如，氯喹、奎宁、甲氟喹、伯氨喹、多西环素、蒿甲醚/本芴醇(lumefantrine)、阿托伐醌/氯胍和磺胺多辛/乙胺嘧啶)、甲硝唑、替硝唑、伊维菌素、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)以及阿苯达唑(albendazole)。
在一些实施方案中，包括但不限于自身免疫应用，其他药剂是免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂，例如甾体抗炎剂或非甾体抗炎剂(NSAID)。类固醇，尤其是肾上腺皮质类固醇及其合成类似物，是本领域公知的。可用于本发明的皮质类固醇的示例包括但不限于羟基三安西松(hydroxyltriamcinolone)、α-甲基地塞米松(alpha-methyldexamethasone)、β-甲基倍他米松(beta-methyl betamethasone)、倍氯米松二丙酸酯(beclomethasone dipropionate)、倍他米松苯甲酸酯(betamethasone benzoate)、倍他米松二丙酸酯(betamethasone dipropionate)、倍他米松戊酸酯(betamethasonevalerate)、氯倍他索戊酸酯(clobetasol valerate)、地奈德(desonide)、去羟米松(desoxymethasone)、地塞米松、醋酸二氟拉松(diflorasone diacetate)、戊酸二氟米松(diflucortolone valerate)、氟拉胺(fluadrenolone)、氟氯奈德(flucloroloneacetonide)、特戊酸二氟米松(flumethasone pivalate)、丙酮化氟新龙(fluosinoloneacetonide)、醋酸氟轻松(fluocinonide)、氟可丁酯(flucortine butylester)、氟可龙(fluocortolone)、醋酸氟强的松(氟泼尼定)(fluprednidene(fluprednylidene)acetate)、氟氢缩松(flurandrenolone)、哈西奈德(halcinonide)、醋酸氢化可的松(hydrocortisone acetate)、丁酸氢化可的松(hydrocortisone butyrate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、可的松(cortisone)、可托多松(cortodoxone)、氟西奈德(flucetonide)、氟氢可的松(fludrocortisone)、双醋二氟拉松(difluorosone diacetate)、fluradrenolone acetonide、甲羟松(medrysone)、安西法尔(amcinafel)、安西菲特(amcinafide)、倍他米松及其酯的平衡物、氯泼尼松(chloroprednisone)、氯可托龙(clocortelone)、克西诺龙(clescinolone)、二氯松(dichlorisone)、二氟泼尼酯(diflurprednate)、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松(flunisolide)、氟米龙(fluoromethalone)、氟培龙(fluperolone)、氟泼尼龙(fluprednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲泼尼松(meprednisone)、帕拉米松(paramethasone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)。可用于本发明的(NSAIDS)包括但不限于水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、乙二醇水杨酸酯(glycol salicylate)、水杨酰胺类(salicylmide)、苄基-2,5-二乙酰氧基苯甲酸(benzyl-2,5-diacetoxybenzoic acid)、布洛芬、富林达克(fulindac)、萘普生(naproxen)、酮洛芬、依托芬酯(etofenamate)、保泰松(phenylbutazone)和吲哚美辛(indomethacin)。在一些实施方案中，免疫抑制剂可以是细胞抑制剂例如烷化剂、抗代谢药(例如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤)、细胞毒性抗生素、抗体(例如巴利昔单抗(basiliximab)、达克珠单抗(daclizumab)和莫罗单抗(muromonab))、抗亲免蛋白剂(anti-immunophilin)(例如环孢霉素、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus))、干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯类(mycophenolate)和小生物制剂(例如芬戈莫德(fingolimod)、多球壳菌素(myriocin))。
在一些实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)包括经修饰的衍生物，即，通过使任何类型的分子共价结合至组合物使得共价结合不妨碍组合物的活性。例如但不限于，衍生物包括已通过例如以下修饰的组合物：糖基化、脂化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化，蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白连接等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，这些技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素(turicamycin)的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一种或多种非-经典氨基酸。在其他实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)进一步包含细胞毒性剂，在示例性实施方案中包括毒素、化学治疗剂、放射性同位素和引起细胞凋亡或细胞死亡的药剂。这些药剂可以与本文所述的组合物偶联(conjugated)。
本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)因此可以在翻译后进行修饰以添加效应子部分例如化学接头，可检测的部分例如荧光染料、酶、底物、生物发光物质、放射性物质，以及化学发光部分，或功能性部分例如链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性物质。
配制
本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)可具有可与无机酸或有机酸反应的足够碱性的官能团，或具有可与无机碱或有机碱反应的羧基，以形成药学上可接受的盐。如本领域所公知，药学上可接受的酸加成盐形成自药学上可接受的酸。这样的盐包括例如以下列出的药学上可接受的盐：Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)和TheHandbook of Pharmaceutical Salts；Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl andC.G.Wermuth(eds.),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，其通过引用以其全文并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的组合物为药学上可接受的盐的形式。
此外，任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)可以作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分施用给受试者。这样的组合物可任选包含合适量的药学上可接受的赋形剂，以提供用于合适施用的形式。药物赋形剂可以是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可以是例如盐水、阿拉伯树胶(gum acacia)、明胶、淀粉糊、滑石粉(talc)、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用给受试者时，药学上可接受的赋形剂是无菌的。当静脉内施用任何本文所述的药剂时，水是有用的赋形剂。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体赋形剂，尤其是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如需要，任何本文所述的药剂也可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
在一些实施方案中，将本文所述的组合物重悬于盐水缓冲液(包括但不限于TBS、PBS等)中。
在多个实施方案中，异二聚体蛋白可以与另一种药剂偶联(conjugated)和/或融合以延长半衰期或改善药效动力学和药代动力学性质。在一些实施方案中，异二聚体蛋白可以与以下一种或多种融合或偶联(conjugated)：PEG、XTEN(例如，作为rPEG)、聚唾液酸(POLYXEN)、白蛋白(例如，人血清白蛋白或HAS)、弹性蛋白样蛋白(ELP)、PAS、HAP、GLK、CTP、转铁蛋白等。在多个实施方案中，每个单独异二聚体蛋白与BioDrugs(2015)29:215–239(其全部内容通过引用并入本文)中描述的一种或多种药剂融合。
施用/给药、给药剂量和治疗方案
本发明包括各种制剂中的所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)。任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)可以采取溶液、悬浮液、乳剂、滴剂、片剂、丸剂(pills)、微丸剂(pellets)、胶囊、含有液体的胶囊、粉末、缓释制剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮液或任何其他适合使用的形式。也可以使用编码蛋白序列的DNA或RNA构建体。在一个实施方案中，组合物为胶囊形式(参见，例如，美国专利号5,698,155)。合适的药物赋形剂的其他示例描述在Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaroeds.,19th ed.1995)中，其通过引用并入本文。
必要时，包含异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的制剂还可以包含增溶剂。还可以用本领域已知的合适的媒介物或递送装置来递送药剂。可以在单个递送媒介物或递送装置中共同递送本文概述的组合治疗剂。用于施用的组合物可任选包含局部麻醉剂例如利多卡因(lignocaine)，以减轻注射部位的疼痛。
包含本发明的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。这样的方法通常包括使治疗剂与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将治疗剂与液体载体、细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起来制备制剂，然后如需要，使产品成型为所需制剂的剂型(例如，湿制颗粒或干制颗粒、粉末混合物等，随后通过本领域已知的常规方法进行压片)。
在一个实施方案中，根据常规方法将任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)配制成适于本文所述的施用方式的组合物。
施用途径包括例如，皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经直肠、通过吸入或局部地，尤其是施用至耳朵、鼻子、眼睛或皮肤。在一些实施方案中，通过口服或肠胃外注射进行施用。在大多数情况下，施用导致任何本文所述的药剂释放到血流中。
任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)均可以口服施用。这些异二聚体蛋白(和/或其他药剂)也可以通过任何其他方便的途径进行施用，例如通过静脉内输注或浓注(bolus injection)，通过上皮层或粘膜皮肤层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。各种递送系统是已知的，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，并且可以用于施用。
在具体实施方案中，可需要局部施用至需要治疗的区域。在一个实施方案中，例如在癌症的治疗中，在肿瘤微环境(例如，在围绕肿瘤细胞和/或饲养肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管，包括例如肿瘤脉管系统；肿瘤浸润淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关的成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ECM)的成分；树突状细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；以及其他位于肿瘤近端的免疫细胞)或淋巴结和/或靶向至肿瘤微环境或淋巴结中，施用异二聚体蛋白(和/或其他药剂)。在多个实施方案中，例如在癌症的治疗中，在肿瘤内施用异二聚体蛋白(和/或其他药剂)。
在多个实施方案中，本发明的异二聚体蛋白允许双重作用，该双重作用提供比常规免疫疗法(例如，用OPDIVO、KEYTRUDA、YERVOY和TECENTRIQ中的一种或多种治疗)所见的更少的副作用。例如，本发明的异二聚体蛋白减少或预防了通常观察到的免疫相关的不良事件，这些不良事件影响各种组织和器官，包括皮肤、胃肠道、肾、外周和中枢神经系统、肝、淋巴结、眼睛、胰腺和内分泌系统；例如垂体炎、结肠炎、肝炎、肺炎、皮疹和风湿病。此外，本发明的局部给药(例如肿瘤内)消除了常规全身施用(例如IV输注)所见的不良事件，并与常规免疫疗法(例如用OPDIVO、KEYTRUDA、YERVOY和TECENTRIQ中的一种或多种治疗)一起使用。
适于肠胃外施用(例如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮液、分散液、乳剂等。它们也可以无菌固体组合物(例如冻干组合物)的形式制造，其可以在使用前立即溶解或悬浮于无菌可注射介质中。它们可以含有例如本领域已知的悬浮剂或分散剂。
任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的剂量以及给药安排可取决于各种参数，包括但不限于所治疗的疾病、受试者的总体健康状况以及主治医生的判断力。任何本文所述的异二聚体蛋白可以在施用其他药剂的(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)之前，同时，或(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)之后施用给有此需要的受试者。在多个实施方案中，将任何本文所述的异二聚体蛋白和其他药剂以间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔少于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时间隔至11小时、间隔11小时至12个小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周或间隔4周来施用。
在多个实施方案中，本发明涉及诱导先天免疫应答的异二聚体蛋白和诱导适应性免疫应答的另一种异二聚体蛋白的共同施用。在这样的实施方案中，诱导先天免疫应答的异二聚体蛋白可以在施用诱导适应性免疫应答的异二聚体蛋白之前、同时或之后施用。例如，可以将异二聚体蛋白以间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔少于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时间隔至11小时、间隔11小时至12个小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周或间隔4周来施用。在一个示例性的实施方案中，诱导先天免疫应答的异二聚体蛋白与诱导适应性应答的异二聚体蛋白间隔1周施用，或每周交替施用(即，在施用诱导先天免疫应答的异二聚体蛋白一周后施用诱导适应性免疫应答的异二聚体蛋白，如此等等)。
任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的剂量可以取决于若干因素，包括病况的严重程度，是否要治疗或预防病况，以及要治疗的受试者的年龄、体重和健康状况。另外，有关具体受试者的药物基因组学(基因型对治疗剂的药代动力学、药效动力学或功效谱的影响)信息可以影响所用剂量。此外，确切的个体剂量可以根据多种因素进行一些调整，这些因素包括所施用药剂的具体组合、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速率、治疗的具体疾病、病症的严重程度以及病症的解剖位置。可以预期剂量会有一些变化。
对于通过肠胃外注射施用任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)，剂量可以是每天约0.1mg至约250mg，每天约1mg至约20mg，或每天约3mg至约5mg。通常，当口服或胃肠外施用时，任何本文所述的药剂的剂量可以是每天约0.1mg至约1500mg，或每天约0.5mg至约10mg，或每天约0.5mg至约5mg，或每天约200至约1,200mg(例如每天约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,100mg、约1,200mg)。
在一些实施方案中，本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)通过肠胃外注射以以下剂量施用：每次治疗约0.1mg至约1500mg，或每次治疗约0.5mg至约10mg，或每次治疗约0.5mg至约5mg，或每次治疗约200至约1,200mg(例如每次治疗约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,100mg、约1,200mg)。
在一些实施方案中，异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的合适剂量的范围是以受试者体重计约0.01mg/kg至约100mg/kg，或受试者体重计约0.01mg/kg至约10mg/kg，例如受试者体重计约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg，包括其间的所有值和范围。
在另一个实施方案中，可以在囊泡中，特别是在脂质体中进行递送(参见Langer,1990,Science 249:1527-1533；Treat等人,in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365(1989))。
可以通过控释或缓释放方式或通过本领域普通技术人员公知的递送装置来施用任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)。示例包括但不限于描述于美国专利号3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；和5,733,556中的那些，以上均通过引用以其全文并入本文。这样的剂型可以不同比例使用以产生期望释放曲线的例如氢丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球或其组合，用于提供一种或多种活性成分的控释或缓释。活性成分的控释或缓释可以通过多种条件来刺激，包括但不限于pH值的变化、温度的变化、适当波长的光的刺激、酶的浓度或可用性、水的浓度或可用性或其他生理条件或化合物。
在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见Medical Applications ofControlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolenand Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy等人,1985,Science 228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)。
在另一个实施方案中，可以将控释系统放置在待治疗的靶区域附近，由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,in Medical Applications of ControlledRelease,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。可以使用在Langer,1990,Science 249:1527-1533)的综述中讨论的其他控释系统。
任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的施用可以独立地是每天1至4次或每月1至4次或每年1至6次或每两年、三年、四年或五年一次。施用可以持续一天或一个月、两个月、三个月、六个月、一年、两年、三年且甚至可以是受试者的一生。
可以根据多种因素来选择使用任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的给药方案，这些因素包括受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况；待治疗病况的严重程度；施用途径；受试者的肾或肝功能；个体的药物基因组学组成；和所用的本发明的具体化合物。任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)可以以单个日剂量施用，或总日剂量可以分成每天两次、三次或四次的分剂量来施用。此外，可以在给药方案期间连续而不是间歇地施用任何本文所述的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)。
细胞和核酸
在多个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码本文所述的异二聚体蛋白(例如，包含第一和第二多肽链的异二聚体蛋白)的核酸。在多个实施方案中，表达载体包含DNA或RNA。在多个实施方案中，表达载体是哺乳动物表达载体。
原核和真核载体均可用于表达异二聚体蛋白。原核载体包括基于大肠杆菌(E.coli)序列的构建体(参见，例如，Makrides，Microbiol Rev 1996，60：512-538)。可用于在大肠杆菌中表达的调节区的非限制性示例包括lac、trp、lpp、phoA、recA、tac、T3、T7和λPL。原核表达载体的非限制性示例可包括λgt载体系列例如λgt11(Huynh等人，在“DNACloning Techniques,Vol.I:A Practical Approach,”1984,(D.Glover,ed.),pp.49-78,IRL Press,Oxford中)和pET载体系列(Studier等人,Methods Enzymol 1990,185:60-89)。然而，原核宿主-载体系统不能进行哺乳动物细胞的大部分翻译后加工。因此，真核-宿主载体系统可以尤其有用。多种调节区可用于在哺乳动物宿主细胞中表达异二聚体蛋白。例如，可以使用SV40早期和晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启动子。可用于哺乳动物细胞的诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白II基因、小鼠乳腺肿瘤病毒糖皮质激素响应性长末端重复序列(MMTV-LTR)、β-干扰素基因和hsp70基因相关的启动子(参见Williams等人,Cancer Res 1989,49:2735-42；和Taylor等人,Mol Cell Biol 1990,10:165-75)。热休克启动子或应激启动子对于驱动融合蛋白在重组宿主细胞中的表达也可以是有利的。
在一些实施方案中，本发明的表达载体包含编码异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的至少第一和/或第二多肽链的核酸，或其互补序列，有效地连接至在哺乳动物细胞中有功能的表达控制区或其互补序列。表达控制区能够驱动有效连接的编码阻断和/或刺激剂的核酸的表达，使得阻断和/或刺激剂在转化有表达载体的人细胞中产生。
表达控制区是影响有效连接的核酸的表达的调节性多核苷酸(有时在本文中称为元件)，例如启动子和增强子。本发明的表达载体的表达控制区能够在人细胞中表达有效连接的编码核酸。在一个实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，细胞是非肿瘤细胞。在一个实施方案中，表达控制区向有效连接的核酸提供可调节的表达。信号(有时称为刺激)能增加或减少与这样的表达控制区有效连接的核酸的表达。这种响应于信号而增加表达的表达控制区通常被称为可诱导的。这种响应于信号而降低表达的表达控制区通常被称为可阻抑的。通常，由这些元件提供的增加或减少的量与存在的信号量成正比；信号量越大，表达的增加或减少越大。
在一个实施方案中，本发明涵盖了使用能够响应于信号(cue)而瞬时产生高水平表达的诱导型启动子。例如，当在肿瘤细胞附近时，通过将转化有包含这种表达控制序列的异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的表达载体的细胞暴露于合适的信号，来诱导所述转化细胞瞬时产生高水平的药剂。示例性的诱导型表达控制区包括那些包含由信号(例如小分子化合物)刺激的诱导型启动子的区域。具体示例可以在例如美国专利号5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941中找到，其均通过引用以其全文并入本文。
表达控制区和基因座控制区包括全长启动子序列，例如天然启动子和增强子元件，以及保留全部或部分全长或非变体功能的亚序列或多核苷酸变体。如本文所用，术语“功能性”及其语法变体在用于核酸序列、亚序列或片段时是指序列具有天然核酸序列(例如，非变体或未修饰的序列)的一种或多种功能。
如本文所用，“有效地连接(operable linkage)”是指组分的物理并置(physicaljuxtaposition)，被描述为允许它们以其预期的方式起作用。在表达控制元件与核酸有效地连接的示例中，该关系使得控制元件调节核酸的表达。通常，调节转录的表达控制区并置在转录核酸的5'端(即“上游”)附近。表达控制区也可以位于转录序列的3'末端(即“下游”)或在转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以位于在距转录序列一定距离的位置(例如，距核酸100至500个、500至1000个、2000至5000个或更多个核苷酸)。表达控制元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列的5'端。表达控制元件的另一个示例是增强子，其可以位于转录序列的5'或3'，或在转录序列内。
在人细胞中起作用的表达系统是本领域公知的，并且包括病毒系统。通常，在人细胞中起作用的启动子是能够与哺乳动物RNA聚合酶结合并启动编码序列的下游(3')转录成mRNA的任何DNA序列。启动子将具有通常位于编码序列的5'端附近的转录起始区，且通常具有位于转录起始位点上游25-30个碱基对的TATA盒。TATA盒被认为可以指导RNA聚合酶II在正确的位置开始RNA合成。启动子通常还将含有上游启动子元件(增强子元件)，通常位于TATA盒上游100至200个碱基对内。上游启动子元件决定了转录起始的速率，并且可以在任一方向上起作用。尤其有用的启动子是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因通常高表达并具有广泛的宿主范围。示例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子和CMV启动子。
通常，由哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3'的调控区，且因此与启动子元件一起位于编码序列的侧翼。成熟mRNA的3'末端通过位点特异性翻译后切割和聚腺苷酸化作用形成。转录终止子和聚腺苷酸化信号的示例包括衍生自SV40的那些。内含子也可以包括在表达构建体中。
有多种可用于将核酸引入活细胞的技术。适合体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、基于聚合物的系统、DEAE-葡聚糖、病毒转导、磷酸钙沉淀法等。对于体内基因转移，也可以使用多种技术和药剂，包括脂质体；基于天然聚合物的递送媒介物，例如壳聚糖和明胶；病毒载体也适用于体内转导。在一些情况下，期望提供靶向剂，例如对肿瘤细胞表面膜蛋白特异的抗体或配体。在采用脂质体的情况下，可使用与和胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白以靶向和/或促进摄取，例如，对特定细胞类型亲和的衣壳蛋白或其片段，针对在循环中经历内化的蛋白的抗体，靶向细胞内定位并延长细胞半衰期的蛋白。受体介导的内吞作用的技术由例如Wu等人,J.Biol.Chem.262,4429-4432(1987)；和Wagner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,3410-3414(1990)描述。
在合适的情况下，也可以使用基因递送剂，例如整合序列。许多整合序列是本领域已知的(参见，例如，Nunes-Duby等人,Nucleic Acids Res.26:391-406,1998；Sadwoski,J.Bacteriol.,165:341-357,1986；Bestor,Cell,122(3):322-325,2005；Plasterk等人,TIG 15:326-332,1999；Kootstra等人,Ann.Rev.Pharm.Toxicol.,43:413-439,2003)。这些包括重组酶和转座酶。示例包括Cre(Sternberg and Hamilton,J.Mol.Biol.,150:467-486,1981)、lambda(Nash,Nature,247,543-545,1974)、Flp(Broach等人,Cell,29:227-234,1982)、R(Matsuzaki等人,J.Bacteriology,172:610-618,1990)、cpC31(参见，例如，Groth等人,J.Mol.Biol.335:667-678,2004)、睡美人(sleeping beauty)、水手(mariner)家族的转座酶(Plasterk等人，同上)以及用于整合病毒例如AAV、逆转录病毒和具有提供病毒整合功能的组分(例如逆转录病毒或慢病毒的LTR序列和AAV的ITR序列)的抗病毒(antivirus)(Kootstra等人,Ann.Rev.Pharm.Toxicol.,43:413-439,2003)。另外，可以使用直接的和靶向的遗传整合策略以插入编码嵌合融合蛋白的核酸序列，这些策略包括CRISPR/CAS9、锌指、TALEN和兆核酸酶基因编辑技术。
在一个方面，本发明提供的用于表达异二聚体蛋白(和/或其他药剂)的表达载体是病毒载体。已知许多可用于基因治疗的病毒载体(参见，例如，Lundstrom,TrendsBiotechnol.,21:1 17,122,2003。示例性病毒载体包括选自抗病毒(LV)、逆转录病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)和α病毒的那些，然而也可以使用其他病毒载体。对于体内使用，未整合到宿主基因组中的病毒载体也适合使用，例如α病毒和腺病毒。α病毒的示例性类型包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)。对于体外使用，整合到宿主基因组中的病毒载体是合适的，例如逆转录病毒、AAV和抗病毒。在一个实施方案中，本发明提供了在体内转导人细胞的方法，包括在体内使实体瘤和本发明的病毒载体接触。
在多个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其包含含有本文所述的异二聚体蛋白的表达载体。
可以将表达载体引入宿主细胞中以产生本发明的异二聚体蛋白。例如，可以在体外或基因工程化地培养细胞。有用的哺乳动物宿主细胞包括但不限于衍生自人、猴子和啮齿动物的细胞(参见，例如，Kriegler in“Gene Transfer and Expression:A LaboratoryManual,”1990,New York,Freeman&Co.)。这些包括通过SV40转化的猴肾细胞系(例如COS-7、ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(例如经亚克隆以在悬浮培养中生长的293、293-EBNA或293细胞，Graham等人,J Gen Virol 1977,36:59)；幼仓鼠肾细胞(例如BHK、ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢-细胞-DHFR(例如CHO、Urlaub和Chasin，Proc Natl Acad Sci USA1980,77:4216)；DG44 CHO细胞，CHO-K1细胞，小鼠睾丸支持细胞(mouse sertoli cell)(Mather,Biol Reprod 1980,23:243-251)；小鼠成纤维细胞(例如NIH-3T3)，猴肾细胞(例如CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(例如VERO-76、ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(例如HELA、ATCC CCL2)；犬肾细胞(例如MDCK、ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(例如BRL 3A、ATCC CRL 1442)；人肺细胞(例如W138、ATCC CCL 75)；人肝细胞(例如Hep G2、HB 8065)；和小鼠乳腺肿瘤细胞(例如MMT 060562、ATCC CCL51)。示例性的用于表达本文所述的融合蛋白的癌细胞类型包括小鼠成纤维细胞系、NIH3T3、小鼠Lewis肺癌细胞系、LLC、小鼠肥大细胞瘤细胞系、P815、小鼠淋巴瘤细胞系、EL4及其卵清蛋白转染子、E.G7、小鼠黑素瘤细胞系、B16F10、小鼠纤维肉瘤细胞系、MC57和人小细胞肺癌细胞系、SCLC#2和SCLC#7。
宿主细胞可从正常或受影响的受试者(包括健康人、癌症患者和患有传染性疾病的患者)，私人实验室保藏所，公共培养物收集所(例如American Type CultureCollection)或商业供应商获得。
可用于体外、离体和/或体内生产本发明的异二聚体蛋白的细胞包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血细胞例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞(例如从骨髓获得的细胞)，脐带血，外周血，胎儿肝脏等。细胞类型的选择取决于所治疗或预防的肿瘤或传染性疾病的类型，并且可以由本领域技术人员确定。
含Fc的大分子(例如Fc融合蛋白)的生产和纯化已成为标准化过程，产品之间的改变很小。例如，许多含Fc的大分子是由人胚肾(HEK)细胞(或其变体)或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(或其变体)产生的，或者在某些情况下是通过细菌或合成方法产生的。生产后，通过与蛋白A色谱柱结合并随后使用各种方法“剥离”来纯化由HEK或CHO细胞分泌的含Fc的大分子。一般而言，将纯化的含Fc的大分子以液体形式储存一段时间，冷冻长时间，或在一些情况下冻干。在多个实施方案中，本文涵盖的异二聚体蛋白的生产与传统的含Fc的大分子相比可以具有独特的特征。在某些实例中，可以使用特定的色谱树脂或使用不依赖于蛋白A捕获的色谱方法来纯化异二聚体蛋白。在其他实施方案中，可以纯化寡聚体状态或多种寡聚体状态的异二聚体蛋白，并使用特定方法富集特定的寡聚体状态。不受理论的束缚，这些方法可以包括用包括特定盐浓度、pH和添加剂组成的特定缓冲液处理。在其他示例中，这样的方法可以包括偏好一种低聚状态胜过另一种低聚状态的处理。可使用本领域中指定的方法额外“剥离”本文获得的异二聚体蛋白。在一些实施方案中，异二聚体蛋白是高度稳定的并且能够耐受宽范围的pH暴露(pH3-12之间)，能够耐受大量的冻/融应激(大于3个冻/融循环)并能够耐受高温下的长时间温育(在40摄氏度下超过2周)。在其他实施方案中，显示异二聚体蛋白保持完整，而没有在这些应激条件下降解、脱酰胺等的迹象。
受试者和/或动物
在一些实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊或非人灵长类动物例如猴子、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物，例如斑马鱼。在一些实施方案中，受试者和/或动物可包含荧光标记的细胞(例如以GFP标记)。在一些实施方案中，受试者和/或动物是包含荧光细胞的转基因动物。
在一些实施方案中，受试者和/或动物是人。在一些实施方案中，人是幼儿。在其他实施方案中，人是成年人。在其他实施方案中，人是老年人。在其他实施方案中，人可以被称为患者。
在某些实施方案中，人的年龄范围是约0个月至约6个月，约6至约12个月大，约6至约18个月大，约18至约36个月大，约1至约5岁，约5至约10岁，约10至约15岁，约15至约20岁，约20至约25岁，约25至约30岁，约30至约35岁，约35至约40岁，约40至约45岁，约45至约50岁，约50至约55岁，约55至约60岁，约60至约65岁，约65至约70岁，约70至约75岁，约75至约80岁，约80至约85岁，约85至约90岁，约90至约95岁或约95至约100岁。
在其他实施方案中，受试者是非人动物，且因此本发明涉及兽医用途。在一个具体实施方案中，非人动物是家养宠物。在另一个具体实施方案中，非人动物是家畜。
试剂盒
本发明提供了能够简化任何本文所述的药剂的施用的试剂盒。示例性的本发明的试剂盒包含单位剂型的任何本文所述的组合物。在一个实施方案中，单位剂型是容器，例如预填充注射器，其可以是无菌的，其包含任何本文所述的药剂和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物。试剂盒可进一步包含指示任何本文所述的药剂的使用的标签或印刷说明。试剂盒还可以包括用于施用位置的睑膜窥镜(lid speculum)、局部麻醉剂和清洁剂。试剂盒还可以进一步包含一种或多种本文所述的其他药剂。在一个实施方案中，试剂盒包含含有有效量的本发明的组合物和有效量的另一种组合物(如本文所述的那些)的容器。
定义
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包括性的并且涵盖“或”和“与”两者。
除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常容差(normal tolerance)范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约应理解为在指定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
指定范围应理解为介于指定范围之间和位于指定范围的两端的任何值。作为示例，1和5之间的范围包括1、2、3、4和5；1到10之间的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；1到100之间的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的探针、组合物、方法和试剂盒相似或等同的其他探针、组合物、方法和试剂盒可用于实施本发明，但本文描述了优选的材料和方法。应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不是旨在限制。
本文所述的任何方面或实施方案均能与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。
在以下实施例中将进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的构建和特征化
构建了包含IL6受体(IL6R)通过电荷极化核心结构域连接至IL-35的异二聚体蛋白(参见例如图1)。具体地，异二聚体蛋白包含两条多肽链。第一多肽链包含IL6R亚基Gp130通过电荷极化核心结构域连接至IL-35亚基IL12α。第二多肽链包含IL6R亚基IL6Rα通过电荷极化核心结构域连接至IL-35亚基IL27β。通过用IL6RA-Beta-IL27β和gp130-Alpha-IL12α构建体的双重瞬时转染在哺乳动物细胞中表达IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白。考马斯亮蓝染色表明了存在表达的蛋白，使用抗人IgG蛋白质印迹证实了表达的蛋白包括与Alpha和Beta构建体的近似分子量相对应的蛋白(参见例如图2)。
在非还原、还原、还原且去糖基化的条件下对纯化蛋白的进一步分析为异二聚体构建体的组装提供了进一步的证据。具体地，通过蛋白质印迹的抗人Fc和抗人IL-6R染色证明了存在对应于包含IL-6R-Fc-IL-35的alpha/beta异二聚体的近似分子量的单个高分子量条带。该异二聚体可以在还原条件下分解成组成性的alpha和beta链，其显示高于仅基于氨基酸含量的预测分子量的表观分子量。由于已知存在糖基化位点，这是预料之中的，并且alpha和beta链的去糖基化产生的单独蛋白通过蛋白分析出现在其预测分子量处(参见例如图3)。
另外，由于SDS的存在可以破坏任何有助于蛋白多聚化的电荷相互作用，通过BlueNative PAGE对IL-6R-Fc-IL-35构建体进一步进行分析。这些数据表明大部分分泌蛋白(预估60％)代表alpha/beta异二聚体(图3)。通过分光光度法分析确认纯化的IL-6R-Fc-IL-35蛋白的浓度(参见例如图4)。
在gp130-Fc(alpha)-IL12A和IL6RA-Fc(beta)-IL27B构建体双重转染在CHO细胞中并随后使用蛋白A纯化分泌蛋白后，对IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白进行了体积排阻色谱(SEC)。通过SEC出现的一个单峰表明了可能仅存在单个种类的异二聚体蛋白，这如所预期是由于在两个构建体中使用电荷极化连接结构域(Fc-alpha和Fc-beta)(图5)。
为确认组装的IL-6R-Fc-IL-35异二聚体保留了与同源配体(例如IL-6)结合并被针对组装的异二聚体的每一个蛋白组分(即IL-6RA、gp130、IL27β/EBI3和IL12α)所识别的能力，进行一系列ELISA测定以证明IL-6R-Fc-IL-35异二聚体的特异性存在。在图6至图15中，在每个图的顶部示出了ELISA测定的示意图。在示意图中，说明了捕获和检测策略。在每种情况下，通过用重组IL-6捕获并用抗IL-27B/EBI3检测(图6)，用重组IL-6捕获并用抗人IL-6RA检测(图7)，用抗人gp130捕获并用抗IL27B/EBI3检测(图8)，用抗人gp130捕获并用抗人IL-6RA检测(图9)，用抗IL-6RA捕获并用抗IL27B/EBI3检测(图10)，用抗IL-6RA捕获并用抗IL-6RA检测(图11)，用抗人p35捕获并用抗IL-27B/EBI3检测(图12)，用抗人p35捕获并用抗人IL-6RA检测(图13)，用抗人p35捕获并用抗IL27B/EBI3(图14)，以及用抗IL27B/EBI3捕获并用抗人IL-6RA检测(图15)，来观察IL-6R-Fc-IL-35异二聚体的存在。
SEQ ID NO：16提供了示例性的电荷极化核心结构域(负-正，即“alpha核心结构域”)的序列，且SEQ ID NO：24中提供了包含杵臼突变的示例性alpha核心结构域。
SEQ ID NO：17提供了示例性的电荷极化核心结构域(正-负，即“beta核心结构域”)的序列，且SEQ ID NO：25中提供了包含杵臼突变的示例性beta核心结构域。
示例性多肽链的组分的序列在以下示出：SEQ ID NO：18是Gp130ECD(类型1)，SEQID NO：19是IL-6RA ECD(类型1)，SEQ ID NO：20是IL-12a(类型2，IL-35的第一部分)，SEQID NO：21是IL-27b(类型2，IL-35的第二部分)。
示例性Gp130-Alpha-IL12A链具有SEQ ID NO：22所示的序列，且示例性IL6RA-Beta-IL27B链具有SEQ ID NO：23所示的序列。
在替代实施方案中，IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白可包含IL6RA-Alpha-IL12a链(SEQ ID NO：34)和Gp130-Beta-IL27b链(SEQ ID NO：35)。
实施例2：IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的进一步表征
对IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白进行体积排阻色谱(SEC)。在吸收波长为210nm下通过SEC出现的单峰，表明了可能仅存在单个种类的蛋白，这如所预期是由于在两个构建体中使用了电荷极化接头结构域(Fc-alpha和Fc-beta)(图16A)。有趣的是，吸收波长为280nm的SEC显示出第二个较低的分子量条带(图16B)。
然后将IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白用于IL-6SINK测定中。在此，测试了IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白阻隔IL6的能力。将DS-1细胞(依赖于外源IL6存活的B细胞系)的培养物与IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白一起在外源IL6的存在下孵育。当DS-1细胞未暴露于IL6时，会导致细胞死亡。因此，进行这些实验以确定IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白是否能阻隔IL6并导致DS-1细胞死亡。
将DS-1细胞在存在摩尔比例增加的IL-6R-Fc-IL-35与IL-6之比下培养24小时。通过caspase 3/7活性(通过荧光素酶读数)测量细胞死亡。
图17显示了IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白(鉴定为Lot’00和Lot’48)能够诱导DS-1细胞中的细胞死亡。实际上，根据所使用的批次，异二聚体蛋白显示出比托珠单抗(Tocilizumab，阻断DS-1与IL6结合的抗人IL-6受体单克隆抗体)高7至281倍的IL-6阻隔能力，这取决于所使用的批次。
然后测试IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的功能。已经报道IL-35在CD4T细胞中诱导非典型调节性表型，其特征在于与IL-35的产生相伴随的FoxP3的产生很少或没有。另外，已知IL-35会关闭TGF-β和IL-10的产生。
在此，从单个供体中分离出磁性富集的人幼稚CD4 T细胞，并用αCD3/αCD28珠子激活，并在所示试剂存在下培养5天(如图18所示)。分离总mRNA并进行RT-qPCR。
图18显示了IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白(鉴定为HdA’00)诱导IL-35(EB13和IL12A的二聚体)的产生。令人惊讶地，异二聚体蛋白也增加了FoxP3的产生。此外，IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白允许细胞增殖，这与其他处理过的药剂不同。尽管已知IL-35会关闭TGF-β和IL-10的产生，但IL-6R-Fc-IL-35异二聚体蛋白导致可检测水平的IL-10的产生(比对照高2倍)。最后，异二聚体蛋白对IL-6的产生没有显著影响。
实施例3：IL-21R-Fc-IL-35异二聚体蛋白的构建和表征
将编码IL21r-Alpha-IL12a链和IL2rg-Beta-IL27B链的构建体双重转染到CHO细胞中，然后使用蛋白A纯化分泌的蛋白。当IL21r-Alpha-IL12a链与IL2rg-Beta-IL27B链(在细胞内或体外)结合时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中称为IL-21R-Fc-IL-35。(图19A)。
在表达的异二聚体蛋白上进行蛋白质印迹。这些揭示了在变性和去糖基化条件下，对应于IL21r-Alpha-IL12a链和IL2rg-Beta-IL27B链的预测分子量的条带(图19B)。
用IL-21R-Fc-IL-35异二聚体蛋白进行体积排阻色谱(SEC)。通过SEC出现的单峰表明可能仅存在单个种类的蛋白，这如所预期是由于在两个构建体中使用了电荷极化接头结构域(Fc-alpha和Fc-beta)(图20)。
在这些实验中，SEQ ID NO：16提供了示例性的电荷极化核心结构域(负-正，即“alpha核心结构域”)序列，而SEQ ID NO：9中提供了示例性的包括杵臼突变的alpha核心结构域。SEQ ID NO：17提供了示例性的电荷极化核心结构域(正-负，即“beta核心结构域”)序列，而SEQ ID NO：25中提供了示例性的包含杵臼突变的beta核心结构域。
在该实施例中使用的示例性多肽链的组分的序列在以下示出：SEQ ID NO：26是IL-21r的胞外域，SEQ ID NO：27是IL2RG的胞外域，SEQ ID NO：20是IL-12a，SEQ ID NO：21是IL-27b。示例性的IL21r-Alpha-IL12a链具有SEQ ID NO：28中所示的序列，并且示例性的IL2rg-beta-IL27B链具有SEQ ID NO：29中所示的序列。
在替代实施方案中，IL-21R-Fc-IL-35异二聚体蛋白可包含IL2rg-Alpha-IL27B链(SEQ ID NO：36)和IL21r-Beta-IL12a链(SEQ ID NO：37)。
实施例4：IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白的构建和特征化
将编码IFNgR-Alpha-IL12a链和IFNGR2-Beta-IL27B链的构建体双重转染到CHO细胞中，然后使用蛋白A纯化分泌的蛋白。当IFNgR-Alpha-IL12a链与IFNGR2-Beta-IL27B链(在细胞内或体外)结合时，它们形成异二聚体蛋白，在本文中称为IFNγR-Fc-IL-35。
在包含IFNgR-Alpha-IL12a链和hIFNGR2-Beta-IL27B链的IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白上进行蛋白质印迹，检测所使用的抗体如每个印迹下方所示。这些揭示了在变性和去糖基化条件下对应于IFNgR-Alpha-IL12a和hIFNGR2-Beta-IL27B的预测分子量的条带(图21)。以黄色突出显示的条带是非特异条带。
对IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白进行体积排阻色谱(SEC)。通过SEC出现的单峰表明可能仅存在单个种类的蛋白，这如所预期是由于在两个构建体中使用了电荷极化接头结构域(Fc-alpha和Fc-beta)(图22)。
在这些实验中，SEQ ID NO：16提供了示例性的电荷极化核心结构域(负-正，即“alpha核心结构域”)序列，且SEQ ID NO：24中提供了示例性的包含杵臼突变的alpha核心结构域。SEQ ID NO：17提供了示例性的电荷极化核心结构域(正-负，即“beta核心结构域”)序列，且SEQ ID NO：25中提供了示例性的包含杵臼突变的beta核心结构域。
在该实施例中使用的示例性多肽链的组分的序列在以下示出：SEQ ID NO：30是IFNgR的胞外域，SEQ ID NO：31是IFNGR2的胞外域，SEQ ID NO：20是IL-12a，且SEQ ID NO：21是IL-27b。示例性的IFNgR-Alpha-IL12a链具有SEQ ID NO：32中所示的序列，并且示例性的IFNGR2-Beta-IL27B链具有SEQ ID NO：33中所示的序列。
在替代实施方案中，IFNγR-Fc-IL-35异二聚体蛋白可包含IFNGR2-Alpha-IL27B链(SEQ ID NO：39)和IFNgR-Beta-IL12a链(SEQ ID NO：38)。
等同方案
尽管已经结合本发明的特定实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，其能够进行进一步的修饰，并且本申请旨在涵盖整体遵循本发明原理的本发明的任何变化、用途或改编，并包括在本发明所属领域内的已知或惯常实践之内的，并且可以应用于上文阐述的基本特征以及所附权利要求的范围之内的内容。
本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文具体描述的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案亦可涵盖在所附权利要求的范围内。
通过引用并入
本文引用的所有专利和出版物均通过引用以其全文并入本文。
仅提供本文所讨论的出版物仅仅是由于它们的公开早于本申请的提交日。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这些出版物。
如本文所用，所有标题仅用于组织，并且不旨在以任何方式限制本公开。任何单独章节的内容均可以同样适用于所有章节。
序列表
<110> 沙塔克实验室有限公司（Shattuck Lab Inc.）
T·施赖伯（Schreiber, Taylor）
G·弗罗姆（Fromm, George）
S·达西瓦（De Silva, Suresh）
<120> 异二聚体蛋白及其用途
<130> SHK-004PC/116981-5004
<150> US 62/688,167
<151> 2018-06-21
<150> US 62/703,248
<151> 2018-07-25
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
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<223> 合成序列
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Gly Ser Gly Ser Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 合成序列
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65 70 75 80
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145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
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Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Lys Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
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Gly Ser Gly Ser Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Gly Pro
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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
145 150 155 160
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
165 170 175
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
195 200 205
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Arg
225 230 235 240
Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Gly Ser
245
<210> 18
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Ser Pro Val Val
1 5 10 15
Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys Val Leu Lys Glu Lys Cys
20 25 30
Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr Ile Val Trp Lys Thr Asn
35 40 45
His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr Ile Ile Asn Arg Thr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser Leu Asn Ile Gln Leu Thr
65 70 75 80
Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu Gln Asn Val Tyr Gly Ile
85 90 95
Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys
100 105 110
Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Gly Gly Arg
115 120 125
Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr
130 135 140
His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys
145 150 155 160
Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val Asn Ile Glu Val Trp Val
165 170 175
Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp His Ile Asn Phe
180 185 190
Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val
195 200 205
Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Thr Trp Thr Asn
210 215 220
Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg
225 230 235 240
Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu
260 265 270
Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Lys Gly Tyr Trp
275 280 285
Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Arg Pro
290 295 300
Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile Asp Pro Ser His Thr Gln
305 310 315 320
Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys Thr Leu Pro Pro Phe Glu
325 330 335
Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val Thr Leu Thr Arg Trp Lys
340 345 350
Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala Thr Lys Leu Thr Val Asn
355 360 365
Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Arg Asn Leu Val
370 375 380
Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile Pro Ala Cys Asp Phe Gln
385 390 395 400
Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala Phe Pro Lys Asp Asn Met
405 410 415
Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu Ser Val Lys Lys Tyr Ile
420 425 430
Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala Pro Cys Ile Thr Asp Trp
435 440 445
Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr Tyr Leu Arg Gly Asn Leu
450 455 460
Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val Thr Pro Val Tyr Ala Asp
465 470 475 480
Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Pro
485 490 495
Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu
500 505 510
Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val Asp Val Gln Asn Gly Phe
515 520 525
Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Gly Asn Glu Thr
530 535 540
Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu
545 550 555 560
Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met Ala Ala Tyr Thr Asp Glu
565 570 575
Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala
580 585 590
Gln Gly Glu Ile Glu
595
<210> 19
<211> 346
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu
1 5 10 15
Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu
20 25 30
Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala
35 40 45
Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu
50 55 60
Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala
65 70 75 80
Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu
85 90 95
Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val
100 105 110
Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val
115 120 125
Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu
130 135 140
Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala
145 150 155 160
Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala
165 170 175
Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys
180 185 190
Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val
195 200 205
Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser
210 215 220
Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala
225 230 235 240
Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His
245 250 255
His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln
260 265 270
Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser
275 280 285
Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala
290 295 300
Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp
305 310 315 320
Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro
325 330 335
Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro
340 345
<210> 20
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 21
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg
1 5 10 15
Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro
20 25 30
Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu
35 40 45
Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro
50 55 60
Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala
65 70 75 80
Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser
85 90 95
Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro
100 105 110
Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln
115 120 125
Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val
145 150 155 160
Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg
165 170 175
Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly
180 185 190
Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly
195 200 205
Lys
<210> 22
<211> 1043
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Ser Pro Val Val
1 5 10 15
Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys Val Leu Lys Glu Lys Cys
20 25 30
Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr Ile Val Trp Lys Thr Asn
35 40 45
His Phe Thr Ile Pro Lys Glu Gln Tyr Thr Ile Ile Asn Arg Thr Ala
50 55 60
Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser Leu Asn Ile Gln Leu Thr
65 70 75 80
Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu Gln Asn Val Tyr Gly Ile
85 90 95
Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys
100 105 110
Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Gly Gly Arg
115 120 125
Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr
130 135 140
His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys
145 150 155 160
Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val Asn Ile Glu Val Trp Val
165 170 175
Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys Val Thr Ser Asp His Ile Asn Phe
180 185 190
Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val
195 200 205
Ile Asn Ser Glu Glu Leu Ser Ser Ile Leu Lys Leu Thr Trp Thr Asn
210 215 220
Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg
225 230 235 240
Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala
245 250 255
Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu
260 265 270
Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Lys Gly Tyr Trp
275 280 285
Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Arg Pro
290 295 300
Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile Asp Pro Ser His Thr Gln
305 310 315 320
Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys Thr Leu Pro Pro Phe Glu
325 330 335
Ala Asn Gly Lys Ile Leu Asp Tyr Glu Val Thr Leu Thr Arg Trp Lys
340 345 350
Ser His Leu Gln Asn Tyr Thr Val Asn Ala Thr Lys Leu Thr Val Asn
355 360 365
Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Arg Asn Leu Val
370 375 380
Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile Pro Ala Cys Asp Phe Gln
385 390 395 400
Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala Phe Pro Lys Asp Asn Met
405 410 415
Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu Ser Val Lys Lys Tyr Ile
420 425 430
Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala Pro Cys Ile Thr Asp Trp
435 440 445
Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr Tyr Leu Arg Gly Asn Leu
450 455 460
Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val Thr Pro Val Tyr Ala Asp
465 470 475 480
Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Pro
485 490 495
Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu
500 505 510
Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val Asp Val Gln Asn Gly Phe
515 520 525
Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Gly Asn Glu Thr
530 535 540
Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu
545 550 555 560
Thr Ser Asp Thr Leu Tyr Met Val Arg Met Ala Ala Tyr Thr Asp Glu
565 570 575
Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala
580 585 590
Gln Gly Glu Ile Glu Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly
595 600 605
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
610 615 620
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
625 630 635 640
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
645 650 655
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
660 665 670
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
675 680 685
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
690 695 700
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
705 710 715 720
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
725 730 735
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
740 745 750
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
755 760 765
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
770 775 780
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
785 790 795 800
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
805 810 815
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
820 825 830
Ser Leu Gly Lys Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Gly Ser Arg Asn
835 840 845
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
850 855 860
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
865 870 875 880
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
885 890 895
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
900 905 910
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
915 920 925
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
930 935 940
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
945 950 955 960
Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln
965 970 975
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
980 985 990
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
995 1000 1005
Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu
1010 1015 1020
His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
1025 1030 1035
Tyr Leu Asn Ala Ser
1040
<210> 23
<211> 804
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu
1 5 10 15
Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu
20 25 30
Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala
35 40 45
Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu
50 55 60
Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala
65 70 75 80
Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu
85 90 95
Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val
100 105 110
Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val
115 120 125
Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu
130 135 140
Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala
145 150 155 160
Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala
165 170 175
Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys
180 185 190
Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val
195 200 205
Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser
210 215 220
Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala
225 230 235 240
Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His
245 250 255
His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln
260 265 270
Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser
275 280 285
Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala
290 295 300
Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp
305 310 315 320
Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro
325 330 335
Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Gly Ser Gly Ser Asp Glu
340 345 350
Gly Gly Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
355 360 365
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
370 375 380
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
385 390 395 400
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
405 410 415
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
420 425 430
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
435 440 445
Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys
450 455 460
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
485 490 495
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
500 505 510
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
515 520 525
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
530 535 540
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
545 550 555 560
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly
580 585 590
Ser Gly Ser Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro Arg Val
595 600 605
Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser Trp Thr
610 615 620
Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile Ala Thr
625 630 635 640
Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys Leu Gln
645 650 655
Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln Leu Phe
660 665 670
Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro Trp Gly
675 680 685
Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile Lys Pro
690 695 700
Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg Gln Leu
705 710 715 720
Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu Ile Phe
725 730 735
Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala Arg Phe
740 745 750
His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg Ala Val
755 760 765
Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp Leu Thr
770 775 780
Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala Thr Met
785 790 795 800
Ser Leu Gly Lys
<210> 24
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> LALA
<222> (19)..(20)
<223> L234A和L235A
<220>
<221> M252Y
<222> (37)..(37)
<220>
<221> S254T
<222> (39)..(39)
<220>
<221> T256E
<222> (41)..(41)
<220>
<221> T-Y
<222> (151)..(151)
<223> 杵突变
<220>
<221> T-Y
<222> (192)..(192)
<223> 杵突变
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 25
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<220>
<221> LALA
<222> (19)..(20)
<223> L234A和L235A
<220>
<221> M252Y
<222> (37)..(37)
<220>
<221> S254T
<222> (39)..(39)
<220>
<221> T256E
<222> (41)..(41)
<220>
<221> Y-T
<222> (151)..(151)
<223> 臼突变
<220>
<221> Y-T
<222> (192)..(192)
<223> 臼突变
<400> 25
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 26
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 26
Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys
1 5 10 15
Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp
20 25 30
Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu
35 40 45
His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met
50 55 60
Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr
65 70 75 80
Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala
85 90 95
Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser
100 105 110
Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe
115 120 125
Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg
130 135 140
Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp
145 150 155 160
Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser
165 170 175
Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln
180 185 190
Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser
195 200 205
Glu Glu Leu Lys Glu
210
<210> 27
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 27
Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met
35 40 45
Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr
50 55 60
Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys
65 70 75 80
Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln
85 90 95
Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn
115 120 125
Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser
130 135 140
Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys
145 150 155 160
Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr
165 170 175
Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp
180 185 190
Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu
195 200 205
Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp
210 215 220
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
225 230 235 240
<210> 28
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 28
Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys
1 5 10 15
Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp
20 25 30
Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu
35 40 45
His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met
50 55 60
Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr
65 70 75 80
Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala
85 90 95
Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser
100 105 110
Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe
115 120 125
Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg
130 135 140
Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp
145 150 155 160
Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser
165 170 175
Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln
180 185 190
Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser
195 200 205
Glu Glu Leu Lys Glu Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Gly Ser Arg Asn
450 455 460
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
465 470 475 480
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
485 490 495
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
500 505 510
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
515 520 525
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
530 535 540
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
545 550 555 560
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
565 570 575
Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln
580 585 590
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
595 600 605
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
610 615 620
Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His
625 630 635 640
Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu
645 650 655
Asn Ala Ser
<210> 29
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 29
Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met
35 40 45
Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln Pro Thr Asn Leu Thr
50 55 60
Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys
65 70 75 80
Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln
85 90 95
Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn
115 120 125
Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser
130 135 140
Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys
145 150 155 160
Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr
165 170 175
Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp
180 185 190
Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu
195 200 205
Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp
210 215 220
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
225 230 235 240
Gly Ser Gly Ser Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Arg
465 470 475 480
Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala
485 490 495
Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala
500 505 510
Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro
515 520 525
Val Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His
530 535 540
Ser Trp Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile
545 550 555 560
Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr
565 570 575
Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr
580 585 590
Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro
595 600 605
Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp
610 615 620
Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg
625 630 635 640
Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser
645 650 655
Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val
660 665 670
Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu
675 680 685
Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly Lys
690 695
<210> 30
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 30
Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro Ser Ser Val Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Asn Val Thr Ile Glu Ser Tyr Asn Met Asn Pro Ile Val Tyr Trp Glu
20 25 30
Tyr Gln Ile Met Pro Gln Val Pro Val Phe Thr Val Glu Val Lys Asn
35 40 45
Tyr Gly Val Lys Asn Ser Glu Trp Ile Asp Ala Cys Ile Asn Ile Ser
50 55 60
His His Tyr Cys Asn Ile Ser Asp His Val Gly Asp Pro Ser Asn Ser
65 70 75 80
Leu Trp Val Arg Val Lys Ala Arg Val Gly Gln Lys Glu Ser Ala Tyr
85 90 95
Ala Lys Ser Glu Glu Phe Ala Val Cys Arg Asp Gly Lys Ile Gly Pro
100 105 110
Pro Lys Leu Asp Ile Arg Lys Glu Glu Lys Gln Ile Met Ile Asp Ile
115 120 125
Phe His Pro Ser Val Phe Val Asn Gly Asp Glu Gln Glu Val Asp Tyr
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Thr Cys Tyr Ile Arg Val Tyr Asn Val Tyr Val Arg
145 150 155 160
Met Asn Gly Ser Glu Ile Gln Tyr Lys Ile Leu Thr Gln Lys Glu Asp
165 170 175
Asp Cys Asp Glu Ile Gln Cys Gln Leu Ala Ile Pro Val Ser Ser Leu
180 185 190
Asn Ser Gln Tyr Cys Val Ser Ala Glu Gly Val Leu His Val Trp Gly
195 200 205
Val Thr Thr Glu Lys Ser Lys Glu Val Cys Ile Thr Ile Phe Asn Ser
210 215 220
Ser Ile Lys Gly
225
<210> 31
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 31
Ser Gln Leu Pro Ala Pro Gln His Pro Lys Ile Arg Leu Tyr Asn Ala
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Ser Trp Glu Pro Val Ala Leu Ser Asn Ser Thr Arg
20 25 30
Pro Val Val Tyr Gln Val Gln Phe Lys Tyr Thr Asp Ser Lys Trp Phe
35 40 45
Thr Ala Asp Ile Met Ser Ile Gly Val Asn Cys Thr Gln Ile Thr Ala
50 55 60
Thr Glu Cys Asp Phe Thr Ala Ala Ser Pro Ser Ala Gly Phe Pro Met
65 70 75 80
Asp Phe Asn Val Thr Leu Arg Leu Arg Ala Glu Leu Gly Ala Leu His
85 90 95
Ser Ala Trp Val Thr Met Pro Trp Phe Gln His Tyr Arg Asn Val Thr
100 105 110
Val Gly Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Thr Pro Gly Glu Gly Ser Leu
115 120 125
Ile Ile Arg Phe Ser Ser Pro Phe Asp Ile Ala Asp Thr Ser Thr Ala
130 135 140
Phe Phe Cys Tyr Tyr Val His Tyr Trp Glu Lys Gly Gly Ile Gln Gln
145 150 155 160
Val Lys Gly Pro Phe Arg Ser Asn Ser Ile Ser Leu Asp Asn Leu Lys
165 170 175
Pro Ser Arg Val Tyr Cys Leu Gln Val Gln Ala Gln Leu Leu Trp Asn
180 185 190
Lys Ser Asn Ile Phe Arg Val Gly His Leu Ser Asn Ile Ser Cys Tyr
195 200 205
Glu Thr Met Ala Asp Ala Ser Thr Glu Leu Gln Gln
210 215 220
<210> 32
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 32
Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro Ser Ser Val Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Asn Val Thr Ile Glu Ser Tyr Asn Met Asn Pro Ile Val Tyr Trp Glu
20 25 30
Tyr Gln Ile Met Pro Gln Val Pro Val Phe Thr Val Glu Val Lys Asn
35 40 45
Tyr Gly Val Lys Asn Ser Glu Trp Ile Asp Ala Cys Ile Asn Ile Ser
50 55 60
His His Tyr Cys Asn Ile Ser Asp His Val Gly Asp Pro Ser Asn Ser
65 70 75 80
Leu Trp Val Arg Val Lys Ala Arg Val Gly Gln Lys Glu Ser Ala Tyr
85 90 95
Ala Lys Ser Glu Glu Phe Ala Val Cys Arg Asp Gly Lys Ile Gly Pro
100 105 110
Pro Lys Leu Asp Ile Arg Lys Glu Glu Lys Gln Ile Met Ile Asp Ile
115 120 125
Phe His Pro Ser Val Phe Val Asn Gly Asp Glu Gln Glu Val Asp Tyr
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Thr Cys Tyr Ile Arg Val Tyr Asn Val Tyr Val Arg
145 150 155 160
Met Asn Gly Ser Glu Ile Gln Tyr Lys Ile Leu Thr Gln Lys Glu Asp
165 170 175
Asp Cys Asp Glu Ile Gln Cys Gln Leu Ala Ile Pro Val Ser Ser Leu
180 185 190
Asn Ser Gln Tyr Cys Val Ser Ala Glu Gly Val Leu His Val Trp Gly
195 200 205
Val Thr Thr Glu Lys Ser Lys Glu Val Cys Ile Thr Ile Phe Asn Ser
210 215 220
Ser Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser
225 230 235 240
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Gly Lys Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Gly Ser Arg Asn Leu
465 470 475 480
Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser
485 490 495
Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln
500 505 510
Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp
515 520 525
Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu
530 535 540
Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile
545 550 555 560
Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala
565 570 575
Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu
580 585 590
Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile
595 600 605
Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala
610 615 620
Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu
625 630 635 640
Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala
645 650 655
Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn
660 665 670
Ala Ser
<210> 33
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 33
Ser Gln Leu Pro Ala Pro Gln His Pro Lys Ile Arg Leu Tyr Asn Ala
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Ser Trp Glu Pro Val Ala Leu Ser Asn Ser Thr Arg
20 25 30
Pro Val Val Tyr Gln Val Gln Phe Lys Tyr Thr Asp Ser Lys Trp Phe
35 40 45
Thr Ala Asp Ile Met Ser Ile Gly Val Asn Cys Thr Gln Ile Thr Ala
50 55 60
Thr Glu Cys Asp Phe Thr Ala Ala Ser Pro Ser Ala Gly Phe Pro Met
65 70 75 80
Asp Phe Asn Val Thr Leu Arg Leu Arg Ala Glu Leu Gly Ala Leu His
85 90 95
Ser Ala Trp Val Thr Met Pro Trp Phe Gln His Tyr Arg Asn Val Thr
100 105 110
Val Gly Pro Pro Glu Asn Ile Glu Val Thr Pro Gly Glu Gly Ser Leu
115 120 125
Ile Ile Arg Phe Ser Ser Pro Phe Asp Ile Ala Asp Thr Ser Thr Ala
130 135 140
Phe Phe Cys Tyr Tyr Val His Tyr Trp Glu Lys Gly Gly Ile Gln Gln
145 150 155 160
Val Lys Gly Pro Phe Arg Ser Asn Ser Ile Ser Leu Asp Asn Leu Lys
165 170 175
Pro Ser Arg Val Tyr Cys Leu Gln Val Gln Ala Gln Leu Leu Trp Asn
180 185 190
Lys Ser Asn Ile Phe Arg Val Gly His Leu Ser Asn Ile Ser Cys Tyr
195 200 205
Glu Thr Met Ala Asp Ala Ser Thr Glu Leu Gln Gln Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
355 360 365
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Arg Lys Gly Gly Lys
450 455 460
Arg Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro
465 470 475 480
Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser
485 490 495
Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile
500 505 510
Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys
515 520 525
Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln
530 535 540
Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro
545 550 555 560
Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile
565 570 575
Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg
580 585 590
Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu
595 600 605
Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala
610 615 620
Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg
625 630 635 640
Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp
645 650 655
Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala
660 665 670
Thr Met Ser Leu Gly Lys
675
<210> 34
<211> 792
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 34
Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu
1 5 10 15
Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu
20 25 30
Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala
35 40 45
Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu
50 55 60
Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala
65 70 75 80
Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu
85 90 95
Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val
100 105 110
Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val
115 120 125
Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu
130 135 140
Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala
145 150 155 160
Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala
165 170 175
Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys
180 185 190
Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val
195 200 205
Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser
210 215 220
Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala
225 230 235 240
Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His
245 250 255
His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln
260 265 270
Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser
275 280 285
Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala
290 295 300
Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp
305 310 315 320
Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro
325 330 335
Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Gly Ser Gly Ser Arg Lys
340 345 350
Gly Gly Lys Arg Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
355 360 365
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
370 375 380
Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
385 390 395 400
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
405 410 415
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
420 425 430
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
435 440 445
Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys
450 455 460
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln
465 470 475 480
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
485 490 495
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
500 505 510
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
515 520 525
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
530 535 540
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
545 550 555 560
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly
580 585 590
Ser Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe
595 600 605
Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met
610 615 620
Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu
625 630 635 640
Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu
645 650 655
Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser
660 665 670
Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys
675 680 685
Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu
690 695 700
Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met
705 710 715 720
Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile
725 730 735
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740 745 750
Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu
755 760 765
Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg
770 775 780
Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
785 790
<210> 35
<211> 597
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 35
Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr Ile Ser Pro Glu Ser Pro Val Val
1 5 10 15
Gln Leu His Ser Asn Phe Thr Ala Val Cys Val Leu Lys Glu Lys Cys
20 25 30
Met Asp Tyr Phe His Val Asn Ala Asn Tyr Ile Val Trp Lys Thr Asn
35 40 45
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50 55 60
Ser Ser Val Thr Phe Thr Asp Ile Ala Ser Leu Asn Ile Gln Leu Thr
65 70 75 80
Cys Asn Ile Leu Thr Phe Gly Gln Leu Glu Gln Asn Val Tyr Gly Ile
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Thr Ile Ile Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys Pro Lys Asn Leu Ser Cys
100 105 110
Ile Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys Glu Trp Asp Gly Gly Arg
115 120 125
Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu Lys Ser Glu Trp Ala Thr
130 135 140
His Lys Phe Ala Asp Cys Lys Ala Lys Arg Asp Thr Pro Thr Ser Cys
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Asp Pro Val Tyr Lys Val Lys Pro Asn Pro Pro His Asn Leu Ser Val
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210 215 220
Pro Ser Ile Lys Ser Val Ile Ile Leu Lys Tyr Asn Ile Gln Tyr Arg
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Thr Lys Asp Ala Ser Thr Trp Ser Gln Ile Pro Pro Glu Asp Thr Ala
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Ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gln Asp Leu Lys Pro Phe Thr Glu
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Tyr Val Phe Arg Ile Arg Cys Met Lys Glu Asp Gly Lys Gly Tyr Trp
275 280 285
Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala Ser Gly Ile Thr Tyr Glu Asp Arg Pro
290 295 300
Ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys Ile Asp Pro Ser His Thr Gln
305 310 315 320
Gly Tyr Arg Thr Val Gln Leu Val Trp Lys Thr Leu Pro Pro Phe Glu
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Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Arg Asn Leu Val
370 375 380
Gly Lys Ser Asp Ala Ala Val Leu Thr Ile Pro Ala Cys Asp Phe Gln
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Ala Thr His Pro Val Met Asp Leu Lys Ala Phe Pro Lys Asp Asn Met
405 410 415
Leu Trp Val Glu Trp Thr Thr Pro Arg Glu Ser Val Lys Lys Tyr Ile
420 425 430
Leu Glu Trp Cys Val Leu Ser Asp Lys Ala Pro Cys Ile Thr Asp Trp
435 440 445
Gln Gln Glu Asp Gly Thr Val His Arg Thr Tyr Leu Arg Gly Asn Leu
450 455 460
Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Val Thr Pro Val Tyr Ala Asp
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Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Gln Ala Pro
485 490 495
Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu
500 505 510
Ala Val Leu Glu Trp Asp Gln Leu Pro Val Asp Val Gln Asn Gly Phe
515 520 525
Ile Arg Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Arg Thr Ile Ile Gly Asn Glu Thr
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Ala Val Asn Val Asp Ser Ser His Thr Glu Tyr Thr Leu Ser Ser Leu
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Gly Gly Lys Asp Gly Pro Glu Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala
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Gln Gly Glu Ile Glu
595
<210> 36
<211> 698
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 36
Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr
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Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe Asn Val Glu Tyr Met
35 40 45
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50 55 60
Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp Lys Val Gln Lys Cys
65 70 75 80
Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln
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Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn
115 120 125
Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser
130 135 140
Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys
145 150 155 160
Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr
165 170 175
Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp
180 185 190
Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn Pro Leu
195 200 205
Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile His Trp
210 215 220
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
225 230 235 240
Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Lys Tyr Gly Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
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450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Asp
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Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala
485 490 495
Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala
500 505 510
Val Asp Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro
515 520 525
Val Ser Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His
530 535 540
Ser Trp Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile
545 550 555 560
Thr Asp Val Gln Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr
565 570 575
Ala Val His Pro Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr
580 585 590
Glu His Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro
595 600 605
Leu Ala Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp
610 615 620
Pro Phe Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg
625 630 635 640
Gln Gly Ala Ala Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser
645 650 655
Phe Ile Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val
660 665 670
Ala Ala Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu
675 680 685
Pro Ala Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly Lys
690 695
<210> 37
<211> 659
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 37
Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys
1 5 10 15
Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp
20 25 30
Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu
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His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met
50 55 60
Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr
65 70 75 80
Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala
85 90 95
Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser
100 105 110
Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe
115 120 125
Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg
130 135 140
Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp
145 150 155 160
Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser
165 170 175
Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln
180 185 190
Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser
195 200 205
Glu Glu Leu Lys Glu Gly Ser Gly Ser Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Gly Ser Arg Asn
450 455 460
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
465 470 475 480
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
485 490 495
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
500 505 510
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
515 520 525
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
530 535 540
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
545 550 555 560
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
565 570 575
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580 585 590
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
595 600 605
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
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Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His
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645 650 655
Asn Ala Ser
<210> 38
<211> 674
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 38
Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro Ser Ser Val Pro Thr Pro Thr
1 5 10 15
Asn Val Thr Ile Glu Ser Tyr Asn Met Asn Pro Ile Val Tyr Trp Glu
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Leu Trp Val Arg Val Lys Ala Arg Val Gly Gln Lys Glu Ser Ala Tyr
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Ala Lys Ser Glu Glu Phe Ala Val Cys Arg Asp Gly Lys Ile Gly Pro
100 105 110
Pro Lys Leu Asp Ile Arg Lys Glu Glu Lys Gln Ile Met Ile Asp Ile
115 120 125
Phe His Pro Ser Val Phe Val Asn Gly Asp Glu Gln Glu Val Asp Tyr
130 135 140
Asp Pro Glu Thr Thr Cys Tyr Ile Arg Val Tyr Asn Val Tyr Val Arg
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Asp Cys Asp Glu Ile Gln Cys Gln Leu Ala Ile Pro Val Ser Ser Leu
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Asn Ser Gln Tyr Cys Val Ser Ala Glu Gly Val Leu His Val Trp Gly
195 200 205
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Ser Ile Lys Gly Gly Ser Gly Ser Asp Glu Gly Gly Glu Asp Gly Ser
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Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
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370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Gly Lys Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Gly Ser Arg Asn Leu
465 470 475 480
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485 490 495
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Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile
545 550 555 560
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565 570 575
Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu
580 585 590
Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile
595 600 605
Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala
610 615 620
Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu
625 630 635 640
Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala
645 650 655
Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn
660 665 670
Ala Ser
<210> 39
<211> 678
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成的肽
<400> 39
Ser Gln Leu Pro Ala Pro Gln His Pro Lys Ile Arg Leu Tyr Asn Ala
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Ser Trp Glu Pro Val Ala Leu Ser Asn Ser Thr Arg
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Pro Val Val Tyr Gln Val Gln Phe Lys Tyr Thr Asp Ser Lys Trp Phe
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50 55 60
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65 70 75 80
Asp Phe Asn Val Thr Leu Arg Leu Arg Ala Glu Leu Gly Ala Leu His
85 90 95
Ser Ala Trp Val Thr Met Pro Trp Phe Gln His Tyr Arg Asn Val Thr
100 105 110
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115 120 125
Ile Ile Arg Phe Ser Ser Pro Phe Asp Ile Ala Asp Thr Ser Thr Ala
130 135 140
Phe Phe Cys Tyr Tyr Val His Tyr Trp Glu Lys Gly Gly Ile Gln Gln
145 150 155 160
Val Lys Gly Pro Phe Arg Ser Asn Ser Ile Ser Leu Asp Asn Leu Lys
165 170 175
Pro Ser Arg Val Tyr Cys Leu Gln Val Gln Ala Gln Leu Leu Trp Asn
180 185 190
Lys Ser Asn Ile Phe Arg Val Gly His Leu Ser Asn Ile Ser Cys Tyr
195 200 205
Glu Thr Met Ala Asp Ala Ser Thr Glu Leu Gln Gln Gly Ser Gly Ser
210 215 220
Arg Lys Gly Gly Lys Arg Gly Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
225 230 235 240
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
245 250 255
Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
260 265 270
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
275 280 285
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
290 295 300
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
305 310 315 320
Leu His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
325 330 335
Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
355 360 365
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Asp Glu Gly Gly Glu
450 455 460
Asp Gly Ser Gly Ser Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr Leu Pro
465 470 475 480
Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp Cys Ser
485 490 495
Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser Phe Ile
500 505 510
Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp Pro Cys
515 520 525
Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp Val Gln
530 535 540
Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val His Pro
545 550 555 560
Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His Ile Ile
565 570 575
Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala Glu Arg
580 585 590
Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe Pro Glu
595 600 605
Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly Ala Ala
610 615 620
Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile Leu Arg
625 630 635 640
Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala Gln Asp
645 650 655
Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala Thr Ala
660 665 670
Thr Met Ser Leu Gly Lys
675

Claims (42)

1.包含第一多肽链和第二多肽链的异二聚体蛋白，其中
第一多肽链包含在氨基末端的第一蛋白的第一亚基，其通过第一电荷极化核心结构域连接至在羧基末端的第二蛋白的第一亚基；且
第二多肽链包含在氨基末端的第一蛋白的第二亚基，其通过第二电荷极化核心结构域连接至在羧基末端的第二蛋白的第二亚基；且
其中第一多肽链和第二多肽链通过第一和第二电荷极化核心结构域上带正电荷的氨基酸残基和带负电荷的氨基酸残基之间的静电相互作用形成异二聚体。
2.如权利要求1所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二电荷极化核心结构域包含多肽接头，其任选选自柔性氨基酸序列、IgG铰链区或抗体序列。
3.如权利要求2所述的异二聚体蛋白，其中所述接头是合成接头，任选PEG。
4.如权利要求2所述的异二聚体蛋白，其中所述接头包含衍生自IgG1，任选人IgG1的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。
5.如权利要求2所述的异二聚体蛋白，其中所述接头包含衍生自IgG4，任选人IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域。
6.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二电荷极化核心结构域在所述电荷极化核心结构域的氨基和羧基末端进一步包含具有带正电荷和/或带负电荷的氨基酸残基的肽。
7.如权利要求6所述的异二聚体蛋白，其中所述包含带正电荷的氨基酸残基的肽可以包括选自His、Lys和Arg的一个或多个氨基酸。
8.如权利要求7所述的异二聚体蛋白，其中所述包含带正电荷的氨基酸残基的肽包含选自以下的序列：YnXnYnXnYn(其中X是带正电荷的氨基酸例如精氨酸、组氨酸或赖氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)(SEQ ID NO：1)、YYnXXnYYnXXnYYn(其中X是带正电荷的氨基酸例如精氨酸、组氨酸或赖氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)(SEQ ID NO：3)和YnXnCYnXnYn(其中X是带正电荷的氨基酸例如精氨酸、组氨酸或赖氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)(SEQ ID NO：5)。
9.如权利要求8所述的异二聚体蛋白，其中所述包含带正电荷的氨基酸残基的肽包含序列RKGGKR(SEQ ID NO：11)或GSGSRKGGKRGS(SEQ ID NO：12)。
10.如权利要求6所述的异二聚体蛋白，其中所述包含带负电荷的氨基酸残基的肽可以包含选自Asp和Glu的一个或多个氨基酸。
11.如权利要求9所述的异二聚体蛋白，其中所述包含带负电荷的氨基酸残基的肽包含选自以下的序列：YnZnYnZnYn(其中Z是带负电荷的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)(SEQ ID NO：2)、YYnZZnYYnZZnYYn(其中Z是带负电荷的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)(SEQ ID NO：4)和YnZnCYnZnYn(其中Z是带负电荷的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸，Y是间隔氨基酸例如丝氨酸或甘氨酸)(SEQ ID NO：6)。
12.如权利要求8所述的异二聚体蛋白，其中所述包含带正电荷的氨基酸残基的肽包含序列DEGGED(SEQ ID NO：13)或GSGSDEGGEDGS(SEQ ID NO：14)。
13.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二电荷极化核心结构域包含一个或多个氨基酸改变，以经由增加氢键和/或范德华力来促进异二聚化。
14.如权利要求13所述的异二聚体蛋白，其中所述一个或多个氨基酸改变在臼基序中产生杵。
15.如权利要求14所述的异二聚体蛋白，其中所述臼基序中的杵通过在第一电荷极化核心结构域中将一个或多个酪氨酸(Y)残基替换为一个或多个苏氨酸(T)残基的一个或多个氨基酸改变而形成，包含和/或通过在第二电荷极化核心结构域中将一个或多个苏氨酸(T)残基替换为一个或多个酪氨酸(Y)残基的一个或多个氨基酸改变而形成。
16.如权利要求14或15所述的异二聚体蛋白，其中所述臼基序中的杵通过在第二电荷极化核心结构域中将一个或多个酪氨酸(Y)残基替换为一个或多个苏氨酸(T)残基的一个或多个氨基酸改变而形成，包含和/或通过在第一电荷极化核心结构域中将一个或多个苏氨酸(T)残基替换为一个或多个酪氨酸(Y)残基的一个或多个氨基酸改变而形成。
17.如权利要求13至16中任一项所述的异二聚体蛋白，其中一个或两个所述电荷极化核心结构域包含选自L234A和L235A(LALA)以及任选P329G的一个或多个效应子和补体沉默取代。
18.如权利要求13至17中任一项所述的异二聚体蛋白，其中一个或两个所述电荷极化核心结构域包含选自M252Y、S254T和T256E的一个或多个半衰期延长突变。
19.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一蛋白选自表1。
20.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第二蛋白选自表1。
21.如权利要求1至20中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白选自细胞因子、生长因子和/或激素。
22.如权利要求21所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白是白介素。
23.如权利要求22所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白是包含IL12α和IL27β亚基的IL-35。
24.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述第一蛋白和/或第二蛋白选自细胞因子、生长因子和/或激素的受体。
25.如权利要求24所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白质是白介素的受体。
26.如权利要求25所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白是包含IL6Rα和gp130亚基的IL6受体。
27.如权利要求25所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白质是包含IL21r和IL2rg亚基的IL21受体。
28.如权利要求25所述的异二聚体蛋白，其中所述第一和/或第二蛋白是包含IFNgR和IFNGR2亚基的IL21受体。
29.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述异二聚体蛋白能够(i)减少或消除免疫抑制信号和(ii)增加或激活免疫刺激信号。
30.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述异二聚体蛋白能够增加效应T细胞与调节性T细胞的比率。
31.如上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白，其中所述异二聚体蛋白能够增加以下细胞的亚群和/或防止其减少：细胞毒性T细胞；效应记忆性T细胞；中央记忆性T细胞；CD8+干细胞记忆效应细胞；TH1效应T细胞；TH2效应T细胞；TH9效应T细胞；TH17效应T细胞；和/或分泌IL-2、IL-4和/或IFN-γ的效应T细胞。
32.药物组合物，其包含上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白。
33.表达载体，其包含编码上述权利要求中任一项所述的异二聚体蛋白的第一和/或第二多肽链的核酸。
34.如权利要求33所述的表达载体，其中所述表达载体是哺乳动物表达载体。
35.如权利要求34所述的表达载体，其中所述表达载体包含DNA或RNA。
36.宿主细胞，其包含如权利要求33至35中任一项所述的表达载体。
37.一种治疗癌症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求32所述的药物组合物。
38.一种治疗自身免疫疾病或病症的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求32所述的药物组合物。
39.一种调节患者的免疫应答的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求32所述的药物组合物。
40.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述患者的T细胞被具有免疫刺激信号的细胞外结构域激活。
41.如权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述患者患有肿瘤，并且一个或多个肿瘤细胞被阻止传递由具有免疫抑制信号的细胞外结构域激活的免疫抑制信号。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述自身免疫疾病或病症选自类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、糖尿病、强直性脊柱炎、干燥综合征、炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)、多发性硬化、结节病、银屑病、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、银屑病、超敏反应(例如过敏、花粉症、哮喘以及急性水肿引起的I型超敏反应)和血管炎。
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