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CN112501338A - 一种水稻粒宽和粒重基因gs5的snp分子标记的开发和应用 - Google Patents

一种水稻粒宽和粒重基因gs5的snp分子标记的开发和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记的开发和应用。所述SNP分子标记为K_050501，K_050501的多态性为A或G。利用所述分子标记，可快速、精准的检测水稻粒宽和粒重基因GS5。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，有利于GS5基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。

Description

一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记的开发和应用
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，具体涉及一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP(单核苷酸多态性)分子标记的开发和应用。
背景技术
水稻是最重要的粮食作物之一，如何提高水稻产量一直是科学研究与育种研究长期关注的重点。水稻产量由单位面积穗数、每穗实粒数和千粒重三个因素构成，千粒重由颖壳的体积和胚乳发育状况两个因素决定，对颖壳形状与体积的描述一般称为粒形，包括粒长、粒宽和粒厚，因此，粒形是重要的产量性状之一。
GS5基因，是第五染色体上的一个正调控粒宽、粒重和灌浆速率的微效基因，窄粒等位基因GS5-H94与宽粒等位基因GS5-ZS97之间的差异主要是启动子区存在的18个多态性位点造成两者表达水平的高低不同。提高GS5的表达量可以增加粒宽，因为GS5影响了一系列细胞周期调控基因的表达，GS5表达量的提高可以促进颖壳细胞分裂，增加颖壳细胞数目。GS5基因表达正向调控水稻籽粒宽度，基因启动子的基因型直接影响籽粒的表型。开发GS5基因的SNP分子标记有利于有利等位基因在水稻产量和稻米品质育种中充分利用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记。
本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。
本发明还提出上述SNP分子标记的检测方法。
本发明还提出上述SNP分子标记的应用。
根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述SNP分子标记为K_050501，其中，K_050501的多态性为A或G。
根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记K_050501的多态性位点位于Chr05.3445198(MSU7.0 position)。
根据本发明的一些实施方式，所述GS5基因的位置在水稻5号染色体的3444071-3445198位碱基。
根据本发明第二方面实施方式的用于检测上述SNP分子标记K_050501的引物组，所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物序列包括Primer SeqAllele X和Primer Seq Allele Y，所述Primer Seq Allele X的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述Primer Seq Allele Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的一些实施方式，所述Primer Seq Allele X的5’端连接FAM或HEX荧光序列，Primer Seq Allele Y的5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。
根据本发明的一些实施方式，所述引物组在水稻育种中的应用。
根据本发明的第三方面实施方式的上述SNP分子标记的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用SNP分子标记K_050501的引物，对K_050501分子标记进行检测；
S3、若K_050501的SNP位点碱基为A，判定测试的水稻样品为纯合窄粒基因型；若检测位点碱基为G，判定测试的水稻样品为宽粒基因型或者中粒基因型。
根据本发明的一些实施方式，优选地，步骤S1中，水稻叶片中提取基因组DNA采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)。
根据本发明的一些实施方式，优选地，步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP位点进行检测。
根据本发明的第四方面实施方式的上述SNP分子标记的应用，所述应用为SNP分子标记在水稻育种中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为利用K_050501分子标记进行检测，选择携带GS5基因的水稻品系进行后续育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测GS5基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于水稻育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
根据本发明实施方式的水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记，至少具有如下有益效果：通过对本发明的水稻粒宽和粒重基因GS5进行SNP分子标记，应用KASP技术反应对水稻材料进行GS5基因检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻粒宽和粒重基因GS5。本发明利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，KASP技术流程中DNA抽提、PCR体系构建和荧光信号检测等基本自动化，可实现96，384，1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量的GS5基因鉴定和筛选。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于GS5基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例的分子标记开发流程图；
图2为本发明实施例的分子标记K_050501的分型图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例为：一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记及其应用，该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因GS5确定物理位置，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1引物设计
根据相关文献，确定GS5(NCBI GenBank：JN256055.1，JN256058.1)基因的位置在水稻5号染色体的3444071-3445198位碱基，提取不同粒型材料在该区间的SNP和侧翼序列，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。标记K_050501有三条引物，如表1所示，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。
表1 K_050501的引物设计
Figure BDA0002830816120000041
2样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
KASP反应测试：KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ng DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形。
表2 KASP检测的反应体系
终浓度 体积(ul)
100UM Primer C 0.42μM 0.0125
100UM Primer X 0.17μM 0.0050
100UM Primer Y 0.17μM 0.0050
2x KASP Master Mix 1x 1.4792
超纯水 1.4983
总体积 3
3标记分型数据
根据上述检测方法，用标记K_050501对宽粒、窄粒和中间型等11份水稻品种进行KASP初筛反应验证，KASP初筛反应验证结果如表3所示，从表3中可以看出标记K_050501基本可以区分窄粒型和其他2种粒型材料，证明了本发明对GS5基因检测的准确性。
表3标记K_050501初筛分型数据
序号 材料名称 表型 K_050501
1 明恢63 窄粒 A:A
2 黄华占 窄粒 A:A
3 籼小占 窄粒 A:A
4 珍汕97B 中间型 G:G
5 南京11 中间型 G:G
6 9311 中间型 G:G
7 中花11 宽粒 G:G
8 Nipponbare 宽粒 G:G
9 武育粳3 宽粒 G:G
10 TP309 宽粒 G:G
11 辽粳294 宽粒 G:G
10 松粳6 宽粒 G:G
11 Asominori 宽粒 G:G
4自然群体验证
利用180份材料对SNP标记K_050501进行自然群体验证。180份材料中包括已知含纯合GS5基因的品种，常见杂交稻、核心水稻育种和核心育种材料构建的F1材料。标记在自然群体分型结果如图2所示，2份的材料检测为具有窄粒纯合GS5基因型且均为已知的GS5供体，其余材料除了分型不明确和无扩增外均为中间型和宽粒纯合GS5基因型。可见，SNP标记检测的位点为高特异型位点，GS5基因未在检测的常见水稻育种中广泛应用，后续导入GS5基因定向改良水稻基因，K_050501可用于水稻GS5基因的高效检测。
本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记的开发和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tattcacgtt tcgcgatta 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tattcacgtt tcgcgattg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtttcaac tggagaggag 20

Claims (10)

1.一种水稻粒宽和粒重基因GS5的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记为K_050501，其中K_050501的多态性为A或G。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记K_050501的多态性位点位于Chr05.3445198。
3.一种用于检测如权利要求1所述的SNP分子标记K_050501的引物组，其特征在于：所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括Primer Seq Allele X和Primer Seq Allele Y，所述Primer Seq Allele X的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Primer Seq Allele Y的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求3所述引物组在水稻育种中的应用。
5.一种如权利要求1所述SNP分子标记的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用SNP分子标记K_050501的引物，对K_050501分子标记进行检测；
S3、若K_050501的SNP位点碱基为A，判定测试的水稻样品为纯合窄粒型；若检测位点碱基为G，判定测试的水稻样品为宽粒型或者中粒型。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤S2中，用KASP技术对SNP位点进行检测。
7.如权利要求1或3任一所述SNP分子标记在水稻育种中的应用。
8.如权利要求7所述的SNP分子标记的应用，其特征在于：所述应用为利用K_050501分子标记进行检测，选择携带GS5基因的水稻品系进行后续育种。
9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
10.一种基因芯片，其特征在于：所述基因芯片包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
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