CN114606337A - 水稻粒型基因glw7的kasp标记开发及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发及其应用，属于基因组序列及植物生物技术领域。它包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻粒型；基因型为水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型；KASP_GLW7位点是水稻基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为C或G，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。本发明利用KASP技术对与水稻粒型基因GLW7紧密连锁的SNP位点进行基因快速分型鉴定，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时分子标记KASP_GLW7的粒长表型选择效率较高，可在水稻的不同种质资源中快速、精准的检测水稻粒型基因GLW7；可在育种早期进行分子标记辅助选择，降低育种成本，加快育种进程。

Description

水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发及其应用

技术领域

本发明涉及基因组序列及植物生物技术领域，具体涉及水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa)是我国最重要的粮食作物之一，我国约六成以上人口以稻米为主食。2020年，我国水稻种植面积达4.5亿亩，约占粮食总面积的四分之一。除食用外，水稻还可作酒精原料、饲料、燃料以及包装材料等。

粒型是水稻的重要指标之一，是影响水稻产量和品质的重要因素，粒型较长的水稻往往产量也较高(张琳,刘艺,张斯威,等.稻米的密度与千粒重及粒型性状的相关性研究[J].中国稻米,2019,25(01):83-86.)。因此，培育长粒型品种是水稻育种的重要方向。分子标记辅助选择技术(Marker-assisted Selection，MAS)是现代分子生物学和传统遗传育种相结合的新型育种模式，可以利用分子标记在植物发育的任何时期从DNA水平对目标植株进行选择，从而弥补传统育种中出现的诸多弊端，是提高水稻育种效率的有效途径(戴扬、熊怀阳、黄剑.分子标记技术在水稻育种中的应用分析[J].农业开发与装备,2020,No.227(11):60-61.)。迄今为止，科学家已克隆了多个水稻粒型基因，包括粒长基因有GS3、GL7、GL3.3等；粒宽基因有GW2、GW5、GS5等；长宽比基因有GW7、TGW3、GS2等(康雪蒙、马梦影、巩文靓、段海燕.水稻粒型基因研究进展及应用[J].农学学报,2020,v.10；No.118(12):27-31.)。大部分基因都开发了相应的Indel、SSR或CAPS分子标记(丁丹.水稻5个粒型相关基因的分子标记开发与效应分析[D].南京农业大学,2014；)。SSR标记、InDel标记或酶切标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台。

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测SNP位点和InDel位点。与SSR、RFLP、InDel等分子标记相比，KASP标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，KASP标记不需要根据DNA片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的水稻粒型KASP分子标记对于推广普及分子标记技术的应用，提高我国优质粒型水稻的育种效率和育种水平具有重要意义。

发明内容

本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：

水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发，其主要步骤如下：

包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻粒型；所述基因型为水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型；所述记KASP_GLW7位点是水稻基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为C或G，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。

作为优选实例，当所述KASP_GLW7位点的基因型为C/C基因型时，水稻为长粒型或者候选为长粒型，其中，所述C/C基因型表示水稻基因组中所述KASP_GLW7位点的核苷酸种类为C的纯合型。

作为优选实例，当所述KASP_GLW7位点的基因型为G/G基因型时，水稻为短粒型或者候选为短粒型；其中，所述G/G基因型表示水稻基因组中所述KASP_GLW7位点的核苷酸种类为G的纯合型。

作为优选实例，当所述KASP_GLW7位点的基因型为C/G基因型时，所述C/G基因型表示水稻基因组中所述KASP_GLW7位点的核苷酸种类为C和G的杂合型。

一种水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的产品，包括以下几种：

a、检测与水稻粒型相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

b、鉴定或辅助鉴定长粒型水稻的产品；

c、用于水稻辅助育种的产品；

d、用于选育长粒型水稻资源的产品。

作为优选实例，所述产品包含以下物质，

I、所述检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_GLW7位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；

II、所述检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

III、含有D1所述PCR引物或D2所述PCR试剂的试剂盒。

作为优选实例，PCR引物主要包括以下几个方面：

i、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-43位的单链DNA，核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-43位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQID No.3的单链DNA组成的引物组；

ii、所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ IDNo.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的产品而提出的应用，主要包括以下几项：

A、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻粒型中；

B、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定长粒型水稻产品中；

C、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中；

D、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在选育长粒型的水稻资源中。

本发明的有益效果是：本发明利用KASP技术对与水稻粒型基因GLW7紧密连锁的SNP位点进行基因快速分型鉴定，可以高、中、低通量的应用在商业化分子育种中；同时分子标记KASP_GLW7的表型选择效率较高，可在水稻的不同种质资源中快速、精准的检测水稻粒型基因GLW7；并且在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少了气溶胶的污染以及溴化乙锭EB(Ethidium bromide)等有毒物的使用，可在育种早期进行分子标记辅助选择，减小育种群体的田间种植规模，降低育种成本，加快育种进程。

附图说明

图1为水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发流程图；

图2为水稻粒型基因GLW7的KASP标记检测品种材料的分型图；

图3为水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发检测F2群体的分型图。

具体实施方式

为了对本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例一

与水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发

与水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的流程如图1所示，据文献报道，获得一个与GLW7基因紧密连锁的SNP位点。

1.引物的确定：将GLW7基因的紧密连锁SNP位点锚定在水稻7号染色体19103121bp位置上(梁文化,张亚东,王才林,等.水稻GLW7基因功能标记的开发和基因效应分析[J].江苏农业学报,2020,036(002):257-264.)，从NCBI数据库下载GLW7基因的紧密连锁SNP位点的侧翼序列，并利用Primer5.0软件，共设计3组KASP引物，利用Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测后，挑选出1套多态性良好的KASP引物用于后续验证，所述用于检测与水稻粒型基因GLW7紧密连锁KASP标记的引物具体如下：

Primer X：5’-gaaggtcggagtcaacggattCACTAGCTCGTCGTCGATCAC-3’(SEQ IDNo.1，小写字母部分为特异荧光标签序列VIC)；

Primer Y：5’-gaaggtgaccaagttcatgctCACTAGCTCGTCGTCGATCAG-3’(SEQ IDNo.2，小写字母部分为特异荧光标签序列FAM)；

Primer R：5’-GGAGGACGACGAGGAGAAGT-3’(SEQ ID No.3)。

所述引物对应的SNP位点为水稻基因组第7号染色体的第19103121位碱基(对应序列表中序列4中第101位核苷酸)；

2.DNA提取：采用常规CTAB法从水稻叶片中提取基因组DNA；

3.KASP反应测试

SNP标记扩增及反应体系：

(1)荧光定量PCR仪AB-Q6 Flex检测：

5μL PCR荧光定量仪检测反应体系包括：基因组DNA 50ng，引物混液0.07μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L^-1各12μL，反向引物Primer R100pmol·L^-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Low Rox)2.5μL；按照荧光定量PCR仪AB-Q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。

以上反应体系为AB-Q6 Flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

(2)选择Douglas Scientific公司ArrayTape平台检测

1.6μL PCR ArrayTape平台检测反应体系包括：含基因组DNA 50ng/μL 0.8μL，引物混液0.03μL(优选引物混液配比：正向引物Primer X、Primer Y 100pmol·L^-1各12μL，反向引物Primer R 100pmol·L-1 30μL,ddH2O 46μL，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，LGC公司2×KASP Mix(Std Rox)0.8μL，根据ArrayTape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。

以上反应体系为Douglas Scientific公司ArrayTape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。

注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。

其中，2×KASP Mix由荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真Taq酶，dNTP，Mg²⁺等组成，荧光探针A的核苷酸序列为：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，5’末端连接一个VIC荧光基团；荧光探针B的核苷酸序列为：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，其5’端连接一个FAM荧光基团；淬灭探针A的核苷酸序列为：5’-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ；淬灭探针B的核苷酸序列为：5’-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3’，其3’端连接一个淬灭基团BHQ。

扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。

实验同时设置反应体系中不添加模板DNA的空白对照(NTC)，每个板设置1个或多个空白对照。

对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型(即检测水稻基因组第7号染色体的第19103121位碱基是C还是G)，若所述待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近X轴(VIC信号)，则待测水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型为G/G纯合型(即水稻基因组第7号染色体的第19103121位碱基为G纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析靠近Y轴(FAM信号)，则待测水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型为C/C纯合型(即水稻基因组第7号染色体的第19103121位碱基为C纯合型)；若待测水稻的扩增产物的荧光信号数据经Douglas基因分型软件分析位于X轴和Y轴中间(VIC和FAM信号)，则待测水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型为C/G杂合型(即水稻基因组第7号染色体的第19103121位碱基为C/G杂合型)，左下角显示为空白对照。

5.标记分型数据分析

为了验证KASP_GLW7位点的可靠性，首先，利用KASP_GLW7对8份水稻品种材料进行分子标记检测(图2)；然后，对8份水稻品种材料进行粒型测量，获得材料的粒型数据，水稻粒型测量方法见文献(梁文化,张亚东,王才林,等.水稻GLW7基因功能标记的开发和基因效应分析[J].江苏农业学报,2020,036(002):257-264.)，材料基因型采用DouglasScientific公司ArrayTape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复，扩增结果表明，KASP_GLW7位点在8份材料中能够获得稳定的PCR产物，并且能够检测到G-VIC和C-FAM两个等位位点(图2)，因此，本发明所述的KASP_GLW7位点可用于水稻粒型基因GLW7的分子标记辅助育种。

表1. 8份测试水稻品种的表型与基因型信息表

序号

品种名称

粒型

基因型

序号

品种名称

粒型

基因型

No.01

农林24

S

G/G

No.05

扬粳805

L

C/C

No.02

农林8号

S

G/G

No.06

沈农265

S

G/G

No.03

扬粳806

S

G/G

No.07

武运粳3号

L

C/C

No.04

扬粳9538

L

C/C

No.08

武运粳7号

L

C/C

注：表中‘L’表示材料的表型为长粒型；‘S’表示材料的表型为短粒型；‘C/C’表示纯合长粒型基因型；‘G/G’表示纯合短粒型基因型；‘C/G’表示杂合长粒型基因型；‘*’表示无检测信号。

实施例2

与水稻粒型基因GLW7的KASP标记在分子标记辅助选择长粒型水稻植株中的应用

为检测本发明KASP_GLW7位点的实用性，利用长粒型材料扬粳805与短粒型材料沈农265杂交获得F1群体，通过F1天然自交产生F2自然分离群体48株，对分离群体进行KASP标记检测和粒型表型验证(表2)，标记检测和粒型表型验证实施方法参考实施例1，对分离群体进行表型与基因型检测和分析，基因型为CC的单株平均粒长为9.39，基因型为GG的单株平均粒长为7.81，基因型为CC的单株平均粒长显著高于基因型为GG的单株，表明标记KASP_GWL7在水稻长粒型植株筛选中具有较高的实用性。

表2.水稻分离群体的表型与基因型信息表

注：表中‘L’表示材料的表型为长粒型；‘S’表示材料的表型为短粒型；‘CC’表示纯合长粒型基因型；‘GG’表示纯合短粒型基因型；‘CG’表示杂合长粒型基因型；‘*’表示无检测信号。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发及其应用

<150> 2021110378261

<151> 2021-09-06

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtcgga gtcaacggat tcactagctc gtcgtcgatc ac 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tcactagctc gtcgtcgatc ag 42

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaggacgac gaggagaagt 20

<210> 4

<211> 201

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

gccgcggcgg cgagcgcggc catggacgcg gccgaggagg aggacgacga ggagaagttc 60

ttgcgggcct tgtccttgcg gtccatgggc ggtggcgcgc gtgatcgacg acgagctagt 120

gctactgtgt gctgtgtgct agcctcctag gggaggtgga agcggtggct ggaggagggt 180

ggagagagct agagctagct c 201

Claims (8)

1.水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发，其特征在于，其主要步骤如下：包括检测待测水稻的基因型，根据待测水稻的基因型鉴定或辅助鉴定水稻粒型；所述基因型为水稻基因组中KASP_GLW7位点的基因型；所述记KASP_GLW7位点是水稻基因组中的一个SNP位点，其核苷酸种类为C或G，为序列表中SEQ ID No.4的第101位核苷酸。

2.根据权利要求1所述的水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发，其特征在于，当所述KASP_GLW7位点的基因型为C/C基因型时，水稻为长粒型或者候选为长粒型，其中，所述C/C基因型表示水稻基因组中所述KASP_GLW7位点的核苷酸种类为C的纯合型。

3.根据权利要求1所述的水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发，其特征在于，当所述KASP_GLW7位点的基因型为G/G基因型时，水稻为短粒型或者候选为短粒型；其中，所述G/G基因型表示水稻基因组中所述KASP_GLW7位点的核苷酸种类为G的纯合型。

4.根据权利要求1所述的水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发，其特征在于，当所述KASP_GLW7位点的基因型为C/G基因型时，所述C/G基因型表示水稻基因组中所述KASP_GLW7位点的核苷酸种类为C和G的杂合型。

5.一种水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的产品，其特征在于，包括以下几种：

a、检测与水稻粒型相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

b、鉴定或辅助鉴定长粒型水稻的产品；

c、用于水稻辅助育种的产品；

d、用于选育长粒型水稻资源的产品。

6.根据权利要求5所述的水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的产品，其特征在于，所述产品包含以下物质，

I、所述检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述KASP_GLW7位点在内的水稻基因组DNA片段的PCR引物；

II、所述检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；

III、含有I所述PCR引物或II所述PCR试剂的试剂盒。

7.根据权利要求5或6任意一项所述的水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的产品所提出的物质，其特征在于，包括以下几个方面：

i、所述PCR引物为由核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.1的第22-43位的单链DNA、核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.2的第22-43位的单链DNA和核苷酸序列是序列表中SEQ IDNo.3的单链DNA组成的引物组；

ii、所述PCR引物为由序列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA、序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA和由序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物组。

8.根据权利要求7所述的水稻粒型基因GLW7的KASP标记开发的产品而提出的应用，其特征在于，主要包括以下几项：

A、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定水稻粒型中；

B、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定长粒型水稻产品中；

C、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在水稻辅助育种或制备水稻辅助育种产品中；

D、应用在检测水稻基因组中KASP_GLW7位点的多态性或基因型的物质在选育长粒型的水稻资源中。

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