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CN109486988B - 高通量检测玉米抗茎腐病基因分型的方法及其试剂盒 - Google Patents

高通量检测玉米抗茎腐病基因分型的方法及其试剂盒 Download PDF

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CN109486988B CN201811462768.5A CN201811462768A CN109486988B CN 109486988 B CN109486988 B CN 109486988B CN 201811462768 A CN201811462768 A CN 201811462768A CN 109486988 B CN109486988 B CN 109486988B
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Abstract

本发明涉及高通量检测玉米茎腐病抗性基因分型的方法及其试剂盒。具体来说，本发明涉及用于高通量检测玉米茎腐病抗性基因的SNP分子标记物，其鉴定方法，用于检测这些SNP分析标记物的方法，引物组以及试剂盒。

Description

高通量检测玉米抗茎腐病基因分型的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及玉米茎腐病抗性的分子鉴定，特别是涉及用于玉米茎腐病抗性分子鉴定的分子标记的高通量检测。
背景技术
玉米茎腐病(Maize Stalk Rot)又称玉米茎基腐病、玉米青枯病等，是玉米的主要病害之一。玉米茎腐病主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)和肿囊腐霉菌(Pythium inflatum Matth.)等多种致病菌引起，主要危害苗期和散粉前植株，受害植物根茎内部组织腐烂坏死，中部表现有青枯、黄枯或青黄枯，对玉米生产造成很大的损失。采用先进的分子育种手段，充分利用玉米资源库中的抗性资源，进行抗病育种和抗病性改良是控制玉米茎腐病最经济有效的途径。
玉米抗茎腐病基因ZmCCT属于包含CCT结构域的一类基因家族，早期对该基因的研究表明，ZmCCT基因是一个参与光周期调节的基因。可见ZmCCT具有双重功能，既参与光周期反应，又参与茎腐病抗性过程。然而，目前玉米茎腐病的抗性鉴定一般是在自然发病和人工接种致病菌的方法下进行抗性鉴定。这种直接观察抗性表型的鉴定方法，工作量巨大，且抗性表型受环境影响较大。因此，亟待开发适合高通量检测与玉米茎腐病抗性相关的分子标记物，以及能够高通量检测与玉米茎腐病抗性相关的分子标记物的方法和试剂盒。
发明内容
本发明根据玉米种质资源中茎腐病抗性基因(ZmCCT)位点的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)信息，筛选适合高通量检测抗玉米茎腐病的SNP作为分子标记物，并且设计出了用于检测所筛选SNP分子标记物的引物，以及相应的检测分型方法和相应的试剂盒，可以用于抗玉米茎腐病抗性的分子诊断，并且所获得的分子标记物可以辅助遗传改良。
一方面，本发明提供了适合高通量检测玉米茎腐病抗性基因(ZmCCT)位点的一种或者多种SNP分子标记物，所述SNP分子标记物选自如下SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142。以玉米基因组B73RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A；A000892对应的位置为94,430,587，等位位点1为A，等位位点2为G；A000894对应的位置为94,420,925，等位位点1为A，等位位点2为G；A001004对应的位置为94,422,051，等位位点1为G，等位位点2为A；A001005对应的位置为94,430,408，等位位点1为A，等位位点2为G；A001141对应的位置为94,441,527，等位位点1为C，等位位点2为T；A001142对应的位置为94,441,467，等位位点1为A，等位位点2为T。
所述SNP位点等位基因型分型有两种或三种：等位基因1纯合型，等位基因2纯合型，或者等位基因1和2杂合型。
另一方面，本发明提供了用于高通量检测玉米茎腐病抗性的方法，所述方法包括从待检测的玉米品种获得的核酸样品中鉴定至少一种选自如下的SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142。
本领域技术人员可以根据已知序列的具体SNP位点选择鉴定方法，所述方法例如可以是：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸、等位基因-特异性扩增等。具体的鉴定试剂可以选自例如等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
优选地，本发明中的鉴定试剂包括等位基因特异性引物。所述特异性引物可以是选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCC(SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCA(SEQ IDNO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGA(SEQ IDNO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGG(SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCA(SEQ IDNO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCG(SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCG(SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCA(SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAA(SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAG(SEQ IDNO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCACACTCTTTGCC(SEQ IDNO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCACACTCTTTGCT(SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)；和
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATGGCGCCAGGTA(SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATGGCGCCAGGTT(SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)。
另外，在已知玉米抗茎腐病基因(ZmCCT基因)位点的特定SNP标记物的前提下，采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪些特异性引物组。本领域技术人员根据如下SNP标记物位点附近的序列：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142可以设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了上述SNP标记物这个前提，因此都在本发明的保护范围内。
另一方面，本发明提供了如下SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142中的一种或者多种在鉴定玉米茎腐病抗性中的应用。
另一方面，本发明提供了筛选玉米抗茎腐病基因(ZmCCT基因)位点与玉米抗茎腐病相关的SNP分子标记物的方法，所述方法包括如下步骤：(1)选择玉米抗茎腐病基因(ZmCCT基因)区段附近的SNP；(2)根据所选择的SNP，对应于每个SNP的引物组；(3)以玉米基因组DNA作为模板，利用步骤(2)设计的引物组进行PCR扩增；(4)对经PCR扩增后的SNP位点进行基因分型，寻找基因分型成功的SNP标记物；以及(5)将基因分型成功的SNP标记物与有统计学意义的数量的已知玉米抗茎腐病表型的样品进行对比，进行T-TEST计算，选择差异达到极显著水平(P<0.05)的SNP分子标记物作为与玉米茎腐病抗性相关的SNP分子标记物。
优选地，基于LGC公司的KASP Master Mix试剂盒设计对应于每个SNP的KASP引物组。
优选地，所述与玉米茎腐病抗性相关的SNP分子标记物为选自玉米抗茎腐病基因(ZmCCT基因)位点的如下SNP标记物的一种或者多种：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142。
另一方面，本发明提供了用于鉴定选自如下的SNP标记物的等位基因特异性引物组：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142。
所述等位基因特异性引物组可以是根据LGC公司的KASP Master Mix试剂盒设计的KASP引物组，例如，可以是选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCC(SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCA(SEQ IDNO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGA(SEQ IDNO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGG(SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCA(SEQ IDNO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCG(SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCG(SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCA(SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAA(SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAG(SEQ IDNO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCACACTCTTTGCC(SEQ IDNO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCACACTCTTTGCT(SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)；和
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATGGCGCCAGGTA(SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATGGCGCCAGGTT(SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)。
另外，在已知玉米抗茎腐病基因(ZmCCT基因)位点的特定SNP标记物的前提下，采用引物常规设计规则来设计扩增该段序列的引物，对于本领域普通技术人员来说是普遍掌握的常规技能，本发明的检测方法不限于采用哪些特异性引物组。本领域技术人员根据表1中所列的如下SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142可以设计出不同的引物对，但都是基于本发明提供了上述SNP标记物这个前提，因此都在本发明的保护范围内。
另一方面，本发明提供了用于鉴定选自表1中的如下SNP标记物的试剂盒：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142，所述试剂盒包含选自如下的试剂：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
优选地，所述试剂盒包含等位基因特异性引物组。进一步优选地，所述等位基因特异性引物组为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCC(SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCA(SEQ IDNO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGA(SEQ IDNO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGG(SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCA(SEQ IDNO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCG(SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCG(SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCA(SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAA(SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAG(SEQ IDNO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCACACTCTTTGCC(SEQ IDNO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCACACTCTTTGCT(SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)；和
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATGGCGCCAGGTA(SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATGGCGCCAGGTT(SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)。
本领域技术人员能够根据具体的SNP标记物设计其它适于本发明用于检测本发明的SNP标记物的等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针，前提是试剂盒中的等位基因特异性寡核苷酸、DNA探针和RNA探针能够与所述SNP标记物进行等位基因特异性杂交。
优选地，所述试剂固定在基质上。进一步优选地，所述试剂排列在阵列上。
另一方面，本发明提供了用于鉴定表1中的一种或者多种如下SNP标记物的试剂在鉴定玉米茎腐病抗性中的应用：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142。
优选地，用于鉴定表1中的一种或者多种如下SNP标记物的试剂选自：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针。
优选地，所述等位基因特异性引物为选自如下的引物组：
(1)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCC(SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGCCTGTAAATCACTCA(SEQ IDNO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG(SEQ ID NO:3)；
(2)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGA(SEQ IDNO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGCCCGAATTCCGG(SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA(SEQ ID NO:6)；
(3)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCA(SEQ IDNO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCTAGGGAACCTCCG(SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG(SEQ ID NO:9)；
(4)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCG(SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAAGAAGCTTTGGGCA(SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG(SEQ ID NO:12)；
(5)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAA(SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACAGTACATCGGCAAAG(SEQ IDNO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC(SEQ ID NO:15)；
(6)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCACACTCTTTGCC(SEQ IDNO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCACACTCTTTGCT(SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)；和
(7)特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATGGCGCCAGGTA(SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATGGCGCCAGGTT(SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC(SEQ ID NO:18)。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术术语，具有与本发明所属技术领域的普通专业人员通常理解的相同的意义。
“SNP”，即“单核苷酸多态性”是指基因组中单个核苷酸的变异所引起的DNA序列的多态性。
“等位基因”是指位于一对同源染色体的给定基因座位置上的一对基因。SNP等位基因就是表征所述SNP的两个核苷酸。
“等位基因特异性寡核苷酸”是指与包含单核苷酸变异的等位基因靶核苷酸杂交的寡核苷酸。
“等位基因特异性杂交”是指当等位基因特异性寡核苷酸与其靶核酸杂交时，所述等位基因特异性寡核苷酸与包含单核苷酸变异的等位基因靶核苷酸特异性碱基配对。
“等位基因特异性引物”是指能用于扩增包含单核苷酸变异的等位基因靶核苷酸的特异性引物。
本发明所鉴定的SNP分子标记物、用于检测所述SNP分子标记物的引物以及相应的检测分型方法具有通量高，成本低，准确率高的特点，为分子标记法辅助选择不同茎腐病抗性玉米后代提供了新的技术手段，可以用于玉米茎腐病分子鉴定。
附图说明
图1显示了KASP法检测样品中成功分型的各基因型点簇分布图。
图2显示了7个SNP标记物在玉米染色体10上的物理位置(基因组位V4)。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照仪器或者试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1玉米茎腐病抗性基因(ZmCCT)位点的SNP分子标记物的选择
从中玉金标记玉米56K SNP芯片上，玉米染色体10上(参考玉米基因组B73RefGen_V4版本的位置)，ZmCCT基因附近选择7个SNP位点进行标记物开发，见下表1。
表1与ZmCCT相连锁的SNP位点信息
(染色体位置为玉米参考基因组B73RefGen_V4位置)
SNP标记名称 染色体号 SNP对应的染色体位置(V4) 等位位点1 等位位点2
A000891 Chr10 94,441,354 C A
A000892 Chr10 94,430,587 A G
A000894 Chr10 94,420,925 A G
A001004 Chr10 94,422,051 G A
A001005 Chr10 94,430,408 A G
A001141 Chr10 94,441,527 C T
A001142 Chr10 94,441,467 A T
根据市售获得的LGC公司的KASP Master Mix检测试剂盒，采用Primer3引物设计软件进行引物设计，设计结果见下表2，共设计了7个KASP标记物引物组，每个标记物引物组包含特异引物1、特异引物2和通用引物，其中特异引物1和特异引物2的5’端分别连接了Allele-1tail和Allele-2tail。Allele-1tail和Allele-2tail这两条加尾序列分别标记了FAM和HEX荧光基团，具体序列显示如下：
Allele-1tail：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT
Allele-2tail：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT
表2标记物引物组设计
Figure GDA0001941067440000091
Figure GDA0001941067440000101
实施例2高通量检测玉米抗茎腐病基因ZmCCT位点的SNP分子标记物
采用实施例1设计的7个KASP引物组，以玉米基因组DNA作为模板，经PCR扩增后对SNP位点进行分析：
1.提取样品基因组DNA：
使用TIANGEN公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP-305)，并按照试剂盒说明书提取供试玉米样品基因组DNA，具体步骤如下：
(1)在液氮中研磨100mg新鲜或20℃冷冻的样品材料；
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预装有700μl、65℃预热的缓冲液GP1的离心管中，所述缓冲液GP1中含有终浓度为0.1wt％的巯基乙醇，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次；
(3)加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min；(注：若提取富含多酌或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿(1:1)进行等体积抽提)；
(4)小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管，加入700μl的缓冲液GP2，充分混匀；
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，弃掉废液；
(7)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前检查是否己加入无水乙醇)，12,000rpm离心30s，倒掉废液；
(8)重复步骤(7)；
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(10)将吸附柱CB3放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量50-200μl洗脱缓冲液TE(pH值在7.0-8.5之间)，室温放置2-5min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液；以及
(11)用紫外分光光度计检测DNA的含量及纯度，结果显示所测样品A260/280介于1.8～2.0之间，表明所提取的DNA纯度较高。
2.PCR扩增：
以步骤1制得的基因组DNA为模板，DNA稀释及转板在TECAN液体自动化工作站上进行；PCR整个过程在Douglas Scenfitic Array Tape平台上完成；在Nexar工作站上将DNA和PCR mix加入384PCR反应Array Tape中；在Soellex水浴中完成PCR反应；在Araya上完成检测荧光强度，读取数据；在Intellics管理系统中完成程序设定和数据分析；引物的核苷酸序列如表2所示。
PCR反应体系为3μl，组分如下：
Figure GDA0001941067440000111
PCR扩增反应条件为：
94℃预变性15min；
第一步扩增反应，94℃预变性20秒，65℃-55℃60秒，10个循环，每个循环降低1℃；
第二步扩增反应，94℃预变性20秒，55℃60秒，35个循环。
在Araya荧光阅读仪上读取荧光信号，数据读取使用Douglas Scenfitic公司Intellics软件进行，结果分析使用Douglas Scenfitic公司Intellics软件进行。
3.基因分型
SNP位点等位基因型分型有三种：等位基因1纯合型，等位基因2纯合型，等位基因1和等位基因2杂合型。如上述2所述，对PCR扩增反应获得的结果进行分析。参见图1，SNP位点等位基因1纯合型(簇1)、SNP位点等位基因2纯合型(簇2)、等位基因1和等位基因2杂合型(簇3)，分别组成分型明确的三个群，阴性对照(簇4)没有明显扩增，这样的基因型点簇分布图对应基因分型成功的标记物，共开发出7个基因分型成功的标记物(参见下表3)。
表3分型结果
SNP标记名称 染色体位置 分型结果
A000891 94,441,354 成功
A000892 94,430,587 成功
A000894 94,420,925 成功
A001004 94,422,051 成功
A001005 94,430,408 成功
A001141 94,441,527 成功
A001142 94,441,467 成功
4.基因型与表型的关联
参照表4对上述分型成功的7个标记物的三种等位基因分型(带有2个抗性片段的纯合型(等位基因1)；带有1个抗性片段的杂合型(等位基因1和等位基因2的杂合型)；无抗性的纯合型(等位基因2))分别赋予数字2，1和0。
表4标记物基因型数字化
Figure GDA0001941067440000121
参见下表5，对46份已知抗性(第二列中列出的是已知的抗性或者易感的表型：HR:高抗；R：抗性；MR：中抗；S：易感；HS：高感)样品的茎腐病抗性表型与基因型进行对比，在茎腐病抗性表型分组之间对标记物结果进行T-TEST计算，P<0.05说明两组间差异达到显著水平，P<0.01说明两组间差异达到极显著水平，分别计算玉米茎腐病高抗&抗/高感、抗&中抗/感&高感(高抗、抗和中抗与感和高感)的P值，P值<0.05的标记物作为可用标记物。参见表6，表4所示的7个标记物及其组合P值<0.05，因此均可以用来区分抗/感及抗&中抗/感&中感(参见表6与图2)。图2显示了标记玉米染色体10上的位置(基因组为V4)。
表6基因型和玉米茎腐病抗性表型的关联性
Figure GDA0001941067440000131
Figure GDA0001941067440000141
Figure GDA0001941067440000151
参见附图1和2，以及表3-6，可以看出，本发明限定的7个SNP标记物无论是组合还是单独都与玉米茎腐病抗性表型成功关联(达到P值<0.05的显著性)；而且用46种已知茎腐病抗性表型的玉米品种也进一步验证了本发明限定的7个SNP标记物与茎腐病抗性表型的相关性。因此，这7个SNP标记物可以用来区分抗性/易感及抗性&中抗/易感&高感表型。
本发明适合高通量检测与玉米茎腐病抗性相关的分子标记物，以及能够高通量检测与玉米茎腐病抗性相关的分子标记物的方法和试剂盒，可利用本发明对玉米进行抗茎腐病基因ZmCCT是否存在、玉米品系茎腐病抗性鉴定、分子辅助选择育种等，以充分利用玉米抗茎腐病品种资源，加快玉米育种的进程。
SEQUENCE LISTING
<110> 中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司
<120> 高通量检测玉米抗茎腐病基因分型的方法及其试剂盒
<130> PP2600YJ66CN
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tcggcaaagc ctgtaaatca ctcc 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tcggcaaagc ctgtaaatca ctca 44
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 3
cagcaaagaa gtcgttgctg atg 23
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tgccaaaagc ccgaattccg a 41
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tgccaaaagc ccgaattccg g 41
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 6
ttggggatac tgtttgaatt gcta 24
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc tgcagaggct agggaacctc ca 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tgcagaggct agggaacctc cg 42
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 9
ggaggatgtg cgtagactac actg 24
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 10
gaaggtgacc aagttcatgc tcagttacaa gaagctttgg gcg 43
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 11
gaaggtcgga gtcaacggat tcagttacaa gaagctttgg gca 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 12
ctcagtctga ccatctcttt gcg 23
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<212> DNA
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<220>
<223> Unknown
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc tcgacaaaca gtacatcggc aaaa 44
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcgacaaaca gtacatcggc aaag 44
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 15
taccgagtac aggacactcg gc 22
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<212> DNA
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<220>
<223> Unknown
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gaaggtgacc aagttcatgc tgcaaaggca cactctttgc c 41
<210> 17
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<212> DNA
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<220>
<223> Unknown
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gaaggtcgga gtcaacggat tgcaaaggca cactctttgc t 41
<210> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
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caaagggacc cacggggtac 20
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<220>
<223> Unknown
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gaaggtgacc aagttcatgc tgctgtcatg gcgccaggta 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unknown
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tgctgtcatg gcgccaggtt 40

Claims (19)

1.用于高通量检测玉米茎腐病抗性基因ZmCCT位点的SNP分子标记物在鉴定玉米茎腐病抗性中的应用，所述SNP分子标记物为A000891，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A。
2.用于高通量检测玉米茎腐病抗性基因ZmCCT位点的SNP分子标记物的组合在鉴定玉米茎腐病抗性中的应用，所述组合包含如下SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A；A000892对应的位置为94,430,587，等位位点1为A，等位位点2为G；A000894对应的位置为94,420,925，等位位点1为A，等位位点2为G；A001004对应的位置为94,422,051，等位位点1为G，等位位点2为A；A001005对应的位置为94,430,408，等位位点1为A，等位位点2为G；A001141对应的位置为94,441,527，等位位点1为C，等位位点2为T；A001142对应的位置为94,441,467，等位位点1为A，等位位点2为T。
3.用于高通量检测玉米茎腐病抗性基因ZmCCT的方法，其特征在于所述方法包括从待检测的玉米品种获得的核酸样品中鉴定至少SNP标记物A000891，所述方法选自：直接测序、等位基因-特异性探针杂交、等位基因-特异性引物延伸和等位基因-特异性扩增，其中以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述等位基因-特异性引物延伸中采用的等位基因特异性引物为如下的引物组：
特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ ID NO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)。
5.根据权利要求3或4的方法，所述方法包括鉴定SNP分子标记物的组合，所述组合包含如下SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A；A000892对应的位置为94,430,587，等位位点1为A，等位位点2为G；A000894对应的位置为94,420,925，等位位点1为A，等位位点2为G；A001004对应的位置为94,422,051，等位位点1为G，等位位点2为A；A001005对应的位置为94,430,408，等位位点1为A，等位位点2为G；A001141对应的位置为94,441,527，等位位点1为C，等位位点2为T；A001142对应的位置为94,441,467，等位位点1为A，等位位点2为T。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述等位基因-特异性引物延伸中采用的等位基因特异性引物为如下的引物组：
(1) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)；
(2) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGA (SEQ ID NO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGG (SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA (SEQ ID NO:6)；
(3) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCA(SEQ ID NO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCG (SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG (SEQ ID NO:9)；
(4) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCG (SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCA (SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG (SEQ ID NO:12)；
(5) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAA (SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAG (SEQ ID NO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC (SEQ ID NO:15)；
(6) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCC (SEQ ID NO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCT (SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)；
(7) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATG GCGCCAGGTA (SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATG GCGCCAGGTT (SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)。
7.用于鉴定限定的SNP标记物A000891的引物组，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A。
8.根据权利要求7的引物组，其特征在于所述引物组为：
特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ ID NO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)。
9.用于鉴定SNP分子标记物的组合的引物组，所述SNP分子标记物的组合包含A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A；A000892对应的位置为94,430,587，等位位点1为A，等位位点2为G；A000894对应的位置为94,420,925，等位位点1为A，等位位点2为G；A001004对应的位置为94,422,051，等位位点1为G，等位位点2为A；A001005对应的位置为94,430,408，等位位点1为A，等位位点2为G；A001141对应的位置为94,441,527，等位位点1为C，等位位点2为T；A001142对应的位置为94,441,467，等位位点1为A，等位位点2为T。
10.根据权利要求9的引物组，包含如下引物：
(1) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)；
(2) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGA (SEQ ID NO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGG (SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA (SEQ ID NO:6)；
(3) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCA(SEQ ID NO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCG (SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG (SEQ ID NO:9)；
(4) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCG (SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCA (SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG (SEQ ID NO:12)；
(5) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAA (SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAG (SEQ ID NO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC (SEQ ID NO:15)；
(6) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCC (SEQ ID NO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCT (SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)；和
(7) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATG GCGCCAGGTA (SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATG GCGCCAGGTT (SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)。
11.用于鉴定SNP标记物A000891的试剂盒，所述试剂盒包含选自如下的试剂之一：等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针；其中以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A。
12.根据权利要求11的试剂盒，所述等位基因特异性引物为如下的引物组：
特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ ID NO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)。
13.用于鉴定SNP标记物的组合的试剂盒，所述试剂盒包含选自如下的试剂之一：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针；所述SNP标记物的组合包含如下SNP标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A；A000892对应的位置为94,430,587，等位位点1为A，等位位点2为G；A000894对应的位置为94,420,925，等位位点1为A，等位位点2为G；A001004对应的位置为94,422,051，等位位点1为G，等位位点2为A；A001005对应的位置为94,430,408，等位位点1为A，等位位点2为G；A001141对应的位置为94,441,527，等位位点1为C，等位位点2为T；A001142对应的位置为94,441,467，等位位点1为A，等位位点2为T。
14.根据权利要求13的试剂盒，其包含如下引物组：
(1) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)；
(2) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGA (SEQ ID NO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGG (SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA (SEQ ID NO:6)；
(3) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCA(SEQ ID NO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCG (SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG (SEQ ID NO:9)；
(4) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCG (SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCA (SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG (SEQ ID NO:12)；
(5) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAA (SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAG (SEQ ID NO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC (SEQ ID NO:15)；
(6) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCC (SEQ ID NO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCT (SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)；和
(7) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCTGTCATG GCGCCAGGTA (SEQ ID NO:19)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCTGTCATG GCGCCAGGTT (SEQ ID NO:20)；
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)。
15.根据权利要求11-14中任一项的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的试剂固定在基质上或排列在阵列上。
16.用于鉴定SNP分子标记物A000891的试剂在检测玉米抗茎腐病表型中的应用，所述试剂选自：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针；其中以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A。
17.根据权利要求16的应用，其中所述等位基因特异性引物为如下引物组：
特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ ID NO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)。
18.用于鉴定SNP分子标记物的组合的试剂在检测玉米抗茎腐病表型中的应用，所述试剂选自：等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、DNA探针和RNA探针；所述SNP分子标记物的组合包含如下SNP分子标记物：A000891、A000892、A000894、A001004、A001005、A001141和A001142，以玉米基因组B73 RefGen_V4版本染色体10为准，所述A000891对应的位置为94,441,354，等位位点1为C，等位位点2为A；A000892对应的位置为94,430,587，等位位点1为A，等位位点2为G；A000894对应的位置为94,420,925，等位位点1为A，等位位点2为G；A001004对应的位置为94,422,051，等位位点1为G，等位位点2为A；A001005对应的位置为94,430,408，等位位点1为A，等位位点2为G；A001141对应的位置为94,441,527，等位位点1为C，等位位点2为T；A001142对应的位置为94,441,467，等位位点1为A，等位位点2为T。
19.根据权利要求18的应用，所述等位基因特异性引物为如下引物组：
(1) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCC (SEQ IDNO:1)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGGCAAAGC CTGTAAATCACTCA (SEQ ID NO:2)；
通用引物：CAGCAAAGAAGTCGTTGCTGATG (SEQ ID NO:3)；
(2) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGA (SEQ ID NO:4)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCCAAAAGC CCGAATTCCGG (SEQ ID NO:5)；
通用引物：TTGGGGATACTGTTTGAATTGCTA (SEQ ID NO:6)；
(3) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCA(SEQ ID NO:7)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAGAGGCT AGGGAACCTCCG (SEQ ID NO:8)；
通用引物：GGAGGATGTGCGTAGACTACACTG (SEQ ID NO:9)；
(4) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCG (SEQ IDNO:10)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CAGTTACAA GAAGCTTTGGGCA (SEQ ID NO:11)；
通用引物：CTCAGTCTGACCATCTCTTTGCG (SEQ ID NO:12)；
(5) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAA (SEQ IDNO:13)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-CGACAAACA GTACATCGGCAAAG (SEQ ID NO:14)，
通用引物：TACCGAGTACAGGACACTCGGC (SEQ ID NO:15)；
(6) 特异引物1：FAM-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCC (SEQ ID NO:16)；
特异引物2：HEX-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-GCAAAGGCA CACTCTTTGCT (SEQ ID NO:17)，
通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)；和
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通用引物：CAAAGGGACCCACGGGGTAC (SEQ ID NO:18)。
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