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CN112410343A - 基于crispr的试剂盒及其应用 - Google Patents

基于crispr的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了crRNA 1,其能识别clfA的SEQ ID NO.1所示靶点，还提供了crRNA2，其能识别mecA的SEQ ID NO.2所示靶点。本发明还提供了crRNA1和2组成的组合物，及基于CRISPR的试剂盒及其进一步的检测应用。本发明经反复筛选得出clfA、mecA基因的识别靶点，进而成功实现灵敏、特异检测MRSA。

Description

基于CRISPR的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR的试剂盒及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌（金葡菌）是一种重要的人类机会致病菌，可以引起多种疾病，如：心内膜炎，肺炎，中毒性休克综合征等。青霉素的发现使感染金葡菌的患者得到了有效治疗，但随着抗生素的大面积使用，很快出现了对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）。因此构建操作简便的MRSA快速筛查测试非常有必要。CRISPR-Cas（Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-associated (Cas) proteins）系统为基因组编辑提供了革命性的工具，具有替代活性的Cas蛋白成为一种检测核酸敏感性的强有力的工具。最近的研究显示利用这些新的CRISPR-Cas技术为病原体和疾病检测提供低成本和实用诊断工具的潜力。Cas12a使用单一的多结构域效应蛋白发挥作用，由一个CRISPR RNA(crRNA)和一个Cas蛋白组装成一个核糖核酸复合物，该crRNA包含针对特定DNA序列的信息。这些多结构域效应蛋白通过识别与目标DNA相邻的PAM序列，使crRNA与目标序列互补，进而发生核酸酶剪切作用。
发明内容
一方面，本发明提供了一种crRNA 1,其能识别金葡菌特异性识别基因clfA的SEQID NO.1所示靶点，或者序列如SEQ ID NO.3所示。
一方面，本发明提供了一种crRNA 2，其能识别甲氧西林耐药基因mecA的SEQ IDNO.2所示靶点，或者序列如SEQ ID NO.4所示。
对应地，本发明提供了上述crRNA 1与crRNA 2的组合形式- crRNA组合物，其可用于检测MRSA金葡菌。
进一方面，本发明提供了一种含上述crRNA组合物的试剂盒，其可含有cas12a蛋白，可称为基于CRISPR-Cas12a的试剂盒。试剂盒中可含有单链DNA荧光探针，结构可为5’6-FAM-TTTTTTTTTTTT-3’BHQ1。
对应地，本发明提供了使用上述基因或其组合应用形式，用于检测MRSA的方法，该方法可用于非诊断目的，可判定样品中是否含有甲氧西林耐药基因或耐药金葡菌，样品可为临床分离的金葡菌标本。检测可包括预先对样品进行clfA、mecA基因扩增，扩增方法可为恒温扩增，如为RAA重组酶介导等温核酸扩增，扩增金葡菌clfA基因用的引物A，其可包含上游引物ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC和下游引物ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC；扩增甲氧西林耐药基因mecA用的引物B，其可包含上游引物CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA和下游引物GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA。
本发明的有益效果为：经反复筛选得出clfA、mecA基因的识别靶点，进而成功实现灵敏、特异检测MRSA。
附图说明
图1为clfA基因特异性检测结果
图2为mecA基因特异性检测结果
图3为实施例2样品鉴定结果。
具体实施方式
下面各实施例均主要涉及如下基因：
1. 金葡菌特异性识别基因clfA，识别靶点SEQ ID NO.1: TTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGA
crRNA SEQ ID NO.3: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGACUACUCAGCAGUAAAGA
RAA恒温扩增引物：
上游引物：ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC
下游引物：ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC
2. 耐甲氧西林耐药基因mecA，识别靶点SEQ ID NO.2: TTTCGGTCTAAAATTTTACCACGT
crRNA SEQ ID NO.4: UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUAAAAUUUUACCACGU
RAA恒温扩增引物：
上游引物：CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA
下游引物：GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA
3. 荧光探针：5’6-FAM-TTTTTTTTTTTT-3’BHQ1
实施例1：
用CRISPR-Cas12a结合RAA恒温扩增技术检测MRSA中clfA基因和mecA基因，为了便于计算基因拷贝数，分别使用包含clfA基因和mecA基因的合成质粒进行灵敏度检测，进一步使用实验室保存的细菌进行特异度检测。具体包括以下步骤：
（1）以样本基因组DNA（灵敏度检测时使用合成质粒的DNA，细菌实验时使用实验室保存的细菌的DNA）为模板，使用RAA核酸扩增试剂对clfA基因和mecA基因分别进行核酸扩增。反应体系共50ul，包括：41.5ul A Buffer，2.5ul B Buffer，2ul 样本DNA，2ul上游引物，2ul下游引物。
（引物序列：clfA基因上游引物：ATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTC，下游引物：ACGCTACTTGAATCATTACTTTTGCTTTCGTTAC；
mecA基因上游引物：CCCAATTTTGATCCATTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGA，下游引物：GAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAA）
具体操作步骤：
a．向装有检测干粉酶制剂的检测单元管中加入41.5ul A Buffer、2.0ul上游引物（10uM）、2.0ul下游引物（10uM）。
b．向检测单元管中加入2.0ul样本DNA（质粒DNA或细菌DNA）。
c．再向检测单元管中加入2.5ul的B Buffer，混合均匀，低速离心10秒钟。
d．将检测单元管置于37℃恒温培养箱或恒温水浴锅中孵育30分钟后得到扩增产物。
e. 反应结束后，取5-10ul反应体系进行电泳检测，使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提反应溶液1:1（体积比）进行纯化，12000rpm/min离心3-5分钟，取上清进行点用检测。将纯化后的产物进行测序，测序结果如下：
clfA扩增序列为：
CGTGTAAATCGATTGGCGTGGCTTCAGTGCTTGTAGGTACGTTAATCGGTTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCAAGTGAAAATAGTGTTACGCAATCTGATAGCGCAAGTAACGAAAGCAAAAGTAATGATTCAAGTAGCGTAATA
mecA扩增序列为：
TCATACTTAGTTCTTTAGCGATTGCTTTATAATCTTTTTTAGATACATTCTTTGGAACGATGCCTATCTCATATGCTGTTCCTGTATTGGCCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAAAATTTTACCACGTTCTGATTTTAAATTTTCAATATGTATGCTTTGGTCTTTCTGCATTCA
将测序得到的基因序列与Gene bank上基因序列进行BLAST比对，结果显示：clfA与Staphylococcus aureus strain pt217 chromosome, complete genome 100%相同；mecA与Staphylococcus aureus strain pt217 chromosome, complete genome 100%相同。
（2）分别检测clfA基因和mecA基因。检测体系共50ul包括：扩增产物5ul（上步扩增产物），Cas12a（1 pM）蛋白5ul，Buffer 5ul，单链DNA荧光探针（10uM）5ul，crRNA 2.5ul（上述crRNA），无酶水27.5ul。将检测体系置于96孔培养皿，将培养皿放置于酶标仪中，以激发光494nm、发射光520nm进行荧光强度检测，每隔2min检测一次，37℃下连续检测60min，得到连续的荧光值报告。
（crRNA序列：clfA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGACUACUCAGCAGUAAAGA，
mecA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUAAAAUUUUACCACGU）
检测结果：
（1）灵敏度
评价该方法灵敏度时，为了便于计算基因拷贝数选择合成质粒进行实验。将合成质粒按浓度梯度稀释，浓度依次为10-5,10-4,10-3,10-2,10-1,10-0 拷贝，按上述方法依次扩增检测，结果如下：该方法可以检测到10-3 拷贝待测基因；只有同时加入相对应的crRNA，cas12a蛋白，荧光探针，阳性基因，才可以检测到荧光值。
2）特异度
我们用实验室保存的表皮葡萄球菌同时进行检测，如图1，样本1，样本2为实验室保存金葡菌，与表皮葡萄球菌明显区分开。如图2，样本1，样本2，样本3为实验室保存耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，样本4，样本5为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌，两者可明显区分。
实施例2：
一、样品采集
实验中使用的细菌样品为临床分离的金黄色葡萄球菌。
二、实验方法
（1）DNA模板的制备
采用DNA试剂盒从细菌样品中提取全基因组DNA。从-80℃冰箱内取出细菌样品冻存管，放于4℃冰箱复温5小时，在超净台中采用无菌接种环快速蘸取菌液，以分段划线法接种于哥伦比亚血琼脂培养板上，37℃恒温箱孵育20小时，挑取血平板上单个菌落，接种于脑心浸液液体培养基中，37℃振荡培养16小时。取2ml菌液按照说明书操作。
（2）RAA恒温核酸扩增
使用RAA核酸扩增试剂对clfA基因和mecA基因分别进行核酸扩增。反应体系共50ul，包括：41.5ul A Buffer，2.5ul B Buffer，2ul 样本DNA，2ul上游引物，2ul下游引物。
a．向装有检测干粉酶制剂的检测单元管中加入41.5ul A Buffer、2.0ul上游引物（10uM）、2.0ul下游引物（10uM）。
b．向检测单元管中加入2.0ul样本DNA。
c．再向检测单元管中加入2.5ul的B Buffer，混合均匀，低速离心10秒钟。
d．将检测单元管置于37℃恒温培养箱或恒温水浴锅中孵育30分钟后得到扩增产物。
（3）CRISPR-Cas12a检测
分别检测clfA基因和mecA基因：
检测体系共50ul包括：扩增产物5ul，Cas12a（1 pM）蛋白5ul，Buffer 5ul，单链DNA荧光探针（10uM）5ul，crRNA 2.5ul，无酶水27.5ul。将检测体系置于96孔培养皿，将培养皿放置于酶标仪中，以激发光494nm、发射光520nm进行荧光强度检测，每隔2min检测一次，37℃下连续检测60min，得到连续的荧光值报告。
三、检测结果
检测结果如图3所示，clfA基因和mecA基因同时检测阳性，判定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 基于CRISPR的试剂盒及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttggacta ctcagcagta aaga 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tttcggtcta aaattttacc acgt 24
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uggacuacuc agcaguaaag a 41
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uggucuaaaa uuuuaccacg u 41

Claims (10)

1.crRNA 1,其能识别MRSA金葡菌特异性识别基因clfA的SEQ ID NO.1所示靶点。
2.crRNA 1，其序列如SEQ ID NO.3所示。
3.crRNA 2，其能识别甲氧西林耐药基因mecA的SEQ ID NO.2所示靶点。
4.crRNA 2,其序列如SEQ ID NO.4所示。
5.检测MRSA金葡菌用crRNA组合物，包含任一在先权利要求所述crRNA 1和任一在先权利要求所述crRNA 2。
6.如权利要求5所述的crRNA组合物，其特征是，所述crRNA 1如权利要求1所述，所述crRNA 2如权利要求3所述。
7.如权利要求5所述的crRNA组合物，其特征是，所述crRNA 1如SEQ ID NO.3所示，所述crRNA 2如SEQ ID NO.4所示。
8.基于CRISPR的试剂盒，其包含任一在先权利要求所述crRNA组合物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包含有cas12a蛋白。
10.检测MRSA金葡菌的方法，包括使用任一在先权利要求所述试剂盒。
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