CN110734988A

CN110734988A - 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）核酸恒温扩增方法

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Publication number: CN110734988A
Application number: CN201810803884.2A
Authority: CN
Inventors: 商学军; 居金良; 于明辉; 崔振玲
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2038-07-20
Also published as: CN110734988B

Abstract

本发明公开了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin‑resistant Staphylococcus aureus，MRSA)核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增耐甲氧西林金黄色球菌(MRSA)的两个特异性引物对，所述引物可以从极低MRSA拷贝数的检测样品中扩增出对应于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的两个特征性序列(SA 23s rRNA和mecA RNA)的扩增产物。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有MRSA(SA 23s rRNA和mecA RNA)的待测样品进行扩增，具有检测效率高，准确度高的特点，具有广阔的应用前景。

Description

一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸恒温扩增方法

技术领域

本发明涉及细菌的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillinresistant staphylococcus aureus，MRSA)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。

1961年Jevons在英国首次发现MRSA，60年代中期扩展到欧洲许多国家及加拿大，70年代末急剧增多遍及世界，并引起爆发流行，导致死亡率上升，医疗费用增加，成为全球性问题。20世纪90年代，世界各地有关MRSA流行的研究报道明显增加。在国外一些大型教学医院，MRSA占临床分离金葡菌的60％～80％。我国1998～1999年院内感染MRSA占金葡菌的比例超过80％，而社区感染MRSA占金葡菌的比例接近22％。各地区和医院的检出率都明显有逐年增加的趋势。几乎所有MRSA都是多重耐药，对现有的β-内酰胺类抗生素如青霉素类和头孢菌素类均不敏感，对氯霉素、氯林可霉素、氨基糖甙类、四环素和大环内酯类抗生素及喹喏酮类亦不敏感，万古霉素等糖肽类抗生素成为治疗MRSA感染的最后一道防线。

目前临床应用的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测方法有：纸片扩散法(K-B法)、肉汤(琼脂)稀释(MIC)法、浓度梯度(E-test)法、自动化药敏检测、Real-Time PCR法等检测方法。

纸片扩散法(K-B法)是在MH琼脂加入苯唑西林，将菌液调至0.5麦氏浊度，涂沫于上述平板，35℃孵育24h，耐药抑菌图≤11mm，敏感抑菌图≥17mm。K-B法的最大优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受，但易造成漏检的情况。受培养环境中各因素影响，一些菌株的耐药性得不到完全表达有关。

肉汤(琼脂)稀释(MIC)法是用MH肉汤(或琼脂)培养液加NaCl至20g/L浓度，同时加入一定量的Ca、Mg离子，将苯唑西林进行倍比稀释约为0.125～16μg/ml，菌浓度为10⁴个/mL，35℃孵育24h，MIC＜2μg/mL即为敏感，＞4μg/mL即为耐药，该法检出率可达95％，重复性好，但操作较说明书繁琐。

浓度梯度(E-test)法是在含20g/L NaCl的MH琼脂平板上，贴上苯唑西林的试条，菌液调至0.5～1麦氏浊度，35℃孵育24h，直接读取MIC值。MIC值＞4μg/mL为耐药，在MIC＜2μg/mL为敏感。E-test法在检测低水平或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确。具有精确、可靠、稳定性好的特点，但价格昂贵。

自动化药敏检测是将菌液稀释后注入药敏板或孔内，然后通过检测菌液浊度、荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果。其优点是较快速，但有时对生长缓慢或延迟表达耐药性的MRSA，在3～4h内难以达到准确的检测水平，容易漏检或误报MRSA。目前市场上有Vitek系统、ATB系统、MicroScan系统、Sensiter ARIS等自动化药敏检测产品。

核酸检测主要是Real-Time PCR法，需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的检测试剂盒非常必要。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒、细菌的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒、细菌的特性进行专门设计。目前尚无针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的MRSA检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对MRSA的SA23s rRNA和mecA RNA的特异性引物对，所述引物对包括：

(i)SA 23s rRNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

(ii)SA 23s rRNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:5所示；

(iii)mecA RNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:6所示；和

(iv)mecA RNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:7所示。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述反应体系还包括：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23srRNA和mecA RNA的捕获探针。

在另一优选例中，所述反应体系还包括：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23srRNA的特异性检测探针和mecA RNA的特异性检测探针。

在另一优选例中，所述MRSA SA 23s rRNA和mecA RNA的捕获探针可分别与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的靶标核酸SA 23s rRNA和mecA RNA序列特异结合。

在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的检测探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。

在另一优选例中，所述的检测探针的5'端标记FAM荧光基团，且检测探针的3'端标记DABCYL淬灭基团。

在另一优选例中，所述MRSA SA 23s rRNA检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述mecA RNA的检测探针的序列如SEQ ID NO.:9所示。

在另一优选例中，所述的MRSA SA 23s rRNA的检测探针和mecA RNA的检测探针用于与在T7RNA聚合酶作用下分别与根据所述MRSA靶标核酸SA 23s rRNA和mecA RNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。

在另一优选例中，所述方法还包括：在另一阳性(对照)反应体系或阴性(对照)反应体系中进行扩增反应。

在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、SA 23s rRNA内标和mecA RNA IC RNA内标、所述捕获探针和所述检测探针。

在另一优选例中，所述的反应体系中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的SA数量小于500个拷贝/ml，较佳地为1-100个拷贝/ml，更佳地为1-50个拷贝/ml，最佳地1-20个拷贝/ml；mecA拷贝数小于1000个/ml，较佳地为1-500个拷贝/ml，更佳地为1-100个拷贝/ml，最佳地1-20个拷贝/ml。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在扩增反应过程之中或之后，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23s rRNA和mecA RNA的特异性检测探针发出的荧光信号。

在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。

在另一优选例中，所述反应体系中还含有待测的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或衍生自所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SA 23s rRNA或mecA RNA的核酸。

在另一优选例中，所述的待测核酸是来自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌培养物的核酸。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断非治疗性的。

在本发明的第二方面，提供了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的非诊断性检测方法，所述检测方法包括：

(a)提供一反应体系，所述反应体系含有待测样品，并且所述反应体系还含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23s rRNA的特异性检测探针和mecA RNA的特异性检测探针；

(b)用如本发明第一方面中所述的扩增方法对所述反应体系进行扩增；和

(c)在扩增反应过程之中或之后，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23srRNA的特异性检测探针和mecA RNA的特异性检测探针发出的荧光信号。

在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。

在另一优选例中，所述对照组包括：MRSA阳性对照组、MRSA阴性对照组、MRSA内标对照组。

在本发明的第三方面，提供了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的SA 23s rRNA的特异性引物对，所述引物对包括：

(i)SA 23s rRNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

(ii)SA 23s rRNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:5所示；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的用于扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的mecA RNA的特异性引物对，所述引物对包括：

(iii)mecA RNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:6所示；和

(iv)mecA RNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:7所示；

以及(c)使用说明书。

在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。

在另一优选例中，还含有选自下组的一种或多种组分：

(d)捕获探针；

(e)检测探针；

(f)MRSA内标序列；和/或

(g)内标检测探针。

在另一优选例中，包括选自下组的一个或多个特征：

所述MRSA SA 23s rRNA检测探针包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，且mecARNA检测探针包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；和/或

所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和/或

所述MRSA SA 23s rRNA内标序列包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，而所述MRSA SA 23s rRNA的内标检测探针包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；和/或

所述mecA RNA内标序列包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，而mecA RNA的内标检测探针包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。

在另一优选例中，所述的酶是M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述SA 23s rRNA的T7引物、nT7引物和检测探针存在于检测液1中；mecA RNA的T7引物、nT7引物和检测探针存在于检测液2中。

在另一优选例中，所述的SA 23s rRNA内标检测探针存在于检测液1中；所述的mecA RNA内标检测探针存在于检测液2中。

在另一优选例中，所述MRSA内标为竞争性内标，并与MRSA靶标核苷酸(SA 23srRNA)使用同一对引物(SA 23s rRNA的T7和nT7)；与MRSA靶标核苷酸(mecA RNA)使用同一对引物mecA RNA的T7和nT7)。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括MRSA阳性对照和/或MRSA阴性对照。

在另一优选例中，所述试剂盒包括以下的一个或多个特征：

所述捕获探针是与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的靶标核酸SA 23s rRNA和mecARNA序列特异结合的捕获探针；和/或

所述检测探针是与根据所述MRSA靶标核酸SA 23s rRNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的SA检测探针；与根据所述MRSA靶标核酸mecA RNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的mecA检测探针。

在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的靶标核酸SA 23s rRNA和mecA RNA序列特异结合。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：样本保存液、核酸提取液、洗涤液、扩增检测液1、扩展检测液2、酶液、阳性对照、阴性对照和内标；

其中，

所述样本保存液包括硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

所述扩增检测液1包括dNTP和NTP、SA 23s rRNA的T7引物、nT7引物、检测探针和内标检测探针；

所述扩增检测液2包括dNTP和NTP、mecA RNA的T7引物、nT7引物、检测探针和内标检测探针；

所述酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述阳性对照包括含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌10⁴-10⁶拷贝/mL SA 23s rRNA和10⁴-10⁶拷贝/mL耐药mecA基因的体外转录RNA稀释物的混合物；

所述的阴性对照是不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SA23s rRNA和mecA RNA序列或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；

所述的内标是含10⁸拷贝/mL SA 23s rRNA IC RNA(SEQ ID No.:12)稀释物和10⁵拷贝/mL mecA IC RNA(SEQ ID No.:13)稀释物的混合物。

在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

A盒为标本处理单元，包括所述样本保存液、所述核酸提取液和所述洗涤液；

B盒为核酸扩增检测单元，包括所述扩增检测液1、扩增检测液2、酶液、阳性对照、阴性对照及内标。

在本发明的第四方面，提供了一种扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 23srRNA和mecA RNA的特异性引物对，所述引物对包括：

(i)SA 23s rRNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

(ii)SA 23s rRNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:5所示；

(iii)mecA RNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:6所示；和

(iv)mecA RNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的试剂盒或本发明第四方面所述的引物对的用途，用于制备检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的检测试剂盒或检测试剂。

在另一优选例中，所述检测试剂盒或检测试剂用于检测在人鼻、咽拭子和创面分泌物中是否存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了SA比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

其中，曲线1、2、3、4和5的模板浓度分别为5×10⁵拷贝/ml、5×10⁴拷贝/ml、5000拷贝/ml、500拷贝/ml、50拷贝/ml。

图2显示了SA本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图3显示了mecA比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

其中，曲线1、2、3、4和5的模板浓度分别为1×10⁶拷贝/ml、1×10⁵拷贝/ml、1×10⁴拷贝/ml、1000拷贝/ml、100拷贝/ml。

图4显示了mecA本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图5为培养菌样本SAT检测的SA靶标荧光检测结果。

图6为培养菌样本SAT检测的SA内标荧光检测结果。

图7为培养菌样本SAT检测的mecA靶标荧光检测结果。

图8为培养菌样本SAT检测的mecA内标荧光检测结果。

图9为采用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)对照检测培养菌样本的SA结果。

图10为采用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)对照检测培养菌样本的mecA结果。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，经过对靶序列、引物和探针的大量筛选和验证，首次开发了高特异性、高灵敏的专用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的引物对以及配套使用的特异性检测探针。具体地，使用该特定的引物序列对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的两个特异性核酸靶标(SA 23s rRNA和mecA RNA)进行扩增时，具有高特异性、高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)并区分其他金黄色葡萄球菌。在此基础上完成了本发明。

引物和探针

如本文所用，术语“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的两对特异性引物(SA 23srRNA和mecA RNA)”指这样的两组引物(对)，它们扩增出的扩增产物具有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的SA的23s rRNA链和mecA基因的mRNA链。

在引物设计上，为了能够更好地满足目前对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测的需要，本发明人分别选择了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌23s rRNA和耐药基因mecA中高度保守且特异性强的区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示)。优选的引物序列包括如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的SA 23s rRNA引物对及SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成的mecA RNA引物对。

在本发明的扩增方法中，除引物外，反应体系中还可以包括一个或多个探针，如检测探针，捕获探针等。

如本文所用，术语“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的捕获探针”指可与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的靶标核酸(SA 23s rRNA和mecA基因mRNA)序列特异结合的核苷酸序列。本发明的一种优选的捕获探针具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕获探针特异结合于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的靶标核酸SA 23s rRNA和mecA基因mRNA序列。在另一优选例中，当所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)含有MRSA内标(SA和mecA基因IC RNA)时，所述捕获探针还可以与所述MRSA内标序列(SA和mecA基因IC RNA)特异结合，用于设计阴性对照组。

MRSA检测探针均为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。本发明的两种优选分别针对SA23s rRNA和mecA基因mRNA的检测探针具有分别如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

本发明的引物序列和探针序列根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的专用引物和探针序列。

对于本发明而言，优选的引物对和探针如下：

对照物

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。

本发明中可以设置的参照物包括：MRSA阳性对照、MRSA阴性对照和MRSA内标中的一个或多个对照物。

MRSA阳性对照可以是为体外转录的RNA，不具有生物学活性。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。

此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，SA 23s rRNA和mecA基因均为稀释阳性对照100倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。

MRSA内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。MRSA内标分别作为MRSA(SA23s rRNA和mecA基因)RNA的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。

阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

在另一优选例中，所述体外转录的MRSA(SA23srRNA和mecA RNA)通过以下述方法制备：

(1)用化学合成法分别合成MRSA的SA 23s rRNA和耐药mecA的基因片段(SA 23srRNA和耐药mecA阳性片段，其核苷酸序列如序列表中序列10、11所示)；

(2)将SA 23s rRNA和耐药mecA基因片段分别插入到-T载体中，构建SA 23srRNA和耐药mecA的阳性对照质粒；

(3)SA 23s rRNA和耐药mecA的阳性对照质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-SA23s rRNA和

-T-mecA菌株，贮存于-70℃；

(4)分别从-T-SA23s rRNA和

-T-mecA菌株中提取

-T-SA23srRNA和

-T-mecA质粒，将质粒分别进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

在另一优选例中，所述MRSA内标中的体外转录的MRSA(SA 23s rRNA和耐药mecA的基因)IC RNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法分别合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同MRSA的SA 23s rRNA和耐药mecA靶标序列区域(MRSA的SA 23s rRNA和耐药mecA内标片段，其核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID No.:12、13所示)；

(2)将SA 23s rRNA和耐药mecA基因片段克隆到-T载体中，构建MRSA的SA23s rRNA和耐药mecA的内标质粒；

(3)MRSA的SA 23s rRNA和耐药mecA内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-SA23s rRNA IC和

-T-mecA IC菌株，贮存于-70℃；

(4)分别从

-T-SA23s rRNA IC和

-T-mecA IC菌株中提取

-T-SA23s rRNA IC和

-T-mecA IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

检测方法

本发明还提供了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测方法，包括用本发明所述的特异性引物对待测样品进行SA 23s rRNA和耐药mecA的扩增；和在扩增反应过程中或之后，分别检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的SA 23s rRNA和耐药mecA扩增产物，例如通过检测特异性探针发出的荧光信号。

所述方法还可以任选地包括设置两个或多个对照组，如MRSA阳性对照组、MRSA阴性对照组、MRSA内标组等。

在本发明中，检测方法可以用常规的PCR方法，也可用实时荧光检测法等不同的方法。一种特别优选的方法是实时荧光核酸恒温扩增法。

实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)

核酸恒温扩增实时荧光检测技术，其原理是将RNA恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。首先通过M-MLV反转录酶、T7RNA多聚酶和优化探针(optimalprobe,patent pending)技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照、阴性对照和内标信号对检验结果进行判定。

在本发明中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通用型检测技术通过使用针对两组靶标的高特异性和高灵敏度的专用引物对，并配合使用专用的捕获探针，可高效、特异性捕获MRSA的SA 23s rRNA和耐药mecA RNA。核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。

试剂盒

本发明提供了一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测试剂盒，包括：

(a)扩增SA 23s rRNA和耐药mecA的特异性引物对，所述引物扩增出的扩增产物具有MRSA SA 23s rRNA和耐药mecA mRNA序列；

(b)捕获探针；

(c)检测探针。

所述的引物对是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生MRSA SA 23s rRNA和耐药mecA靶标核酸(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)的DNA拷贝的SA 23s rRNA和耐药mecA扩增引物，在本发明的一个优选例中，所述的MRSA扩增引物包括：SA 23s rRNA T7引物：SEQ IDNO:4；和nT7引物：SEQ ID NO:5；耐药mecA T7引物：SEQ ID NO:6；和nT7引物：SEQ ID NO:7。

所述的捕获探针是与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)的靶标核酸(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)序列特异结合的捕获探针；所述的检测探针是分别与根据所述MRSA SA 23s rRNA和耐药mecA靶标核酸(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MRSA SA 23s rRNA和耐药mecA RNA检测探针。在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的检测探针还可与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的靶标核酸(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)序列特异结合。

所述的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)还可以被设计为含有MRSA内标(SA 23srRNA IC和耐药mecA IC RNA)，当耐甲氧西林金黄色葡萄球菌含有MRSA(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)内标时，所述捕获探针和检测探针被设计分别为还可以与所述MRSA(SA 23srRNA和耐药mecA RNA)内标序列特异结合，分别形成MRSA(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)内标对照组。在另一优选例中，所述MRSA(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)内标均为竞争性内标，并分别与MRSA(SA 23s rRNA和耐药mecA RNA)靶标核苷酸(SA 23s rRNA和耐药mecARNA)使用同一对引物(T7和nT7)。

所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述SA T7引物、nT7引物和检测探针存在于同一检测液中，而mecA T7引物、nT7引物和检测探针另外单独存在于同一检测液中。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：样本保存液、核酸提取液、洗涤液、SA23s rRNA扩增检测液、mecA扩增检测液、酶液、MRSA阳性对照、MRSA阴性对照和MRSA内标；其中，所述裂解液包括硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

所述SA 23s rRNA扩增检测液包括dNTP和NTP；SA T7引物、nT7引物、SA检测探针和内标检测探针；

所述mecA扩增检测液包括dNTP和NTP；mecA T7引物、nT7引物、mecA检测探针和内标检测探针；

所述酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述MRSA阳性对照包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SA 23s rRNA和耐药mecA基因的体外转录RNA稀释物；

所述的MRSA阴性对照是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌靶标核酸(SA 23s rRNA和耐药mecARNA)序列或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；

MRSA内标：含MRSA内标RNA(SA 23s rRNA IC RNA和耐药mecA RNA，序列分别如SEQID NO:12、SEQ ID NO:13所示)稀释物。

在另一优选例中，所述试剂盒的一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)样本保存液：HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄ 5-50mM；

(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50μΜ(优选为5-25μΜ)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)SA 23s rRNA扩增检测液：将Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40Mm配制反应液；将SA 23s rRNA扩增引物和SA 23s rRNA检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，SA 23s rRNA检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应配制检测液；将两者按照16:1进行混合。

(5)mecA扩增检测液：将Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40Mm配制反应液；将mecA扩增引物和mecA检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为5pmol/反应，nT7引物浓度优选为2.5pmol/反应，mecA检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应配制检测液；将两者按照16:1进行混合。

(6)酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；

(7)MRSA阳性对照；含10⁴-10⁶拷贝/mL SA 23s rRNA和10⁴-10⁶拷贝/mL耐药mecA基因的体外转录RNA稀释物的混合物；

(8)MRSA阴性对照：不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的靶标核酸(SA 23s rRNA和mecA RNA)序列或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的溶液；

(9)MRSA内标：含10⁸拷贝/mL SA 23s rRNA IC RNA(序列如序列表中序列12所示)稀释物和10⁵拷贝/mL mecA IC RNA(序列如序列表中序列13所示)稀释物的混合物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一个或多个容器，且上述的各个组分可分别位于一个或多个容器中，在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

A盒为标本处理单元，包括所述样本保存、所述核酸提取液和所述洗涤液；

B盒为核酸扩增检测单元，包括所述SA 23s rRNA扩增检测液和mecA扩增检测液、酶液、MRSA阳性对照、MRSA阴性对照及MRSA内标。

在另一优选例中，所述的检测探针包括如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，和/或所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

利用以上试剂盒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：

1)用样本保存液裂解待测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，得到含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸的裂解液；

2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和和MRSA IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸(SA 23s rRNA和mecA RNA)和MRSA IC RNA(SA 23s rRNA ICRNA和mecA IC RNA)；

3)将步骤2)提取的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸(SA 23s rRNA和mecA RNA)和MRSA IC RNA(SA 23s rRNA IC RNA和mecA IC RNA)加入由SA 23s rRNA扩增检测液和mecA扩增检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物酶液，由此开始在42℃下继续温育60分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；

4)根据荧光信号产生的时间和强度参照MRSA阳性对照、MRSA阴性对照和MRSA内标检测结果分别对SA 23s rRNA和mecA待测样品进行综合定性检测。

在上述检测操作中，所述步骤1)中的待测样品为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌培养物。

与现有的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测相比，本发明具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对MRSA靶核酸(SA 23s rRNA和mecA)设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获MRSA(SA 23s rRNA和mecA)的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要40分钟。

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

综上所述，本发明试剂盒能够检测鼻、咽拭子、创面分泌物或无菌体液中如脑脊液中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达50拷贝/mL和100拷贝/mL)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(40分钟完成扩增检测)的特点，将在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用主要原料酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1用于实时荧光核酸恒温扩增检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的专用引物和探针的设计

本发明选择MRSA(SA 23s rRNA和mecA)基因中高度保守且特异性强的区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA的SA 23s rRNA和mecA)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一条可与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的靶标核酸(SA 23s rRNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为:5'TGCACACCGGATGGCCAATCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3'(SEQ ID No.:3)；一条可与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的靶标核酸(mecA RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针相同的，其核苷酸序列为:5'TGCACACCGGATGGCCAATCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3'(SEQ ID No.:3)；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下分别产生MRSA靶标核酸SA 23s rRNA的DNA拷贝的SA扩增引物以及一对靶标核酸mecA的DNA拷贝的mecA扩增引物，所述SA23s rRNA和mecA扩增引物分别由单独的T7引物和nT7引物组成，SA T7引物序列为5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACATATTTC

TCTACACCTTT 3'(SEQ ID No.:4)，nT7引物序列为5'AGCGATTGATGGTGATACGGTT 3'(SEQ ID No.:5)；

mecA T7引物序列为5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTCTTTAGCGATTGCTTTATAATC 3'(SEQ ID No.:6)，nT7引物序列为5'AATCAGAACGTGGTAAAA 3'(SEQ ID No.:7)；

(3)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述MRSA靶标核酸SA 23s rRNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的SA检测探针，所述SA检测探针的核苷酸序列为5'CCGUCAUUCAGACUAUUAUUGGACGG 3'(SEQ ID No.:8)，5'端用FAM荧光标记，3'端用DABCYL荧光标记；一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述MRSA靶标核酸mecA RNA的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的mecA检测探针，所述mecA检测探针的核苷酸序列为5'CACAUCAGGAACAGCAUAUGAGAUGUG 3'(SEQ ID No.:9)，5'端用FAM荧光标记，3'端用DABCYL荧光标记。

(4)其他对比序列

在引物、探针设计过程中，产生了诸多对引物和探针序列，比如数十对引物以及相应的检测探针，例如对于靶标SA，包括以下引物对和检测探针：

T7引物S1a：5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACCGTATCACCATCAATCGCTT 3'(如SEQID NO:18所示)，

nT7引物S1b：5'CAAATGCATCACAAACAGA 3'(如SEQ ID NO:19所示)，

检测探针S1c为5'CGCUCUGAAGAUCCAACAGUGAGCG 3'(如SEQ ID NO:20所示)，

其中检测探针的5'端用FAM荧光标记，3'端用DABCYL荧光标记。

对于靶标MecA，包括以下引物对和检测探针：

T7引物M1a：5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCTTTGGTCTTTCTG 3'(如SEQ IDNO:21所示)，

nT7引物M1b：5'CTACGGTAACATTGATCGCA 3'(如SEQ ID NO:22所示)，

检测探针M1c5'CGCCGGUGGAAGUUAGAUUGGGCGGCG 3'(如SEQ ID NO:23所示)，

其中检测探针的5'端用FAM荧光标记，3'端用DABCYL荧光标记。

(5)扩增筛选

对于设计的各组序列，采用相同的反应体系进行扩增，比对灵敏度检测并选取较优者。通过筛选、比对各设计引物对、探针序列，挑选出检测灵敏度高的最佳引物、探针序列。

部分结果如图1-4所示。

SA的结果如图1、图2所示，(图1为比对组，图2为本发明组)；mecA的结果如图3、图4所示(图3为比对组，图4为本发明组)。

SA比对组(采用S1a、S1b引物对和S1c检测探针)的灵敏度可检测出500拷贝/mL，而本发明组的灵敏度最优，可达50拷贝/mL。本发明组的灵敏度至少提高了一个数量级。

mecA比对组(采用M1a、M1b引物对和M1c检测探针)的灵敏度可检测出1000拷贝/mL，而本发明组的灵敏度最优，可达100拷贝/mL。而本发明组的灵敏度至少提高了一个数量级，可达100拷贝/mL或更低。

此外，从曲线形状可明显看出，两组发明组均优于比对组。

因此确定优选的引物对如下：对于SA，引物对为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO:5；探针序列为SEQ ID NO:8；

对于mecA，引物对为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO:7；探针序列为SEQ ID NO:9。

(6)内标和内标检测探针的筛选

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的MRSA内标(SEQ ID No.:12；SEQ IDNo.:13)，分别优化了内标检测探针，MRSA(SA 23s rRNA和mecA)内标与MRSA靶标核苷酸((SA 23s rRNA和mecA)RNA)分别拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述MRSA内标均可通过MRSA(SA 23srRNA和mecA)靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与MRSA(SA 23s rRNA和mecA)检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为SA:5'CCGACAGUGAUACGAGAGTCGG 3'(SEQ ID No.:14)，mecA:5'CCGACCCAGGUAUCAGUGTCGG3'(SEQ ID No.:15)，5'端标记HEX荧光基团，3'端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2制备耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，TargetCapture Oligo)、T7引物、nT7引物、MRSA(SA 23srRNA)检测探针、SA内标检测探针、MRSA(mecA)检测探针、mecA内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等组分。

所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和MRSA检测探针、内标检测探针分别存在于MRSA(SA 23srRNA)检测液和MRSA(mecA)检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15--35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括样本保存液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括扩增检测液1、扩增检测液1、酶液、MRSA阳性对照、MRSA阴性对照和MRSA内标，主要成分如下：

A盒(标本处理单元)组成为：

样本保存液；含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

洗涤液：主要含1％(V/V)SDS。

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

扩增检测液1：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；SA各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，SA检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

扩增检测液2：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；mecA各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为2.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为5pmol/反应，mecA检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

MRSA阳性对照；含10⁴-10⁶拷贝/mL SA 23s rRNA和10⁴-10⁶拷贝/mL耐药mecA基因的体外转录RNA稀释物的混合物；

MRSA阴性对照：不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的靶标核酸(SA 23s rRNA和mecA RNA)序列或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的溶液；

MRSA内标：含10⁸拷贝/mL SA 23s rRNA IC RNA(SEQ ID No.:12)稀释物和10⁵拷贝/mL mecA IC RNA(SEQ ID No.:13)稀释物的混合物。

试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。

具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：

(1)样本保存液：HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄ 5-50mM；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)扩增检测液1：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；SA各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，SA检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(5)扩增检测液2：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；mecA各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为2.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为5pmol/反应，mecA检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

(9)MRSA内标：含10⁸拷贝/mL SA 23s rRNA IC RNA(SEQ ID No.:12)稀释物和10⁵拷贝/mL mecA IC RNA(SEQ ID No.:13)稀释物的混合物。

MRSA阳性对照中的体外转录的MRSA(SA23srRNA和mecA RNA)，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法分别合成MRSA的SA 23s rRNA和耐药mecA的基因片段(SA 23srRNA和耐药mecA阳性片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.:10、SEQ ID No.:11所示)；

(2)将SA 23s rRNA和耐药mecA基因片段分别插入到

-T载体中，构建SA 23srRNA和耐药mecA的阳性对照质粒；

(3)SA 23s rRNA和耐药mecA的阳性对照质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-SA23s rRNA和

-T-mecA菌株，贮存于-70℃；

(4)分别从

-T-SA23s rRNA和

-T-mecA菌株中提取

-T-SA23srRNA和

实施例3耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实时荧光核酸恒温扩增检测方法

1、样本采集、运输及保存

样本采集

1.1鼻、口咽拭子标本采集：用医用棉拭子取鼻、口咽部分泌物，将拭子头置于2mL生理盐水浸泡贴管壁挤干，向其中加入2mL样本保存液中备用，该样本为待测样本。

1.2创面分泌物样本采集：用医用棉拭子取创面分泌物，将拭子头置于2mL生理盐水浸泡贴管壁挤干，向其中加入2mL样本保存液中备用，该样本为待测样本。

标本运输和保存

所采集的标本可立即用于测试或长期保存于-70℃，-20℃保存期为6个月，标本应避免反复冻融。标本运送采用0℃冰壶。

2、核酸提取

2.1在样品处理管(1.5mL离心管)中加入400μl样本保存液(HEPES 50mM，(NH₄)₂SO₄35mM)和400μl待测样本(不足以生理盐水补足)，用样本保存裂解待测样品中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，得到含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌核酸的裂解液。

2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入200μl核酸提取液(HEPES 200mM，EDTA100mM，LiCl 800mM，捕获探针15μΜ，磁珠150mg/L)和20μl内标溶液(含10⁸拷贝/mL SA 23srRNA IC RNA和10⁵拷贝/mL mecA IC RNA RNA)，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟，将准备好的液体平均分成两等分备用。

2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES 25mM，NaCl150mM，1％SDS，EDTA 2.5mM；)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。

2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

在上述检测操作中，所述步骤2.1中的待测样品为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌培养物。

3、SAT核酸扩增检测

3.1向样品处理管中分别加入40μl扩增检测液(40μl反应液+2.5μl检测液)洗涤磁珠。反应液具体包含Tris 15mM，MgCl₂ 15mM，dNTP 2.5mM，NTP 3mM，PVP40 1％，KCl 10mM；SA检测液中T7引物浓度为7.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，SA检测探针浓度为5pmol/反应，SA内标检测探针浓度为5pmol/反应；mecA检测液中T7引物浓度为2.5pmol/反应，nT7引物浓度为5pmol/反应，mecA检测探针浓度为5pmol/反应，mecA内标检测探针浓度为5pmol/反应。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7RNA聚合酶1000U/反应、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mMKCl、0.25mM EDTA、0.5％(v/v)Triton X-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇)。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品)，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(HEX和VIC波长相近，内标信号检测，F2)。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

①结果判定：

SA：F1通道：dt≤35的样本为SA阳性；35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果F1通道：dt＜40的样本为SA阳性。

mecA：F1通道：dt≤35的样本为mecA阳性；35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果F1通道：dt＜40的样本为mecA阳性。

②结果判定：F1通道dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35，则为阴性。

③结果判定：

表1

SA检测结果	mecA检测结果	MRSA结果判断
			+	+	+
—	+	—
			+	—	—
—	—	—

质量控制：所设置阳性对照、临界弱阳性对照和阴性对照的dt值应同时满足以下条件，否则，实验视为无效，需重新进行。

(1)SA阳性对照、SA临界弱阳性对照：F1通道：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35。

(2)SA阴性对照：F1通道：dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35。

(3)mecA阳性对照、mecA临界弱阳性对照：F1通道：阳性对照dt≤临界弱阳性对照dt≤35。

(4)mecA阴性对照：F1通道：dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35。

本试剂盒针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌设计，采用实时荧光恒温扩增检测RNA，比常规PCR操作更简便，灵敏度、特异性更高，仅需40分钟即可完成扩增检测；因扩增产物为RNA而非DNA，在环境中易降解，低污染。试剂盒内添加竞争性内标可进一步减少因体系抑制引起的假阴性结果，确保检测结果更准确。

5、结果

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌样本编号为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌培养物或其他细菌培养物标本1-7，另设阴性对照(不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌靶标核酸(SA23srRNA和mecA RNA)序列或不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的溶液)、阳性对照(含10⁴-10⁶拷贝/mL SA 23s rRNA和10⁴-10⁶拷贝/mL mecA基因的体外转录RNA稀释物的混合物)各一个。结果SA如图5(F1荧光通道)和图6(F2荧光通道)所示；mecA如图7(F1荧光通道)和图8(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，结合结果判定标准，判定样本1、3、4、6、7为阳性，样本2、5为阴性。结果表明本发明试剂盒用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌准确性高，但上机扩增检测时间仅需40分钟具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通用型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海仁度生物科技有限公司

<120> 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）核酸恒温扩增方法

<130> P2018-0782

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

agcgattgat ggtgatacgg ttaaattaat gtacaaaggt caaccaatga cattcagact 60

attattggtt gatacacctg aaacaaagca tcctaaaaaa ggtgtagaga aatatg 116

<210> 2

<211> 125

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

aatcagaacg tggtaaaatt ttagaccgaa acaatgtgga attggccaat acaggaacag 60

catatgagat aggcatcgtt ccaaagaatg tatctaaaaa agattataaa gcaatcgcta 120

aagaa 125

<210> 3

<211> 54

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

tgcacaccgg atggccaatc caataaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 54

<210> 4

<211> 46

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

aatttaatac gactcactat agggagacat atttctctac accttt 46

<210> 5

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

agcgattgat ggtgatacgg tt 22

<210> 6

<211> 51

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

aatttaatac gactcactat agggagattc tttagcgatt gctttataat c 51

<210> 7

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

aatcagaacg tggtaaaa 18

<210> 8

<211> 26

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

ccgucauuca gacuauuauu ggacgg 26

<210> 9

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

cacaucagga acagcauaug agaugug 27

<210> 10

<211> 434

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

cgtaaataga agtggttctg aagatccaac agtatatagt gcaacttcaa ctaaaaaatt 60

acataaagaa cctgcgacat taattaaagc gattgatggt gatacggtta aattaatgta 120

caaaggtcaa ccaatgacat tcagactatt attggttgat acacctgaaa caaagcatcc 180

taaaaaaggt gtagagaaat atggtcctga agcaagtgca tttacgaaaa aaatggtaga 240

aaatgcaaag aaaattgaag tcgagtttga caaaggtcaa agaactgata aatatggacg 300

tggcttagcg tatatttatg ctgatggaaa aatggtaaac gaagctttag ttcgtcaagg 360

cttggctaaa gttgcttatg tttataaacc taacaataca catgaacaac ttttaagaaa 420

aagtgaagca caag 434

<210> 11

<211> 424

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

aggcgttaaa gatataaaca ttcaggatcg taaaataaaa aaagtatcta aaaataaaaa 60

acgagtagat gctcaatata aaattaaaac aaactacggt aacattgatc gcaacgttca 120

atttaatttt gttaaagaag atggtatgtg gaagttagat tgggatcata gcgtcattat 180

tccaggaatg cagaaagacc aaagcataca tattgaaaat ttaaaatcag aacgtggtaa 240

aattttagac cgaaacaatg tggaattggc caatacagga acagcatatg agataggcat 300

cgttccaaag aatgtatcta aaaaagatta taaagcaatc gctaaagaac taagtatttc 360

tgaagactat atcaaacaac aaatggatca aaattgggta caagatgata ccttcgttcc 420

actt 424

<210> 12

<211> 430

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

cgtaaataga agtggttctg aagatccaac agtatatagt gcaacttcaa ctaaaaaatt 60

acataaagaa cctgcgacat taattaaagc gattgatggt gatacggtta aattaatgta 120

caaaggtcaa ccaatgacag ugauacgaga gttgatacac ctgaaacaaa gcatcctaaa 180

aaaggtgtag agaaatatgg tcctgaagca agtgcattta cgaaaaaaat ggtagaaaat 240

gcaaagaaaa ttgaagtcga gtttgacaaa ggtcaaagaa ctgataaata tggacgtggc 300

ttagcgtata tttatgctga tggaaaaatg gtaaacgaag ctttagttcg tcaaggcttg 360

gctaaagttg cttatgttta taaacctaac aatacacatg aacaactttt aagaaaaagt 420

gaagcacaag 430

<210> 13

<211> 419

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

aggcgttaaa gatataaaca ttcaggatcg taaaataaaa aaagtatcta aaaataaaaa 60

acgagtagat gctcaatata aaattaaaac aaactacggt aacattgatc gcaacgttca 120

atttaatttt gttaaagaag atggtatgtg gaagttagat tgggatcata gcgtcattat 180

tccaggaatg cagaaagacc aaagcataca tattgaaaat ttaaaatcag aacgtggtaa 240

aattttagac cgaaacaatg tggaattggc caataccagg uaucaguata ggcatcgttc 300

caaagaatgt atctaaaaaa gattataaag caatcgctaa agaactaagt atttctgaag 360

actatatcaa acaacaaatg gatcaaaatt gggtacaaga tgataccttc gttccactt 419

<210> 14

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

ccgacaguga uacgagagtc gg 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

ccgacccagg uaucagugtc gg 22

<210> 16

<211> 112

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

agcgattgat ggtgatacgg ttaaattaat gtacaaaggt caaccaatga cagugauacg 60

agagttgata cacctgaaac aaagcatcct aaaaaaggtg tagagaaata tg 112

<210> 17

<211> 120

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

aatcagaacg tggtaaaatt ttagaccgaa acaatgtgga attggccaat accagguauc 60

aguataggca tcgttccaaa gaatgtatct aaaaaagatt ataaagcaat cgctaaagaa 120

<210> 18

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

aatttaatac gactcactat agggagaccg tatcaccatc aatcgctt 48

<210> 19

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 19

caaatgcatc acaaacaga 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 20

cgcucugaag auccaacagu gagcg 25

<210> 21

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 21

aatttaatac gactcactat agggagaatg ctttggtctt tctg 44

<210> 22

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 22

ctacggtaac attgatcgca 20

<210> 23

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 23

cgccggugga aguuagauug ggcggcg 27

Claims

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有针对MRSA的SA 23s rRNA和mecA RNA的特异性引物对，所述引物对包括：

(i)SA 23s rRNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

(ii)SA 23s rRNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:5所示；

(iii)mecA RNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:6所示；和

(iv)mecA RNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:7所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23s rRNA和mecA RNA的捕获探针。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23s rRNA的特异性检测探针和mecA RNA的特异性检测探针。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：在扩增反应过程之中或之后，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23s rRNA和mecA RNA的特异性检测探针发出的荧光信号。

5.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

(b)用如权利要求1中所述的扩增方法对所述反应体系进行扩增；和

(c)在扩增反应过程之中或之后，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA SA 23s rRNA的特异性检测探针和mecA RNA的特异性检测探针发出的荧光信号。

6.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的SA23s rRNA的特异性引物对，所述引物对包括：

(i)SA 23s rRNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

(ii)SA 23s rRNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:5所示；

(iii)mecA RNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:6所示；和

(iv)mecA RNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:7所示；

以及(c)使用说明书。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种组分：

(d)捕获探针；

(e)检测探针；

(f)MRSA内标序列；和/或

(g)内标检测探针。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：

所述MRSA SA 23s rRNA检测探针包括如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，且mecA RNA检测探针包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；和/或

所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；和/或

所述MRSA SA 23s rRNA内标序列包括如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，而所述MRSASA 23s rRNA的内标检测探针包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；和/或

所述mecA RNA内标序列包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；而mecA RNA的内标检测探针包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。

9.一种扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 23s rRNA和mecA RNA的特异性引物对，其特征在于，所述引物对包括：

(i)SA 23s rRNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

(ii)SA 23s rRNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:5所示；

(iii)mecA RNA的T7引物：序列如SEQ ID NO:6所示；和

(iv)mecA RNA的nT7引物：序列如SEQ ID NO:7所示。

10.如权利要求6所述的试剂盒或权利要求9所述的引物对的用途，其特征在于，用于制备检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的检测试剂盒或检测试剂。