Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2024048236A1 - ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法 - Google Patents

ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024048236A1
WO2024048236A1 PCT/JP2023/029165 JP2023029165W WO2024048236A1 WO 2024048236 A1 WO2024048236 A1 WO 2024048236A1 JP 2023029165 W JP2023029165 W JP 2023029165W WO 2024048236 A1 WO2024048236 A1 WO 2024048236A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
base
base sequence
group
nos
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/029165
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
章玄 岡本
壮太朗 高野
Original Assignee
国立研究開発法人物質・材料研究機構
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人物質・材料研究機構 filed Critical 国立研究開発法人物質・材料研究機構
Publication of WO2024048236A1 publication Critical patent/WO2024048236A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present disclosure relates to polynucleotides, kits, and diagnostic methods.
  • Patent Document 1 states, ⁇ A step of using a sample containing two or more cells or cell-like structures, and encapsulating the cells or cell-like structures one cell or structure at a time in a droplet; gelling to produce a gel capsule; and lysing the cell or cell-like structure by immersing the gel capsule in one or more lysis reagents, wherein the polynucleotide in the cell is dissolved in the gel.
  • a method for amplifying a polynucleotide in a cell or cell-like structure comprising the steps of:
  • Genome analysis technology is particularly useful for infectious diseases caused by difficult-to-cultivate bacteria and viruses.
  • One of the objectives of the present disclosure is to provide polynucleotides that may be used as markers for in vitro diagnosis of infectious diseases. Moreover, one of the problems of the present disclosure is to provide a primer set and a diagnostic method.
  • polynucleotide disclosed herein is selected from the group consisting of: A polynucleotide consisting of at least one type of base sequence. (a) at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 4; (b) a base sequence having 80% or more homology to at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4; (c) A base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • kit disclosed herein that includes a primer set and/or a probe includes a primer set designed from a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4, and/or Alternatively, it is a kit containing the probe.
  • kits comprising the primer set and/or probe disclosed herein is the following (e) to (n) [(e) to (n) are e, f, g , h, k, m, n] is a kit containing a primer set and/or probe designed from at least one region selected from the group consisting of: (e) region from base 641 to base 768 of SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 5), (f) Region from base 992 to base 1129 of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 6) (g) Region from base 1223 to base 1338 of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 7) (h) Region from base 695 to base 793 of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 8) (k) Region from base 3938 to base 4030 of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 9) (m) Region from base 2377 to base 2484 of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 10) (n) Region from base 27
  • polynucleotide disclosed herein is selected from the group consisting of: A polynucleotide consisting of at least one type of base sequence.
  • At least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 11 At least 80% of the base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 5 to 11
  • polynucleotides are provided that may be used as markers for in vitro diagnosis of infectious diseases. Further, according to the present disclosure, a primer set and a diagnostic method are provided.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for determining a region (biomarker sequence) that is specifically detected in periodontal disease patients.
  • FIG. 2 is a diagram showing a procedure for determining a region (biomarker sequence) that is specifically detected in periodontal disease patients.
  • a numerical range expressed using " ⁇ ” means a range that includes the numerical values written before and after " ⁇ " as the lower limit and upper limit.
  • a first embodiment of the polynucleotide disclosed herein is a polynucleotide consisting of at least one base sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below.
  • a sequence analysis method that is quantitative at the level of a single membrane vesicle is required.
  • nucleotide sequence unique to a specific membrane vesicle is identified, there is another problem in applying this nucleotide sequence to PCR (polymerase chain reaction), etc. to detect diseases. . Selection is necessary to reduce the risk of false positive rate (events in which the desired signal is detected even in healthy individuals). This selection method had not been previously established.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 are marker sequences that were selected and obtained by a method that was previously unknown, and are novel. In addition, if selected using an appropriate method, it can function as a marker with a low false positive rate in the diagnosis of infectious diseases, especially periodontal disease (diagnosis of the presence or absence of disease and the degree of progression). It has an effect.
  • the polynucleotides consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 were generally acquired by the following novel procedure.
  • membrane vesicles were extracted from saliva collected from healthy subjects and patients with periodontal disease.
  • the base sequence of the DNA contained in the extracted membrane vesicles was analyzed for each membrane vesicle using single cell/particle analysis technology.
  • the host (bacteria or virus) of each membrane vesicle was then identified based on the sequences derived from each membrane vesicle.
  • hosts were identified that were more abundant in saliva samples from patients with periodontal disease compared to healthy individuals.
  • sequence reads derived from membrane vesicles were mapped against the entire genome sequence of the host, and genomic regions obtained from a large number of membrane vesicles were identified (quantitatively).
  • genomic regions parts with low homology to other bacteria and viruses were determined to be biomarker sequence candidates.
  • biomarker candidate sequences those with low alignment scores were selected in comparison with saliva samples from healthy individuals.
  • sequence reads for bacteria (or viruses) of the same taxon were excluded. In this way, sequences 1 to 3 derived from bacteria and sequence 4 derived from virus were identified.
  • the polynucleotide of Example 1 derived from Sequences 1 to 4 selected and obtained through the above procedure can reduce the risk of false positives when used as a marker for diagnosing infectious diseases, particularly periodontal disease.
  • This polynucleotide can also be the basis for the design of primer sets and probes.
  • polynucleotide refers to a polymer form of nucleotides of any length. This term refers only to the primary structure of the molecule.
  • the nucleotide sequence (b) preferably has 85% or more homology, and preferably 90% or more homology to at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 4. is more preferable, it is still more preferable to have a homology of 95% or more, and it is particularly preferable to have a homology of 98% or more. Note that the above also applies to the base sequence (r) described below.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, using a polynucleotide as a probe using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like. It can be obtained by Note that the above also applies to (t) described later.
  • polynucleotides that hybridize under stringent conditions can also be obtained according to the instructions included with common hybridization kits.
  • hybridization kits include the Random Primed DNA Labeling Kit (manufactured by Roche Diagnostics), which prepares probes by a random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • SSC after hybridization is performed at 65°C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a polynucleotide-immobilized filter, SSC at a concentration of 0.1 to 2 times It can also be obtained by washing the filter at 65°C using a (saline-sodium citrate) solution (the composition of a 1x SSC solution is 150mM sodium chloride and 15mM sodium citrate).
  • a (saline-sodium citrate) solution the composition of a 1x SSC solution is 150mM sodium chloride and 15mM sodium citrate.
  • Stringent conditions include, for example, combining a polynucleotide-immobilized filter and a polynucleotide probe in 50% formamide, 5x SSC (750mM sodium chloride, 75mM sodium citrate), and 50mM sodium phosphate (pH 7). .6), after incubation overnight at 42°C in a solution containing 5x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g/L denatured salmon sperm DNA, e.g. Conditions include washing the filter in 2 ⁇ SSC solution.
  • the above conditions can also be set by adding and/or changing a blocking reagent used to suppress hybridization background. Addition of blocking reagents may involve altering hybridization conditions to adapt the conditions.
  • a second embodiment of the polynucleotide disclosed herein is a marker for detecting an infectious disease from the base sequence of a membrane vesicle extracted from a biological sample in the first embodiment. , a polynucleotide.
  • the polynucleotide of the first embodiment has a membrane vesicle-derived sequence that is specifically expressed in infectious disease patients and is obtained by selection using a novel technique. Therefore, if membrane vesicles extracted from biological samples are used as specimens, they can function as highly accurate diagnostic markers for detecting infectious diseases (particularly periodontal disease).
  • the biological sample refers to a sample obtained from a human or a non-human animal, and may be subjected to predetermined pretreatment.
  • a sample may be, for example, saliva, feces, saliva, sputum, surgical cleaning fluid, blood, skin/body mucous membrane swab, swab, or other collected samples, and saliva is particularly preferred.
  • the sample may also be subjected to pretreatment, and preferably undergoes treatment to extract membrane vesicles.
  • Membrane vesicles are contained in the above-mentioned biological sample together with host cells (or virus-infected host cells), etc., and membrane vesicles are separated from the host cells, Preferably, it is obtained.
  • the method for separating host cells and membrane vesicles in a biological sample is not particularly limited, and any known method may be used.
  • membrane vesicles can be obtained in the supernatant by centrifugation.
  • a membrane filter eg, pore size 0.1 to 0.9 ⁇ m
  • host cells remaining in the centrifugal supernatant can be easily separated.
  • the centrifuged supernatant may contain contaminants such as proteins in addition to host cells, for example, it may be concentrated using a 100-200 kDa cutoff filter and then precipitated by ultracentrifugation to precipitate membrane vesicles. Methods of recovery may also be used.
  • the precipitate obtained in this way may contain structures (e.g., flagella, flagella, etc.) derived from host cells (e.g., bacteria), and in order to remove these,
  • host cells e.g., bacteria
  • a method for further purification using density gradient centrifugation using sucrose or the like may be used.
  • a biological sample is placed in a centrifuge tube with a volume of 1 to 100 mL (eg, 50 mL), and heated at 3,000 to 9,000 rpm (eg, 7,000 rpm) at 1 to 20°C (eg, 4°C) for 1 to 30 minutes (eg, 10 centrifuged for 1 minute).
  • a centrifuge tube with a volume of 1 to 100 mL (eg, 50 mL), and heated at 3,000 to 9,000 rpm (eg, 7,000 rpm) at 1 to 20°C (eg, 4°C) for 1 to 30 minutes (eg, 10 centrifuged for 1 minute).
  • the precipitate contains host cells, etc., and the supernatant is passed through a 0.1 to 0.9 ⁇ m (for example, 0.22 ⁇ m) filter. and stored in a separate centrifuge tube at 1-10°C (eg, 4°C).
  • the supernatant is then placed in an ultracentrifuge tube, e.g. Ultracentrifuge for ⁇ 3 hours (eg, 2 hours). After ultracentrifugation, the supernatant is discarded and the precipitated membrane vesicles (OMVs) are resuspended in a buffer (e.g., PBS buffer, pH 7.4) and stored at 1-10°C (e.g., 4°C). Ru. Furthermore, this ultracentrifugation step may be repeated multiple times.
  • a buffer e.g., PBS buffer, pH 7.4
  • the obtained liquid may be diluted in order to adjust the number (concentration) of membrane vesicles contained per unit amount. This dilution process facilitates the separation and acquisition of individual membrane vesicles in the single cell/particle analysis described below.
  • the dilution method is not particularly limited, but includes, for example, a method of diluting to an appropriate concentration based on the concentration of membrane vesicles in the liquid observed by dynamic light scattering or the like.
  • the method for observing the concentration of membrane vesicles is to irradiate the particles with a laser, track the Brownian motion of each particle from the scattered light (tracking method), and calculate the particle diameter and diameter based on the Stokes-Einstein formula from the diffusion rate.
  • a method of calculating the number of objects is preferable.
  • Single cell/particle analysis can be used to isolate membrane vesicles and obtain their base sequences.
  • single cell/particle analysis is synonymous with “single particle analysis”, and is based on the analysis of membrane vesicles from a specimen (sample) containing multiple types and/or multiple cells. This refers to a method of separating each individual and performing genome analysis.
  • Single cell/particle analysis is, for example, a method in which membrane vesicles are collected one by one in each of a large number of microwells arranged on a plane, and genome analysis is performed on each membrane vesicle.
  • the device described in Patent Document 1 the device described in International Publication No. 2017/094101, the device described in International Publication No. 2016/038670, etc. Examples include those using known devices and/or methods.
  • membrane vesicles include outer membrane vesicles produced by bacteria, etc., “exosomes” produced and released by animal cells through the endocytic pathway, and “apoptosis” caused by apoptosis. “Corpuscles” are also included. Among these, membrane vesicles produced from cells infected with periodontal disease bacteria or periodontal disease-related viruses are preferred.
  • Membrane vesicles produced by bacteria are produced in such a way that part of the bacterial cell membrane is stretched outside the bacterial body.
  • examples include "outer membrane vesicles (OMVs),” which are microvesicles such as microvesicles, and “outer-inner membrane vesicles,” which are produced when bacteria rupture and lyse.
  • OMVs outer membrane vesicles
  • its size is not particularly limited, it is often 10 to 1000 nm, for Gram-negative bacteria it is often 10 to 300 nm, and for Gram-positive bacteria it is often 50 to 150 nm.
  • membrane vesicles may be detected in membrane vesicles, and the term "membrane vesicle” as used herein does not include virus-derived DNA. You can leave it there.
  • a third embodiment of the polynucleotide disclosed herein is a polynucleotide in which the infectious disease in the second embodiment is periodontal disease.
  • polynucleotides consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 were determined from DNA base sequences derived from membrane vesicles extracted from the saliva of healthy individuals and patients with periodontal disease.
  • the polynucleotide of the third embodiment is based on a sequence that is specifically expressed in this periodontal disease patient and whose eligibility as a marker is ensured, and is derived from a sample containing saliva (or saliva itself). as a marker for the detection of periodontal disease, the risk of false positives is reduced to a greater extent.
  • the first embodiment of the kit disclosed herein is a kit that includes a primer set and/or probe designed from a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • the base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 4 is a marker sequence selected from the DNA base sequence of membrane vesicles that are specifically expressed in periodontal disease patients. Primer sets and probes designed based on this are suitable for amplifying the above markers by real-time qPCR or the like.
  • a second embodiment of the kit disclosed herein includes a primer set and/or probe designed from at least one region selected from the group consisting of (e) to (n) below.
  • SEQ ID NOs. 5 to 11 are predetermined regions selected from SEQ ID NOs. 1 to 4, respectively. That is, it is part of the base sequences of SEQ ID NOS: 1 to 4. These sequences (regions) were particularly selected as sequences of about 100 bp suitable for detection by qPCR. In other words, a kit containing a primer set and/or probe based on the above sequence (region) can be used to accurately detect infectious diseases (particularly periodontal disease).
  • a third embodiment of the kit disclosed herein is a polynucleotide consisting of at least one base sequence selected from the group consisting of (p) to (t) below.
  • At least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 11 At least 80% of the base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 5 to 11 A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to at least one base sequence selected from the group consisting of homologous base sequences (t) SEQ ID NOs: 5 to 11. base sequence of
  • SEQ ID NOs: 5 to 11 are part of the base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4, and were particularly selected as sequences of about 100 bp suitable for detection by qPCR method.
  • the kit of the third embodiment based on the above base sequence can be used to accurately detect infectious diseases (particularly periodontal disease).
  • the nucleotide sequence (r) preferably has 85% or more homology to at least one nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 5 to 11, and 90% or more homology. It is more preferable to have a homology of 95% or more, and it is particularly preferable to have a homology of 98% or more.
  • the first embodiment of the diagnostic method disclosed herein analyzes the base sequence of membrane vesicles extracted from a biological sample, and the following (a) to (c) [a, b, c ], and (p) to (t) confirming the presence or absence of a polynucleotide consisting of at least one base sequence selected from the group consisting of [p, r, t], or a part thereof. It is a diagnostic method, including.
  • Base sequence At least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 5 to 11 (r) At least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 5 to 11, 80 Hybridize under stringent conditions to a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to at least one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 11 (t) having a homology of % or more.
  • the above-mentioned polynucleotide is a marker for diagnosing infectious diseases (particularly periodontal disease). This is a method to obtain information for diagnosing whether a donor (subject) is suffering from an infectious disease (typically periodontal disease) or the progress of the disease.
  • confirmation of the presence or absence may be quantitative or non-quantitative.
  • Non-quantitative confirmation of presence or absence includes, for example, measuring whether the marker is present in the base sequence of membrane vesicles isolated from a biological sample, and comparing it with a control sample.
  • quantitative confirmation of the presence or absence may include a method of measuring the concentration and/or amount of the marker.
  • other compounds that bind to the above-mentioned marker or its derivative compound can also be used to confirm the presence or absence.
  • the method (detection method) used to confirm the presence or absence is not particularly limited, but includes, for example, real-time PCR, qPCR, real-time qPCR, Northern blotting, microarray, immunoassay, SAGE method, CAGE method, mass spectrometry, molecular Interaction analysis, next generation sequencer, etc. are mentioned, and among them, real-time PCR or real-time qPCR is preferable.
  • Real-time PCR and real-time qPCR are methods for monitoring nucleic acids amplified by PCR in real time. For example, it can be carried out using a commercially available kit such as LightCycler480SYBRGreenIMaster (Roche).
  • Examples of the monitoring method include an intercalation method, a hybridization method, and a LUX (LightUponeXtension) method.
  • a typical intercalation method is to measure the amount of nucleic acid by utilizing the property that a fluorescent substance such as SYBRRG Green I enters double-stranded nucleic acid and emits light upon irradiation with excitation light. Since the intensity of fluorescence increases in proportion to the amount of nucleic acid, the amount of amplified nucleic acid can be determined by measuring the fluorescence intensity.
  • quantitative methods using real-time PCR can be roughly divided into two quantitative methods: absolute quantitative method and relative quantitative method, and these methods can be used as appropriate.
  • a substance capable of binding to the marker (or a part thereof) or a derivative derived from the marker is labeled with a labeling substance and used for real-time PCR, Northern blotting, etc. Can be done.
  • This labeling can be performed by a known method.
  • labeling substance it is possible to use labeling substances known to those skilled in the art such as fluorescent dyes, enzymes, coenzymes, chemiluminescent substances, and radioactive substances.
  • specific examples include radioisotopes, fluorescein, Examples include rhodamine, dansyl chloride, umbelliferone, luciferase, peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, horseradish peroxidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide oxidase, microperoxidase, and biotin.
  • biotin when used as a labeling substance, avidin bound to an enzyme such as alkaline phosphatase may be further added after adding the biotin-labeled antibody.
  • a primer set refers to a set of primers consisting of a forward primer and a reverse primer.
  • Primers are typically for real-time (q) PCR, and methods for designing such primers and probes are known.
  • Probes and primers for real-time PCR can be designed using, for example, PRIMER EXPRESS® software (Applied Biosystems, Foster City, CA), Primer Quest software (Integrated DNA Technologies), etc. This can be done using the software.
  • a second embodiment of the diagnostic method disclosed herein is a diagnostic method in the first embodiment, which further includes collecting the biological sample from the subject.
  • the biological sample collected from the subject is not particularly limited, but is preferably saliva itself or a sample containing saliva.
  • a third embodiment of the diagnostic method disclosed herein is a diagnostic method in the first or second embodiment of the diagnostic method, wherein the infectious disease is periodontal disease.
  • SEQ ID NOS: 1 to 4 are marker sequences selected based on samples collected from healthy individuals and patients with periodontal disease, and SEQ ID NOs: 5 to 11 are partial regions thereof. In diagnostic methods based on these, when the infectious disease is periodontal disease, more accurate results with reduced risk of false positives can be obtained.
  • a fourth embodiment of the diagnostic method disclosed herein is a method for diagnosing an infectious disease, in which the base sequence of membrane vesicles extracted from a biological sample is analyzed. This is a diagnostic method in which information for diagnosing the presence or absence of infection is obtained by detecting amplification of a target nucleic acid region using the kit of the second embodiment.
  • a fifth embodiment of the diagnostic method disclosed in this specification is the diagnostic method of the fourth embodiment, further comprising collecting the biological sample from the subject, and wherein the infectious disease is periodontal disease. This is a diagnostic method.
  • the biological sample used in the diagnostic methods of the fourth and fifth embodiments is not particularly limited, it is preferably saliva itself or a sample containing saliva.
  • Saliva was obtained from three healthy subjects and six patients with periodontal disease. Regarding patients with periodontal disease, patients classified as stage III/grade C (classification of periodontal disease by the American Academy of Periodontology and the European Federation of Periodontology) were targeted. These patients had not received any antibiotics for 3 months, were non-smokers, and had no diabetes or other systemic diseases. Saliva collection was performed using the Saliva Collection Aid (Salimetrics LLC. Carlsbad, CA). A mixture of samples from three healthy individuals was used as a healthy individual sample, and samples from six periodontal disease patients were mixed together as periodontal disease patient sample 1 and periodontal disease patient sample 2. , used for subsequent analyses. In addition, below, a healthy person sample, periodontal disease patient sample 1, and periodontal disease patient sample 2 may be collectively referred to as a "saliva sample.”
  • the separated membrane vesicle sample was treated with deoxyribonuclease (DNase) to degrade nucleic acid components outside the membrane vesicle. Specifically, 2 ⁇ L of DNase (13 units (U)/ ⁇ L) was added to 100 ⁇ L of purified membrane vesicle sample, and the mixture was treated at 37° C. for 30 minutes and at 80° C. for 10 minutes.
  • DNase deoxyribonuclease
  • the membrane vesicle sample was diluted and the membrane vesicle concentration was adjusted to a concentration of 40,000 particles/ ⁇ L.
  • the particles are irradiated with a laser, the Brownian motion of each particle is tracked from the scattered light (tracking method), and the diffusion rate of the particles is determined based on the Stokes-Einstein equation.
  • a method was used to calculate the diameter and number of pieces. Zetaview (DKSH, Germany) was used for measurements and calculations.
  • the membrane vesicles after encapsulation were dissolved by adding the following reagents. 50U/ ⁇ L Ready-lyse Lysozyme Solution (Epicentre), 2U/mL Zymolyase (Zymo research), 22U/mL lysostaphin (MERCK), 250U/mL mutanolysin (MERCK), This treatment was carried out overnight at 37° C. in DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline).
  • DPBS Dynabecco's Phosphate-Buffered Saline
  • the DNA in the gel beads after dissolution was amplified using REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN). After DNA amplification, the gel bead DNA molecules were stained with a nucleic acid staining reagent (1x SYBR Green), and gel beads with a certain level of fluorescence observed were placed in a 96-well plate using a cell sorter (FACSMelody cell sorter (BD Bioscience)). One gel bead at a time was separated and collected.
  • a nucleic acid staining reagent (1x SYBR Green
  • FACSMelody cell sorter BD Bioscience
  • SPAdes Bankevik et al., SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-C These short read sequences were combined ( A long base sequence called a contig of several kbp to several tens of kbp was created.
  • the protein coding region is determined by prokka (Seemann, Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics, 30, 14, 201 4) to predict and detect one of those CDS. For one, we performed a homology search using NCBI's complete protein sequence nr database and GTDB database as references, and determined that the bacterium that has the most CDS regions with the highest degree of matching in its genome is the host bacterium for that particle. .
  • the host bacterial profile of membrane vesicles obtained as a result of the analysis of all particles was compared between healthy samples and patient samples, and the phylum Patescibacteria was found as the bacterial taxonomic group with the highest abundance ratio in the patient samples.
  • FIG. 1 is a comparison of the base sequence profiles of membrane vesicles in samples from healthy individuals and samples from patients with periodontal disease. Based on the information on the detected base sequences, we identified the bacterial taxon from which the base sequences inside each membrane vesicle were derived.
  • FIG. 1 is a heat map showing the detected base sequence lengths as frequencies when each bacterial strain is divided into phylum level (phylum) and genus level (genus). It was found that nucleotide sequences derived from TM7x, which belongs to the phylum Patescibacteria, are frequently detected in periodontal disease patient samples.
  • bacterial strain A (Patescibacteria TM7x sp900555265), which was detected the most, was designated as a membranous vesicle host bacterial strain unique to periodontal disease patients.
  • Figure 2 shows the results, showing the length of the region of virus-derived base sequences detected in each membrane vesicle for each species.
  • virus species B Podviridae ctUiB3
  • virus species B which was detected the most in periodontal disease patients compared to healthy individuals, was designated as a virus specific to periodontal disease patients.
  • a homology search was performed using the frequently occurring region as a query sequence and the biological protein sequence (nr) spanning all domains registered with NCBI as a reference sequence (diamond). Alignment score (Max Score) of the top 20 protein coding sequences from the hit protein coding sequences in the database, excluding sequences of taxonomic groups to which the same strains or species belong (phylum in the case of bacteria, family in the case of viruses) The sum of these values was calculated, and only the sequence with the minimum value was selected as a biomarker candidate sequence.
  • membrane vesicle-derived sequence reads whose hosts are bacterial strains belonging to the same taxonomic group (phylum level) as the bacterial strain A mentioned above were added to the membrane vesicle host bacteria of bacterial strain A. mapped against the genome.
  • the final biomarker sequences (SEQ ID NOs: 1 to 3) for detecting periodontal disease were selected by excluding the regions detected in the sequence reads of these membrane vesicles from healthy subjects from the above biomarker candidate sequences. .
  • FIG. 3 is a diagram showing a procedure for determining a region (biomarker sequence) that is specifically detected in periodontal disease patients.
  • Figure 3 (A) shows the results of mapping the internal nucleotide sequence of membrane vesicles determined to be derived from TM7x sp900555265, among membrane vesicles derived from periodontal disease patient samples, to the reference sequence (genome sequence of TM7x sp900555265). It is a figure showing an example.
  • the vertical axis of FIG. 3(A) represents individual membrane vesicles, and the horizontal axis represents the position on the genome sequence.
  • the heat map in FIG. 3(B) represents the genome regions that are frequently detected in FIG. 3(A).
  • the horizontal axis represents the position on the genome sequence.
  • Figure 3 (C) shows that among membrane vesicles derived from healthy subjects, membrane vesicles determined to be derived from the phylum Patescibacteria and containing TM7x sp900555265 were mapped to the reference sequence (genome sequence of TM7x sp900555265). It is something.
  • the vertical axis and the horizontal axis are the same as in FIG. 3(A).
  • the heat map in FIG. 3(D) represents the genomic regions that are frequently detected in FIG. 3(C).
  • the horizontal axis represents the position on the genome sequence.
  • FIG. 3(E) is a map of the genomic regions specifically detected in periodontal disease patients from a comparison of FIG. 3(B) and FIG. 3(D) above. Each of these becomes a biomarker sequence.
  • biomarker candidate sequence obtained above was used as the biomarker sequence (SEQ ID NO: 4). Among these sequences, continuous DNA regions of 1000 bp or more were targeted.
  • FIG. 4 is a diagram showing a procedure for determining a region (biomarker sequence) that is specifically detected in periodontal disease patients.
  • Figure 4 (B) shows the nucleotide sequence inside a membrane vesicle containing a CDS region determined to be derived from Podviridae ctUiB3, which was determined to be derived from a periodontal disease patient sample, to the reference sequence (genome sequence of ctUiB3).
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the results.
  • the vertical axis of FIG. 4(B) represents individual membrane vesicles, and the horizontal axis represents the position on the genome sequence.
  • FIG. 4(A) shows the detection frequency for each region
  • the heat map in FIG. 4(C) shows the genome regions detected with high frequency in FIG. 4(A). In both cases, the horizontal axis represents the position on the genome sequence. This genomic region becomes a biomarker sequence.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

以下の（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、感染症の体外診断のマーカーとして使用され得る。 （ａ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列、 （ｂ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列、 （ｃ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列

Description

ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法
　本開示は、ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法に関する。
　単一細胞・粒子解析を行う方法、及び、そのための装置が知られている。
　特許文献１には「２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用い、該細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する工程と、該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解する工程であって、該細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、工程と、該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程とを含む、細胞または細胞様構造物中のポリヌクレオチドを増幅する方法。」が記載されている。
国際公開第２０１９／２１６２７１号
　多様な細胞を含む生物学的サンプルに難培養性細胞やウイルス粒子が含まれる場合、その難培養性細胞・ウイルス粒子の機能解析のためには、その生物学的サンプルの全ゲノム解析が不可欠とされてきた。特許文献１に記載されるような単一細胞・粒子解析は、１細胞・１粒子を分離し、その細胞・粒子中のポリヌクレオチドを増幅して読み取ることができるため、特に難培養性細胞・ウイルス粒子の全ゲノム解析に大きく貢献している。また、個々の細胞・ウイルス粒子に分離せずに行う、従来公知の全ゲノム（メタゲノム）解析も、依然として上記のような目的には有用である。
　近年、上記のようなゲノム解析技術を、疾病の体外診断に活用する試みが盛んになされている。特に、難培養性の細菌やウイルスが原因となる感染症では、ゲノム解析技術が有用となる。
　本開示の課題の一つは、感染症の体外診断のマーカーとして使用できる場合があるポリヌクレオチドの提供にある。また、本開示の課題の一つは、プライマーセット、及び、診断方法の提供にある。
　本明細書に開示されるポリヌクレオチドの実施形態の１つは、以下の（ａ）～（ｃ）［（ａ）～（ｃ）は、ａ，ｂ，ｃを意味する］からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列、
（ｂ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列、
（ｃ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
　本明細書に開示される、プライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットの実施形態の１つは、配列番号１～４からなる群より選択される塩基配列から設計されるプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットである。
　本明細書に開示される、プライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットの実施形態の１つは、以下の（ｅ）～（ｎ）［（ｅ）～（ｎ）はｅ，ｆ，ｇ，ｈ，ｋ，ｍ，ｎを意味する］からなる群より選択される少なくとも１種の領域から設計されるプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットである。
（ｅ）配列番号３の６４１塩基から、７６８塩基までの領域（配列番号５）、
（ｆ）配列番号２の９９２塩基から、１１２９塩基までの領域（配列番号６）
（ｇ）配列番号２の１２２３塩基から、１３３８塩基までの領域（配列番号７）
（ｈ）配列番号２の６９５塩基から、７９３塩基までの領域（配列番号８）
（ｋ）配列番号４の３９３８塩基から、４０３０塩基までの領域（配列番号９）
（ｍ）配列番号４の２３７７塩基から、２４８４塩基までの領域（配列番号１０）
（ｎ）配列番号４の２７０５塩基から、２８０６塩基までの領域（配列番号１１）
　本明細書に開示されるポリヌクレオチドの実施形態の１つは、以下の（ｐ）～（ｔ）［（ｐ）～（ｔ）は、ｐ，ｒ，ｔを意味する］からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（ｐ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
（ｒ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
（ｔ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
　本開示によれば、感染症の体外診断のマーカーとして使用できる場合があるポリヌクレオチドが提供される。また、本開示によれば、プライマーセット、及び、診断方法が提供される。
健常者サンプルと、歯周病患者サンプル内の膜小胞の塩基配列のプロファイルの比較結果である（細菌由来）。 健常者サンプルと、歯周病患者サンプル内の膜小胞の塩基配列のプロファイルの比較結果である（ウイルス由来）。 歯周病患者に特異的に検出される領域（バイオマーカー配列）の決定手順を表す図である。 歯周病患者に特異的に検出される領域（バイオマーカー配列）の決定手順を表す図である。
　以下の説明は、非限定的な実施形態に基づいてなされる。なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　本明細書に開示されるポリヌクレオチドの第１の実施形態は、以下の（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
（ｂ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
（ｃ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
　従来、試料中に含まれる膜小胞内部の全塩基配列を決定した上で、各細菌由来膜小胞に特有の塩基配列を特定し、目的とする細菌由来膜小胞の有無を検証する試みがなされていた。しかし、この特定技術をヒト由来サンプルに適用し、疾患診断技術へと確立した例はなかった。
　その理由の一つは、単一の膜小胞レベルでの定量性を有する配列解析手法が確立されていなかったことである。健常者由来サンプルと、疾患患者由来サンプルとの比較は、必然的に「異なるサンプル」間での比較解析となる。特定のＤＮＡを持つ膜小胞の存在比を「異なるサンプル」間で比較検討するには、単一の膜小胞レベルでの定量性を有する配列解析手法が要求される。
　また、仮に、特定の膜小胞に特有の塩基配列が同定されたとしても、この塩基配列をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）等に適用して、疾病検出を行うためにはもう一つの問題がある。それは、偽陽性率（健常者においても目的とするシグナルが検出されてしまう事象）のリスクを低下させるために、選抜を要することである。この選抜方法も従来確立されてはいなかった。
　配列番号１～４の塩基配列は、従来知られていなかった手法により、選抜、取得されたマーカー配列であり、新規なものである。また、適切な方法によって選抜されたことにより、感染症、特に、歯周病の診断（り患の有無、進行の程度の診断）において、偽陽性率の低いマーカーとして機能し得るという、従来にない効果を有している。
　具体的な取得方法は後述されるが、配列番号１～４の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、概ね、以下の新規な手順により取得された。
　まず、健常者、及び、歯周病患者から採取された唾液から膜小胞が抽出された。次に、抽出された膜小胞に含まれるＤＮＡの塩基配列が、単一細胞・粒子解析の技術により、膜小胞の個々について解析された。次に、個々の膜小胞に由来する配列に基づき、個々の膜小胞の宿主（細菌、又は、ウィルス）が同定された。次に、健常者と比較して、歯周病患者の唾液サンプルにおいて存在比が高い宿主が特定された。次に、その宿主の全ゲノム配列に対して、膜小胞由来のシークエンスリードがマッピングされ、（定量的に）多数の膜小胞から取得されたゲノム領域が特定された。次に、特定されたゲノム領域のうち、他の細菌、及び、ウィルスと相同性が低い部分がバイオマーカー配列候補と決定された。次に、バイオマーカー候補配列のうち、健常者の唾液サンプルとの比較で、アライメントスコアが低いものが選抜された。更に、同分類群の細菌（又はウィルス）のシークエンスリードが除外された。このようにして細菌由来の配列１～３、ウィルス由来の配列４が特定された。
　上述の手順を経て選抜、取得された配列１～４に由来する実施例１のポリヌクレオチドは、感染症、特に歯周病診断のマーカーとして用いられる場合、偽陽性の発生リスクを低下させ得る。また、このポリヌクレオチドは、プライマーセット、及び、プローブの設計の基礎とされ得る。
　なお、本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は上記分子の一次構造のみを指す。
　（ｂ）の塩基配列は、配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して８５％以上の相同性を有することが好ましく、９０％以上の相同性を有することがより好ましく、９５％以上の相同性を有することが更に好ましく、９８％以上の相同性を有することが特に好ましい。なお、上記は、後述する（ｒ）の塩基配列においても同様である。
　また、（ｃ）における、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えばポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得ることができる。
　なお、上記は、後述する（ｔ）においても同様である。
　ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション方法は公知であり、例えばモレキュラー・クローニング第４版［Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（２０１２）］、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ［ＡＳＭ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）］、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｍａｎｕａｌ［Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９９７）］の他、多数の他の標準的な教科書に従って条件を決定して行うことができる。
　また、一般的なハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従って、ストリンジェントな条件（下）でハイブリダイズするポリヌクレオチドを取得することもできる。このようなハイブリダイゼーションキットとしては、例えば、ランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等が挙げられる。
　より具体的には、例えば、ポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得することもできる。
　また、ストリンジェントな条件とは、例えばポリヌクレオチドを固定化したフィルターとポリヌクレオチドプローブとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば、約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中でフィルターを洗浄する条件が挙げられる。
　なお、上記の条件は、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、及び／又は、変更することにより設定することもできる。ブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
　本明細書に開示されるポリヌクレオチドの第２の実施形態は、第１の実施形態において、生物学的試料から抽出された膜小胞の塩基配列から、感染症を検出するためのマーカーである、ポリヌクレオチドである。
　上述のとおり、第１の実施形態のポリヌクレオチドは、新規な手法により選抜して取得された感染症患者に特異的に発現する膜小胞由来の配列を有する。したがって、生物学的試料から抽出された膜小胞を検体とすれば、感染症（特に歯周病）を検出するための精度の高い診断用マーカとして機能し得る。
　ここで、生物学的試料とは、ヒト、又は、ヒト以外の動物から所得されたサンプルを意味し、所定の前処理が行われたものであってもよい。
　このようなサンプルとしては、例えば、唾液、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、皮膚・身体粘膜の拭い液、及び、スワブ等の採取試料であってもよく、なかでも、唾液が好ましい。
　また上記サンプルは、前処理を行われてもよく、膜小胞を抽出する処理が行われることが好ましい。
　膜小胞は、上記の生物学的試料に、一形態として宿主細胞（又はウイルスに感染した宿主細胞）等とともに含まれた状態となっており、この宿主細胞から、膜小胞が分離され、取得されることが好ましい。
　生物学的試料中の宿主細胞と膜小胞とを分離する方法としては特に限定されず、公知の方法が使用され得る。例えば、遠心分離により、膜小胞を上清中に取得できる。更に、分離した遠心上清をメンブランフィルター（例えば、孔径０．１～０．９μｍ）を用いてろ過すれば、遠心上清に残留する宿主細胞等を容易に分離できる。
　遠心上清には、宿主細胞以外にもタンパク質等の夾雑物質が含まれている場合があるので、例えば、１００～２００ｋＤａカットオフフィルタで濃縮された後、超遠心によって膜小胞を沈殿させて回収する方法も使用され得る。
　また、このようにして得られた沈殿物には、宿主細胞（例えば細菌）由来の構造体（例えば、せん毛、及び、べん毛等）が含まれることがあり、これらを除去するために、例えば、スクロース等を用いた密度勾配遠心法を用いて、更に精製する方法が使用されてもよい。
　上記処理を含む試料の調製方法をより具体的に説明する。
　まず、生物学的試料が容量が１～１００ｍＬ（例えば５０ｍＬ）の遠心管に収容され、３０００～９０００ｒｐｍ（例えば７０００ｒｐｍ）、１～２０℃（例えば４℃）で、１～３０分間（例えば、１０分間）遠心される。
　上清と沈殿物とに分離されたら、沈殿物には宿主細胞等が含まれているため、これが分離され、上清が０．１～０．９μｍ（例えば、０．２２μｍ）のフィルターに通され、別の遠心管に収容され、１～１０℃（例えば、４℃）で保存される。
　次に、上清が超遠心チューブに収容され、例えば、遠心力として１５０，０００～３００，０００×ｇ（例えば、２１０，０００×ｇ）で、１～１０℃（例えば、４℃）で１～３時間（例えば、２時間）超遠心される。超遠心後、上清が破棄され、沈殿した膜小胞（ＯＭＶ）が緩衝液（例えば、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー）に再懸濁され、１～１０℃（例えば、４℃）で保存される。更に、この超遠心の工程は複数回繰り返えされてもよい。
　なお、単位量あたりに含まれる膜小胞の数（濃度）を調整するために、得られた液は希釈されてもよい。この希釈処理により、後述する単一細胞・粒子解析において、１個体ずつの膜小胞が分離取得されやすくなる。
　希釈の方法としては特に限定されないが、例えば、動的光散乱法等により観察される液中の膜小胞の濃度に基づき、適当な濃度に希釈する方法が挙げられる。
　膜小胞の濃度の観察方法は、粒子にレーザを照射し、その散乱光から各粒子のブラウン運動を追跡し（トラッキング法）、その拡散速度から、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式に基づき粒子の径と個数とを計算する方法が好ましい。
　膜小胞を分離して、その塩基配列を取得する方法としては、単一細胞・粒子解析が使用できる。
　本明細書において、「単一細胞・粒子解析」とは、「一粒子解析」と同義であり、複数種類、及び／又は、複数個の細胞が含まれる検体（試料）から、膜小胞の１個ずつを分取しゲノム解析する方法を意味する。
　単一細胞・粒子解析は、例えば、平面上に配列した多数のマイクロウェルのそれぞれに膜小胞を一つずつ分取し、その膜小胞の個々について、ゲノム解析を行う方法である。単一細胞・粒子解析には、例えば、特許文献１に記載された装置、国際公開第２０１７／０９４１０１号に記載された装置、及び、国際公開第２０１６／０３８６７０号に記載された装置等のような公知の装置、及び／又は、方法を使用するものが挙げられる。
　本明細書における、「膜小胞」には、細菌等により産生される外膜小胞、動物細胞等により、エンドサイトーシス経路により産生、放出される「エクソソーム」、及び、アポトーシスによって生ずる「アポトーシス小体」も含まれるものとする。なかでも、歯周病菌、又は、歯周病に関連するウイルスに感染した細胞から産生される膜小胞が好ましい。
　細菌により産生される（「細菌に由来する」、又は、「細菌の」ということがある）膜小胞としては、細菌の細胞膜の一部が菌体外にくびり取られるようにして産生されたマイクロベシクルである「外膜小胞（ＯＭＶ；ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｅｓｉｃｌｅ）」や細菌が破裂溶菌することによって生じる「内外膜小胞（ｏｕｔｅｒ－ｉｎｎｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｖｅｓｉｃｌｅ）」等が挙げられる。その大きさは、特に限定されないが、１０～１０００ｎｍである場合が多く、グラム陰性細菌では１０～３００ｎｍであることが多く、グラム陽性細菌では５０～１５０ｎｍであることが多い。
　なお、膜小胞中に、ウイルスＤＮＡが検出されることがあることを本発明者らは知見しており、本明細書に含まれる「膜小胞」には、ウイルス由来のＤＮＡが含まれていてもよい。
　本明細書に開示されるポリヌクレオチドの第３の実施形態は、第２の実施形態において、上記の感染症が、歯周病である、ポリヌクレオチドである。
　上述のとおり、配列番号１～４の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、健常者、及び、歯周病患者の唾液から抽出された膜小胞に由来するＤＮＡ塩基配列から決定された。第３の実施形態のポリヌクレオチドは、この歯周病患者に特異的に発現し、かつ、マーカーとしての適格性が確保された配列に基づくものであり、唾液を含む検体（又は唾液そのもの）からの歯周病の検出のためのマーカーとして、偽陽性のリスクがより大きく低減される。
　本明細書に開示されるキットの第１の実施形態は、配列番号１～４からなる群より選択される塩基配列から設計されるプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットである。
　上述のとおり、配列番号１～４からなる群より選択される塩基配列は、歯周病患者に特異的に発現する膜小胞のＤＮＡ塩基配列から選抜されたマーカー配列である。これをもとに設計されたプライマーセット、及び、プローブは、リアルタイムｑＰＣＲ等による、上記マーカーの増幅に適する。
　本明細書に開示されるキットの第２の実施形態は、以下の（ｅ）～（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の領域から設計されるプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットである。
（ｅ）配列番号３の６４１塩基から、７６８塩基までの領域（配列番号５）、
（ｆ）配列番号２の９９２塩基から、１１２９塩基までの領域（配列番号６）
（ｇ）配列番号２の１２２３塩基から、１３３８塩基までの領域（配列番号７）
（ｈ）配列番号２の６９５塩基から、７９３塩基までの領域（配列番号８）
（ｋ）配列番号４の３９３８塩基から、４０３０塩基までの領域（配列番号９）
（ｍ）配列番号４の２３７７塩基から、２４８４塩基までの領域（配列番号１０）
（ｎ）配列番号４の２７０５塩基から、２８０６塩基までの領域（配列番号１１）
　配列番号５～１１は、それぞれ、配列番号１～４から選択された所定の領域である。すなわち、配列番号１～４の塩基配列の一部である。これらの配列（領域）は、特に、ｑＰＣＲ法による検出に適した１００ｂｐ程度の配列として選択されたものである。言い換えれば、上記配列（領域）に基づくプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキットは、感染症（特に歯周病）を精度よく検出するのに使用され得る。
　本明細書に開示されるキットの第３の実施形態は、以下の（ｐ）～（ｔ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（ｐ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
（ｒ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
（ｔ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
　上述のとおり、配列番号５～１１は、配列番号１～４の塩基配列の一部であり、特に、ｑＰＣＲ法による検出に適した１００ｂｐ程度の配列として選択されたものである。上記塩基配列に基づく、第３の実施形態のキットは、感染症（特に歯周病）を精度よく検出するのに使用され得る。
　なお、（ｒ）の塩基配列は、配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して８５％以上の相同性を有することが好ましく、９０％以上の相同性を有することがより好ましく、９５％以上の相同性を有することが更に好ましく、９８％以上の相同性を有することが特に好ましい。
　本明細書に開示される診断方法の第１の実施形態は、生物学的試料から抽出された膜小胞の塩基配列を解析し、以下の（ａ）～（ｃ）［ａ，ｂ，ｃ］、及び、（ｐ）～（ｔ）［ｐ，ｒ，ｔ］からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、その一部の存否を確認することと、を含む、診断方法である。
（ａ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
（ｂ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
（ｃ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
（ｐ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
（ｒ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
（ｔ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
　上記ポリヌクレオチドは、感染症（特に歯周病）の診断のためのマーカーであり、上記診断方法は、言い換えれば、マーカーを定量的、又は、非定量的に検出することにより、生物学的試料の提供者（被験者）が感染症（典型的には歯周病）に、り患していること、又は、その進行状況を診断するための情報を得る方法である。
　なお、存否の確認は、定量的であっても、非定量的であってもよい。非定量的な存否の確認は、例えば、上記マーカーが生物学的試料から分離された膜小胞の塩基配列中に存在するか否かの測定、及び、コントロール試料との比較等が挙げられる。一方、定量的な存否の確認は、上記マーカーの発言の濃度、及び／又は、量を測定する方法が挙げられる。なお、存否の確認には、上記マーカー、又は、その派生化合物と結合する他の化合物を用いることもできる。
　なお、存否の確認に用いられる方法（検出方法）としては特に限定されないが、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ｑＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、免疫測定法、ＳＡＧＥ法、ＣＡＧＥ法、質量分析法、分子間相互作用解析、及び、次世代シークエンサー等が挙げられ、なかでも、リアルタイムＰＣＲ、又は、リアルタイムｑＰＣＲが好ましい。
　リアルタイムＰＣＲ、リアルタイムｑＰＣＲは、ＰＣＲによって増幅する核酸をリアルタイムでモニタリングする方法である。例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＭａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）等の市販のキット等を用いて実施可能である。
　上記モニタリングの方法としては、インターカレーション法、ハイブリダイゼーション法、ＬＵＸ（ＬｉｇｈｔＵｐｏｎｅＸｔｅｎｓｙｏｎ）法などが挙げられる。インターカレーション法の典型的な方法は、ＳＹＢＲＲＧｒｅｅｎＩなどの蛍光物質が二本鎖の核酸に入り込み、励起光の照射によって発光を発する特性を利用して核酸量を測定する方法である。蛍光の強さは核酸の量に比例して強くなるため、蛍光強度を測定することによって核酸の増幅量を知る事ができる。
　また、リアルタイムＰＣＲを使用した定量方法では、大きく分けて絶対定量法と相対定量法の２つの定量方法がありそれらを適宜使用できる。
　また、検出方法の一形態として、上記マーカー（若しくはその一部）、又は、上記マーカー由来の派生物質に結合可能な物質を標識物質で標識し、リアルタイムＰＣＲ、及び、ノーザンブロッティング等に使用することができる。この標識は公知の方法により行うことが可能である。
　標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、及び、放射性物質等の当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、及び、ビオチン等が挙げられる。
　なお、標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼ等の酵素を結合させたアビジンをさらに添加してもよい。
　また、本明細書において、プライマーセットとは、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなる一組のプライマーを意味する。プライマーは、典型的には、リアルタイム（ｑ）ＰＣＲ用であることが好ましく、このようなプライマー、及び、プローブの設計方法は公知である。リアルタイムＰＣＲ用のプローブ及びプライマーの設計は、例えば、ＰＲＩＭＥＲ　ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等のソフトウェアを使用して行うことができる。
　本明細書に開示される診断方法の第２の実施形態は、第１の実施形態において、更に、被験者から上記生物学的試料を採取することを含む、診断方法である。
　上記診断方法によれば、被験者が感染症にり患しているかを診断できる。被験者から採取される生物学的試料は特に限定されないが、唾液そのもの、又は、唾液を含む試料であることが好ましい。
　本明細書に開示される診断方法の第３の実施形態は、診断方法の第１又は第２の実施形態において、上記感染症が歯周病である、診断方法である。
　上述のとおり、配列番号１～４は健常者、及び、歯周病患者から採取された検体に基づき選抜されたマーカー配列であり、配列番号５～１１は、その一部領域である。これらに基づく診断方法においては、感染症が歯周病である場合、より正確、かつ、偽陽性のリスクが低減された精度の高い結果が得られる。
　本明細書に開示される診断方法の第４の実施形態は、感染症の診断方法であって、生物学的試料から抽出された膜小胞の塩基配列を解析し、診断方法の第１又は第２の実施形態のキットを用いて標的核酸領域の増幅を検出することで、感染の有無を診断するための情報を得る、診断方法である。
　本明細書に開示される診断方法の第５の実施形態は、第４の実施形態の診断方法において、更に、被験者から上記生物学的試料を採取することを含み、上記感染症が歯周病である、診断方法である。
　なお、第４、及び、第５の実施形態の診断方法における生物学的試料は特に限定されないが、唾液そのもの、又は、唾液を含む試料であることが好ましい。
［検体採取］
　健常者３人、及び、歯周病患者６人からそれぞれ唾液を入手した。歯周病患者については、ステージＩＩＩ・グレードＣ（アメリカ歯周病学会・ヨーロッパ歯周病連盟による歯周病分類）に分類される患者を対象とした。これらの患者については、３か月間に亘って抗生物質の投与がなく、非喫煙者であり、糖尿病、その他の全身性疾患の無いものを対象とした。唾液の採取は、Ｓａｌｉｖａ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ａｉｄ　（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ　ＬＬＣ．　Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ）を用いて実施された。健常者３人のサンプルを混和したものを健常者サンプルとし、歯周病患者６人のサンプルを３人分ずつ混和したものを、歯周病患者サンプル１、及び、歯周病患者サンプル２として、その後の解析に使用した。なお、以下では、健常者サンプル、歯周病患者サンプル１、及び、歯周病患者サンプル２をあわせて、「唾液サンプル」ということがある。
［細胞膜小胞の分離］
　唾液サンプルを７８００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間遠心し、沈殿物と上清に分離した。分離した遠心上清を、メンブレンフィルター（孔径０．２２μｍ）を用いてろ過し、上清に残留する菌体等を除去した。得られたろ過後の上清からＥｘｏＢａｃｔｅｒｉａ　ＯＭＶ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）によって膜小胞のみを分離した。
［膜小胞外の核酸成分の除去］
　分離後の膜小胞サンプルに対してデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）処理を行い、膜小胞外部にある核酸成分を分解した。具体的には１００μＬの精製後の膜小胞サンプルに対して、２μＬのＤＮａｓｅ（１３　ｕｎｉｔｓ　（Ｕ）／μＬ）を添加し、３７℃で３０分、８０℃で１０分の処理を行なった。
［濃度調整と粒子数定量］
　膜小胞サンプルを希釈し、４００００粒子／μＬの濃度になるように膜小胞の濃度の調整を行なった。膜小胞の粒子数の定量方法としては、粒子にレーザを照射し、その散乱光から各粒子のブラウン運動を追跡し（トラッキング法）、その拡散速度から、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式に基づき粒子の径と個数とを計算する方法をとった。測定と算出には、Ｚｅｔａｖｉｅｗ（ＤＫＳＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。
［一粒子解析］
　膜小胞が１粒子ずつ封入されるように濃度調整を行なった上で、膜小胞サンプルとアガロースゲルを混和し、膜小胞１粒子ごとに１ゲルビーズに封入した。
　封入後の膜小胞を下記の試薬を加えることで溶解させた。
　５０Ｕ／μＬ　Ｒｅａｄｙ－ｌｙｓｅ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、
　２Ｕ／ｍＬ　Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（Ｚｙｍｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ）、
　２２Ｕ／ｍＬ　ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ（ＭＥＲＣＫ）、
　２５０Ｕ／ｍＬ　ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ（ＭＥＲＣＫ）、
　この処理はＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）中、３７℃で、一晩（オーバーナイト）処理した。
　次に、０．５ｍｇ／ｍＬ　ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＭＥＲＣＫ）ｉｎ　ＤＰＢＳ、３７℃で８時間処理した。
　最後に、１ｍｇ／ｍＬ　プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　（Ｐｒｏｍｅｇａ））と０．５％　ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）をＤＰＢＳに溶解させた溶液によって、４０℃で一晩処理を行なった。
　溶解後のゲルビーズ内ＤＮＡは、ＲＥＰＬＩ－ｇ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ　（ＱＩＡＧＥＮ）によって増幅操作を行なった。ＤＮＡ増幅を行なった後、ゲルビーズＤＮＡ分子を核酸染色試薬（１×　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ）によって染色し、一定以上の蛍光が観察されたゲルビーズを、セルソーター（ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｅｒ　（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））によって、９６ウェルプレートに１ゲルビーズずつ分離採取した。
　次いで、ウェルプレートに分取した上でＲＥＰＬＩ－ｇ　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｃｅｌｌ　Ｋｉｔ　で二度目の増幅操作を行い、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）　を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ用のライブラリ作製を行なった上で、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｍｉｓｅｑ又はＨｉｓｅｑを用いて、シークエンシングを行い、ショートリードの塩基配列を得た。これらの操作を健常者サンプルについては１９２粒子、患者サンプルについては５７６粒子に対して行い、１粒子ごとに塩基配列を得た。
［データ処理］
　得られたショートリード塩基配列（１５０ｂｐ程度）の中でシークエンスのクオリティが低い配列を、ｆａｓｔｐ（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ｆａｓｔｐ：　ａｎ　ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ　ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　ＦＡＳＴＱ　ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　３４，　１７，　２０１８）を用いて除去した。
　その後、ＳＰＡｄｅｓ（Ｂａｎｋｅｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，　ＳＰＡｄｅｓ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．　Ｊ．　Ｃｏｍｐｕｔ．　Ｂｉｏｌ．，　１９，　５，　２０１２）を用いて、これらのショートリード配列を結合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）させ、数ｋ～数十ｋｂｐ程度のコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）と呼ばれる長い塩基配列を作成した。
　各膜小胞内部の塩基配列のうちタンパク質コード領域（ＣＤＳ）をｐｒｏｋｋａ（Ｓｅｅｍａｎｎ，　Ｐｒｏｋｋａ：　ｒａｐｉｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，　３０，　１４，　２０１４）を用いて予測・検出し、それらのＣＤＳの一つ一つに対し、ＮＣＢＩの全タンパク質配列　ｎｒデータベース　とＧＴＤＢデータベースをリファレンスとして相同性検索を行い、一致度の最も高いＣＤＳ領域をゲノム中に最も多く有する細菌がその粒子の宿主細菌であると判断した。
　相同性検索には、ｄｉａｍｏｎｄ（Ｂｕｃｈｆｕｎｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ　ａｔ　ｔｒｅｅ－ｏｆ－ｌｉｆｅ　ｓｃａｌｅ　ｕｓｉｎｇ　ＤＩＡＭＯＮＤ，　Ｎａｔ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ．，　１８，　２０２１）を使用した。この際、ウイルス由来のＣＤＳが含まれる膜小胞も検出されたため、それらの膜小胞については内部のウイルス由来ＤＮＡの帰属情報（ウイルスの種）を得た。
　全粒子の解析の結果得られた膜小胞の宿主細菌プロファイルについて、健常者サンプルと患者サンプルの比較を行い、患者サンプルにおいて最も存在量比の高かった細菌分類群としてＰａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａ門を得た。
　図１は、健常者サンプルと、歯周病患者サンプル内の膜小胞の塩基配列のプロファイルの比較結果である。検出された塩基配列の情報を基に、各膜小胞内部の塩基配列が由来する細菌の分類群を特定した。図１は各細菌株を門レベル（ｐｈｙｌｕｍ）と属レベル（ｇｅｎｕｓ）で分けた場合の検出塩基配列長を頻度としてヒートマップで表したものである。歯周病患者サンプルでＰａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａ門に属するＴＭ７ｘ由来の塩基配列が高頻度に検出されることがわかった。
　上記に属する宿主細菌株のうち、最も検出数の高かった細菌株Ａ（Ｐａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａ　ＴＭ７ｘ　ｓｐ９００５５５２６５）を歯周病患者特有の膜小胞宿主細菌株とした。
　また、ウイルス由来配列を対象とした同様の比較も行った。図２はその結果であり、各膜小胞で検出されたウイルス由来塩基配列の領域長を種ごとに表示したものである。上記比較によって、健常者に比べ歯周病患者において最も検出数の多かったウイルス種Ｂ（Ｐｏｄｖｉｒｉｄａｅ　ｃｔＵｉＢ３）を歯周病患者特有のウイルスとした。
　上記の細菌株Ａ（またはウイルス種Ｂ）の全ゲノム配列（ドラフトゲノム配列）に対して、細菌株Ａ由来と判定された膜小胞由来のシークエンスリード（又はウイルス種Ｂ由来のＣＤＳを含む膜小胞由来のシークエンスリード）をマッピングし、有意に多くの膜小胞で検出率の高かったゲノム領域をその膜小胞における頻出ＤＮＡ領域とした（Ｈｙｐｅｒ－ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ：　ｐ値＜１．０－０６）。
　次に、上記頻出領域をクエリー配列とし、ＮＣＢＩに登録されている全ドメインにわたる生物のタンパク質配列（ｎｒ）をリファレンス配列として相同性検索を行った（ｄｉａｍｏｎｄ）。
　ヒットしたデータベース上のタンパク質コード配列の中から、同株もしくは同種が属する分類群（細菌の場合は門、ウイルスの場合は科）の配列を除く上位２０のタンパク質コード配列のアラインメントスコア（Ｍａｘ　Ｓｃｏｒｅ）の総和を計算し、それらの値が最小となった配列のみをバイオマーカー候補配列として選択した。
　次に、上記バイオマーカー候補配列を、健常者の膜小胞から得られたコンティグに対して相同性検索を行い、上位２０のタンパク質コード配列のアラインメントスコア（Ｍａｘ　Ｓｃｏｒｅ）の総和を計算し、それらの値が最小となる配列を選抜した。
　更に、健常者で検出された膜小胞の宿主細菌の中で、上記細菌株Ａと同分類群（門レベル）に属する細菌株を宿主とする膜小胞由来シークエンスリードを、細菌株Ａのゲノムに対してマッピングした。これら健常者由来膜小胞のシークエンスリードで検出された領域を、上記バイオマーカー候補配列から除外することにより、最終的な歯周病検出用のバイオマーカー配列（配列番号１～３）を選択した。
　図３は、歯周病患者に特異的に検出される領域（バイオマーカー配列）の決定手順を表す図である。
　図３（Ａ）は、歯周病患者サンプル由来の膜小胞のうち、ＴＭ７ｘ　ｓｐ９００５５５２６５　由来と判定された膜小胞内部の塩基配列を参照配列（ＴＭ７ｘ　ｓｐ９００５５５２６５のゲノム配列）にマップさせた結果の一例を表す図である。図３（Ａ）の縦軸は個々の膜小胞を表し、横軸は、ゲノム配列上の位置を表す。
　また、図３（Ｂ）のヒートマップは、図３（Ａ）において、高頻度に検出されたゲノム領域を表している。横軸は、ゲノム配列上の位置を表す。
　これに対し、図３（Ｃ）は、健常者由来の膜小胞のうちＴＭ７ｘ　ｓｐ９００５５５２６５が含まれる、Ｐａｔｅｓｃｉｂａｃｔｅｒｉａ門由来と判定された膜小胞を参照配列（ＴＭ７ｘ　ｓｐ９００５５５２６５のゲノム配列）にマップさせたものである。縦軸、及び、横軸は、図３（Ａ）と同様である。
　図３（Ｄ）のヒートマップは、図３（Ｃ）において、高頻度に検出されたゲノム領域を表している。横軸は、ゲノム配列上の位置を表す。
　図３（Ｅ）は、上記図３（Ｂ）、図３（Ｄ）の比較から、歯周病患者に特異的に検出されたゲノム領域をマップしたものである。このそれぞれが、バイオマーカー配列となる。
　ウイルス配列の場合も同様に、健常者で検出されたウイルス由来配列の中でもウイルスＢと同分類群（科レベル）に属するウイルス由来ＣＤＳを含む膜小胞由来シークエンスリードを、ウイルスＢのゲノムに対してマッピングした。健常者由来膜小胞のシークエンスリードで検出された領域は無かったため、上記で得られたバイオマーカー候補配列をそのままバイオマーカー配列とした（配列番号４）。これらの配列のうち連続した１０００ｂｐ以上のＤＮＡ領域を対象とした。
　図４は、歯周病患者に特異的に検出される領域（バイオマーカー配列）の決定手順を表す図である。
　図４（Ｂ）は、歯周病患者サンプル由来の膜小胞のうち、Ｐｏｄｖｉｒｉｄａｅ　ｃｔＵｉＢ３由来と判定されたＣＤＳ領域を含む膜小胞内部の塩基配列を参照配列（ｃｔＵｉＢ３のゲノム配列）にマップさせた結果の一例を表す図である。図４（Ｂ）の縦軸は個々の膜小胞を表し、横軸は、ゲノム配列上の位置を表す。
　また、図４（Ａ）は、領域ごとの検出頻度を表し、図４（Ｃ）のヒートマップは、図４（Ａ）において、高頻度に検出されたゲノム領域を表している。いずれも、横軸は、ゲノム配列上の位置を表す。このゲノム領域がバイオマーカー配列となる。
［プライマー配列、オリゴヌクレオチドプローブ配列の選定］
　得られたバイオマーカー配列の中から、プローブ法（５′－ヌクレアーゼ法）によるｑＰＣＲでの検出に適した１００ｂｐ程度の配列を複数選択した（配列番号５～８（細菌由来）、配列番号９～１１（ウイルス由来））。
　この対象配列の選択ならびにプライマー配列、オリゴヌクレオチドプローブ配列の設計にあたっては、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＰｒｉｍｅｒ　Ｑｕｅｓｔ（登録商標）Ｔｏｏｌ　（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｇ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒｑｕｅｓｔ）を用いた
　この対象配列を増幅産物に含むよう設計されたプライマー（対）とプローブを用いて、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓブランドが提供する、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ」を組わせることで、唾液サンプルを用いた歯周病患者特有の膜小胞由来塩基配列、すなわち、歯周病の検出を行うことができる。
［配列番号１：歯周病マーカー配列（細菌由来）］
ＧＣＡＴＡＣＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＣＡＴＣＴＴＧＴＣＣＧＡＣＣＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＡＣＧＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣＡＧＡＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＡＧＴＣＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＣＧＧＡＡＡＣＴＣＣＧＡＣＡＣＴＡＧＣＧＴＧＡＴＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＣＡＧＴＡＡＴＴＡＧＡＡＧＣＧＴＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＧＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＣＴＣＴＡＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＣＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＡＴＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＧＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＣＧＡＣＧＡＣＡＣＴＡＡＡＣＣＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＣＡＡＴＡＴＣＡＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＡＡＴＧＴＣＧＡＣＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＣＧＧＣＡＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＡＣＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＴＴＡＡＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧＡＧＴＴＴＧＡＣＡＣＡＡＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＡＣＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＴＣＡＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＧＴＧＴＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＴＧＡＧＣＧＡＣＣＡＴＴＴＧＴＧＣＧＣＴＴＣＴＴＡＧＧＡＡＣＧＣＴＧＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＴＣＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＣＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴＴＴＣＡＡＡＴＡＧＣＣＡＡＣＣＧＣＴＴＧＡＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＧＣＣＣＣＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＣＣＡＧＧＴＡＡＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＡＣＣＴＴＡＡＣＧＣＣＧＴＣＡＡＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴＡＡＴＣＡＡＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＣＧＡＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＧＧＣＡＣＧＣＧＡＡＴＡＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＡＴＡＧＣＴＣＧＡＡＴＧＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＡＣＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣＧＡＡＴＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴＣＧＣＧＣＴＴＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＣＧＴＣＡＡＣＡＣＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＣＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＣＡＧＴＣＡＣＴＣＧＣＣＣＡＴＣＣＡＴＡＡＧＴＡＣＴＧＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＴＴＣＧＴＣＧＣＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＴＣＧＣＡＴＡＴＣＧＣＴＧＡＣＧＣＣＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＧＡＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＣＡＡＴＣＧＣＡＴＡＡＧＴＧＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＴＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＧＣＧＡＡＣＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＡＧＣＧＣＴＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＴＴＡＴＣＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＧＣＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡＧＣＣＧＡＡＧＴＴＴＧＴＡＧＧＧＴＴＧＡＣＴＡＧＣＧＣＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＴＧＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＴＧＡＣＣＣＡＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＴＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＡＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＧＴＴＡＧＴＣＧＡＧＣＣＧＴＡＴＣＴＡＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＣＣＧＡＡＣＧＡＣＴＣＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧＴＧＡＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＣＣＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡＣＧＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＴＴＧＡＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＧＡＡＣＴＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＣＧＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＡＡＡＣＧＣＴＴＣＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＴＣＡ
［配列番号２：歯周病マーカー配列（細菌由来）］
ＣＣＡＧＣＧＣＣＴＧＴＣＣＧＴＣＴＡＧＣＧＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣＧＧＡＣＣＧＣＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＡＴＴＡＡＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＧＴＴＡＡＧＡＣＴＡＡＴＣＣＣＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＣＧＴＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＴＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＡＴＣＣＣＧＴＣＧＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧＡＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＣＣＧＣＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＴＣＣＡＡＡＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＣＧＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＴＡＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＣＧＴＡＣＴＴＴＧＣＧＧＧＡＡＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＧＧＴＴＣＡＧＣＧＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＡＧＡＣＡＡＣＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＴＡＴＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＴＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＴＡＡＴＴＴＴＣＡＴＣＡＡＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＧＧＡＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＴＴＣＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＣＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＡＡＡＣＣＴＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＴＡＡＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧＣＣＡＣＧＣＴＴＧＧＣＧＴＴＴＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＴＣＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴＣＧＧＣＧＡＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＴＴＣＣＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＣＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＣＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＧＴＧＴＡＡＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＧＡＣＧＣＴＴＣＡＴＡＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＧＡＣＴＡＣＣＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＴＧＣＣＧＴＣＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＴＡＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＣＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＡＴＧＡＧＣＧＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＧＴＴＧＣＧＴＴＴＣＧＧＧＡＡＡＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＴＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＡＴＡＡＣＴＧＣＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＴＴＴＧＴＣＴＣＧＣＧＣＣＣＴＡＧＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＣＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＡＣＣＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＡＣＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＴＣＧＣＧＧＡＡＴＴＡＣＴＡＣＧＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＡＣＣＧＴＣＧＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＡＡＡＣＧＴＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＣＧＡＡＧＣＧＴＣＧＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＧＴＴＧＣＣＧＴＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＧＣＡＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＴＣＧＴＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＡＧＡＣＴＡＧＣＡＧＴＴＡＣＧＧＡＣＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＡＣＧＴＣＣＡＣＴＡＧＧＡＡＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣＡＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＧＡＣＣＧＡＴＣＧＧＡＴＡＧＡＴＴＣＡＴＣＡＡＣＡＴ
［配列番号３：歯周病マーカー配列（細菌由来）］
ＴＣＧＣＧＴＡＡＴＴＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＴＡＣＧＴＡＡＴＴＧＣＧＡＴＣＡＴＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＣＧＧＣＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＣＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＣＧＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＡＣＴＣＡＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＣＡＣＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＡＣＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＴＴＣＧＴＧＴＧＴＡＡＴＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＣＧＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＡＴＣＡＴＣＧＴＡＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＣＴＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＧＡＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴＧＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＡＴＴＴＣＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＧＣＴＣＴＧＡＡＡＣＧＣＣＡＡＴＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＡＡＴＴＣＧＴＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＡＴＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＣＴＧＴＧＣＧＧＴＴＧＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＧＣＡＣＧＡＴＴＡＧＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＧＴＣＧＡＴＧＡＴＡＴＡＡＣＧＣＡＴＡＡＡＴＡＧＣＧＡＴＴＣＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＣＧＴＣＣＡＧＴＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＴＴＧＴＣＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＣＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＴＡＧＡＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＴＡＡＴＣＴＴＧＣＧＡＡＴＣＡＴＡＧＣＧＴＧＡＧＴＣＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＴＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＣＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＴＴＴＣＡＴＣＧＡＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＧＣＴＡＡＴＴＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＧＡＴＴＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＴＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＣＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＧＧＴＣＡＧＡＴＡＧＴＣＴＧＧＣＧＴＣＡＡＡＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＴＧＣＡＡＴＡＧＡＡＣＧＧＴＣＴＴＡＡＧＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＡＡＣＡＣＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＴＧＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＧＴＣＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＡＴＣＧＣＧＴＣＴＴＣＡＴＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＡＡＡＧＡＡＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＡＴＴＣＧＴＡＡＡＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＧＴＣＴＴＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴＡＡＴＡＡＣＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＧＣＧＣＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＣＡＡＡＣＧＡＡＴＣＧＴＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＣＧＴＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＧＣＧＴＣＣＡＧＣＡＧＴＣＧＧＣＧＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＴＴＧＴＧＣＣＡＡＣＡＴＡＡＣＡＧＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＣＣＡＧＴＡＧＣＧＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＡＡＡＡＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＴＴＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＴＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＴＡＡＡＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＡＴＣＧＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＡＡＣＧＡＣＧＣＡＧＣＣＣＴＡＴＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＴＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＡＣＧＡＣＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＣＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＴＣＧＣＴＴＣＡＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧＣＧＡ
［配列番号４：歯周病マーカー配列（ウイルス由来）］
ＡＴＴＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴＡＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴＡＴＣＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＴＡＣＧＡＧＣＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＧＣＡＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＴＣＴＡＴＡＧＧＴＣＴＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＣＴＡＣＴＧＴＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＴＴＡＧＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＡＣＣＴＴＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＧＧＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＡＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＡＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＧＴＡＡＧＴＣＧＴＴＣＴＴＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＣＧＡＡＴＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＡＴＡＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＡＡＧＡＧＴＡＴＣＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＧＴＣＴＴＡＣＣＴＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＣＴＡＣＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＡＴＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＡＡＴＡＧＧＡＧＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＴＣＧＧＣＡＧＡＣＣＴＡＡＧＴＧＧＧＴＣＧＡＴＴＣＣＴＣＴＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＧＴＴＧＴＡＴＡＣＣＡＡＴＣＣＡＴＡＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＧＡＣＴＡＴＡＧＡＡＡＴＣＴＣＣＡＴＡＣＴＣＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＧＣＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＴＴＴＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＣＴＡＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＣＣＡＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＴＧＴＡＡＧＧＴＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡＡＧＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＴＧＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＡＡＧＧＡＣＴＡＴＴＧＴＴＡＣＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡＴＡＡＴＡＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＣＴＡＴＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＡＡＴＣＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＴＡＣＧＣＴＴＧＴＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣＴＧＣＧＴＡＴＴＧＣＴＧＴＡＡＧＴＡＡＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＴＡＣＧＧＡＴＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＣＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＣＧＴＡＴＴＣＴＧＴＧＴＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＡＧＣＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＣＧＴＴＧＡＧＣＴＡＡＴＧＣＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＡＧＴＡＣＣＴＡＡＴＣＣＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＴＴＡＧＣＴＡＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＴＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＡＴＣＴＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＣＧＴＣＴＴＧＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＴＴＴＡＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＣＧＣＣＣＡＡＴＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＧＴＡＴＧＧＧＴＴＡＣＣＡＧＣＧＴＡＴＡＣＡＴＣＧＧＧＡＧＴＧＴＧＴＡＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＴＴＧＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＧＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＣＴＡＴＡＣＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＡＴＡＣＧＴＡＴＴＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＴＡＴＴＧＴＡＧＴＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣＴＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴＡＧＧＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＴＣＡＣＴＣＴＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＡＧＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＴＧＧＴＣＴＣＴＡＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＡＴＴＧＴＡＣＴＧＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＡＴＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＣＣＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧＴＡＴＣＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＴＴＴＣＴＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＣＧＣＴＴＡＧＣＡＴＡＴＡＡＣＡＣＡＴＣＡＴＣＴＴＧＡＧＴＴＧＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴＧＡＴＴＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＣＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＣＴＡＴＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＡＴＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＡＡＴＣＣＴＣＣＡＡＣＴＧＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡＡＴＡＧＴＣＧＡＡＣＣＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＡＧＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＴＣＣＧＡＡＡＣＣＴＡＴＡＣＣＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡＣＡＣＴＣＴＴＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＡＴＴＡＣＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＡＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＴＧＣＧＴＴＡＴＣＴＣＣＴＡＡＣＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＧＴＣＴＡＴＡＣＴＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＣＡＴＧＴＴＡＣＧＴＣＴＴＧＡＴＧＣＧＴＡＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＴＡＣＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＡＴＴＴＡＧＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＣＴＴＡＣＣＴＣＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＡＧＣＴＣＴＡＧＧＡＡＴＴＧＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＴＡＴＣＴＣＴＡＴＧＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＡＡＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＴＡＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＧＣＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＡＧＡＡＣＴＣＴＴＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＡＧＴＧＴＴＧＴＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＡＡＣＡＴＴＡＣＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＧＡＡＣＴＣＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＣＴＡＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＧＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＧＴＣＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＡＡＣＡＴＡＡＣＴＴＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＧＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＡＧＴＴＴＡＡＣＧＴＣＴＧＡＣＡＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＡＧＡＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＡＣＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＣＣＡＧＴＡＴＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＡＣＧＡＧＧＴＣＴＧＡＧＡＡＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＴＴＡＴＡＧＴＴＧＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＡＴＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＴＣＣＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＣＴＴＡＡＡＣＧＴＣＴＴＡＡＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＴＣＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＴＡＡＴＴＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＡＡＴＴＴＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＧＡＧＴＡＴＣＴＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＡＡＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＴＣＴＡＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＣＴＡＴＡＴＡＣＴＧＴＡＴＴＧＴＡＡＡＴＡＡＡＣＴＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＴＡＡＴＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＣＣＡＡＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＡＴＴＣＴＧＡＧＴＴＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＡＣＧＴＧＴＡＣＡＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＡＣＴＡＧＴＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＣＴＡＴＡＡＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＣＴＴＡＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴＡＡＧＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＴＴＣＧＧＣＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＴＡＴＡＴＣＴＡＴＡＡＡＣＡＴＣＣＧＡＡＴＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＣＴＡＴＡＣＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＴＡ
［配列番号５：ＤＮＡ領域（細菌由来）］
ＣＴＧＧＧＴＣＧＣＧＴＧＴＡＡＡＧＴＡＴＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＧＡＴＡＧＡＡＣＧＧＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＴＣＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧＡＡＣＡＣＣＡ
［配列番号６：ＤＮＡ領域（細菌由来）］
ＧＣＡＴＴＡＡＣＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＣＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＣＡＧＴＣＣＣＡＴＴＧＣＣＴＴＡＧＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＣＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＧＣＣＧ
［配列番号７：ＤＮＡ領域（細菌由来）］
ＡＣＡＣＣＡＧＣＣＧＡＣＴＣＴＣＴＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＡＣＧＴＴＣＧＴＧＣＣＧＴＣＣＧＡＧＴＴＧＧＴＣＡＡＡＴＡＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣ
［配列番号８：ＤＮＡ領域（細菌由来）］
ＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＴＣＧＴＣＴＴＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＴＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＡＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧ
［配列番号９：ＤＮＡ領域（ウイルス由来）］
ＡＡＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＧＴＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＴＣＣＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＴＴＧ
［配列番号１０：ＤＮＡ領域（ウイルス由来）］
ＧＣＡＡＣＴＣＴＡＧＣＡＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＣＡＣＧＣＴＴＡＧＣＡ
［配列番号１１：ＤＮＡ領域（ウイルス由来）］
ＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡＡＴＡＧＴＣＧＡＡＣＣＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＡＧＣＴＡＡＧＣＡＣ

Claims (11)

  1. 　以下の（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
    （ｂ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
    （ｃ）配列番号１～４からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
  2. 　生物学的試料から抽出された膜小胞の塩基配列から、感染症を検出するためのマーカーである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 　前記感染症が、歯周病である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 　配列番号１～４からなる群より選択される塩基配列から設計されるプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキット。
  5. 　以下の（ｅ）～（ｎ）からなる群より選択される少なくとも１種の領域から設計されるプライマーセット、及び／又は、プローブを含むキット。
    （ｅ）配列番号３の６４１塩基から、７６８塩基までの領域（配列番号５）、
    （ｆ）配列番号２の９９２塩基から、１１２９塩基までの領域（配列番号６）
    （ｇ）配列番号２の１２２３塩基から、１３３８塩基までの領域（配列番号７）
    （ｈ）配列番号２の６９５塩基から、７９３塩基までの領域（配列番号８）
    （ｋ）配列番号４の３９３８塩基から、４０３０塩基までの領域（配列番号９）
    （ｍ）配列番号４の２３７７塩基から、２４８４塩基までの領域（配列番号１０）
    （ｎ）配列番号４の２７０５塩基から、２８０６塩基までの領域（配列番号１１）
  6. 　以下の（ｐ）～（ｔ）からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ｐ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列
    （ｒ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に対して、８０％以上の相同性を有する塩基配列
    （ｔ）配列番号５～１１からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列に相補的な塩基配列からなる核酸に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
  7. 　感染症の診断方法であって、
    　生物学的試料から抽出された膜小胞の塩基配列を解析し、請求項１又は請求項６に記載のポリヌクレオチドの塩基配列、又は、その一部の存否を確認することと、を含む、診断方法。
  8. 　更に、被験者から前記生物学的試料を採取することを含む、請求項７に記載の診断方法。
  9. 　前記感染症が歯周病である、請求項７又は８に記載の診断方法。
  10. 　感染症の診断方法であって、
    　生物学的試料から抽出された膜小胞の塩基配列を解析し、請求項４又は５に記載のキットを用いて標的核酸領域の増幅を検出することで、感染の有無を診断するための情報を得る、診断方法。
  11. 　更に、被験者から前記生物学的試料を採取することを含み、
    　前記感染症が歯周病である、請求項１０に記載の診断方法。
PCT/JP2023/029165 2022-09-01 2023-08-09 ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法 WO2024048236A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022139056 2022-09-01
JP2022-139056 2022-09-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024048236A1 true WO2024048236A1 (ja) 2024-03-07

Family

ID=90099274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/029165 WO2024048236A1 (ja) 2022-09-01 2023-08-09 ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024048236A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022102246A1 (ja) * 2020-11-11 2022-05-19 国立研究開発法人物質・材料研究機構 細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022102246A1 (ja) * 2020-11-11 2022-05-19 国立研究開発法人物質・材料研究機構 細胞で産生された膜小胞に由来する塩基配列を解析する方法、その装置、及び、そのプログラム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOR B., BEDREE J.K., SHI W., MCLEAN J.S., HE X.: "Saccharibacteria (TM7) in the Human Oral Microbiome", JOURNAL OF DENTAL RESEARCH, INTERNATIONAL ASSOCIATION FOR DENTAL RESEARCH, US, vol. 98, no. 5, 1 May 2019 (2019-05-01), US , pages 500 - 509, XP093143894, ISSN: 0022-0345, DOI: 10.1177/0022034519831671 *
DATABASE NUCLEOTIDE ANONYMOUS : "MAG TPA_asm: Caudoviricetes sp. isolate ctUiB3, partial genome", XP093143897, retrieved from NCBI *
HAN PINGPING, BARTOLD PETER MARK, SALOMON CARLOS, IVANOVSKI SASO: "Salivary Small Extracellular Vesicles Associated miRNAs in Periodontal Status—A Pilot Study", INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES, MOLECULAR DIVERSITY PRESERVATION INTERNATIONAL (MDPI), BASEL, CH, vol. 21, no. 8, Basel, CH , pages 2809, XP093143899, ISSN: 1422-0067, DOI: 10.3390/ijms21082809 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110541022B (zh) 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒
JP6430826B2 (ja) 無細胞病原体特異的核酸を検出する方法およびキット
US10889868B2 (en) Exosomal biomarkers diagnostic of tuberculosis
US20230257822A1 (en) Methods for detecting tissue damage, graft versus host disease, and infections using cell-free dna profiling
WO2019075868A1 (zh) 一种检测布鲁菌感染的方法及其应用
CN113088579B (zh) 一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法
CN111733227B (zh) 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用
US7381547B2 (en) Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR
CN111662959A (zh) 一种真菌高通量快速检测方法
WO2024048236A1 (ja) ポリヌクレオチド、キット、及び、診断方法
US20240200151A1 (en) Metagenomic next-generation sequencing of microbial cell-free nucleic acids in subjects with lyme disease
CN116479150A (zh) 单管一步法RPA-Cas12a/Cas13a快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
US20210207125A1 (en) Method of isolating nucleic acids for long sequencing reads
JP2020534859A (ja) 緑膿菌による肺定着／感染の発現リスクを予測する方法
Hajia et al. Is PCR assay reliable for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis
WO2021211802A1 (en) Digital pcr assays for detection of pathogens
WO2021087174A1 (en) Method and kit for direct detection of bacterial blood diseases
CN114107454A (zh) 基于宏基因/宏转录组测序的呼吸道感染病原检测方法
WO2023042673A1 (ja) 膜小胞の検出方法、バイオマーカー配列の探索方法、膜小胞検出装置、バイオマーカー配列探索装置、プログラム、コンピュータ、及び、疾病バイオマーカーの探索方法
Cheng et al. Cell-free DNA Tissues-of-Origin Profiling to Predict Graft versus Host Disease and Detect Infection after Hematopoietic Cell Transplantation
CN114561393B (zh) 一种特异性识别鸟-胞内分枝杆菌复合群的dna适配子及其筛选方法和应用
CN115029429B (zh) 炎症相关蛋白联合在预测art治疗敏感性中的应用
CN112410343B (zh) 基于crispr的试剂盒及其应用
JP2021500921A (ja) Ｆｉｍｈ遮断剤の治療効率を評価するための新規ツール
RU2776163C1 (ru) Способ выявления ДНК бактерии Mycobacterium tuberculosis с помощью изотермической петлевой амплификации

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23860002

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1