CN112390856A - 一种具有生物活性的多肽eep2和二倍体的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有生物活性的多肽EEP2和二倍体的固相合成方法，即Tyr‑Ala‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Pro‑Pro‑Leu和Tyr‑Ala‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Pro‑Pro‑Leu‑Arg‑Arg‑Tyr‑Ala‑Ala‑Pro‑Pro‑Ser‑Pro‑Pro‑Leu的制备方法。采用此固相接肽合成方法，反应副产物少，纯化难度低，产量较高，反应操作简单，适合工业自动化生产。主要合成步骤：以Fmoc‑Leu‑Wang树脂为原料，将Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Ser（Y）‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Boc‑Tyr（Y）‑OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接，使用HPLC进行纯化，得到生物活性多肽EEP2。二倍体合成方法与EEP2合成策略相似，仅进行重复序列氨基酸依次连接。本发明操作简单，生产成本低，环境污染低，便于实施工业自动化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽EEP2和二倍体的制备方法，具体涉及多肽EEP2和二倍体的固相合成方法。
背景技术
EEP2是由9个氨基酸组成的多肽，结构式为：
EEP2是一种HLA-A2限制性ECM1特异性的CTL表位肽， 而EEP2二倍体是使用两个精氨酸将两个EEP2进行连接的CTL表位肽。两者均可与人HLA-A2分子的结合位点进行结合、可激活ECM1特异性的CTL细胞的表位肽，可用于研制靶向抗原ECM1的治疗性肽疫苗，该发现已申请中国发明专利，申请号201710050501.4；委托蛋白合成公司采用标准Fmoc方案，应用美国PE公司生产的ABI43IA型多肽合成仪进行多肽的合成，简述如下：按照多肽序列使肽链从羧基端向氨基端延伸，合成后，选用TFA/DCM进行切割，表位肽收集液在常温下减压干燥至1-2mL，然后用至少50 mL预冷乙醚沉淀，然后抽滤，得到的多肽粗产品。然而本课题组研究发现，本技术领域公知现有的标准Fmoc固相合成方法合成该多肽，存在合成副产物多、不易分离纯化、反应步骤多的问题。我们在标准的Fmoc合成策略上进行了改良，采用含有其他保护基的氨基酸原料进行合成，减少了反应步骤，提高了多肽的产率。
发明内容
本发明的目的在于提供具有生物活性的多肽EEP2及其二倍体的一种合成方法，解决了采用液相合成法产率低，反应操作复杂，生产周期长等问题；同时提供了一种反应条件温和，适合工业化生产多肽EEP2的固相合成方法。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
Fmoc:芴甲氧羰基
Fmoc-AA：芴甲氧羰基保护的氨基酸
Boc：叔丁氧羰基
DIC：N，N’—二异丙基碳二亚胺
HOAt：1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
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HOBt：1-羟基苯并三唑
6-NO2-HOBt：1-羟基6-硝基苯并三唑
6-CF3-HOBt：1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑
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Pro：脯氨酸
Ser：丝氨酸
Leu：亮氨酸
Ala：丙氨酸
Tyr：酪氨酸
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
MeOH：甲醇
TFA：三氟乙酸
Pip：六氢吡啶
Trt：三苯甲基
OPmb：五甲基苄酯
tBu：叔丁基
OMob：对甲氧苄酯
Aoc：叔戊氧羰基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃
本发明的技术解决方案是：
一种多肽EEP2的固相合成方法，其步骤如下：
步骤1、以Fmoc-Leu-Wang 树脂为原料，采用Fmoc固相合成策略将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser（Y）-OH、Fmoc-Ala-OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接；
步骤2、去除N端Fmoc，与Boc-Tyr（Y）-OH进行连接；
步骤3、用裂解试剂切割肽树脂，无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
步骤4、经制备型HPLC进行分离纯化、冻干得到多肽EEP2：
步骤5、采用质谱鉴定多肽EEP2。
所述步骤1和2中，使用多肽偶联剂：DIC+X,其中X=HOAt、6-HOAt、HOBt、6-NO2-HOBt、6-CF3-HOBt、6-Cl-HOBt等。缩合反应温度维持在0~30℃，反应时间为1~4h。
所述步骤1和2中，脱出Fmoc的试剂为Pip和DMF，其体积比（Pip：DMF=1：10~1：2），室温反应0.5~2h。
所述的Fmoc-Ser（Y）-OH、Boc-Tyr（Y）-OH的保护基Y为Trt、OPmb、tBu、OMob、Aoc、Pbf等。
所述步骤3中，脱出Boc和Y的裂解肽试剂均为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H2O=1：1~9：1），室温反应0.5~2h。沉淀粗肽时无水乙醚体积为8~12倍
所述步骤1和2中，脱保护及缩合反应的检测方法如下：检测时分别取三滴5%茚三酮无水乙醇溶液和三滴80%苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒，100℃反应5min，观察颜色变化，来确定脱保护或缩合反应是否完全。
上述多肽EEP2固相合成方法中，裂解肽树脂试剂为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H2O=1：1~10：1），室温反应0.5~2h，沉淀，离心沉淀得到粗肽。
所述步骤4中，使用高效液相色谱进行纯化，采用C18制备柱，流动相为V（0.1%TFA的乙腈溶液）：V水=2：8；流速为：10ml/min；检测波长为254nm，梯度洗脱得到EEP2。
一种多肽EEP2二倍体的固相合成方法，其步骤如下：
步骤1、以Fmoc-Tyr（Y）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Y）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂为原料，采用Fmoc固相合成策略，以DIC/X为多肽偶联剂，将Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser（Y）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接；
步骤2、去除N端Fmoc，与Boc-Tyr（Y）-OH进行连接；
步骤3、用裂解试剂切割肽树脂，无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
步骤4、经制备型HPLC进行分离纯化、冻干得到多肽EEP2：
步骤5、采用质谱鉴定多肽。
所述步骤1和2中，使用多肽偶联剂：DIC+X,其中X=HOAt、6-HOAt、HOBt、6-NO2-HOBt、6-CF3-HOBt、6-Cl-HOBt、HODhbt等。缩合反应温度维持在0~30℃，反应时间为1~4h。
所述步骤1和2中，脱出Fmoc的试剂为Pip和DMF，其体积比（Pip：DMF=1：10~1：2），室温反应0.5~2h。
所述的Fmoc-Ser（Y）-OH、Boc-Tyr（Y）-OH的保护基Y为Trt、OPmb、tBu、OMob、Aoc、Pbf等。
所述步骤3中，脱出Boc和Y的裂解肽试剂均为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H2O=1：1~9：1），室温反应0.5~2h。沉淀粗肽时无水乙醚体积为8~12倍
所述步骤1和2中，脱保护及缩合反应的检测方法如下：检测时分别取三滴5%茚三酮无水乙醇溶液和三滴80%苯酚无水乙醇溶液与待检测树脂颗粒，100℃反应5min，观察颜色变化，来确定脱保护或缩合反应是否完全。
上述多肽EEP2固相合成方法中，裂解肽树脂试剂为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H2O=1：1~10：1），室温反应0.5~2h，沉淀，离心沉淀得到粗肽。
所述步骤4中，使用高效液相色谱进行纯化，采用C18制备柱，流动相为V（0.1%TFA的乙腈溶液）：V水=3：7；流速为：10ml/min；检测波长为230nm，梯度洗脱得到EEP2二倍体。
有益技术效果：本发明采用固相合成法，所需设备简单，利于自动化生产。本发明具有的优点如下：（1）采用Y保护的Ser和Tyr进行接肽反应的原料，反应副产物少，且在裂解肽树脂试剂中易脱保护，操作简便，反应效率高；（2）N端氨基酸采用Boc-Tyr（Y）-OH为原料，Boc可在裂解肽树脂试剂中脱去，较使用Fmoc-Tyr（Y）-OH为原料省去一步脱Fmoc的反应；（3）反应条件温和；（4）肽偶联剂为DIC+X，X=HOAt、6-HOAt、HOBt、6-NO2-HOBt、6-CF3-HOBt、6-Cl-HOBt、HODhbt等室温即可反应完全。（5）合成操作简单，易实现工业自动化生产。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来对本发明进行阐述。
实施例
实施例1 Fmoc-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加Fmoc-Leu-Wang树脂（替代度0.308mmol/g，0.62mmol）装入固相反应管中，DMF洗2次，再加入20mlDMF溶胀30min。30%Pip的DMF溶液脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例2 Fmoc-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例3 Fmoc-Ser(Trt)-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ser（Trt）-OH（0.7g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2.5h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例4 Fmoc-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例5 Fmoc-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例6 Fmoc-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ala-OH（0.38g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例7 Fmoc-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ala-OH（0.38g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例8 Boc-Tyr（tBu）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Boc-Tyr（tBu）-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例9 Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu的合成
将Boc-Tyr（tBu）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂转移到切肽瓶中，加入TFA的水溶液，冰浴反应2h。过滤，抽干，滤液加无水乙醚中，离心，用无水乙醚洗三次，离心得到沉淀，干燥后得到粗肽。溶解粗肽，进行过滤，滤液经制备型C18柱进行纯化，收集所需流出液，浓缩，然后冻干，获得多肽EEP2 0.413g（收率：73%，纯度：97.2%）。
实施例10 Fmoc-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-wang树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Tyr（Trt）-OH（0.79g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例11 Fmoc-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Arg（Pbf）-OH（0.80g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例12 Fmoc-Arg（Pbf）-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）- Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Arg（Pbf）-OH（0.80g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例13 Fmoc-leu-Arg（Pbf）-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Arg（Pbf）-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Leu-OH（0.43g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例14 Boc-Tyr（tBu）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Arg（Pbf）-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro -Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Leu-Arg（Pbf）-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ser(Trt)-OH（0.70g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ala-OH（0.38g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ala-OH（0.38g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。加30%Pip的DMF溶液，脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Boc-Tyr（tBu）-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
实施例15 Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser -Pro-Pro-Leu的合成
将Boc-Tyr（tBu）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Arg（Pbf）-Arg（Pbf）-Tyr（Trt）-Ala-Ala-Pro -Pro-Ser（Trt）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂转移到切肽瓶中，加入TFA的水溶液，冰浴反应2h。过滤，抽干，滤液加无水乙醚中，离心，用无水乙醚洗三次，离心得到沉淀，干燥后得到粗肽。溶解粗肽，进行过滤，滤液经制备型C18柱进行纯化，收集所需流出液，浓缩，然后冻干，获得多肽EEP2二倍体0.302g（收率：23%，纯度：89.2%）。
对比例
例1 Fmoc-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加Fmoc-Leu-Wang树脂（替代度0.308mmol/g，0.62mmol）装入固相反应柱中，DMF洗2次，再加入20mlDMF溶胀30min。30%Pip的DMF溶液脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例2 Fmoc-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例3 Fmoc-Ser -Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ser-OH（0.40g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2.5h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例4 Fmoc-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例5 Fmoc-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Pro-OH（0.42g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应2h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例6 Fmoc-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ala-OH（0.38g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例7 Fmoc-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Ala-OH（0.38g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例8 Boc-Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂的合成
加20%Pip的DMF溶液对Fmoc-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
加入5mlDMF溶解Fmoc-Tyr-OH（0.50g，1.23mmol）和HOBt（0.17g，1.23mmol），冰浴10分钟，加入DIC（0.20ml，1.23mmol），预活化5min，将活化好的溶液加入固相反应管中，反应3h，抽干反应液，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
例9 Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu的合成
加30%Pip的DMF溶液对Fmoc-Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂脱保护两次（时间分别为5min和20min），DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
将Tyr-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Pro-Pro-Leu-Wang 树脂转移到切肽瓶中，加入TFA的水溶液，冰浴反应2h。过滤，抽干，滤液加无水乙醚中，离心，用无水乙醚洗三次，离心得到沉淀，干燥后得到粗肽。溶解粗肽，进行过滤，滤液经制备型C18柱进行纯化，收集所需流出液，浓缩，然后冻干，获得多肽EEP2 0.260g（收率：46%，纯度：95.6%）。
表1 改良Fmoc合成策略与标准Fmoc合成策略合成EPP2 的对比
| 名称 | 纯度 | 产率 |
| 改良Fmoc合成策略 | 97．2% | 73% |
| 标准Fmoc合成策略 | 95.6% | 46% |
序列表
<110> 辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司
<120> 一种具有生物活性的多肽EEP2和二倍体的固相合成方法
<140> 2019107626305
<141> 2019－08－19
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu
1 5
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu Arg Arg Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Pro Pro Leu
1 5 10 15 20
Claims (16)
1.一种生物活性多肽EEP2的制备方法，包括如下步骤：
1）以Fmoc-Leu-Wang 树脂为原料，采用Fmoc固相合成策略，以DIC/X为多肽偶联剂，将Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser（Y）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接；
2）去除N端Fmoc，与 Boc-Tyr（Y）-OH进行连接；
3）用裂解试剂切割肽树脂，切肽试剂为TFA/H2O，过滤，滤液加入无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
4）经制备型HPLC，采用C18柱进行分离纯化，冻干得到多肽EEP2；
5）采用质谱鉴定多肽EEP2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：接肽反应温度维持在0~30℃，反应时间为1~4h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc反应温度在15~40℃，反应时间为0.5~2h。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc试剂为Pip和DMF，其体积比为1：10~1：2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：多肽偶联剂为DIC/X，其中X=HOAt、6-HOAt、HOBt、6-NO2-HOBt、6-CF3-HOBt、6-Cl-HOBt、HODhbt等。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：裂解肽树脂试剂为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H2O=1：1~10：1），室温反应0.5~2h，沉淀粗肽时无水乙醚体积为8~12倍，离心沉淀得到粗肽。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-Ser（Y）-OH、Boc-Tyr（Y）-OH的保护集团Y为Trt、OPmb、tBu、OMob、Aoc、Pbf等。
8.根据权利要求1所述纯化方法，其特征在于，流动相：V（0.1%TFA的乙腈溶液）：V水=2：8；流速为：10ml/min；检测波长为254nm，再经冻干得到白色终产物。
9.一种生物活性多肽EEP2二倍体的制备方法，包括如下步骤：
1）以Fmoc-Tyr（Y）-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser（Y）-Pro-Pro-Leu-Wang树脂为原料，采用Fmoc固相合成策略，以DIC/X为多肽偶联剂，将Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser（Y）-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH按EEP2的氨基酸排列序列依次进行连接；
2）去除N端Fmoc，与 Boc-Tyr（Y）-OH进行连接；
3）用裂解试剂切割肽树脂，切肽试剂为TFA/H2O，过滤，滤液加入无水乙醚沉淀，离心后得到粗肽；
4）经制备型HPLC，采用C18柱进行分离纯化，冻干得到多肽EEP2；
5）采用质谱鉴定多肽EEP2。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：接肽反应温度维持在0~30℃，反应时间为1~4h。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc反应温度在15~40℃，反应时间为0.5~2h。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：脱Fmoc试剂为Pip和DMF，其体积比为1：10~1：2。
13.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：多肽偶联剂为DIC/X，其中X=HOAt、6-HOAt、HOBt、6-NO2-HOBt、6-CF3-HOBt、6-Cl-HOBt等。
14.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：裂解肽树脂试剂为TFA的水溶液，其体积比（TFA：H2O=1：1~10：1），室温反应0.5~2h，沉淀粗肽时无水乙醚体积为8~12倍，离心沉淀得到粗肽。
15.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述的Fmoc-Ser（Y）-OH、Boc-Tyr（Y）-OH的保护集团Y为Trt、OPmb、tBu、OMob、Aoc、Pbf等。
16.根据权利要求9所述纯化方法，其特征在于，流动相：V（0.1%TFA的乙腈溶液）：V水=3：7；流速为：10ml/min；检测波长为230nm，再经冻干得到白色终产物。
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