CN110903352A

CN110903352A - 一种西曲瑞克的制备方法

Info

Publication number: CN110903352A
Application number: CN201911376082.9A
Authority: CN
Inventors: 刘宝生; 张巍; 李湘; 徐琪
Original assignee: Chinese Peptide Co
Current assignee: Chinese Peptide Co
Priority date: 2019-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-03-24

Abstract

本发明涉及一种西曲瑞克的制备方法，具体采用了一种固液相结合的合成方法。按照西曲瑞克序列从C端到N端的顺序，在偶联试剂的作用下利用固相合成法逐个连接1‑9片段，再将1‑9片段全保护切割后与与DAla‑NH₂.HCl在液相中进行片段缩合，得到全保护的西曲瑞克，再用裂解液切割，再以冰乙醚沉淀切割液得到西曲瑞克粗肽，最后经过反相高效液相色谱纯化得到西曲瑞克成品，本发明具有方法简单、适宜工业生产、生产效率高等优点。

Description

一种西曲瑞克的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种西曲瑞克的制备方法，具体采用了一种固液相结合的合成方法。

背景技术

西曲瑞克(商品名Cetrotide)是一种有效的黄体酮释放激素抑制素(LH-RH)受体拮抗剂，它能控制卵巢的刺激作用，预防不成熟卵泡过早排出，帮助受孕。并可用于治疗乳腺癌和妇科癌，子宫内膜异位症，性早熟，子宫肌瘤，卵巢雄激素过多和经前综合症。

中文名称：西曲瑞克

英文名称：Cetrorelix acetate

序列:Ac-D2Nal¹-D4Cpa²-D3Pal³-Ser⁴-Tyr⁵-DCit⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-DAla¹⁰-NH₂

分子式：C₇₀H₉₂ClN₁₇O₁₄

分子量:：1431.06

目前已知的合成西曲瑞克的方法当中，以固相合成法居多，从C端开始按照序列在树脂上依次进行氨基酸的连接：

专利CN101284863B公开了西曲瑞克的一种固相合成方法：以Fmoc-Linker-MBHA-Resin作起始原料，按照序列依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的十肽树脂，进行乙酰化反应，然后进行切割获得醋酸西曲瑞克，并经C18或C8色谱柱进行分离纯化，再冷冻干燥，获得西曲瑞克醋酸盐或三氟醋酸盐。所述氨基酸偶联反应温度为35-50摄氏度。这个方法会产生比较多的消旋杂质，影响产品质量。

专利CN101863960B公开了一种西曲瑞克的制备方法。该方法以Boc氨基酸及王树脂为原料，逐个加入C端氨基酸，再以10wt％的氨水进行氨解，然后以H₂和Pd为脱保护试剂，制得西曲瑞克。该方法采用H₂与Pd进行脱保护反应24h，反应时间长，粗肽收率仅为60～70％，而H₂使用较为危险，Pd金属除尽难度大，对设备要求高，不适合大规模生产。

专利CN104277093A公开了一种以RinkAmide-AM Resin为载体，以的DIC/HOBt为缩合剂，采用微波反应技术，得到的西曲瑞克粗品经反相高效液相色谱纯化以及我们特有的醋酸转盐技术，制得的醋酸西曲瑞克纯品收率达到30％以上。该方法采用的微波合成法，对设备要求很高，不适用于大规模工业化合成。

专利CN104086632A公开了一种使用以AM树脂为起始树脂，按照西曲瑞克主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中肽序6位氨基酸采用Fmoc-D-Orn(Dde)-OH代替侧基无保护的Fmoc-Cit-OH，虽然此合成方法可以控制毒性[D-Ci t(Ac)]因由瑞克杂质含量在0.1％以下，但是合成过程中采用毒性水合肼试剂脱除Dde保护，工艺复杂且安全性低。

专利CN104610433 A和专利CN104892732 A均公开了一种西曲瑞克的制备方法，以Fmoc-Linker氨基树脂为起始原料，从C端到N端依次连接九个具有Fmoc保护基的氨基酸，脱去Fmoc保护基后再连接Ac-D-2-Nal-OH得到N端乙酰化的肽树脂，即Ac全保护十肽树脂。用裂解试剂切割肽树脂，冰乙醚沉淀切割液获得西曲瑞克粗肽，再以HPLC制备色谱柱分离纯化，冷冻干燥后得西曲瑞克三氟醋酸盐或西曲瑞克醋酸盐。该方法需要额外制备的Ac-D-2-Nal-OH原料，导致生产成本较高。

专利CN 107778355 A公开了一种合成西曲瑞克的方法。采用全新的氨基树脂作为载体，以及采用保护的D-Orn为D-Cit的前体，而后脱除侧链保护基与叔了基异氨酸醋反应生成D-Cit(tBu),通过特有的含有溴化氢的三氟醋酸溶液来酸解西曲瑞克肽树脂。该方法D-Orn转化为D-Cit(tBu),增加了一步反应，难以保证转化完全并且使用了有毒的溴化氢，不利于大规模工业化生产。

专利CN 107337717 A采用片段法5+5合成西曲瑞克，两个片段可以同时合成，缩短了合成周期。但这种方法后固相合成片段B的固相合成采用价格昂贵的Sieber树脂，成本较大。并且片段B多出了全保护切割步骤，导致总体工艺步骤多且步骤复杂，在大规模生产中具有较大的风险。

上述专利的方法存在方法复杂、不适宜工业生产、生产效率低等问题。因此，目前迫切需要开发一种简单、高效、适宜规模生产的方法。

发明内容

为解决上述指出的技术问题，本发明提供一种固液相结合法合成西曲瑞克的方法，方案如下:

西曲瑞克的制备方法，包括如下步骤:

a)按照西曲瑞克序列从C端到N端的顺序，在偶联试剂的作用下利用固相合成法逐个连接1-9片段得到Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTC Resin肽树脂；

b)将步骤a)得到的肽树脂全保护切割得到全保护的西曲瑞克-A；Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-OH；

c)将步骤b)得到的西曲瑞克-A与DAla-NH₂.HCl在液相中进行片段缩合，得到全保护的西曲瑞克；

d)将步骤c)得到的全保护的西曲瑞克以裂解液切割，再以冰乙醚沉淀切割液得到西曲瑞克粗肽；

e)将步骤d)得到的西曲瑞克粗肽经过反相高效液相色谱纯化得到西曲瑞克成品，完成西曲瑞克的合成。

作为优选，步骤(a)中，所述的树脂为CTC树脂，且其取代度为0.3-0.8mmol/g。

作为优选，步骤(a)中，所述固相合成法逐个连接采用CTC树脂为固相载体，所述CTC树脂与Fmoc-Pro-OH发生偶联反应得到Fmoc-Pro-CTC树脂,然后脱Fmoc保护后，以1.5-4倍摩尔量的投料比依次偶联相应的Fmoc保护氨基酸，每一个氨基酸联均在缩合试剂存在条件下进行，每一步偶联过程中均用Kaiser test试剂检测反应终点，每一步连接反应结束后，进行洗涤，然后采用脱保护试剂脱Fmoc保护后，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应:依次分别偶联Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-DCit-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-D-3Pal-OH Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH，从而得到Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTCResin。

作为优选，步骤(a)中所述的配置缩合试剂选自缩合试剂+碱的组合，其中缩合试剂选自HBTU、HATU、PyAOP、PyBOP、EDC.HCl+HOBT、DIC+HOBT等试剂中的一种，碱选自NMM,DIPEA，Et₃N中的一种；当与HOBT混合时，比例为1：1；缩合试剂与碱的比例为1：1。

作为优选，步骤(a)中所述固相合成反应的氨基酸投料量为树脂摩尔数的1.5-4倍，反应温度范围为5-40℃。

作为优选，步骤(b)中所述切割，切割液选自HFIP/DCM体系，二者体积比为3：7，浓度为8-10ml/g，温度为10-35℃。

作为优选，步骤(c)中所述在液相中进行片段缩合，其缩合试剂选自缩合试剂A+B的组合，其中缩合试剂选自HBTU、HATU、PyAOP、PyBOP等试剂中的一种与NMM,DIPEA，Et₃N中的一种的组合，或者EDC.HCl、DIC等试剂中的一种与HOBT的组合，其混合比例为1:1。

作为优选，步骤(c)中所述在液相中进行片段缩合，其缩合试剂、碱、DAla-NH₂.HCl、西曲瑞克-A的比例为1:1:1:1到3:3:3:1。

作为优选，步骤(d)中所述裂解液采用TFA，H₂O，EDT，TIS的一种或者多种组合。更加优选TFA，H₂O，EDT，TIS的比例为，90：5：2.5：2.5。

作为优选，步骤e)中，所述的反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，使用的流动相A为磷酸、三乙胺水溶液，B相为20％的流动相A的乙腈溶液，采用梯度洗脱的方式收集不同时间段的流出液，用HPLC的检测结果判断样品的纯度，合格的样品经换盐和冷冻干燥之后，就可以获得西曲瑞克成品。

本发明采用9+1的片段法制备西曲瑞克，具有以下优点：

1.西曲瑞克片段A的C端选取Pro⁹氨基酸，在和D-Ala-NH₂.HCl的液相合成时不会发生消旋化反应。

2.西曲瑞克片段A和D-Ala-NH₂.HCl的液相合成反应，与普通液相合成相比其后处理为沉淀、过滤，操作简单，产物纯度高。

3.采用9+1固相液相混合法，末端采用D-Ala-NH₂.HCl，避免了价格较高的Seiber树脂等氨基树脂的使用，降低生产成本。

液相和固相合成混合使用，既解决了液相合成法不适合连接长链的缺点，以及液相合成法后续处理复杂的缺点，也解决了固相合成中成本较高、粗品纯度较低的特点。是两种方法找到了一个稳定的平衡点，在实现顺利反应、成本控制、减少杂质和减少后处理的基础上，实现了大规模生产。

具体实施方式:

本发明说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如下：

D-2Nal:D-2-萘丙氨酸

D-4Cl-Phe:D-4-氯-苯丙氨酸

D-3Pal:D-3-吡啶丙氨酸

Ser:丝氨酸

Tyr:酷氨酸

D-Cit:D-瓜氨酸

Leu:亮氨酸

Arg:精氨酸

Pro:脯氨酸

D-Ala:D-丙氨酸

DIC:N,N一二异丙基碳化二亚胺

HOBt:1-羟基苯并三氮唑

CTC:2-三苯甲基氯

HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯

HATU:2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

PyAOP:(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐

PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷

NMM:N-甲基吗啉

DIPEA：N-二异丙基乙二胺

Et₃N：三乙胺

EDC.HCl：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

TFA:三氟乙酸

EDT：乙二硫醇

TIS：三异丙基硅烷

实施例1：

Fmoc-Pro-CTC Resin的制备

准确称取170g CTC Resin(Sub：0.96mmol/g)与Fmoc-Pro-OH(60.5g),加入1500mLDCM,待氨基酸完全溶解后，在搅拌状态下缓慢滴加DIPEA 85mL,室温搅拌2-3小时，反应结束后加入甲醇170mL封端30分钟，滤去反应液，DMF洗涤树脂3次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤2次，甲醇洗涤3次，真空干燥后得到239g Fmoc-Pro-CTC Resin，测得取代度为0.62mmol/g。Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTC Resin的制备

准确称取取代度为0.62mmol/g的Fmoc-Pro-CTC Resin 64.5g到固相反应器中，加入树脂体积2-3倍的DMF溶胀2h，抽干DMF后加入20％PIP/DMF溶液搅拌30分钟脱除Fmoc保护基，再用DMF洗涤6次，每次2分钟，茚三酮检测为阳性后，加入活化的氨基酸溶液(Fmoc-Arg(Pbf)-OH 51.9g和HOBt 10.94g于烧杯中加入少量DMF溶解，冰浴下加入DIC12.54mL活化15分钟)在20℃下反应1小时，再加入9mLNMM反应1.5-2h后，茚三酮检测为阴性后抽干反应液，DMF洗涤4次，抽干。

随后再依次进行上述操作:脱保护，洗涤，偶联，洗涤操作。其中，偶联的Fmoc保护氨基酸依次为Fmoc-Leu-OH,Fmoc-DCit-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-D-3Pal-OH Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH。偶联温度均在20℃,偶联每个氨基酸反应终点均采用Kaiser test检测，从而得到Fmoc-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTC Resin树脂。

加入20％PIP/DMF溶液搅拌30分钟，反应结束后DMF洗涤6次，加入1600mL(Ac₂O:NMM:DMF＝10:6:84)反应30min,茚三酮检测阴性后，抽干反应液，DMF洗涤4次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤1次，MeOH洗涤3次，抽干。所得树脂经过真空干燥得到Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTC Resin。Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTC Resin的切割

将六氟异丙醇和DCM按照3:7体积比配制成切割液850mL，冷却到10℃以下，备用。按照切割液/肽树脂8mL～10mL/g的比例量取冷却后的切割液，加入反应器中，开动搅拌器；将肽树脂106g慢慢加入切割液中，温度恢复到10-35℃时，开始记录反应时间，整个切割时间为1小时。反应结束后将树脂切割液混合物过滤，收集滤液；用切割液(2ml/g肽树脂)212mL洗涤树脂一次，再用DCM(2ml/g肽树脂)212mL洗涤树脂一次，收集合并滤液。将水浴温度控制在35℃以下，使用水泵/旋转蒸发仪浓缩滤液，去除低沸点溶剂，得到油状物；再将水浴温度控制在40±2℃，使用油泵/旋转蒸发仪浓缩滤液，去除高沸点溶剂，产物由油状物逐渐变成固体，期间不断将大块固体捣碎成小块，当产品性状完全变成固体小颗粒时，继续油泵旋转蒸发0.5小时。将所得固体小颗粒减压真空干燥至恒重(期间如果有结块，将其研碎之后继续抽干)后得到西曲瑞克-A粗品77.02g。

全保护西曲瑞克Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-DAla-NH₂的合成。

量取DMF 72mL(4mL/g LHRH-022-A粗品)和DIPEA 4.7mL(2.6eq.)加入到反应器中，开动搅拌器，在氮气氛围下，将反应器内溶液温度冷却到0-10℃，再将H-DAla-NH₂·HCl1.689g(1.3eq.)和西曲瑞克-A 18.0g(1.0eq.)加入反应器中，恢复温度到10-35℃。反应器内溶液随着升温和不断搅拌逐渐变澄清，此时加入HBTU 5.14g(1.3eq.)，搅拌至溶液澄清后，开始计时。反应器内溶液在10℃～35℃条件下反应2～3小时。HPLC检测反应结束。

将乙醚和苯甲醚按照3:1的体积比配制成沉淀液。量取10倍于DMF体积的沉淀液加入到沉淀器中，并且剧烈搅拌，将反应器内溶液慢慢加入，大量固体沉淀生成。将沉淀器内固液混合物转移到离心杯中，离心后倾倒除去上层清液，杯底固体用乙醚洗涤之后离心，倾倒除去上层清液；此过程反复两次。所得产品用水泵真空干燥1小时以上，再用油泵干燥8小时以上至恒重，得到全保护西曲瑞克粗品17.42g。

西曲瑞克Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser-Tyr-DCit-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂的制备

将TFA、H₂O和EDT按照97:1:2的体积比配制成切割液126mL，保存在-5℃，备用。将切割液(7-9mL/g粗品)加入反应器内，开动搅拌器，在氮气氛围下，将反应器内溶液温度冷却到0℃以下。将全保护西曲瑞克粗品18.0g在10-30分钟之内加入到切割液中，控制加料速度，使反应器内混合物温度不超过10℃。加料完毕之后，控制反应器内混合物温度在0℃以下，搅拌10分钟。恢复温度到15-40℃，开始记录反应时间，反应2.5小时。

量取10倍于切割液体积的乙醚1260mL加入到沉淀器中，剧烈搅拌并且将乙醚温度冷却到0℃以下。将反应器内混合物慢慢加入到沉淀器内，控制加料速度，使沉淀器内混合物温度始终不超过10℃，加完之后，沉淀器内混合物在0℃以下搅拌10分钟，大量固体沉淀生成。将沉淀器内固液混合物转移到离心杯中，离心后倾倒除去上层清液，杯底固体用乙醚洗涤之后离心，倾倒除去上层清液；此过程反复三次。所得产品用水泵真空干燥1小时以上，再用油泵在室温条件下干燥8小时以上真空干燥至恒重，得到西曲瑞克粗品14.2g。

西曲瑞克Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser-Tyr-DCit-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂的纯化：

将西曲瑞克粗肽溶于乙睛和水的混合溶液中，抽滤，滤液采用C18反相色谱柱子上样纯化，收集样品峰并合并合格样品后，进行脱盐，冻干，得到西由瑞克精肽，纯化后精肽收率48.9％，纯度为98.0％，单杂＜0.5％。

以下实施例的条件和反应步骤与实施例1相同，不同之处见下表：

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种西曲瑞克的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:

a)按照西曲瑞克序列从C端到N端的顺序，在偶联试剂的作用下利用固相合成法逐个连接1-9片段得到Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTCResin肽树脂；

2.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的树脂为CTC树脂，且其取代度为0.3-0.8mmol/g。

3.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述固相合成法逐个连接采用CTC树脂为固相载体，所述CTC树脂与Fmoc-Pro-OH发生偶联反应得到Fmoc-Pro-CTC树脂,然后脱Fmoc保护后，以1.5-4倍摩尔量的投料比依次偶联相应的Fmoc保护氨基酸，每一个氨基酸联均在缩合试剂存在条件下进行，每一步偶联过程中均用Kaisertest试剂检测反应终点，每一步连接反应结束后，进行洗涤，然后采用脱保护试剂脱Fmoc保护后，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应:依次分别偶联Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-DCit-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-D-3Pal-OHFmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH，从而得到Ac-D2Nal-D4Cpa-D3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tbu)-DCit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-CTCResin。

4.根据权利要求1、2或3所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述的配置缩合试剂选自缩合试剂+碱的组合，其中缩合试剂选自HBTU、HATU、PyAOP、PyBOP、EDC.HCl+HOBT、DIC+HOBT等试剂中的一种，碱选自NMM,DIPEA，Et₃N中的一种；当与HOBT混合时，比例为1：1；缩合试剂与碱的比例为1：1。

5.根据权利要求1、2或3所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(a)中所述固相合成反应的氨基酸投料量为树脂摩尔数的1.5-4倍，反应温度范围为5-40℃。

6.根据权利要求1、2或3所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(b)中所述切割，切割液选自HFIP/DCM体系，二者体积比为3：7，浓度为8-10ml/g，温度为10-35℃。

7.根据权利要求1、2或3所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述在液相中进行片段缩合，其缩合试剂选自缩合试剂A+B的组合，其中缩合试剂选自HBTU、HATU、PyAOP、PyBOP等试剂中的一种与NMM,DIPEA，Et₃N中的一种的组合，或者EDC.HCl、DIC等试剂中的一种与HOBT的组合，其混合比例为1:1。

8.根据权利要求7所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(c)中所述在液相中进行片段缩合，其缩合试剂、碱、DAla-NH₂.HCl、西曲瑞克-A的比例为1:1:1:1到3:3:3:1。

9.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤(d)中所述裂解液采用TFA，H₂O，EDT，TIS的一种或者多种组合。

10.根据权利要求1所述的西曲瑞克的制备方法，其特征在于，步骤e)中，所述的反相高效液相色谱制备色谱柱分离纯化，使用的流动相A为磷酸、三乙胺水溶液，B相为20％的流动相A的乙腈溶液，采用梯度洗脱的方式收集不同时间段的流出液，用HPLC的检测结果判断样品的纯度，合格的样品经换盐和冷冻干燥之后，就可以获得西曲瑞克成品。