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CN111450100A - 一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN111450100A
CN111450100A CN202010238217.1A CN202010238217A CN111450100A CN 111450100 A CN111450100 A CN 111450100A CN 202010238217 A CN202010238217 A CN 202010238217A CN 111450100 A CN111450100 A CN 111450100A
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camellia
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程金生
万维宏
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Shaoguan University
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Abstract

本发明提供了一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物，包括以下按质量份数计原料：金花茶咖啡碱15‑40份，金花茶绿原酸10‑30份，罗汉果甜苷2‑6份，可溶性淀粉15‑35份，水溶性糊精5‑10份，柠檬酸0.5‑3份，10％淀粉浆2‑5份。本发明还提供了一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物及其制备方法和应用。相对于现有技术，本发明发现咖啡碱和绿原酸对新型冠状病毒有良好的抑制作用，且二者配合协同作用下病毒抑制率显著提高，因此，本发明首创性地提出了将咖啡碱和绿原酸配合作为主要抗病毒活性成分，再复配罗汉果甜苷、可溶性淀粉、水溶性糊精、柠檬酸和10％淀粉浆等辅料配合形成组合物，该组合物可以内服，为预防新型冠状肺炎提供了一种新配方、新思路。

Description

一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物及其制备方法和应用。
背景技术
金花茶(Camellia nitidissima C.W.Chi)属于山茶科，山茶属，根据中国疾病预防控制中心营养与食品安全所的检验表明，金花茶属无毒级，含有多种营养及药用活性成分如茶多酚类、黄酮类、氨基酸类、咖啡碱、绿原酸等，具有非常高的药用价值。尤其是金花茶中含量丰富的绿原酸(Chlorogenic acid)和咖啡碱(Caffeine)，绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、降血压血脂和清除自由基等作用；咖啡碱是茶叶中一种含量很高的生物碱，适度地使用有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上常用于治疗神经衰弱和昏迷复苏。
李丽静等(李丽静,王继彦,王岩等.返魂草提取物及其有效成分抗病毒作用的研究[J]. 中国中医基础医学杂志,2004，011(8):585-587)研究表明，绿原酸和咖啡碱均对流感病毒(RMI 型)和对新城鸡瘟病毒(NDV型)具有强烈的抑制效果。
但是，目前暂未有将金花茶绿原酸和咖啡碱应用于新型冠状病毒防治的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物及其制备方法和应用，该金花茶咖啡碱、绿原酸组合物可用于灭杀新型冠状病毒。
本发明提供了一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物，包括以下按质量份数计原料：金花茶咖啡碱15-40份，金花茶绿原酸10-30份，罗汉果甜苷2-6份，可溶性淀粉 15-35份，水溶性糊精5-10份，柠檬酸0.5-3份，10％淀粉浆2-5份。
相对于现有技术，本发明发现咖啡碱和绿原酸对新型冠状病毒有良好的抑制作用，且二者配合协同作用下病毒抑制率显著提高，因此，本发明首创性地提出了将咖啡碱和绿原酸配合作为主要抗病毒活性成分，再复配罗汉果甜苷、可溶性淀粉、水溶性糊精、柠檬酸和10％淀粉浆等辅料配合形成组合物，该组合物可以内服，并为预防新型冠状肺炎提供了一种新配方、新思路。
进一步地，金花茶咖啡碱25份，金花茶绿原酸20份，罗汉果甜苷3份，可溶性淀粉20份，水溶性糊精6份，柠檬酸1份，10％淀粉浆3份。
本发明还提供了一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)金花茶预处理：选取金花茶老茶叶或下脚料，洗净、干燥、破碎、过筛后获得金花茶茶粉；
(2)分别提取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，其中，
提取金花茶咖啡碱的步骤为：称取所述金花茶茶粉，加入去离子水、在超声和水浴条件下浸提2-5次，过滤，在滤液中加入等体积无水乙醇并进行第一次超声处理，静置，过滤，离心获得上清液a；调节所述上清液a的pH7.0-8.0，加入金属盐进行第二次超声处理，过滤，离心获得上清液b；在上清液b中加入NaCl，超声后加入乙酸乙酯，在35-80℃水浴温度下超声，静置，分离出乙酸乙酯相，将产品真空干燥后获得粗制金花茶咖啡碱；将所述粗制金花茶咖啡碱进行提纯处理获得金花茶咖啡碱；
提取金花茶绿原酸的步骤为：称取所述金花茶茶粉，加入80％乙醇，物料比为1:10-30，在25-80℃条件下反应1-4h获得粗制金花茶绿原酸；对粗制金花茶绿原酸采用大孔树脂进行一次纯化处理；再采用半制备性液相色谱进行二次纯化处理；最后进行三次纯化处理：水溶解、沉淀、过滤、滤液浓缩、真空干燥获得金花茶绿原酸；
(3)配料：按一定比例称取步骤(2)制备的金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，并混合罗汉果甜苷，可溶性淀粉，水溶性糊精，柠檬酸和10％淀粉浆，获得金花茶咖啡碱、绿原酸组合物。
相对于现有技术，本发明从金花茶老茶叶和下脚料中提纯金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，提高了金花茶下脚料的利用率，提高了金花茶附加值；同时，本发明采用提纯处理获得精制的金花茶咖啡碱，其纯度高达99.5％，并采用三次纯化处理对金花茶绿原酸进行提纯，其纯度高达99.5％，使得提纯后的金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸的质量符合国家食品或医药规范的要求。
进一步地，在步骤(3)后，还包括步骤(4)制粒步骤：在步骤(3)后，还包括步骤(4)制粒步骤：将步骤(3)的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物通过中药制粒机制成金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒，其中，颗粒的粒度为10-50目。
进一步地，在步骤(4)后还包括步骤(5)灭菌步骤：在步骤(4)后还包括步骤(5) 灭菌步骤：将金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒使用137Cs-γ射线辐射3-6h，再采用紫外线照射16h。本发明对金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒进行两次灭菌处理，防止其发生变质，保证产品的质量符合国家食品或医药产品规范。
进一步地，步骤(2)提取金花茶咖啡碱的步骤中，金属盐为氯化钙、氯化镁、氯化锌、硝酸锌的任意一种。由于金花茶中富含丰富的茶多酚，因此本发明采用金属盐与茶多酚配位生成沉淀，由此除去金花茶中的茶多酚，进而达到提纯的目的。
进一步地，步骤(2)提取金花茶咖啡碱的步骤中，提纯处理的步骤为：将粗制金花茶咖啡碱放入容器中，在其上方倒扣一表面皿，搅拌条件下加热所述容器，控制温度在115-125℃，使粗制金花茶咖啡碱升华结晶并附着在所述表面皿的内表面，重复上述步骤，获得金花茶咖啡碱。本发明采用升华结晶的方式获得高纯度的金花茶咖啡碱。
进一步地，步骤(2)提取金花茶绿原酸的步骤中，一次纯化处理的条件为：采用大孔树脂分离提纯，上样浓度为0.15-0.5mg/ml，pH 2.0-4.0，进样液体积/大孔树脂质量比值为10-30 ml·L-1，流速为1-5ml/min，洗脱剂为30％乙醇；三次纯化处理的条件为：以二次纯化金花茶绿原酸的体积为1倍，分别加入2、3、4、5倍的水溶解，沉淀、过滤、滤液浓缩、真空干燥获得金花茶绿原酸。
进一步地，步骤(3)中，各原料的质量份数比例为：金花茶咖啡碱15-40份，金花茶绿原酸10-30份，罗汉果甜苷2-6份，可溶性淀粉15-35份，水溶性糊精5-10份，柠檬酸0.5-3份，10％淀粉浆2-5份。
进一步地，将所述金花茶咖啡碱、绿原酸组合物用于灭杀新型冠状病毒。
具体实施方式
本发明提供了一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物(以下简称金花茶咖啡碱、绿原酸组合物)，包括以下按质量份数计原料：金花茶咖啡碱15-40份，金花茶绿原酸10-30份，罗汉果甜苷2-6份，可溶性淀粉15-35份，水溶性糊精5-10份，柠檬酸0.5-3份， 10％淀粉浆2-5份。
基于上述配方，本发明还提供了一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)金花茶预处理：选取金花茶的老茶叶或下脚料，洗净、干燥、破碎、以20-40目过筛后获得金花茶茶粉。
(2)分别提取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸。
提取金花茶咖啡碱的步骤：称取所述金花茶茶粉2-15g，加入30-300mL去离子水、在超声和水浴条件下浸提2-5次，过滤，在滤液中加入等体积无水乙醇并进行第一次超声处理，第一次超声处理的条件为300-500w超声5-20min，静置30-120min，过滤，离心获得上清液a；调节所述上清液a的pH7.0-8.0，加入金属盐(氯化钙、氯化镁、氯化锌、硝酸锌中的任意一种)进行第二次超声处理，获得茶多酚沉淀，过滤，离心获得上清液b；在上清液b中加入占溶液总重量0.1-0.4％的NaCl溶液，300-500w条件下超声2-10min后加入50-550mL乙酸乙酯，在35-80℃水浴温度下超声15-60min，静置30-90min，分离出乙酸乙酯相，将产品在30-60℃下真空干燥2-6h，获得粗制金花茶咖啡碱；将所述粗制金花茶咖啡碱进行提纯处理获得金花茶咖啡碱，提纯处理的步骤为：将粗制金花茶咖啡碱放入容器中，在其上方倒扣一表面皿，搅拌条件下加热所述容器，控制温度在115-125℃，并在表面皿上铺设冰块或散热片，使粗制金花茶咖啡碱升华结晶并附着在所述表面皿的内表面，每5-10min刮下表面皿内表面的结晶，并翻动容器中的粗制咖啡碱，重复上述步骤3-5次，获得金花茶咖啡碱，纯度为99.5％以上。
提取金花茶绿原酸的步骤：称取所述金花茶茶粉4-6g，加入80％乙醇，物料比为1:10-30，在25-80℃条件下反应1-4h获得粗制金花茶绿原酸；一次纯化处理：采用大孔树脂分离提纯，上样浓度为0.15-0.5mg/ml，pH 2.0-4.0，进样液体积/大孔树脂质量比值为10-30ml·L-1，流速为1-5ml/min，洗脱剂为30％乙醇；二次纯化处理：采用半制备性液相色谱对一次纯化金花茶绿原酸进行二次纯化，真空干燥后获得二次纯化金花茶绿原酸；三次纯化处理：以二次纯化金花茶绿原酸的体积为1倍，分别加入2、3、4、5倍的水溶解，沉淀、过滤、滤液浓缩、真空干燥获得金花茶绿原酸，纯度为99.5％以上。
(3)配料：按一定比例称取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，并混合罗汉果甜苷，可溶性淀粉，水溶性糊精，柠檬酸和10％淀粉浆获得金花茶咖啡碱、绿原酸组合物。其中各原料的质量份数比例为：金花茶咖啡碱15-40份，金花茶绿原酸10-30份，罗汉果甜苷2-6份，可溶性淀粉15-35份，水溶性糊精5-10份，柠檬酸0.5-3份，10％淀粉浆2-5份。
(4)制粒：将步骤(4)的混合粉末金花茶咖啡碱、绿原酸组合物通过中药制粒机制成金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒，所述颗粒的粒度为10-50目。其中，冲孔板孔径1.50mm，轧辊电机频率40-50HZ、送料电机频率30-50HZ、油缸压力16-24bar，且制粒方式为干法制粒。需要说明的是，还可以将本发明的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物制备成口服液、含片等其他形式的内服药物。
(5)灭菌：将金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒使用137Cs-γ射线辐射3-6h，再采用紫外线照射16h。
以下通过实施例1和实施例2对本发明进行详细说明。
实施例1
(1)金花茶预处理：选取金花茶的老茶叶或下脚料，洗净、干燥、破碎、以20目过筛后获得金花茶茶粉。
(2)分别提取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸：
提取金花茶咖啡碱的步骤：称取所述金花茶茶粉5g，加入100mL去离子水、在超声和水浴条件下浸提3次，过滤，在滤液中加入等体积无水乙醇并进行第一次超声处理，第一次超声处理的条件为400w超声5min，静置40min，过滤，离心获得上清液a；调节所述上清液a的pH7.0-8.0，加入氯化钙2.5g进行第二次超声处理，获得茶多酚沉淀，过滤，离心获得上清液b；在上清液b中加入NaCl10.02g，400w条件下超声5min后加入200mL乙酸乙酯，在40℃水浴温度下400w条件下超声30min，静置50min，分离出乙酸乙酯相，将产品在40℃下真空干燥4h，获得粗制金花茶咖啡碱；将所述粗制金花茶咖啡碱进行提纯处理获得金花茶咖啡碱，提纯处理的步骤为：将粗制金花茶咖啡碱放入250mL烧杯中，在其上方倒扣一翻边金属罩，搅拌条件下加热烧杯，控制温度在120℃，并在翻边金属罩上铺设冰块或散热片，使粗制金花茶咖啡碱升华结晶并附着在所述表面皿的内表面，每5min刮下表面皿内表面的结晶，并翻动容器中的粗制咖啡碱，重复上述步骤3次，获得金花茶咖啡碱，纯度为99.5％以上。
提取金花茶绿原酸的步骤：称取所述金花茶茶粉3g，加入80％乙醇，物料比为1:20，在 35℃条件下反应2h获得粗制金花茶绿原酸；一次纯化处理：采用大孔树脂分离提纯，上样浓度为0.2mg/ml，pH 3.0，进样液体积/大孔树脂质量比值为20ml·L-1，流速为2ml/min，洗脱剂为30％乙醇；二次纯化处理：再采用半制备性液相色谱对一次纯化金花茶绿原酸进行二次纯化，真空干燥后获得二次纯化金花茶绿原酸；三次纯化处理：以二次纯化金花茶绿原酸的体积为1倍，分别加入2、3、4、5倍的水溶解，沉淀、过滤、滤液浓缩、40℃真空干燥获得金花茶绿原酸，纯度为99.5％以上。
(3)配料：按一定比例称取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，并混合罗汉果甜苷，可溶性淀粉，水溶性糊精，柠檬酸和10％淀粉浆获得金花茶咖啡碱、绿原酸组合物。其中各原料的质量份数比例为：金花茶咖啡碱25份，金花茶绿原酸20份，罗汉果甜苷3份，可溶性淀粉20份，水溶性糊精6份，柠檬酸1份，10％淀粉浆3份。
(4)制粒：将步骤(3)的混合粉末金花茶咖啡碱、绿原酸组合物通过中药制粒机制成金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒，所述颗粒的粒度为20目。其中，冲孔板孔径1.50mm，轧辊电机频率50HZ、送料电机频率40HZ、油缸压力20bar，且制粒方式为干法制粒。需要说明的是，还可以将本发明的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物制备成口服液、含片等其他形式的内服药物。
(5)灭菌：将金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒使用137Cs-γ射线辐射4h，辐射量选用6kGY，通过选择抗辐射性强的短小芽孢杆菌作为电离辐射灭菌的指示剂，确保辐射灭菌质量；再采用紫外线照射16h。
实施例2
(1)金花茶预处理：选取金花茶的老茶叶或下脚料，洗净、干燥、破碎、以30目过筛后获得金花茶茶粉。
(2)分别提取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸：
提取金花茶咖啡碱的步骤：称取所述金花茶茶粉10g，加入200mL去离子水、在超声和水浴条件下浸提4次，过滤，在滤液中加入等体积无水乙醇并进行第一次超声处理，第一次超声处理的条件为500w超声10min，静置45min，过滤，离心获得上清液a；调节所述上清液a的pH7.0-8.0，加入氯化锌6.15g进行第二次超声处理，获得茶多酚沉淀，过滤，离心获得上清液b；在上清液b中加入NaCl0.04g，400w条件下超声5min后加入400mL乙酸乙酯，在45℃水浴温度下500w条件下超声20min，静置60min，分离出乙酸乙酯相，将产品在35℃下真空干燥4.5h，获得粗制金花茶咖啡碱；将所述粗制金花茶咖啡碱进行提纯处理获得金花茶咖啡碱，提纯处理的步骤为：将粗制金花茶咖啡碱放入平底锅中，在其上方倒扣一翻边金属罩，搅拌条件下加热平底锅，控制温度在122℃，并在翻边金属罩上铺设冰块，使粗制金花茶咖啡碱升华结晶并附着在所述表面皿的内表面，每8min刮下表面皿内表面的结晶，并翻动容器中的粗制咖啡碱，重复上述步骤4次，获得金花茶咖啡碱，纯度为99.5％以上。
提取金花茶绿原酸的步骤：称取所述金花茶茶粉5g，加入80％乙醇，物料比为1:25，在 40℃条件下反应3.5h获得粗制金花茶绿原酸；一次纯化处理：采用大孔树脂分离提纯，上样浓度为0.3mg/ml，pH 2.5，进样液体积/大孔树脂质量比值为18ml·L-1，流速为2.5ml/min，洗脱剂为30％乙醇；二次纯化处理：再采用半制备性液相色谱对一次纯化金花茶绿原酸进行二次纯化，真空干燥后获得二次纯化金花茶绿原酸；三次纯化处理：以二次纯化金花茶绿原酸的体积为1倍，分别加入2、3、4、5倍的水溶解，沉淀、过滤、滤液浓缩、真空干燥获得金花茶绿原酸，纯度为99.5％以上。
(3)配料：按一定比例称取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，并混合罗汉果甜苷，可溶性淀粉，水溶性糊精，柠檬酸和10％淀粉浆获得金花茶咖啡碱、绿原酸组合物。其中各原料的质量份数比例为：金花茶咖啡碱30份，金花茶绿原酸20份，罗汉果甜苷3.5份，可溶性淀粉25份，水溶性糊精6份，柠檬酸1.5份，10％淀粉浆3份。
(4)制粒：将步骤(3)的混合粉末通过中药制粒机制成金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒，所述颗粒的粒度为30目。其中，冲孔板孔径1.50mm，轧辊电机频率45HZ、送料电机频率40HZ、油缸压力19bar，且制粒方式为干法制粒。需要说明的是，还可以将本发明的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物制备成口服液、含片等其他形式的内服药物。
(5)灭菌：将金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒使用137Cs-γ射线辐射5h，辐射量选用2-35kGY，通过选择抗辐射性强的短小芽孢杆菌作为电离辐射灭菌的指示剂，确保辐射灭菌质量；再采用紫外线照射16h。
以下通过验证实验证明本申请实施例1和实施例2的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物在抗新型冠状病毒中的功效。
(1)设计引物，获得第一代重组病毒：以新型冠状病毒COVID-19的RNA为模板，并以反转录酶合成cDNA，以cDNA为模板，用PCR技术分别获得COVID-19S、M、E基因。构建以上三个基因的pMD-18T重组质粒，鉴定。并进一步地构建以上三个基因的pFastBacTM Dual重组质粒，并通过PCR、双酶切及测序鉴定。将pFastBacTMDual重组质粒分别转化进入DH10Bac感受态细胞中，摇床培养12～16h，进行PCR检测。挑取阳性菌落，扩菌，提取Bacmid DNA，获得三个重组rBacmid DNA，将其分别转染Sf9细胞，收获上清，即为第一代重组病毒。
(2)获得第二、三代重组病毒：用100μl第一代重组病毒感染Sf9细胞，28℃放置2h，期间轻轻晃动培养瓶以使病毒均匀地吸附细胞。移除上清液，加2ml完全培养基，28℃培养72h之后，收集上清液，获得第二代重组病毒。将收获的病毒按上述方法继续传代，得到第三代重组病毒。将三种重组杆状病毒分别命名为rB-S、rB-M、rB-E，进行噬斑纯化并噬斑计数。
(3)获得感染细胞：将纯化的病毒感染Sf9细胞，培养，分别收集上清液及细胞，Western-bloting、血凝试验、间接免疫荧光实验检测重组蛋白的表达。再用纯化的三种重组杆状病毒rB-S、rB-M或rB-S、rB-M、rB-E共同侵染Sf9细胞，28℃培养箱中培养约5d，收集感染的细胞，PBS吹散贴壁细胞，洗涤三次，超声波破碎，4℃，12,000g离心10min，取上清液。利用蔗糖密度梯度超速离心，纯化COVID-19VLP，Western-bloting鉴定VLPs的组成蛋白，并利用透射电镜观察VLPs的形态。
(4)添加金花茶咖啡碱、绿原酸组合物：将纯化的COVID-19病毒样颗粒(VLPs)溶解在PBS溶液作为病毒原液，分别开展梯次COVID-19稀释病毒液(10-1、10-2、10-3.....10-9) 制备，随后开展病毒接种(37℃，5％CO2孵育箱)，弃生长液，用PBS液冲洗次后，加入 10PFU/ml的病毒液100μl(其中包含l％牛血清白蛋白的PBS液)置4℃吸附1h。吸附后的细胞用PBS液洗涤，添加本发明实施例1和实施例2制备(本例以实施例1参数为例)的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的PBS分散液0.5-3ml，金花茶咖啡碱、绿原酸组合物浓度为 0.005-0.30mg/ml，于37℃、5％CO2孵育箱培养8-72h，收集不同时间段培养液，用PBS洗去死细胞，活的细胞用MTT(噻唑蓝)比色法测得，用空斑形成单位(PFU)测定病毒繁殖量，观察在不同时间段(8h，10h，18h,24h,36h,48h,72h)显微镜观察致细胞病变效应 (cytopathic effect)，直至受到抗病毒产品病毒持续作用，产生的CPE不再进展为止。设置相同条件下的空白对照组(金花茶咖啡碱、绿原酸组合物替换为等体积的PBS液)记录不同金花茶咖啡碱、绿原酸组合物详细抗COVID-19病毒详细数据。按照本专利所述方法，COVID-19 病毒在37℃孵育，10h后病毒PFU达到高峰。研究数据显示，以添加本发明所述金花茶咖啡碱、绿原酸组合物0.5ml为例，在0.005-0.01mg/ml浓度区间内，该口服剂无明显抑制COVID-19 病毒效果。在0.01-0.30mg/ml浓度区间内，金花茶咖啡碱、绿原酸组合物对COVID-19病毒有显著抑制效果，并在浓度为0.16mg/ml时有最佳抗COVID-19病毒效果。如数据显示空白对照组的COVID-19病毒滴度为16.71×104PFU/ml，而当金花茶咖啡碱、绿原酸组合物浓度分别为0.015mg/ml、0.04mg/ml、0.10mg/ml、0.16mg/ml、0.23mg/ml和0.30mg/ml时，其 COVID-19病毒滴度观测值分别为14.77×104PFU/ml、10.18×104PFU/ml、2.31×104PFU/ml、 0.92×104PFU/ml、0.97×104PFU/ml和1.01×104PFU/ml。所有实验组抗COVID-19病毒效果均显著优于空白对照组，其中在0.16mg/ml最优浓度条件下，添加金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的实验组COVID-19病毒PFU值仅约相当于空白对照组的5.5％，COVID-19病毒活性大幅降低。实验结果也充分表明，本发明实施例1和实施例2制备的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物能够有效抗击新型冠状病毒。
相对于现有技术，本发明发现咖啡碱和绿原酸对新型冠状病毒有良好的抑制作用，且二者配合协同作用下病毒抑制率显著提高，因此，本发明首创性地提出了将咖啡碱和绿原酸配合作为主要抗病毒活性成分，再复配罗汉果甜苷、可溶性淀粉、水溶性糊精、柠檬酸和10％淀粉浆等辅料配合形成组合物，该组合物可以内服，并为预防新型冠状肺炎提供了一种新配方、新思路。本发明从金花茶老茶叶和下脚料中提纯金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，提高了金花茶下脚料的利用率，提高了金花茶附加值；同时，本发明采用提纯处理获得精制的金花茶咖啡碱，其纯度高达99.5％，并采用三次纯化处理对金花茶绿原酸进行提纯，其纯度高达 99.5％，使得提纯后的金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸的质量符合国家食品或医药规范的要求。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (10)

1.一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物，其特征在于：包括以下按质量份数计原料：金花茶咖啡碱15-40份，金花茶绿原酸10-30份，罗汉果甜苷2-6份，可溶性淀粉15-35份，水溶性糊精5-10份，柠檬酸0.5-3份，10％淀粉浆2-5份。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物，其特征在于：金花茶咖啡碱25份，金花茶绿原酸20份，罗汉果甜苷3份，可溶性淀粉20份，水溶性糊精6份，柠檬酸1份，10％淀粉浆3份。
3.一种抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金花茶预处理：选取金花茶老茶叶或下脚料，洗净、干燥、破碎、过筛后获得金花茶茶粉；
(2)分别提取金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，其中，
提取金花茶咖啡碱的步骤为：称取所述金花茶茶粉，加入去离子水、在超声和水浴条件下浸提2-5次，过滤，在滤液中加入等体积无水乙醇并进行第一次超声处理，静置，过滤，离心获得上清液a；调节所述上清液a的pH7.0-8.0，加入金属盐进行第二次超声处理，过滤，离心获得上清液b；在上清液b中加入NaCl，超声后加入乙酸乙酯，在35-80℃水浴温度下超声，静置，分离出乙酸乙酯相，将产品真空干燥后获得粗制金花茶咖啡碱；将所述粗制金花茶咖啡碱进行提纯处理获得金花茶咖啡碱；
提取金花茶绿原酸的步骤为：称取所述金花茶茶粉，加入80％乙醇，物料比为1:10-30，在25-80℃条件下反应1-4h获得粗制金花茶绿原酸；对粗制金花茶绿原酸采用大孔树脂进行一次纯化处理；再采用半制备性液相色谱进行二次纯化处理；最后进行三次纯化处理：水溶解、沉淀、过滤、滤液浓缩、真空干燥获得金花茶绿原酸；
(3)配料：按一定比例称取步骤(2)制备的金花茶咖啡碱和金花茶绿原酸，并混合罗汉果甜苷，可溶性淀粉，水溶性糊精，柠檬酸和10％淀粉浆，获得金花茶咖啡碱、绿原酸组合物。
4.根据权利要求3所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于：在步骤(3)后，还包括步骤(4)制粒步骤：将步骤(3)的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物通过中药制粒机制成金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒，其中，颗粒的粒度为10-50目。
5.根据权利要求4所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于：在步骤(4)后还包括步骤(5)灭菌步骤：将金花茶咖啡碱、绿原酸颗粒使用137Cs-γ射线辐射3-6h，再采用紫外线照射16h。
6.根据权利要求3所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)提取金花茶咖啡碱的步骤中，金属盐为氯化钙、氯化镁、氯化锌、硝酸锌的任意一种。
7.根据权利要求3所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)提取金花茶咖啡碱的步骤中，提纯处理的步骤为：将粗制金花茶咖啡碱放入容器中，在其上方倒扣一表面皿，搅拌条件下加热所述容器，控制温度在115-125℃，使粗制金花茶咖啡碱升华结晶并附着在所述表面皿的内表面，重复上述步骤，获得金花茶咖啡碱。
8.根据权利要求3所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于：步骤(2)提取金花茶绿原酸的步骤中，一次纯化处理的条件为：采用大孔树脂分离提纯，上样浓度为0.15-0.5mg/ml，pH 2.0-4.0，进样液体积/大孔树脂质量比值为10-30ml·L-1，流速为1-5ml/min，洗脱剂为30％乙醇；三次纯化处理的条件为：以二次纯化金花茶绿原酸的体积为1倍，分别加入2、3、4、5倍的水溶解，沉淀、过滤、滤液浓缩、真空干燥获得金花茶绿原酸。
9.根据权利要求3所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，各原料的质量份数比例为：金花茶咖啡碱15-40份，金花茶绿原酸10-30份，罗汉果甜苷2-6份，可溶性淀粉15-35份，水溶性糊精5-10份，柠檬酸0.5-3份，10％淀粉浆2-5份。
10.一种如权利要求1-9任一所述的抗新型冠状病毒的金花茶咖啡碱、绿原酸组合物的应用，其特征在于：将所述金花茶咖啡碱、绿原酸组合物用于灭杀新型冠状病毒。
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