CN111394506A - 一种小麦分子标记及其在鉴定小麦粒重性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦分子标记及其在鉴定小麦粒重性状中的应用。本发明提供了一种引物组，由引物6A‑90K‑236‑A、引物6A‑90K‑236‑B和引物6A‑90K‑236‑C组成；引物6A‑90K‑236‑A为序列1所示的单链DNA分子；引物6A‑90K‑236‑B为序列2所示的单链DNA分子；引物6A‑90K‑236‑C为序列3所示的单链DNA分子。本发明还保护一种鉴定待测小麦的粒重性状的方法，包括如下步骤：(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行KASP；(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦的基因型；(3)根据基因型结果进行判断：AA基因型小麦的粒重高于GG基因型小麦。本发明可用于分子标记辅助育种，对于培育高产小麦具有重大应用价值。

Description

一种小麦分子标记及其在鉴定小麦粒重性状中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦分子标记及其在鉴定小麦粒重性状中的应用。

背景技术

小麦是最重要的粮食作物之一，但由于种质资源、育种材料和方法的限制及多种生物和非生物逆境的影响，全球小麦产量增速逐渐放缓。耕地面积大幅减少，人口持续增加，粮食安全受到严重威胁，如何提高小麦产量是当前亟待解决的重要问题。

千粒重是重要的产量因子，遗传力较高，相对于产量受环境影响较小，且与产量显著正相关因此，改良千粒重，即利用分子标记聚合粒重基因，是提高产量的重要途径。因此，发掘更多的小麦粒重基因，开发基因特异性分子标记，是进行基因聚合育种和产量性状分子机理研究的重要基础。

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR，竞争性等位基因特异性PCR)是由英国LGC(Laboratory of the Government Chemist，政府化学家实验室)开发的一项经济有效、灵活的SNP分型技术，基于引物末端碱基的特异匹配和通用荧光探针对SNP进行分型，可在96、384和1536孔PCR板中进行，荧光定量PCR仪或普通PCR仪结合酶标仪即可满足大部分用户的需求。与其他标记相比，KASP标记更适合应用于分子标记辅助选择育种。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦分子标记及其在鉴定小麦粒重性状中的应用。

本发明提供了一种引物组，由引物6A-90K-236-A、引物6A-90K-236-B和引物6A-90K-236-C组成；

引物6A-90K-236-A为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

引物6A-90K-236-B为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

引物6A-90K-236-C为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

所述引物组的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)或(d8)：

(d1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(d3)筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d4)筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d5)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状的产品；

(d6)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品；

(d7)制备用于筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(d8)制备用于筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

本发明还保护所述引物组的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)或(d8)：

(d1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(d3)筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d4)筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d5)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状的产品；

(d6)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品；

(d7)制备用于筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(d8)制备用于筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组。

所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：

(d1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(d3)筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d4)筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：

(d1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(d3)筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d4)筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的粒重性状的方法，包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行KASP；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦的基因型；

(3)根据基因型结果进行判断：AA基因型小麦的粒重高于GG基因型小麦。

所述粒重为千粒重。

所述基因型为基于特异SNP的基因型。

反应体系(总体积为5μl)：模板DNA(DNA含量为110ng-220ng)，2×KASP reactionmix 2.5μl，引物混合试剂0.056μl，余量为ddH₂O。

2×KASP reaction mix，又称为KASP 2×Master Mix，为LGC公司产品(货号KBS-1016-002)。

引物混合试剂提供的有效成分为6A-90K-236-A、6A-90K-236-B和6A-90K-236-C。反应体系中，6A-90K-236-A、6A-90K-236-B和6A-90K-236-C的浓度均为100μM。

FAM，蓝色(聚集于X轴)，代表AA基因型。

HEX，红色(聚集于Y轴)，代表GG基因型。

本发明还保护所述方法在小麦育种中的应用。所述育种的目的为获得高粒重小麦。所述育种的目的为获得高千粒重小麦。所述育种的目的为获得高产小麦。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的粒重性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；AA基因型小麦的粒重显著高于GG基因型小麦。所述粒重为千粒重。

本发明还保护一种小麦育种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；选择AA基因型小麦进行育种。所述育种的目的为获得高粒重小麦。所述育种的目的为获得高千粒重小麦。所述育种的目的为获得高产小麦。

以上任一所述特异SNP为小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第25位核苷酸。所述特异SNP为A/G多态。

本发明还保护一种特异DNA分子，如序列表的序列4所示。

本发明还保护所述特异DNA分子在鉴定小麦籽粒性状中的应用。所述籽粒性状为粒重性状。所述粒重具体可为千粒重。

本发明可用于分子标记辅助育种，对于培育高产小麦具有重大应用价值。

附图说明

图1为基因分型结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR),竞争性等位基因特异性PCR。

实施例1、与小麦千粒重性状相关的KASP引物组的获得

高凤梅等利用周8425B/中国春重组自交系F2:8群体的246个家系,在6A染色体上检测到一个在多个环境下稳定的千粒重主效QTL，可解释10.3％的表型变异。

进一步发现了一个与其紧密连锁的SNP，命名为特异SNP。

小麦基因组中特异SNP及其周边序列如序列表的序列4所示，其中第25位为特异SNP位点，为A/G多态。

设计KASP引物组，由2条上游引物(6A-90K-236-A和6A-90K-236-B)和1条下游引物(6A-90K-236-C)组成。小麦基因组中KASP引物组的靶序列及其周边序列如序列表的序列5所示。

6A-90K-236-A(序列表的序列1)：

5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTacaacaAcaagAcatttgagagtaA-3’；

6A-90K-236-B(序列表的序列2)：

5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTacaacaAcaagAcatttgagagtaG-3’；

6A-90K-236-C(序列表的序列3)：5’-gcagaatacctccagggaagT-3’。

实施例2、特异SNP的基因型与小麦千粒重性状的大样本关联分析

供试小麦为229种冬小麦，均为现有种质资源，具体见表1的第2列。

一、检测不同品种小麦SNP位点的基因型

检测各个供试小麦基于特异SNP的基因型。

取供试小麦的叶片，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用实施例1的KASP引物组进行KASP。其中，携带荧光序列FAM的扩增产物经荧光照射显示蓝色，而携带荧光序列HEX的扩增产物经荧光照射显示红色。

反应体系(总体积为5μl)：模板DNA(DNA含量为110ng-220ng)，2×KASP reactionmix 2.5μl，引物混合试剂0.056μl，余量为ddH₂O。

2×KASP reaction mix，又称为KASP 2×Master Mix，为LGC公司产品(货号KBS-1016-002)。2×KASP reaction mix包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B，以及高保真的Taq酶，dNTP等。荧光探针A的序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，5′末端连接1个荧光基团FAM；荧光探针B的序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，5′末端连接1个荧光基团HEX；淬灭探针A的序列为5′-AGCATGAACTTGGTCACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ；淬灭探针B的序列为5′-AATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′，3′末端连接淬灭基团BHQ。

引物混合试剂提供的有效成分为6A-90K-236-A、6A-90K-236-B和6A-90K-236-C。反应体系中，6A-90K-236-A、6A-90K-236-B和6A-90K-236-C的浓度均为100μM。

反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序。反应程序：95℃预变性15min；95℃变性20s，退火60s(第一个循环退火温度为65℃,每个循环退火温度下降0.8℃),9个循环；95℃变性20s，57℃延伸60s，35个循环。

将反应产物在PHERAstar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据，结果以散点图的形式展示，每个点代表一个样本，相同基因型的点集中在一个区域，显示蓝色说明基因型为AA，显示红色说明基因型为GG。

结果图见图1。

二、性状调查

两年(2017年度和2018年度)、两地(北京昌平和河南安阳)种植供试小麦，平行条件下进行正常的田间管理，收获后统计千粒重。

每种供试小麦取四个批次试验(2017年度昌平、2017年度安阳、2018年度昌平、2018年度安阳)的千粒重平均值。

三、基因型与性状的关系

步骤一得到各个小麦的基因型及其步骤二得到的各个小麦的千粒重见表1和表2。

229个小麦品种中：197个品种显示为AA基因型，千粒重平均值为44.1g；32个品种显示为GG基因型，千粒重平均值为37.9g；AA基因型小麦的千粒重显著高于GG基因型小麦。统计测验显示基因效应达到了显著差异(P<0.001)。

表1

表2

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龙江省农业科学院克山分院

<120> 一种小麦分子标记及其在鉴定小麦粒重性状中的应用

<130> GNCYX201265

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tacaacaaca agacatttga gagtaa 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tacaacaaca agacatttga gagtag 46

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gcagaatacc tccagggaag t 21

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 4

acaacaacaa gacatttgag agtargggtc caacttccct ggaggtattc tgc 53

<210> 5

<211> 801

<212> DNA

<213> Triticum aestivum

<400> 5

ttagttatgg tcatttggta attttgacaa tgagaacaaa aatttatccc aagatcatat 60

accttgattt aaaaaagttc tggctgtgac taggattaat cagattattt gcaaatcatg 120

tgtagaaaac ttggatcagc tatggtaaaa gctctcatgc catatatatc atgtggatat 180

ctacatatcg tttttccaga tgctattgga aaagttgttg atatcgaacc ttccatgttg 240

agaaactaga aatagtattt atgtgtttta ccctgctcta atgtttgttt cccagtttga 300

gaatggcaag aagatgctta ttctccatgg tacaaggact agcgcagttt tgaaattcgt 360

gctggcagac gtttttcacc tgatgcgtga tcattatgtg aagtatgcca ataacaagga 420

caacaacaag acatttgaga gtargggtcc aacttccctg gaggtattct gcctcaaatc 480

ttacagcaac cttttattca catttccttt tttgtagttg gtgacaataa ggaattgtta 540

ttcacttgag aaaatcaaga ttaaatcgat gatgctatca aaagtaaatg actttctgag 600

ctagacagtg gctttttgag cactaatata gaacctatct caaacctttc ccatgtctgt 660

cataatgatc ttttcatttt cctttgtata ttaagctaga gaatattatt ctgcattatt 720

ttcaaccgtt actttgtacc ccgactgtac attcttccag tgaacacatc aaaatagcag 780

gtccgcagat ctaaaggctc a 801

Claims (10)

1.引物组，由引物6A-90K-236-A、引物6A-90K-236-B和引物6A-90K-236-C组成；

引物6A-90K-236-A为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

引物6A-90K-236-B为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

引物6A-90K-236-C为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

2.权利要求1所述引物组的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)或(d8)：

(d1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(d3)筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d4)筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d5)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状的产品；

(d6)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品；

(d7)制备用于筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(d8)制备用于筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

3.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组。

4.权利要求3所述试剂盒的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：

(d1)鉴定或辅助鉴定小麦的粒重性状；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状；

(d3)筛选或选育具有不同粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种；

(d4)筛选或选育具有不同千粒重性状的小麦单株或株系或品系或品种。

5.一种鉴定待测小麦的粒重性状的方法，包括如下步骤：

(1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行KASP；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦的基因型；

(3)根据基因型结果进行判断：AA基因型小麦的粒重高于GG基因型小麦。

6.权利要求5所述方法在小麦育种中的应用。

7.一种鉴定小麦的粒重性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；AA基因型小麦的粒重高于GG基因型小麦；所述特异SNP为小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第25位核苷酸。

8.一种小麦育种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异SNP的基因型；选择AA基因型小麦进行育种；所述特异SNP为小麦基因组中的序列表的序列4所示DNA分子的第25位核苷酸。

9.特异DNA分子，如序列表的序列4所示。

10.权利要求9所述特异DNA分子在鉴定小麦籽粒性状中的应用。

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