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CN110872597A - 一种鸭tlr7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法 - Google Patents

一种鸭tlr7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法 Download PDF

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卢立志
顾天天
田勇
陈黎
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陶争荣
杜雪
徐坚
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Abstract

本发明公开了一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：步骤1、鸭TLR7基因PCR扩增及回收；步骤2、In Fusion进行载体和目的片段的重组；步骤3、菌落PCR检测。本发明在PCR上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点，这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组，这种克隆方法效率较高，并可通过测序有效地鉴定PCR产物，本发明具有：①快速：仅需要15分钟反应时间；②简单：不受片段酶切位点的影响，无需对片段酶切；③高效：阳性率达95％以上；④无缝：不引入额外的序列等优点。

Description

一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法。
背景技术
天然免疫系统是机体防御的第一道关卡，它们能识别病原微生物，触发细胞内与细胞间的信号通路，对抗病原体感染。模式识别受体(PRRs)是机体天然免疫系统的重要成分，主要有Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体(RLRs)、NOD样受体(NLRs)、AIM2样受体(ALRs)和C型凝集素样受体(CLRs)等，能够识别病原相关分子模式(PAMPs)，如微生物鞭毛、肽聚糖、脂多糖、CpG基序、单链和双链RNA等，释放有抗病原微生物作用的细胞因子(如IFN-β等)，从而诱导机体产生抗病原微生物天然免疫反应，在控制病原微生物感染和疫病发生过程中发挥重要作用。
TLRs是近年发现并备受关注的天然免疫系统中重要的一类PRRs，迄今已在人类和动物中发现至少16种，其中人10种，鼠12种，鸡10种，但这类受体在结构上均为典型的I型跨膜蛋白，每个成员都有类似的结构特征，包括胞外识别PAMPs的LRRs(富亮氨酸重复基序)、单一的跨膜区和胞内与接头分子(如MyD88、TIRAP等)相关的TIR(Toll/IL-1受体同源区)3个结构域，并具有识别病毒颗粒或DNA、dsRNA和ssRNA等核酸，诱导前炎症因子和I型干扰素(IFN-I)等细胞因子产生和树突状细胞(DC)成熟，启动获得性免疫反应的功能。目前在人类已经证明具有病毒识别功能的有TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR9，但不同TLRs识别的PAMPs不同，如TLR3识别双链RNA病毒以及病毒复制过程中产生的双链RNA中间体，TLR7和TLR8识别富含G/U的单链RNA病毒，TLR9识别DNA病毒的非甲基化CpG DNA序列，它们在抗病毒天然免疫反应中具有重要作用。
TLR7是TLRs家族的重要成员之一。在哺乳动物中，TLR7激活可产生多种炎症因子[包括IFN-α、IFN-β、白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]，共刺激分子(CD40、CD80、CD86)、主要组织相容性复合体分子(MHC)IFN-α的上调。然而，目前对禽类TLR7的研究刚刚开始，有限的研究结果证明，鸡具有完整的TLR7基因，编码蛋白含有1047个氨基酸和1个富亮氨酸重复的保守模式，其氨基酸序列与人类TLR7同源性仅为62％，且鸡TLR7的配体识别模式与人和小鼠的TLR7有较大差别。生物信息学分析结果表明，鸡TLR7的基因结构有别于人和小鼠，其基因的外显子Ⅱ显著长于人和小鼠，且在转录过程中存在选择性剪切(ahernative splice)，产生3种不同的转录产物，导致LRR结构域发生明显变化，可能正是这种差异导致了PAPMs识别功能的变化。与鸡相似，鸭也具有完整的TLR7基因，但鸭TLR7与鸡TLR7的氨基酸序列同源性仅为85％，其差异主要发生在结合配体的LRR结构域。在斑胸草雀中，TLR7基因有两种(基因倍增导致)。但禽类TLR7基因功能研究迄今却鲜有报道。
自从人类TLRs被发现以来,以调控机体天然免疫和适应性免疫功能，预防和治疗人类疾病为目的TLRs免疫调控剂的研究在医药界引起巨大反响和广泛研究，为以TLRs为靶向，研发新型免疫增强剂和靶向治疗药物奠定了基础。目前，多种TLRs激动剂作为人类疫苗免疫增强剂和治疗药物的安全性和功效已经得到验证，并已在世界各地广泛应用。而动物TLRs免疫调控剂的研究起步较晚，虽有研究表明一些畜禽TLRs配体具有潜在的免疫调控作用，可诱导DC活化产生大量IL-12和I型干扰素，在机体天然免疫反应中发挥着十分重要的作用，但对于其作用的详细机制还不十分清楚，畜禽生产中的应用还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸭TLR7(duckTLR7)真核表达重组质粒载体DuckTLR7-pcDNA3.1-HA构建与鉴定方法，目的在于：①用它作为运载工具，将目的基因TLR7转移到宿主细胞中去；②利用它在宿主细胞内对目的基因TLR7进行大量的复制(称为克隆)，为深入研究鸭TLR7的免疫调控功能及其分子机制，开发以TLR7为靶向的新型免疫增强剂和靶向治疗药物奠定基础。其具体技术方案为：
一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1、鸭TLR7基因PCR扩增及回收
1.1模板
采用鸭脾脏cDNA为模板。
1.2设计引物
根据NCBI给出的鸭TLR7参考序列(XM_005029178.3)，按照引物设计原则设计PCR引物，并在上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点，引物序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：2所示；
1.3 PCR扩增体系及条件
在50μL反应体系中，分别加入灭菌去离子水1.0μl、zTLR7-F(10uM)1.0μl、zTLR7-R(10uM)1.0μl、鸭脾脏cDNA2.0μl和
Figure BDA0002285069410000031
PCR SuperMix,High Fidelity 45μl。
按照下列条件进行PCR扩增：94℃预变性2min，PCR扩增反应32个循环(94℃,30sec；62℃,30sec；68℃,3.5min)。
1.4 P PCR扩增产物切胶回收，进行下面融合反应。
步骤2、In Fusion进行载体和目的片段的重组
采用
Figure BDA0002285069410000032
Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Invitrogen货号：A14606)进行重组质粒的构建；
步骤3、菌落PCR检测
挑选菌落，LB液体培养基摇床培养3-5h；然后采用步骤1中所述的特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为在50μL反应体系中，分别加入灭菌去离子水1.0μl、zTLR7-F(10uM)1.0μl、zTLR7-R 10uM 1.0μl、鸭脾脏cDNA2.0μl和
Figure BDA0002285069410000041
PCR SuperMix,HighFidelity 45μl。
所获PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择阳性菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。
进一步，步骤2中，具体反应体系为在10μL体系中，分别加入灭菌去离子水2.0ul、duckTLR7纯化产物2.0ul、pcDNA3.1-HA(BamHI/EcoRI)(50ng)1.0ul和
Figure BDA0002285069410000042
2X EnzymeMix 5.0ul。反应条件为室温放置20min，冰上放置2-3min，然后全部转化感受态细胞DH5α。
进一步，步骤3中，反应条件为94℃预变性2min，PCR扩增反应32个循环，94℃,30sec；62℃,30sec；68℃,3.5min。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明在PCR上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点，这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组，这种克隆方法效率较高，并可通过测序有效地鉴定PCR产物。
(2)本发明选用的pcDNA3.1-HA载体包含以下成分：可在多种哺乳动物细胞中高水平表达的人巨细胞病毒(CMV)启动子、可以促进克隆的正向(+)和反向(-)多个克隆位点、可用于选择稳定细胞系的新霉素抗性基因、潜伏感染SV40或表达SV40大T抗原(如COS-1、COS-7)的细胞系的外泌体复制，因而可在大多数动物细胞中进行高水平稳定的非复制性瞬时表达。
(3)本发明采用In Fusion无缝克隆方法进行载体和目的片段的重组，不受传统克隆方法的限制，无论载体类型或插入片段组成如何，针对各种克隆应用都能保持出色的准确性，无需传统连接方法的亚克隆操作。甚至插入片段大小或片段数量增加，克隆成功率仍然很高，且比传统连接酶的方法速度快。
(4)本发明进行重组质粒构建所采用的
Figure BDA0002285069410000051
Seamless Cloning andAssembly Enzyme Mix无缝酶混合技术可用于创建高达13kb的构建体，并可用于高通量组装。能够在一个室温反应中将1至4个任意序列组成PCR片段，同时和定向克隆到任何线性化的载体上，具有：①快速：仅需要15分钟反应时间；②简单：不受片段酶切位点的影响，无需对片段酶切；③高效：阳性率达95％以上；④无缝：不引入额外的序列等优点。
附图说明
图1是PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中，M：DL5K DNA marker(100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)，1：zTLR7 CDS PCR扩增产物(3270bp)；
图2是质粒PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中，M：DL5K DNA marker(100，250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)，duckTLR7 1-4：菌落PCR(约3270bp)；
图3是duckTLR7-pcDNA3.1-HA重组载体片段原始测序峰图；
图4是duckTLR7-pcDNA3.1-HA重组载体与NCBI提供鸭TLR7序列比较结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1鸭TLR7基因PCR扩增及回收
1.1模板
采用鸭脾脏cDNA为模板。
1.2设计引物
根据NCBI给出的鸭TLR7参考序列(XM_005029178.3)，按照引物设计原则设计PCR引物，并在上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点(表1)。
表1引物名称及序列
Figure BDA0002285069410000061
1.3 PCR扩增体系及条件
如表2所示，在50μL反应体系中，分别加入灭菌去离子水、zTLR7-F(10uM)、zTLR7-R(10uM)、鸭脾脏cDNA和
Figure BDA0002285069410000064
PCR SuperMix,High Fidelity。
表2 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002285069410000062
*注：Invitrogen，货号：12532-016
按照表3所示条件进行PCR扩增。
表3 PCR扩增反应条件
Figure BDA0002285069410000063
Figure BDA0002285069410000071
1.4 PCR扩增结果
所获PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。
PCR扩增产物切胶回收，进行下面融合反应。
2 In Fusion进行载体和目的片段的重组
采用
Figure BDA0002285069410000074
Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix(Invitrogen货号：A14606)进行重组质粒的构建，具体反应体系及条件如表4。
表4 Duck TLR7和pcDNA3.1融合反应体系及条件
Figure BDA0002285069410000072
3菌落PCR检测
挑选菌落，LB液体培养基摇床培养3-5h；然后采用特异性引物(同步骤1)进行PCR扩增。PCR扩增反应体系和反应条件分别见表5和表6。
表5 PCR扩增反应体系
Figure BDA0002285069410000073
Figure BDA0002285069410000081
表6 PCR扩增反应条件
Figure BDA0002285069410000082
所获PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2。
选择1号阳性菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，部分片段原始测序峰图见图3。
通过MegAlign序列比对，表明编码区和NCBI提供序列有些差异，但未影响该基因整个CDS编码，无移码突变(图4)，成功构建了duckTLR7-pcDNA3.1-HA重组载体。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttggtaccga gctcggatcc gccaccatgt catgctacac tctcctctc 49
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggaacatc gtatgggtaa acagtttcct ggagaaggtt g 41

Claims (3)

1.一种鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤
步骤1、鸭TLR7基因PCR扩增及回收
1.2模板
采用鸭脾脏cDNA为模板；
1.2设计引物
根据NCBI给出的鸭TLR7参考序列XM_005029178.3，按照引物设计原则设计PCR引物，并在上游引物起始密码子ATG前加入Kodak序列和BamHI酶切位点，引物序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：2所示；
1.3PCR扩增体系及条件
在50μL反应体系中，分别加入灭菌去离子水1.0μl、zTLR7-F 10uM 1.0μl、zTLR7-R10uM 1.0μl、鸭脾脏cDNA2.0μl和
Figure FDA0002285069400000011
PCR SuperMix,High Fidelity 45μl；
按照下列条件进行PCR扩增：94℃预变性2min，PCR扩增反应32个循环，94℃,30sec；62℃,30sec；68℃,3.5min；
1.4P PCR扩增产物切胶回收，进行下面融合反应；
步骤2、In Fusion进行载体和目的片段的重组
采用
Figure FDA0002285069400000012
Seamless Cloning and Assembly Enzyme Mix，Invitrogen货号：A14606，进行重组质粒的构建；
步骤3、菌落PCR检测
挑选菌落，LB液体培养基摇床培养3-5h；然后采用步骤1中所述的特异性引物进行PCR扩增；PCR扩增反应体系为在50μL反应体系中，分别加入灭菌去离子水1.0μl、zTLR7-F 10uM1.0μl、zTLR7-R 10uM 1.0μl、鸭脾脏cDNA2.0μl和
Figure FDA0002285069400000021
PCR SuperMix,High Fidelity45μl；
所获PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择阳性菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。
2.根据权利要求1所述的鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，其特征在于，步骤2中，具体反应体系为在10μL体系中，分别加入灭菌去离子水2.0ul、duckTLR7纯化产物2.0ul、pcDNA3.1-HA 50ng 1.0ul和
Figure FDA0002285069400000022
2X Enzyme Mix 5.0ul，反应条件为室温放置20min，冰上放置2-3min，然后全部转化感受态细胞DH5α。
3.根据权利要求1所述的鸭TLR7真核表达重组质粒载体的构建与鉴定方法，其特征在于，步骤3中，反应条件为94℃预变性2min，PCR扩增反应32个循环，94℃,30sec；62℃,30sec；68℃,3.5min。
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