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CN107988254A - 一种mta1基因表达载体的构建与鉴定方法 - Google Patents

一种mta1基因表达载体的构建与鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其包括有以下步骤，具体的：a、引物设计；b、MTAl基因的扩增；c、pIRES2‑MTAl真核表达载体的构建；d、pIRES2‑MTAl真核表达载体的鉴定。通过上述方法设计，本发明能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。

Description

一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法
技术领域
本发明涉及基因表达载体构建技术领域，尤其涉及一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法。
背景技术
通过使用差异cDNA文库筛选技术，Pencil等首次从具有不同转移潜能的13762NF鼠乳腺癌细胞株中分离出一种新的与乳腺癌转移相关的基因，之后经过同源性检测发现，在高转移潜能的人乳腺癌细胞系中，也存在着同源物，并且其表达情况和乳腺癌的侵袭转移能力呈现出正相关，故被命名为肿瘤转移相关基因1，即MTA1。MTA1广泛表达于乳腺癌、卵巢癌、食管癌、胃肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织中，并且其表达水平在肿瘤的转移、浸润及复发中起着非常重要的作用。
MTA1基因定位于染色体14q32.3，基因全长2.3kb，cDNA全长2 756 bp，编码含715个氨基酸残基的蛋白，相对分子量约80 kd。MTA1主要由四个保守结构域组成，如BMH结构域（bromo-adjacenthomology）、egl-27 、ELM2结构域（MTA1homologydomain 2）、SANT结构域（Swi3, Ada2, NCoR andTFIIIB domain）、GATA 样锌指模体，这些结构可能对恶性肿瘤的转移、侵袭有一定的作用，但具体原因不明。MTAl和其同源基因-MTA2、MTA3均属于核小体重构与组蛋白脱乙酰复合物nucleosomeremodel-ingand histone deacetylase, NuRD）的重要组成部分。MTAl与 NuRD复合物中的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）相互作用，通过染色体区域组蛋白的乙酰化与脱乙酰化来调控靶基因的转录，从而参与肿瘤的发生发展及浸润转移。Higashijima等利用免疫组化的方法检测结直肠癌患者临床标本中的MTAl和HDAC1的表达及分析患者的5年生存率，结果发现 MTAl和HDAC1的表达水平可以作为判断结直肠癌预后的指标。
正常的成人组织中，除大脑、肝、肾，心肌外，MTAl基因呈低水平的表达，然而在多种具有高转移能力的恶性肿瘤中呈现高表达。最早的研究证实，具有高转移能力乳腺癌细胞株MTAl基因的表达水平是无转移能力细胞株的4倍，提示癌细胞的转移与其表达的MTAl基因的水平有密切关系。近年来研究发现，在乳腺癌细胞中高表达的MTAl 基因和HDACs共同介导抑制雌激素受体（ER）的转录，而ER的减少或消失与乳腺癌的形成以及恶性程度有关。有研究报道， 也高表达于卵巢癌组织MTA1中。田菁等进一步研究发现，不同FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及不同病理分级的卵巢癌组织中，MTA1 的表达与FIGO分期期别呈正相关；与卵巢癌组织学分化程度呈负相关。该结果提示，MTA1 的高表达在肿瘤恶性增殖、浸润转移中起到重要作
用。在消化道肿瘤中，如食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌及胰腺癌等癌组织中，研究发现MTAl蛋白的过表达与食管癌、胃癌及结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移以及预后差密切相关。最近的研究表明，MTA1在上皮-间质转化（epithelial- mesenchymaltransition, EMT）中起着重要的作用，其可以通过诱导EMT使结直肠癌细胞的浸润转移能力增强。另外，有研究报道，MTA1通过结合FosB/HDAC2复合物的部分启动子使E-cadherin的表达下调，最终导致EMT，从而增强癌细胞的浸润与侵袭能力。
总之，MTA1的过表达确实与诸多恶性肿瘤的形成、浸润转移有着密不可分的相关性；但是，具体分子机制仍待深入研究阐明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，该MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。
一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，包括有以下步骤，具体的：
a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据MTAl开放阅读框架序列设计特异性引物，扩增产物的总长度约为2186bp；MTAl引物序列：上游引物为5'-CGGAATTCATGGCCGCCAACATGTAC-3'，且上游引物引入EcoR I位点；下游引物为5'-CGGGATCCCTAGTCCTCGATGACGATG-3'，且下游引物引入BamH I位点；上游引物的GAATTC为保护碱基，下游引物的GATCCC酶切位点；
b、MTAl基因的扩增：SW480细胞用RPM1640完全培养基置于5% CO2 37℃培养，取对数生长期细胞作为实验用，收集细胞，采用TRIzol一步法提取SW480细胞总RNA，参照逆转录试剂盒的标准要求合成cDNA用作PCR反应模板；
c、pIRES2- MTAl真核表达载体的构建：将真核表达载体pIRES2-eGFP与目的基因MTAl回收产物分别同时进行双酶切，目的基因MTAl酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，将真核表达载体pIRES2-eGFP酶切产物跑胶，凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物用T4 DNA连接酶连接；
d、pIRES2- MTAl真核表达载体的鉴定：将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，用转化的DH5α感受态菌液涂布于含30 mg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-16 h，长出的单个菌落即为转化的菌落，挑取单克隆，在含30mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养12-16 h；菌液用碱裂解法小量提取质粒DNA，PCR扩增质粒上的目的基因，凝胶电泳鉴定扩增产物。
其中，于所述步骤b中，PCR反应体系容量为50μL，包括2×Power TaqPCRMasterMix 25μL，上下游引物各加2.5μL，cDNA 5μL，无菌去离子水补至50μL；反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃变性45sec，55℃退火1 min，72℃延伸2.5 min，扩增35个循环，最后72℃延伸7 min。
其中，于所述步骤c中，双酶切反应体系容量为50μL，包括Restriction EnzymeEcoR I和BamH I各1μL，10×NEB Buffer 5μL，DNA 1μg，无菌去离子水补至50μL。
其中，于所述步骤c中，连接反应体系容量为10μL，包括T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer1μL，MTAl和pIRES2-eGFP为10∶1，置于PCR仪上6℃连接过夜。
本发明的有益效果为：本发明所述的一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其包括有以下步骤，具体的：a、引物设计；b、MTAl基因的扩增； c、pIRES2- MTAl真核表达载体的构建；d、pIRES2- MTAl真核表达载体的鉴定。通过上述方法设计，本发明能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。
附图说明
下面利用附图来对本发明进行进一步的说明，但是附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。
图1为PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳并于紫外线透射仪下观察电泳结果；
图2为plRES-MTA1双酶切鉴定结果。
图3为pIRES2-MTA1部分测序结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明进行说明。
一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，包括有以下步骤，具体的：
a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据MTAl开放阅读框架序列设计特异性引物，扩增产物的总长度约为2186bp；MTAl引物序列：上游引物为5'-CGGAATTCATGGCCGCCAACATGTAC-3'，且上游引物引入EcoR I位点；下游引物为5'-CGGGATCCCTAGTCCTCGATGACGATG-3'，且下游引物引入BamH I位点；上游引物的GAATTC为保护碱基，下游引物的GATCCC酶切位点；
b、MTAl基因的扩增：SW480细胞用RPM1640完全培养基置于5% CO2 37℃培养，取对数生长期细胞作为实验用，收集细胞，采用TRIzol一步法提取SW480细胞总RNA，参照逆转录试剂盒的标准要求合成cDNA用作PCR反应模板；
c、pIRES2- MTAl真核表达载体的构建：将真核表达载体pIRES2-eGFP与目的基因MTAl回收产物分别同时进行双酶切，目的基因MTAl酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，将真核表达载体pIRES2-eGFP酶切产物跑胶，凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物用T4 DNA连接酶连接；
d、pIRES2- MTAl真核表达载体的鉴定：将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，用转化的DH5α感受态菌液涂布于含30 mg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-16 h，长出的单个菌落即为转化的菌落，挑取单克隆，在含30mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养12-16 h；菌液用碱裂解法小量提取质粒DNA，PCR扩增质粒上的目的基因，凝胶电泳鉴定扩增产物。
其中，于所述步骤b中，PCR反应体系容量为50μL，包括2×Power TaqPCRMasterMix 25μL，上下游引物各加2.5μL，cDNA 5μL，无菌去离子水补至50μL；反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃变性45sec，55℃退火1 min，72℃延伸2.5 min，扩增35个循环，最后72℃延伸7 min。
进一步的，于所述步骤c中，双酶切反应体系容量为50μL，包括RestrictionEnzyme EcoR I和BamH I各1μL，10×NEB Buffer 5μL，DNA 1μg，无菌去离子水补至50μL。
更进一步的，于所述步骤c中，连接反应体系容量为10μL，包括T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA Ligase Buffer1μL，MTAl和pIRES2-eGFP为10∶1，置于PCR仪上6℃连接过夜。
通过上述方法设计，本发明能够克隆MTAl基因并构建真核表达载体，即可为下一步的研究奠定基础。
以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (4)

1.一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：
a、引物设计：从GenBank数据库上搜索MTAl基因的mRNA序列，通过查阅文献并根据MTAl开放阅读框架序列设计特异性引物，扩增产物的总长度约为2186bp；MTAl引物序列：上游引物为5'-CGGAATTCATGGCCGCCAACATGTAC-3'，且上游引物引入EcoR I位点；下游引物为5'-CGGGATCCCTAGTCCTCGATGACGATG-3'，且下游引物引入BamH I位点；上游引物的GAATTC为保护碱基，下游引物的GATCCC酶切位点；
b、MTAl基因的扩增：SW480细胞用RPM1640完全培养基置于5% CO2 37℃培养，取对数生长期细胞作为实验用，收集细胞，采用TRIzol一步法提取SW480细胞总RNA，参照逆转录试剂盒的标准要求合成cDNA用作PCR反应模板；
c、pIRES2- MTAl真核表达载体的构建：将真核表达载体pIRES2-eGFP与目的基因MTAl回收产物分别同时进行双酶切，目的基因MTAl酶切产物用PCR产物回收试剂盒纯化，将真核表达载体pIRES2-eGFP酶切产物跑胶，凝胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物用T4 DNA连接酶连接；
d、pIRES2- MTAl真核表达载体的鉴定：将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，用转化的DH5α感受态菌液涂布于含30 mg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养12-16 h，长出的单个菌落即为转化的菌落，挑取单克隆，在含30mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃振荡培养12-16 h；菌液用碱裂解法小量提取质粒DNA，PCR扩增质粒上的目的基因，凝胶电泳鉴定扩增产物。
2.根据权利要求1所述的一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其特征在于：于所述步骤b中，PCR反应体系容量为50μL，包括2×Power TaqPCR MasterMix 25μL，上下游引物各加2.5μL，cDNA 5μL，无菌去离子水补至50μL；反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃变性45sec，55℃退火1 min，72℃延伸2.5 min，扩增35个循环，最后72℃延伸7 min。
3.根据权利要求1所述的一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其特征在于：于所述步骤c中，双酶切反应体系容量为50μL，包括Restriction Enzyme EcoR I和BamH I各1μL，10×NEB Buffer 5μL，DNA 1μg，无菌去离子水补至50μL。
4.根据权利要求1所述的一种MTA1基因表达载体的构建与鉴定方法，其特征在于：于所述步骤c中，连接反应体系容量为10μL，包括T4 DNA Ligase 1μL，10×T4 DNA LigaseBuffer1μL，MTAl和pIRES2-eGFP为10∶1，置于PCR仪上6℃连接过夜。
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